4: 1 تأثير التسميد البوتاسي والرش بالبورون في نمو صنفين من نباتات القرنفل وازهارهما: اٌغذسج ٚاخشْٚ 2016، 39 - 26 ( : 1) 8ِعٍح د٠اٌٝ ٌٍعٍَٛ اٌضساع١ح ، 26 Pseudomonas fluorescens ISHعسل ٔرُمٍخ ٔرٕطٍف اَسٌى انجرٔرٍٍس انًُزج يٍ انجكزرٌب دٔرِ فً رذْٕر َٕعٍخ انججٍ انطري انعرالًدراسخ ٔ ٔدراسخ P. fluorescens اسزخالص ٔرُمٍخ ٔرٕطٍف اَسٌى انجرٔرٍٍس انًُزج يٍ انجكزرٌب -2 .رأثٍرِ فً ثرٔرٍُبد انحهٍت غبزي يُعى عسٌس *** عبير يحًذ عهً طبنح ** ح *زٌبد طبرق انسذر ziadsedrah@gmail.com - ظاِعح د٠اٌٝ –و١ٍح اٌضساعح -ِذسط* Salih1943@yahoo.com - ظاِعح تغذاد –و١ٍح اٌضساعح -اعرار ** Ghazi_m56@yahoo.com -ظاِعح تغذاد –و١ٍح اٌعٍَٛ -ار اعر*** انًسزخهض تاٌرشعي١ة تىثش٠ريياخ Pseudomonas fluorescens ISHٔميٟ انٔيض٠ُ إٌّيرط ِيٓ اٌثىرش٠يا -DEAEاٌّثييادي % ، ٚوشِٚاذٛغشاف١ييا اٌرثييادي األ٠ييٟٛٔ تلعييرعّاي 80 – 30األ١ِٔٛييَٛ تٕغييثح ع ييثا Sepharose ٚاٌرش ١ح اٌٙالِيٟ عٍيٝ عّيٛدSephacryl S-200 ٚأِىيٓ اٌصويٛي عٍيٝ عيذد ِيشاخ ، و١ٍيٛ داٌريْٛ ، 47.2% . ٚتٍغ اٌيٛصْ اٌعض٠ييٟ ٌالٔيض٠ُ 32.8ِشج ٚحو١ٍح عٔض١ّ٠ح ِمذاس٘ا 18.5ذٕم١ح ٚوأد دسظيح اٌصيشاسج اٌّصٍيٝ عٍٝ اٌرشذ١ة ، 7.5ٚ 8.0ٚتٍغ اٌشلُ ا١ٌٙذسٚظ١ٕٟ األِصً ٌٍفعا١ٌح ٚاٌصثاخ 40 -30دلائك تذسظاخ حشاسج ذشاٚحد ت١ٓ 10َ ، ٚعحرفع انٔض٠ُ تىاًِ فعا١ٌرٗ عٕذ حضٕٗ 40ٌٍفعا١ٌح فمذ ( ، عر Metalloproteasesَ . ذث١ٓ اْ اٌثشٚذ١١ض ل١ذ اٌذساعح ٘ٛ ِٓ ِعّٛعح اٌثشٚذ١١ضاخ اٌّعذ١ٔح ) وّا ذث١ٓ احرٛاء انٔض٠ُ عٍيٝ ٔغيثح عا١ٌيح ِيٓ . EDTAج اٌىالت١ح انٔض٠ُ فعا١ٌرٗ ذّاِاً عٕذ ععرعّاي اٌّاد اٌصٛاِض األ١ٕ١ِح اٌىاس٘ح ٌٍّياء ٚاٌثيش١ٌٚٓ ٚاٌغغيري١ٓ ، ٚذثي١ٓ اْ امٔيض٠ُ ٠ّرٍيه اٌفيح عا١ٌيح ٌٍث١راوياص٠ٓ ِماسٔح ِع واص٠ٕاخ اٌص١ٍة امخشٜ. ض٠ُ اٌثشٚذ١١ض ، اٌعثٓ اٌطشٞ.