الحسيني وآخران 2112، 11 – 1(: 2)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 1 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ المعزولة من Vibrio fluvialis وVibrio cholerae بكتريا تأثير بعض العوامل البيئية علـى *1األسماك المتداولة في االسواق المحلية لمدينتي البصرة والناصرية 2عذراء عودة الجبوري 2التميميمنال بادي 1خديجة صادق الحسيني Khadeeja_jaffer@ yahoo.com قـسم علوم االغذية، كلية الزراعة، جامعة البصرة، العراق 1 قسم علوم الحياة، كلية العلوم، جامعة ذي قار، العراق 2 المستخلص من األسماك الطازجة والمجمدة وهي spp. Vibrio تم عزل وتشخيص بكتيريا الضمات Barbus والبني Hypophthalmichthys molitrix والكارب الفضي Tenualosa ilishaالصبور sharpeyi والشانكAcanthopagrus arabicus سمكة من أسواق محافظة البصرة 211، إذ جمعت سمكة من الكارب الفضي 111عت وشملت )سوق البصرة الكبير والعشار والتنومة وخمسة ميل( بينما جم مرت عملية جمع والبني والشانك من أسواق محافظة الناصرية وشملت )السوق الكبير وسوق هرج(، است . ُجلبت األسماك إلى المختبر في 2112/ تشرين الثاني/21ولغاية 2112/ حزيران/2 العينات للفترة من أخذت العينات منها وزرعت مباشرة على حافظة مصنوعة من الفين مخلوطاً مع الثلج المجروش و سترات – األوساط الزرعية )آالكار المغذي، وأكار الدم، وأكار الماكونكي، والوسط االنتقائي )ثيوسلفات 24-18م لمدة 22( ثم ُحضنت األطباق هوائياً في درجة حرارة TCBSالسكروز الصفراوية الصلب – من بكتيريا الضمات وُشخص الجنس باالعتماد على شكل عزله 21ساعة. بعد فترة الحضن تم تشخيص وفحص الحركة بعدها المستعمرات والخاليا تحت المجهر وفحص أنزيم الكاتليز، وأنزيم االوكسيديز، التؤكيدي، اذ تم API20Eشخصت األنواع باالعتماد على الفحوصات الكيموحيوية. واستعمل نظام ولوحظ وجود هذه البكتريا في األسماك fluvialis و choleraهي Vibrioتشـخيص نوعين من بكتيريا تم دراسـة قابلية العزالت على تحمل الحموضة، إذ الطازجة أكثر من وجودها في األسماك المجمدة. عند أرقام %111بنسبة تحمل للحموضة تصل الى .fluvialis Vو V.choleraمتازت عزالت إ .V بينما لوحـظ أن نسبة تحمل الحموضة لبكتيريا، 0.1و2.1و2.1و 0.1و 0.1و 1.1و 1.1هيدروجنية cholera فـي حيـن أن بكتيريا 5.1عنـد رقم هيدروجيـني % 01بلغـت ،fluvialis V. كانت أكثر ن أوبينت الدراسة على التوالي. 5.1و 5.1هيدروجيني عند رقم %11و %21لى إتحمالً وبنسبة تصل %0عند تركيز ملحي %111و %01على مقاومة الملوحة بلغت V. choleraقابلية ضمات الكوليرا . وكانت عزالت %9و %0لعزالت النمو عند تراكيز ملحية على التوالي، بينما لم تستطع ا %2و fluvialis V. 0عند تركيز %111سب مختلفة بلغت لتراكيز ولكن بنمقاومة للملوحة وعند كافة ا% ناك عزلة واحدة مقاومة وبنسبة كانت ه %9، بينما عند تركيز ملحي %0 عند تركيز %51و %2و وهي من ضمن العزالت المجمدة. وقد استطاعت كافة عزالت البكتيريا من مختلف المصادر النمو 21% وقت أجراء التجربة، اال ان ° م 15م وكذلك بدرجة حرارة الغرفة والتي كانت 37م و 25بدرجة حرارة م ولم تستطع أي من 5بعض عزالت بكتريا الضمات استطاعت النمو بكثافة قليلة جداً على درجة حرارة م. - 20هذه العزالت النمو في درجة حرارة ، spp. Vibrio ، البكتريا الضمية Vibrio fluvialisوVibrio cholerae بكتريا عزل وتشخيص: المفتاحية الكلمات .االسماك الطازجة والمجمدة .*مستل من رسالة ماجستير للباحث الثالث 1 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الحسيني وآخران 2112، 11 – 1(: 2)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 2 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ المقدمة تُمثل الثروة السمكية في الوقت الحاضر أحد محاور التنمية االقتصادية واإلجتماعية في العديد من وتقليل الواردات دول العالم نظراً للدور الذي تلعبه في المساهمة في توفير الغذاء وزيادة الصادرات والمحافظة على التنوع البيولوجي، كما تعد الثروة المائية إحدى مجاالت التنمية الهامة والتي ال يقل دورها في إقتصاد الدول عن دور البترول فيما لو أستغلت استغالل علمي، بل قد تمتاز األولى في أنها تتعامل مع الثانية والتي تتعامل مع مادة احتياطها محدود، وبالتالي عنصر دائم االستمرار والتجدد ال ينضب، بعكس (.1992، آخرونفهي معرضة لالنقراض بعد فترة )برانية و من البكتيريا السائدة والمصنفة كفلورا طبيعية تعيش في األسماك، األ أنها Vibrioتُعد انواع جنس لجهاز المناعي ألي سبب من إالجهاد قد تكون ضارة لألسماك )ميكروب إنتهازي( السيما عند إختالل ا (. فضالً عن ان انواع هذا الجنس ممرضة لالنسان وكون االسماك احدى اهم Hameed,1993) البيئي (.2111 )البنا، طرائق نقلها وصفت بكتيريا الضمات بانها بكتيريا سالبة لصبغة كرام ذات شكل يشبه الضمة محبة للملوحة )األوكسيديز والكاتاليز( ط واحد في أحد أقطابها، وتكون موجبة ألختبارالهوائية اختيارية وتمتلك سو 1.1وغير مكونة لألبواغ، وقد تتواجد بأشكال مختلفة عند تعرضها لظروف بيئية قاسية، قطرها مايكروميتر، ولها القدرة على تخمير سكريات الكلوكوز والمانيتول 2.0 -1.5مايكروميتر وطولها Colleeوالسكروز والمانوز والمالتوز والتريهالوز مع إنتاجها غاز وغير قادرة على تخمير األرابينوز ) et al., 1996 ة وال يوإنتخابية تحت ظـروف هوائ(، لها القابلية على النمو على أوساط زرعية إعتيادية TCBS. وأن هذه البكتيريا تنمو بشكل جيد على وسط (Sleigh and Timbury,1994)وائية ه ملم بعد تحضينها لمدة 2-2ومخمرة الالكتوز مكونة مستعمرات صفراء اللون كبيرة مسطحة قطرها من ويمكنها°م 22دقيقة، أما درجة الحرارة المثلى لنموها فهي 21ساعة، ولها زمن جيل أقل من 10-25 وتتحمل درجات حرارة واطئة جداً °م 52إلى ° م 10النمو في مدى واسع من درجات الحرارة يتراوح من عالي pH قاعدي وتتحمل pH. وتحبذ النمو فيJohnston and Brown, 2002)° )م 21 -تصل إلى الصفة ، وهذه 0.0، إال ان الرقم الهيدروجيني المثالي لنموها هو5.1ومنخفض يصل الى 11يصل الى كلوريد الصوديوم، %1استعملت في أختبار أوساط العزل والتشخيص لهذه البكتيريا. يحفز نموها بإضافة ؛ ويتم عزلها من المياه وبراز ٪11ويحتوي حامضها النووي على السايتوسين وعلى الكوانين بنسبة (. (Holt et al., 1994والصرف الصحي والمنتجات البحرية الحيوانات وبراز اإلنسان ذ إ، Vibrionaceaeفهي واحدة من جنس الضمات والذي يعود لعائلة V. fluvialisأما بكتيريا ، Furniss et al., (1977) Bergys et al., (2007)ترجع إلى القسم الخامس حسب موسوعة وتشترك في كون أفرادها ذات شكل عصوي منحني متحركة عن طريق اسواطها القطبية وهي محبة ، ومن ضمن متطلباتها االخرى احتياجها لملح Dulcic et al., (1998)للملوحة وسالبة لصـبغة كرام -Dكلوريد الصوديوم وكونها موجبة ألنزيم األوكسيديز وإيجابية لفحص النترات، ولها قدرة على تخمر مع السايتوسين في من الكوانين ٪11الجلوكوز والكربوهيدرات األخرى مع إنتاج الحامض والغاز ولديها الحامض النووي؛ ويتم عزلها من المياه وبراز الحيوانات وبراز اإلنسان ومن قنوات الصرف الصحي (Furniss et al., 1977).والمنتجات البحرية وتهدف الدراسة الحالية الى: وذي قار، سواق المحلية في محافظتي البصرةعزل بكتيريا الكوليرا من األسماك المأخوذة من األ .1 والتي تعد من المناطق الوبائية بالنسبة لضمات الكوليرا حسب تقارير وزارة الصحة.وتشخيصها وفق http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الحسيني وآخران 2112، 11 – 1(: 2)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 2 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الفحوصات المجهرية الكيموحيوية )فحص األوكسيديز وفحص قابلية البكتريا على أنتاج األندول استغالل السترات وإختبار المثيل األحمر وإختبار فوكس بروسكاور وإختبار قابلية البكتريا على كمصدر وحيد للكربون وإختبار أنتاج أنزيم اليوريز وإختبار قابلية البكتريا على الحركة و تخمر سكر V. choleraتيريا( الخاصة بالكشف عن بكH2Sو CO2)المانيتول وإختبار تخمر السكريات وإنتاج التي عزلت وشخصت من األسماك المدروسة.V. fluvialis و إختبار كيموحيوي والمعتمدة من قبل 20التي تحتوي على APi20Eخيص باستعمال عدة تأكيد التش .2 (.(WHOمنظمة الصحة ألعالمية إختبار مدى قدرة البكتيريا على تحمل بعض الظروف البيئية وهي الحموضة والملوحة والحرارة. .2 المواد وطرائق البحث :تجمع العينا -1 عينة 111عينة من أربعة أسواق من محافظة البصرة و 211عينة من االسماك، منها 201جمعت ، إذ 2112/تشرين الثاني/21ولغاية 2112/حزيران/2ية، للفترة الممتدة من من اسواق محافظة الناصر من 10من سوق البصرة الكبير و 12جمعت عينات اسماك الصبور من أسواق محافظة البصرة كاألتي: من سوق خمسة ميل، بينما جمعت اسماك الكارب الفضي كاألتي: 9من سوق التنومه و 21سوق العشار و من سوق خمسة ميل، في 12من سوق التنومه و 0من سوق العشار و 12من سوق البصرة الكبير و 11 من سوق العشار 12من سوق البصرة الكبيرو 9حين أن ما تم جمعه من عينات من اسماك الشانك هي من سوق 15مسة ميل، وكانت العينات المجموعة من سمك البني من سوق خ 11من سوق التنومه و 19و من سوق خمسة ميل. 9من سوق التنومه و 19من سوق العشار و 0البصرة الكبير و سمكة من الكارب 11منها كاألتي: 111أما من اسواق محافظة ذي قار فكان عدد عينات االسماك من سوق هرج 21ك الشانك كان عدد العينات من السوق الكبير ومن أسما 21الفضي من سوق هرج و من السوق الكبير. 21من سوق هرج و 21من السوق الكبير، ومن سمك البني 21و ونُقلت عينات األسماك محفوظة بالثلج إلى المختبر، وبعد تحضير العينة وضعت في ماء الببتون م لمـدة 22ت بـدرجة حـرارة وُحضن 0القاعدي المضاعف لغرض التنشيط ويكون الرقم الهـيدروجيني . زرعت العينات مباشرة على األوساط (Collee et al., 1996; Holt et al., 1994)( سـاعة 0-0) ت األطباق هوائياً في درجة حرارة، ثم ُحضن(TCBSالمغذي والدم والمكونكي و الزرعية )وسط آكار ساعة، إذ لوحظت صفات وأشكال المستعمرات النامية بأجراء الفحص التشخيصي 24-18م لمدة 22 المجهري. العزل والتشخيص: -2 ينات وضعت في ماء الببتون فوظة بالثلج وبعـد ان حضرت العنقلت العينات الى المختبر مح ساعة 0-0م لمدة 22وُحضنت بدرجة حرارة 8.6القاعدي المضاعف بحيث ان الرقم الهيدروجيني (Islam et al., 1994; Elliot et al., 2001) .