، أ P.fluorescens ،Psychrotrophic bacteriaانكهًبد انًفزبحٍخ : انًمذيخ % ِٓ األح١اء اٌّعٙش٠ح فيٟ اٌص١ٍية اٌطياصض 10ٔغثح م ذض٠ذ عٓ Pseudomonasظٕظ ّص٠ً إٌٛ اٌشئ١ظ اٌّغثة ٌٍّشاوً فٟ ِعاي صٕاعح األٌثاْ ٌىٛٔٙا P. fluorescens. ٚذعذ اٌّصٍٛب حذ٠صاً ٌزٞ ٠صًٍ اٌىاص٠ٕاخ ِغثثاً اٌّشاسج ٚحوٛي إٌغيعح اٌٍضظيح ذٕرط عٔض٠ُ اٌثشٚذ١١ض اٌّماَٚ ٌٍصشاسج اٌعا١ٌح ا ( .Vyletelova ٚHanus ،2000% )80-55فٟ األظثاْ اٌطش٠ح راخ اٌّصرٜٛ اٌشطٛتٟ ، اٌٙاضيّحاٌرٟ ذصفيض اٌرصٍيً اٌّيائٟ ٌٍثشٚذ١ٕياخ( ِٓ انٔض٠ّاخ Proteasesذعذ اٌثشٚذ١١ضاخ ) وٛٔٙيا ذييدٞ أ١ّ٘يح خاصيح ٘يٟ ذّرٍيه ٚٚحيٛاِض ا١ٕ١ِيح ، ار ذعًّ عٍٝ ذىغ١ش اٌثشٚذ١ٕاخ عٌيٝ تثر١يذاخ إٌثاذياخ ٚاٌص١ٛأياخ اٌّخرٍفيح وفيٟ اٌىائٕياخ اٌص١يح ، ٚذٛظيذ ِّٙيحادٚاساً فغ١ٌٛٛظ١ح ٚذطث١ماخ صيٕاع١ح ( . Bayoumi ٚBahobil ،2011) ٚاألح١اء اٌّعٙش٠ح ٌٍص١ٍيية اٌخيياَ اٌّعييذ اٌٍّٛشييح P. fluorescensٌييُ ذييذسط اٌثشٚذ١١ييضاخ إٌّرعييح ِييٓ اٌثىرش٠ييا فٟ اٌعشاق توٛسج ِفوٍح ، ِٓ ح١س ظشٚف عٔراظٙا ٚطشائيك ذٕم١رٙيا ٚذٛصي١فٙا اٌطشٞ ٌوٕاعح اٌعثٓ ٚطث١عييح ذشو١ثٙييا ٚدساعييح ذهش١شاذٙييا فييٟ تشٚذ١ٕيياخ اٌص١ٍيية ، ٌييزا أظش٠ييد ٘ييزٖ اٌذساعييح فييٟ ِصاٌٚييح ٌث١يياْ Pseudomonasٌعضٌييح اٌّص١ٍييح ذٕم١ييح ٚذٛصيي١ز أييض٠ُ اٌثشٚذ١١ييض إٌّييرط ِييٓ ااٌعٛأيية أعييالٖ تغ١ييح fluorescens . ٟٚدساعح ذشو١ثٗ ٚذصذ٠ذ دٚس ٘زا انٔض٠ُ فٟ ذذ٘ٛس ٔٛع١ح اٌعثٓ اٌطشٞ اٌعشال ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ . 2014/ 7 / 16اٌثصس ذغٍُذاس٠خ . 2014/ 12/ 24ذاس٠خ لثٛي إٌشش .اطشٚحح دورٛساٖ ٌٍثاحس امٚيِٓ ظضء اٌثصس http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ mailto:ziadsedrah@gmail.com mailto:Salih1943@yahoo.com mailto:Ghazi_m56@yahoo.com http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ اٌغذسج ٚاخشْٚ 2016، 39 - 26 ( : 1) 8ِعٍح د٠اٌٝ ٌٍعٍَٛ اٌضساع١ح ، 27 طرائك انجحثانًٕاد ٔ إسزخالص إَسٌى انجرٔرٍٍس : تلعيرعّاي Pseudomonas fluorescens ISHأٔرط عٔض٠ُ اٌثشٚذ١١ض