بعد ذلك تم أجراء الفحص التشخيصي المجهري (، ثم TCBSوزرعت مباشرة على األوساط الزرعية )وسط آكارالمغذي وأكار الدم وأكار الماكونكي و 11ساعة، بعد فترة الحضن تم تشخيص 24-18م لمدة 22حضنت األطباق هوائياً في درجة حرارة مستعمرة من بكتيريا الضمات. http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الحسيني وآخران 2112، 11 – 1(: 2)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 5 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الفحوصات المجهرية -3 ساعة بوساطة عروة 18-24وبعمر TCBSنقل جزء من المستعمرات النقية النامية على وسط إلى شريحة زجاجية وضع عليها قطرة من الماء المقطر، ونشرت على مساحة من سطح (Loop)الناقل الشريحة وتم تثبيتها وصبغت بصبغة كرام، بعدها تم فحصها تحت العدسة الزيتية للمجهر الضوئي للتمييز (.(Betty et al., 2007بين شكل الخاليا وايجابيتها وسلبيتها لصبغة كرام وية الفحوصات الكيموحي -4 Koneman) الجل تشخيص العزالت أجريت الفحوصات الكيموحيوية التالية وحسـب ما ُذكر في et al., 1992 ; Betty et al., 2007) :وكاالتي- فحص األوكسيديز -أ تم أجراء هذا الفحص بأخذ عينة من المزروع البكتيري النامي على وسط االكار المغذي المحضر ساعة بوساطة عيدان خشبية معقمة على ورقة ترشيح مبللة 24على أن تكون المستعمرات النامية بعمر بكاشف األوكسيديز، ودل ظهور اللون البنفسجي على إيجابية الفحص. ريا على إنتاج األندول فحص قابلية البكت -ب م 37اجري الفحص بتلقيح وسط ماء الببتون بالعزالت البكتيرية وحضنت األنابيب بدرجة حرارة ، والدليل على ايجابية Kovac's reagentكوفاكس ساعة، بعد ذلك أضيفت قطرة من كاشف 24لمدة الفحص هو ظهور حلقة حمراء. إختبار المثيل األحمر -ج م لمدة 37تم تلقيح وسط أحمر المثيل فوكس بروسكاور بالعزالت البكتيرية وحضنت بدرجة حرارة قطرات من كاشف المثيل األحمر إلى الوسط ورّج برفق حيث إن تغير 5ساعة ثم أضيفت بعد ذلك 24 إلى اللون االحمر دليل على إيجابية الفحص. لون الوسط إختبار فوكس بروسكاور -د ساعة، بعد 24م لمدة º 37لقح وسط المثيل فوكس بروسكاور بالعزالت البكتيرية وحضنت بدرجة MR-VPفي وسط إلى النمو الحاصل Bوقطرتين من الكاشف Aقطرات من الكاشف 6ذلك تم إضافة ومزج جيداً، أن ظهور اللون الوردي دليل على إيجابية الفحص. إختبار قابلية البكتريا على استغالل السترات كمصدر وحيد للكربون -ر 24تم أجراء هذا الفحص بنقل جزء من المزروع البكتيري النامي على وسط االكار المغذي وبعمر كار سيمون ستريت المائل، وزرع بطريقة الطعن والتخطيط على ساعة، بوساطة إبرة معقمة إلى وسط أ ساعة، أن تغير لون الوسط من اللون 24م ولمدة 37السطح المائل وحضنت األنابيب بدرجة حرارة االخضر إلى األزرق هو دليل على إيجابية هذا الفحص. إختبار أنتاج أنزيم اليوريز -ز م لمدة 37تم تلقيح األنابيب الحاوية على أكار اليوريا بالعزالت البكتيرية وحضنت بدرجة حرارة ساعة، وكان تغير لون الوسط إلى اللون الوردي داللة على إنتاجية البكتريا ألنزيم اليوريز. 24 قابلية البكتريا على الحركة و تخمر سكر المانيتول إختبار -و تم أجراء هذا االختبار وذلك بنقل جزء من المزروع البكتيري النامي على وسط اآلكار المغذي ساعة بوساطة إبرة معقمة إلى وسط اكار المانيتول شبه الصلب وزرع بطريقة الطعن وحضن 24وبعمر ير لون الوسط إلى األصفر وإنتشار النمو وظهوره بشكل تضبب ساعة. تغ 24م لمدة 37بدرجة حرارة حول منطقة الطعن يعطي ايجابية الفحص. http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الحسيني وآخران 2112، 11 – 1(: 2)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 1 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ H2Sو CO2إختبار تخمر السكريات وإنتاج -ي بالعزالت البكتيرية وذلك بطريقة الطعن Kliglers تم تلقيح وسط آكار كليكلر الحديد المائل ساعة، بعدها تم التحري عن وجود 24م لمدة 37حرارة والتخطيط على السطح المائل وحضن بدرجة H2S إذ يتكون راسب أسود في قعر األنبوبة وCO2 من خالل ظهور الفقاعات الغازية ويعّد دليالً على ، وتغير لون الوسط إلى اللون األصفر دليل على تخمير سكر الكلوكوز والالكتوز. وتم تأكيد CO2تحرر إختبار كيموحيوي والمعتمدة من قبل منظمة 20التي تحتوي على 20E APIالتشخيص بإستعمال عدة (.(WHOالصحة العالمية إختبار قابلية البكتيريا على تحمل الحموضة -3 اجري إختبار تحمل الحامض بطريقة االنابيب وبإستعمال وسط الببتون وعلى النحو التالي: تحضير العالق البكتيري .1 نقية ومنفردة وحديثة بواسطة عروة نقل من سطح وسط اآلكار المغذي الى مستعمرات 1-5نقلت ساعة للحصول على تركيز 10م ولمدة 22مل من وسط الببتون القاعدي وُحضنت عند درجة حرارة 11 إذ استعمل هذا العالق في المراحل الالحقة من اإلختبار. 1-خلية مل110 يدروجيني المختلفتحضير وسط الببتون القاعدي ذي الرقم اله .2 حضر وسط الببتون بقيم مختلفة عن الرقم الهيدروجيني وباستعمال حامض الهيدروكلوريك، مل في كل انبوبة وبواقع ثالث مكررات لكل عزلة بكتيرية وُعقمت 11، إذ وضع 9-2تراوحت مابين هذه األنابيب في المؤصدة. إجراء االختبار .3 ل عزلة بواسطة ماصة دقيقة الى األنابيب الحاوية على وسط مل من العالق البكتيري لك 0.1نقل ساعة، إذ أن مكان 25م لمدة 22الببتون ذي االرقام الهيدروجينية المختلفة وبعدها ُحضنت بدرجة حرارة وجود العكورة دليل على النمو وعدم وجودها دليل على عدم النمو، أن االنابيب التي كانت رائقة تم نقل للتاكد من عدم وجود النمو، كما تم تغيير الرقم MacConkyو TCBSوسط جزء منها الى ساعة للتاكد 25م لمدة 22وُحضنت مرة اخرى بدرجة حرارة 0الهيدروجيني لألنابيب سالبة النمو إلى من وجود النمو من عدمه. اختبار قابلية البكتيريا على تحمل كلوريد الصوديوم: -4 تحضير العالق البكتيري: مستعمرات نقية ومنفردة وحديثة بواسطة عروة نقل من سطح وسط اآلكار المغذي إلى 1-5نقلت ساعة للحصول على تركيز 10م ولمدة 22مل من وسط الببتون القاعدي وُحضنت على درجة حرارة 11 ر.إذ استعمل هذا العالق في المراحل الالحقة من اإلختبا 1-خلية مل110 تحضير وسط الببتون القاعدي بتراكيز ملحية مختلفة: من العالق البكتيري 1.1، ثم لقحت هذه االنابيب بـ %9و %0و %2و %0حضرت تراكيز ملحية ساعة بعدها تم قراءة النتائج بظهور أو عدم ظهور النمو 10م لمدة 22المحضر وُحضنت بدرجة حرارة )العكورة(. http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الحسيني وآخران 2112، 11 – 1(: 2)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 0 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ إختبار تحمل بكتريا الضمات لدرجات الحرارة المختلفة: - 5 تحضير العالق البكتيري: مستعمرات نقية ومنفردة وحديثة بواسطة عروة نقل من سطح وسط اآلكار المغذي الى 1-5نقلت ساعة للحصول على 10م ولمدة 22مل من وسط الببتون القاعدي وُحضنت على درجة حرارة 11 إذ استعمل هذا العالق في المراحل الالحقة من اإلختبار. 1-خلية مل110تركيز تحضير وسط الببتون القاعدي: .4 حضر هذا الوسط حسب التعليمات المثبتة على العبوة من قبل الشركة المصنعة ويتم تحضيره م 121القاعدي، وعقم بالمؤصدة بدرجة حرارة NaOHمل من 11و NaClغم11غم ببتون و11بإضافة م وصب في أنابيب معقمة وُحفظ في 45، ثم ترك في الحمام المائي ليبرد إلى درجة حرارة دقيقة 15لمدة مل لكل أنبوبة 11لحين االستعمال. ُصب في أنابيب زجاجية محكمة الغلق وبواقع ºم4 الثالجة بدرجة وبثالث مكررات لكل عزلة. اجراء االختبار: .5 أنبوبة لكل عزلة )وهي 11الوسط أعاله بحيث أصبح لدينا مل من العالق البكتيري الى 1.1اضيف م 11م و 21م و 22حصيلة خمس درجات حرارية وثالث مكررات( ُحضنت هذه األنابيب بدرجة حرارة ساعة وبعدها تم مالحظة العكورة، كما تم إعادة النماذج التي لم 10م. وتركت األنابيب لمدة 21-م و 1و ساعة للتاكد من 10م لمدة 22م( إلى حاضنة درجة حرارتها 21-م، 1ي تظهر فيها العكورة )درجت وجود بكتريا حية من عدمه. النتائج والمناقشة خالل الدراسة الحالية تم عزل وتشخيص بكتيريا الضمات من أسماك الكارب الفضي والشانك ، في حين (1 جدولال)سمكة 111والبني بهياتها الطازجة والمجمدة من اسواق محافظة الناصرية وبواقع جمعت أسماك الصبور والكارب الفضي والشانك والبني بهياتها الطازجة والمجمدة، وقد جمعت هذه دة ، واستمرت عملية جمع العينات للم(2 جدولال)سمكة 211العينات من أسواق محافظة البصرة وبواقع .2112تشرين الثاني//21ولغاية 2112/حزيران/2من اعداد األسماك المجموعة من اسواق محافظة الناصرية .1جدول ال هيئة االسماك اعداد االسماك مصدر االسماك نوع االسماك الكارب 21 السوق الكبير طازج 11 مجمد 11 11 سوق هرج طازج 0 مجمد 2 الشانك 21 السوق الكبير طازج 12 مجمد 12 21 سوق هرج طازج 11 مجمد 11 البني 21 السوق الكبير طازج 10 مجمد 12 21 سوق هرج طازج 12 مجمد 12 111 المجموع http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الحسيني وآخران 2112، 11 – 1(: 2)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 2 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ اعداد األسماك المجموعة من اسواق مدينة البصرة .2جدولال وأن هذه النسبة تُعد قليلة % 2.0لوحظ من نتائج هذه الدراسة أن نسبة عزل ضمات الكوليرا بلغ ي غير مواسم الوباء لبكتيريا ضمات الكوليرا وقد يعزى الســبب في ذلك إلى احــتمال كون هذه البكتيريا ف Chavez)و )2115تتماشى مع نتائج )عباس، واجد بنسب بسيطة جداً في المياه وهذه النتيجةلذا فانها تت et al., 2006) و .(Yildiz and Schoolnik, 1999) الفحوصات المجهرية -1 TCBS 1921) Lythgoe and(لووحظ ظهوور المسوتعمرات البكتيريوة بلوون اصوفر علوى وسوط Lythgoe وتمتلوك سووطاً كما ظهرت تلك المستعمرات تحت المجهر عصوية الشكل او موا يشوبه الضومة في احد أقطابها مما يعطيها صفة القدرة على الحركة. الفحوصات الكيموحيوية -2 ، وأنهووا KIAبينووت االختبووارات الكيموحيويووة ان هووذه البكتريووا أنتجووت قاعوودة / حووامض فووي اختبووار موجبووة إلختبووار األوكسوويديز وسووالبة إلختبووار األنوودول وإختبووار فوووكس بروسووكاور واليوووريز، ومتحركووة .,.Collee et al) 1990ومحللة للدم من نوع بيتا عند زرعها على آكار الدم ) هيئة االسماك اعداد االسماك مصدر االسماك نوع االسماك الصبور 12 سوق البصرة الكبير طازج 0 مجمد 0 10 العشار طازج 0 مجمد 0 21 التنومة طازج 11 مجمد 11 9 خمسة ميل طازج 1 مجمد 5 الكارب الفضي 11 سوق البصرة الكبير طازج 1 مجمد 1 12 العشار طازج 2 مجمد 0 0 التنومة طازج 5 مجمد 5 12 خمسة ميل طازج 9 مجمد 0 الشانك 9 سوق البصرة الكبير طازج 1 مجمد 5 12 العشار طازج 9 مجمد 0 19 التنومة طازج 11 مجمد 9 11 خمسة ميل طازج 1 مجمد 1 البني 15 سوق البصرة الكبير طازج 2 مجمد 2 0 العشار طازج 5 مجمد 5 19 التنومة طازج 11 مجمد 9 9 خمسة ميل طازج 1 مجمد 5 211 المجموع http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الحسيني وآخران 2112، 11 – 1(: 2)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 0 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ كيدي:ؤالت API20Eفحص -3 22تي: لتأكيود تشوخيص بكتيريوا الضومات وكواآل API20Eتم اختبار هذا التشخيص باستعمال عودة يمثل االختبارات البايوكيميائية. 