ِٓ اٌعضٌح اٌّص١ٍح ٌٍثىرش٠يا 10% ح١ٍة فشص ٚاٌٍّمح تيـ 1اٌّذعُ تـ Minimal salts mediumاٌٛعظ اٌرشو١ثٟ 7 عيذ ٚ خ َ /ِيً ت َ . ٚذُ اٌرخٍص ِٓ 15دٚسج / دل١مح ٚدسظح حشاسج 125عاعح فٟ حاضٕح ٘ضاصج تغشعح 96ِذج حضٓ َ.4دل١مح تذسظح حشاسج 15ٌّذج xg 10000اٌخال٠ا اٌثىر١ش٠ح تاٌطشد اٌّشوضٞ تغشعح تغ١يح سويض اٌّغيرخٍص انٔض٠ّيٟ اٌخياَ تلعيرعّاي وثش٠رياخ األ١ِٔٛيَٛ اٌويٍثح ، ٚرُمٍخ إَسٌى انجرٔرٍٍزس : % ، ٚذيُ اٌرصيشٞ عيٓ 90 – 20اعرّاد ٔغثح ا ثا ِصٍٝ ٌٍرشع١ة فمذ أخرثشخ ٔغة ا ثا ِرذسظح ت١ٓ ظييشخ تعييذ٘ا خطييٛج ذٕم١ييح تلعييرعّاي وشِٚٛذٛغشاف١ييا اٌرثييادي اٌفعا١ٌييح انٔض١ّ٠ييح فييٟ اٌشاعيية اٌثشٚذ١ٕييٟ . اٌّش ييح تٛعيياطح ٚوييزٌه تاعييرعّاي اٌرش يي١ح اٌٙالِييٟ DEAE-Sepharoseام٠ييٟٛٔ تٛعيياطح اٌّثييادي ىٙشتيائٟ تٙيالَ ِرعيذد األوش٠يً اٌ اٌرشح١يًتطش٠ميح ٔمياٚج انٔيض٠ُ ، ٚع١ٕيد Sephacryl S-200اٌٙالِيٟ ، شيُ ظيشٜ ذع١ي١ٓ (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)اِا٠يذتٛظٛد اٌعٛاِيً اٌّاعيخح . ، Laemmli(1970)اٌّٛصييٛفح ِييٓطش٠مييح ٚفميياً ٌٍ ٌإلٔييض٠ُ تطش٠مييح اٌرش يي١ح اٌٙالِييٟاٌييٛصْ اٌعض٠يييٟ ٛاٌصثيياخ دسظييح اٌصييشاسج اٌّصٍييٝ ٌفعا١ٌييح انٔض٠ّٚشثاذييٗ ٚ اٌييشلُ ا١ٌٙييذسٚظ١ٕٟ األِصييً ٌفعا١ٌييح انٔييض٠ُٚعيي١ٓ ٚفمييييا ٌّييييا ٚسد فييييٟ اٌىٛا ييييز فييييٟ فعا١ٌييييح انٔييييض٠ُٚذييييهش١ش األ٠ٛٔيييياخ اٌفٍض٠ييييح اٌصييييشاسٞ ٌإلٔييييض٠ُ ٚ Bisswanger2008) األ١ٕ١ِيح تاذثيا اٌطش٠ميح اٌريٟ ( ، وزٌه ظشٜ ذصذ٠ذ ذشو١ة انٔض٠ُ ِٓ اٌصٛاِض ( ٚدساعييح ذييهش١ش امٔييض٠ُ فييٟ تشٚذ١ٕيياخ اٌص١ٍيية تاعييرعّاي 1999) Devaraj ٚManjunathaٚصييفٙا Mitchell ٚMarshall (1989. )اٌطش٠مح اٌّٛصٛفح ِٓ انُزبئج ٔانًُبلشخ تعييذٖ ذشو١ييض ٚحييذج/ٍِغُ تييشٚذ١ٓ ، ظييشٜ 233.4تٍغييد اٌفعا١ٌييح إٌٛع١ييح ٌإلٔييض٠ُ فييٟ سا ييح اٌّضسعييح اٌّغرخٍص انٔض٠ّٟ اٌخاَ تلعرعّاي وثش٠راخ األ١َِٔٛٛ اٌوٍثح ، ٚتعذ اٌرصشٞ عٓ اٌفعا١ٌح انٔض١ّ٠ح فيٟ % نظيشاء ع١ٍّيح اٌرشعي١ة ٌٍّغيرخٍص اٌخياَ نٔيض٠ُ 80 – 30اٌشاعة اٌثشٚذ١ٕٟ ع١ٕيد ٔغية ان يثا 911.6٘زٖ فعا١ٌح ٔٛع١ح ِمذاس٘ا ح خطٛج اٌرٕم١أعطد . ٚلذ P.fluorescens ISHاٌثشٚذ١١ض إٌّرط ِٓ ( . 