2جدول ال، و.fluvialis Vكانت بكتيريا 2و V. choleraكانت بكتيريا API 20Eالفحوصات البايوكيميائية باستعمال عدة .3جدول ال Results Reaction Enzymes Test + Arginine dihydrolase ADH + G Beta - glactosides ONP - Lysine decaboxylase LDC - utilization Citrate CIT - Ornithin decaboxylase ODC - production H2S H2S - Urease URE - Tryptophane Deaminase TDA - Indole production IND - Acetone production NP + Glatinase GEL + Glucose- fermentation GLN - Inositol fermentation INO + Sorbitol fermentation SOR - Rhamnose fermentation RHA + Sucrose fermentation SAC + Melibinose fermentation MEL + Amydgalin fermentation AMY + Arabinose fermentation ARA توزيع وأعداد األسماك المصابة في محافظة الناصرية .4جدول ال هيئة األسماك إعداد األسماك مصدر األسماك نوع األسماك عدد األسماك المصابة نوع اإلصابة الكارب السوق الكبير 21 V.cholerae 2 طازج 11 - 1 مجمد 11 سوق هرج 11 V.cholerae 1 طازج 0 V.cholerae 1 مجمد 2 الشانك السوق الكبير 21 V.cholerae 1 طازج 12 - 1 مجمد 12 سوق هرج 21 V.cholerae 1 طازج 11 - 1 مجمد 11 البني السوق الكبير 21 - 1 طازج 10 - 1 مجمد 12 سوق هرج 21 V.cholerae 1 طازج 12 - 1 مجمد 12 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الحسيني وآخران 2112، 11 – 1(: 2)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 9 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ توزيع وأعداد األسماك المصابة في محافظة البصرة .5جدول ال هيئة األسماك إعداد األسماك مصدر األسماك نوع األسماك عدد األسماك المصابة نوع اإلصابة الصبور سوق البصرة الكبير 12 V.cholerae 2 طازج 0 V.cholerae 2 مجمد 0 10 سوق العشار - 1 طازج 0 - 1 مجمد 0 21 التنومه سوق V.cholerae 2 طازج 11 - 1 مجمد 11 9 سوق خمسة ميل V.cholerae 1 طازج 1 V.cholerae 1 مجمد 5 الكارب سوق البصرة الكبير - 1 طازج 1 11 - 1 مجمد 1 V.cholerae 1 طازج 2 12 سوق العشار V.cholerae 1 مجمد 0 V.fluvialis 1 طازج 5 0 سوق التنومه - 1 مجمد 5 V.cholerae 2 طازج 9 12 سوق خمسة ميل - 1 مجمد 0 الشانك سوق البصرة الكبير V.cholerae 1 طازج 1 9 - 1 مجمد 5 V.cholerae 2 طازج 9 12 سوق العشار - 1 مجمد 0 V.fluvialis 1 طازج 11 19 سوق التنومه - 1 مجمد 9 - 1 طازج 1 11 خمسة ميلسوق - 1 مجمد 1 البني سوق البصرة الكبير - 1 طازج 2 15 V.fluvialis 1 مجمد 2 - 1 طازج 5 10 سوق العشار - 1 مجمد 5 سوق التنومه V.cholerae 1 طازج 11 19 - 1 مجمد 9 V.cholerae 1 طازج 1 9 سوق خمسة ميل - 1 مجمد 5 قابلية البكتيريا على تحمل الحموضة -4 إلختبار قابلية بكتيريا الضمات المعزولة في هذه الدراسة لتحمل حامضية البيئة أو الرقم الهيدروجيني، يتضح جلياً أن كال النوعين بغض النظر عن مصادر العزل لم يستطع مقاومة رقم استطاعت النمو بصورة جيدة V. fluvialis فيما عدا عزلة واحدة من عزالت 4.5هيدروجيني أقل من كخط شروع لتقدير 4.5، ويُعد الرقم الهيدروجيني %21وقاومت الحموضة بنسبة 5عند رقم هيدروجيني .V و V.choleraeقابلية تحمل بكتيريا الضمات للحموضة، إذ كانت نسبة تحمل الحموضة لبكتيريا fluvialis01% عند %111نسبة تحملها للحموضة كانت على التوالي، في حين أن %11وpH مقداره .1شكل ال ( وكما مبين في2.1،0.1، 2.1، 0.1، 0.1، 1.1، 1.1) http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الحسيني وآخران 2112، 11 – 1(: 2)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 11 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ في تحمل الحموضة V. fluvialis و V. choleraقابلية الضمات .1شكل ال لورقم اإستنتج من الدراسوة الحاليوة إن بكتيريوا الضومات تمتلوك مودى واسوع مون التحمول للتغيورات فوي . كوذلك (Islam et al., 1994; Elliot et al., 2001)الهيدروجيني وهذا موا اتفوق موع دراسوات أخورى Brooks et al).) 8.5-9.5 ـدودعند رقم هيدروجيني عالي جداً بح دراسة أخرى تؤكـد نمـو الضمات كركوك، وجد الباحث من نهر ديالى في محافظة V. fluvialisكذلك في دراسة لعزالت بكتيريا 2007 ,. ( أن الضومات 2112(. في حوين ذكورت الفرطوسوي )2115)عباس، 11-1تراوح بين pH انها نمت عند ، كوذلك فوي دراسوات أخورى أثبتوت أن لضومات الكووليرا القودرة علوى pH 4.5 =نمت بصووره جيوده عنود ( موجووووودة علووووى gshB، Pnpجينووووات لتحموووول الحموضووووة ) االمتالكهوووو 5مقاومووووة الوووورقم الهيوووودروجيني .(Al-Ani et al., 2000; Merrell and Camilli, 2002)الكروموسوم الكبير . تحمل البكتيريا لتركيز مختلفة من كلوريد الصوديوم 5 %0بينووت موون الدراسووة الحاليووة قابليووة بكتيريووا ضوومات الكوووليرا علووى مقاومووة الملوحووة ضوومن تركيووز fluvialis .. أمووا بكتيريووا %9و %0و فووي درجووة ملوحووة ، اال أن كافووة العووزالت لووم تسووتطع النموو%2و V قابليتها علوى مقاوموة الملوحوة فوي كول التراكيوز الموذكورة، فضوالً عون وجوود عزلوة 2شكل الفلوحظ من نووي ذها موون سوومك البموون كلوريوود الصووديوم وهووذه العزلووة تووم اخو %9واحودة اسووتطاعت النمووو علوى تركيووز ى العوويش لهووا قوودرة علوو .Vibrio sppوقوود اظهوورت الدراسووات أنالمجموود موون سوووق البصوورة الكبيوور. tcpR والسـوـبب يوـرجع فوي توـحملها للوـملوحة هوو احــوـتوائها علوى جيوـنات %0والتــــوـواجد فوي تركيوز Holt et al., 1994) Janda et al., 1988; (Collier et al., 1998; Mashra etتحمل الملوحة ل al.,2003; كافة العزالت بغض النظر عن مصودر العوزل تمكنوت مون النموو علوى نسوبة . وبشكل عام فأن . وهذا موا تطوابق موع دراسوة % 9و 8و 7وتباينت نسب نموها على درجات الملوحة األخرى %6ملوحة كوذلك وجود %11و 0و 2و 1(، إذ وجد أنواع الضمات تنمو وتتحمل تراكيز ملحيوة هوي 2115الصنهير ) ، وقد عوزى السوبب الوى قابليوة هوذه %12و 11تستطيع النمو عند تركيز V. fluvialisان بعـض عزالت االنوعا من البكتيريا للتأقلم، إذ انه عزلها من اسماك نهرية تعيش في مياه عذبة. كذلك فان دراسات أخورى Finegold and Martin, 1982; Lennette et) %11على تحمل تركيز V. fluvialisذكرت قدرة al., 1985). 0 50 100 0 60 100 100 100 100 100 100 100 20 50 100 100 100 100 100 100 100 V. cholerae V. fluvialis http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الحسيني وآخران 2112، 11 – 1(: 2)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 11 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ في تحمل الملوحة V. fluvialis و V. choleraقابلية الضمات .2شكل ال . تأثير درجات الحرارة على نمو البكتيريا6 م وكووذلك 37م و 25اسووتطاعت كافووة عووزالت البكتيريووا موون مختلووف المصووادر النمووو بدرجووة حوورارة أن عووزالت بكتيريووا 0وقووت أجووراء التجربووة. كمووا بووين جوودول °م 15بدرجووة حوورارة الغرفووة والتووي كانووت م ولم تستطع أي من هذه العزالت النمو في 5الضمات استطاعت النمو بكثافة قليلة جداً على درجة حرارة وفووي ،م. أجريووت هووذه التجربووة بإسووتعمال وسووط زرعووي سووائل )موواء الببتووون القاعوودي( -20درجووة حوورارة محاولة للتعرف على مدى تأثير درجات الحرارة الواطئة علوى حيويوة وبقواء بكتيريوا الضومات فقود توم نقول م إلووى الوسووط الزرعووي -20و م 5جووزء موون وسووط النمووو المووزروع بالبكتيريووا والمحضوونة بدرجووة حوورارة الزرعيوة م. من ناحية أخرى تم تحويل األوسواط 37وُحضنت بدرجة حرارة TCBSالتخصصي الصلب سوواعة. 24 م ولموودة 37م إلووى درجووة -20م و 5السووائلة الملقحووة ببكتيريووا الضوومات والمحضوونة بدرجووة م بعود التحويول. كموا 37ولوحظ من النتائج المبينة فوي الجودول أن كافوة العوزالت اسوتطاعت النموو بدرجوة م 37ها بدرجوة حورارة عنود حضون TCBSم من النمو على وسوط 5استطاعت كافة العزالت المنقولة من م. -20بعد نقلها من درجة حرارة TCBSفي حين لم تستطع العزالت األخرى النمو على وسط تأثير درجات الحرارة المختلفة على نمو الضمات .6جدول ال نوع العزلة ت درجات الحرارة )م( 37الحضن على °م زرع على TCBS 37 25 15 5 20- 5 20- 5 20- 1- V. cholerae + + + _ _ + + + _ 2- V. fluvialis + + + _ _ + + + _ المصادر معووارف الحديثووة. االسووكندرية، . التسوومم البكتيووري والفطريووة، مكتبووة ال2111البنووا، عموورو عبوود الوورحمن. ص.110جمهورية مصر العربية. الفيبريووو فووي بعووض األسووماك . موودى إنتشووار وأمراضووية أنووواع موون 2115 الصوونيهر، أنووور عيسووى محموود. جامعوووة الملوووك –. كليوووة العلووووم لعربيوووة السوووعودية، اطروحوووة دكتووووراهالمسوووتزرعة فوووي المملكوووة ا ص. 103سعود. 0 50 100 6 7 8 9 Nacl تركيز 100 60 0 0 100 100 40 20 V. cholerae V. fluvialis http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الحسيني وآخران 2112، 11 – 1(: 2)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 12 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ تحديووود المحتووووى الجينوووي ودراسوووة توووأثير بعوووض العوامووول الكيميائيوووة .2112الفرطوسوووي، هنووواء فرحوووان. محليواً. رسوالة ماجسوتير. كليوة المعزولوة Vibrio cholerae والفيزياويوة علوى ضومات الكووليرا ص.151الجامعة المستنصرية. -العلوم سوى محوي سوعيد، عثموان، محمود فتحوي برانية، احمود عبود الوهواب، الجمول عبود الورحمن عبود اللطيوف، عي . االسس العلمية والعملية لتفريخ ورعاية االسوماك والقشوريات 1992صادق شريف شمس الدين. و ص. 05 .الثاني. الدار العربية للنشر والتوزيع، القاهرة الجزء –في الوطن العربي مون ميواه نهور ديوالى Vibrio fluvialis . عوزل وتشوخيص بكتريوا 2115عبواس، نجودت بهجوت مهودي. ( العوودد12المجلوود ) ودراسووة تووأثير بعووض العواموول البيئيووة عليهووا. مجلووة تكريووت للعلوووم الصوورفة. (1:)223-225 . Al-Ani, Z. N.; N. H. Amer and S. Samera. 2000. Acid tolerance of Vibrio cholerae. J. Technical. 9: 18. Berge`s, L.; H. Rodriguez-Villalobos; A. Deplano and M. Struelens. 2007. Prospective evaluation of imipenem / EDTA combined disc and E-test for detection of metallo-β-lactamase producing Pseudomonas aeruginosa. J. Antimicrobial Chemother. 50: 812-813. Betty, A. ; F. Daniel and S. Alice. 2007. Diagnostic Microbiology. (12th ed). China. 24: 1031p. Brooks, F. ; S. Janet; C. Karen and A. Stephen. 2007. A Lange medical book of Medical Microbiology. 24th. The McGraw- Hill Companies, Inc. America: 263-269. Chavez, D. C.; V. P. Sedas; E. O. Borunda, F. L. and F. L. Reynosa. 2006. Influence of water temperature and salinity on seasonal occurrence of Vibrio cholerae and enteric bacteria in oyster- producing area of Veracruz Mexico Mar. Pollut. Bull. 3: 334-342. Collee, J. G.; A. G. Fraser; B. P. Mermion and A. Simmons. 1996. Mackie and MacCatney. Practical Medical Microbiology. P.425. (14th ed.) Churchill Linvingstone Philadelphia. Colleir, L. ; A. Balows and M. Sussman, 1998. Topley and Wilson`s Microbiology and Microbial Infections, (9th ed.) 2. Systematic Bacteriology. Arnold, Great Britain. Dulcic, J., N. Skakelja; M. Kraljevic and P. Cetinic. 1998. On the fecundity of the Black Sea bream, Spondyliosoma cantharus (L.), from the Adriatic Sea (Croatian coast). Scientia Marina., 62(3): 289-294. Elliot, E. l; C. A. Kaysnar and N. L. Tamplin. 2001.Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus and other Vibrio spp. Bacteriological Analytical Manual online. chapter-9 Center for Food Safety and Applied Nutrition. http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الحسيني وآخران 2112، 11 – 1(: 2)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 12 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ Finegold, S. M. and W. J. Martin. 1982. Diagnostic Microbiology. (6th ed.) Mosby Company. Furniss, A. L.; J. V. Lee and T. J. Donovan. 1977. Group F, a new Vibrio? Lancet. 10: 565-566. Hameed, A. S. S. 1993. A study of the aerobic heterotrophic bacterial flora of hatchery reared eggs, larvae and post-larvae of Penaeus indicus. Aquaculture 117: 195-204. Holt, J. G.; N. R. Krieg, P. H. Sneath and H. Bergy. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, (9th ed). Lippincott, Williams and Wilkins. East Lansing. Mich. Islam, M . S. ; Hasan, M. K.; Miah, M. A.; M. Yunis ; K. Zaman and M. J. Albert. 1994. Isolalation of Vibrio cholerae O139 synonyin from aquatic environment in Bangladish: Application for disease transmission. Appl. Invir. Micro. 60: 1684-1686. Janda, J. M; C. Powers; R. G. Bryant and S. L. Abbot. 1988. Current prespectives on the epidemiology and pathogensis of clinically significant Vibrio spp. Clin. Micro .Rev., 1(3): 245- 267. Johnston, M. D. and M. H. Brown. 2002. An investigation into the changed physiological state of Vibrio cholerae bacteria as a survival mechanism in response to cold temperature and studies on their sensitivity to heating and freezing. Appl. Micro. 92(6): 1066-1077. Koneman, E. W.; S. D. Allen, W. M. Jawa and P. C. Sachreckeber. 1992. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. (4th ed.) J. B. Lippincott company. Philadelphia. Lennette, E. H. ; A. Balows; W. J. Hausler and H. J. Shadomy. 1985. Manual of Clinical Microbiology, (4th ed.). American Society for Microbiology Washington, D. C. Lythgoe, J. and G. Lythgoe. 1971. Fishes of the sea: The coasted water of the British Isles, Northern Europe and the Mediterranean, A photographic guide in colour. Blandford Press, London, England. Merrell, D. S. and A. Camilli. 2002. Acid tolerance of gastrointestinal pathogens. Current Opinion in Microbiology.5: 51-55. Mishra, A.; R. Srivastava; C. Pruzzo and B. Srivastaval. 2003. Mutation in tcpR gene (VC 0832) of Vibrio cholerae O1 causes loss of tolerance to hight Osmolarity and affects colonization and virulence in infant mice. J. Med. Microbiol., 52: 933-939. http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الحسيني وآخران 2112، 11 – 1(: 2)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 15 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ Sleigh, J. D. and M. G. Timbury. 1994. pH- Regulated Gene and Survival at External pH-Cellular and Molecular BologyI (2nd ed.). P.1539 -1546. ASM. Press, Washington. Iu, L.; A. S. Maramovich and A. L. Gintsburg, 2001. Strategies of adaptive changes in Vibrio cholera in natural water reservoirs. Vestn. Ross. Akad. Med. Nauk. 11: 20-25. Wai, S. N.; Y. Mizunoe; A. Takade; S. Kawabata and S. lchiy. 1998. Vibrio cholera O1 strain TSI- 4- produces the exopolysaccharide Materials that Detect Morphology, Stress Resistance and Biofilm Formation. Appl. Envi. Micro.,64(10): 3648-3655. Yildiz, F. H. and G. K. Schoolink. 1999. Vibrio cholera O1 Eltor: Identification of gene cluster required for the rugose colony type exopolysaccharid production, chlorine resistance Biofilm formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96(7): 4028-4033. EFFECT OF SOME ENVIRONMENTAL CONDITION VIBRIO CHOLERAE AND VIBRIO FLUVIALIS BACTERIA ISOLATING FROM FISH PROFFERED IN LOCAL MARKETS OF BASRAH AND NASIRIYAH CITY Al- Hussainy Khadeeja S. 1 Asst. Prof. Al-Tememy Manal S. 2 AL-gboory Athra O. 3 1 Department of Food Science, Collage of Agriculture, University of Basrah, Basrah,Iraq yahoo .com @ Khadeeja_jaffer 2. Department of Life Sciences, Collage of Sciences, University of Dhi Qar, Dhi Qar, Iraq 3 Department of Life Science , Collage of Sciences, University of Dhi Qar, Dhi Qar, Iraq ABSTRACT There was isolating and identifying Vibrios bacteria that taken from fresh and frozen fish, such as Suoboor Tenualosa ilisha, Silver carp Hypophthalmichthys molitrix, Beni Barbus sharpey and Shanak Acanthopagrus arabicus, we collected 210 fish from Basrah markets (Big market in Basrah, Al- Ashar, Al- Tanoma and Khmsameel) while we collected 150 fish from Silver carp, Beni and Shanak from Nasiriyah market (Big market and Harj market) this collecting process of samples taken a period from 2-June to 30-November\2013. Fish bring to laboratory and the samples taken from it and planted directly on agricultural medians. (nutrient agar, blood agar, MacConkey agar and selective media (Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose Agar TCBS)) then the dishes were incubated aerobically at temperature 37Cº for 18 – 24 hours. After the period of incubation, we identify 30 positive samples from Vibrios and this genus relianced to the shap of cultures and cell under microscope and by Catalase test http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الحسيني وآخران 2112، 11 – 1(: 2)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 11 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ ,Oxidase test and motion test afer that identifying the types relianced to biochemical tests and using certain API20E system, that indenting two kinds from Vibrios bacteria Vibrio cholera and Vibrio fluvialis. we confirmed that fresh fish including these bacteria more than frozen fish.Vibrio cholera and Vibrio fluvialis bacteria to be distinguished by percentage of durability of acidittoy reach to 100% at pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 and 8.0, while we observed that the percentage of durability of acidity for Vibrio cholera bacteria reach to 60% at pH 4.5, but the Vibrio fluvialis bacteria was more resistant to acidity on 20% and 50% at pH 4.0 and 4.5 respectively. The study showed the ability of Vibrio cholera bacteria to resistant for salinity was reach to percentages 60% and 100% at concentrations 6% and 7% respectively, but it didn't grow on concentrations 8% and 9%. For the Vibrio fluvialis bacteria was resistant salinity in all concentrations but with different percentage reach to 100% at concentrations 6%, 7% and 40% at concentration 8%, but at concentration 9% there is only one sample had resistant on 20% which it as frozn sample. All isolation from different sources could growth in 25 and 37 Cº and in room temperature 15 Cº through worken in this experiment, but some isolation of Vibrios bacteria could growth with little density in 5 Cº, while it couldn't growth in -20 Cº. key words: isolating V.cholerae and V. fluvialis, Vibrios bacteria, Vibrio spp., fresh and frozen fish and identifying. *Part of Msc. thesis for the third researcher. http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/