1) اٌعذٚي % 78.1ِشج ٚحو١ٍح عٔض١ّ٠ح تٍغد 3.9ٚحذج/ٍِغُ تشٚذ١ٕثعذد ِشاخ ذٕم١ح انعسنخ انًحهٍخ نجكزرٌب إَسٌى انجرٔرٍٍس انًُزج يٍخطٕاد رُمٍخ . 1جذٔل ان Pseudomonas fluorescens ISH . خطٕح انزُمٍخ انحجى )يم( انفعبنٍخ ًٌٍخاإلَس )ٔحذح/يم( رركٍس انجرٔرٍٍ )يهغى/يم( انفعبنٍخ انُٕعٍخ )ٔحذح/يهغى ثرٔرٍٍ( انفعبنٍخ انكهٍخ )ٔحذح( عذد يراد انزُمٍخ انحظٍهخ اإلَسًٌٍخ % انًسزخهض اإلَسًًٌ انخبو 100 63.50 0.272 233.4 6350 1.0 100.0 انزرسٍت ثإسزعًبل كجرٌزبد األيٍَٕٕو 30 – 80 % 10 495.90 0.544 911.6 4959 3.9 78.1 انزجبدل األًٌَٕ DEAE- Sepharose 25 92.7 0.040 2317.5 2317 9.9 36.5 انزرشٍح انٓاليً Sephacryl S-200 15 138.80 0.032 4337.5 2082 18.6 32.8 اٌغذسج ٚاخشْٚ 2016، 39 - 26 ( : 1) 8ِعٍح د٠اٌٝ ٌٍعٍَٛ اٌضساع١ح ، 28 عادٌيح اٌشيصٕاخ اٌّٛظيٛدج عٍيٝ تّوثش٠رياخ األ١ِٔٛيَٛ حذز اٌرشع١ة فٟ ٘زٖ اٌخطٛج ٔر١عح ٌم١اَ طثمح اٌّاء اٌّص١طح تيٗ ِّيا ٠ييدٞ عٌيٝ ذم١ٍيً رائث١ريٗ ( تDisruptionانخالي )فضالً عٓ ٔض٠ُ ، ان عطح (.Whitaker ،1972ِٚٓ شُ ذشع١ثٗ ) ريذاخً ٚرٌه ٌ ىثش٠راخ األ١َِٔٛٛ عٔض٠ّاخ ِٕماج ظضئ١اتِٓ خطٛج اٌرشع١ة حعذ انٔض٠ّاخ إٌاذعذ اظشاء ع١ٍّيح اٌرٕافيز اٌغشيائٟ ذُ عِشاسٖ تعذ فمذ ٔض٠ُ ٌٚغشض ذٕم١ح ان، ّخرٍفح اٌثشٚذ١ٕاخ اٌِذ٠اخ رٚتاْ اٌّيٛاصْ تّصٍيٛي فٛعيفاخ اٌويٛد٠َٛ اٌيذاس DEAE-Sepharoseعٍٝ عّٛد اٌرثادي األ٠ٟٛٔ اٌغياٌة . 7.0ِٛمس تشلُ ١٘ذسٚظ١ٕٟ 0.05ترشو١ض (Wash)فييييٟ وييييً ِييييٓ أظييييضاء اٌغغييييً عييييذج خطييييٛج ٚظييييٛد لّييييُ تشٚذ١ٕ١ييييح ٘ييييزٖ اٌأظٙييييشخ فٟ األظضاء اٌّغرشدج تاٌرذسض اٌٍّصٟ فعا١ٌح عٔض١ّ٠حراْ تشٚذ١ٕ١ راْلّ( ٚاِرٍىد (Elutionعرشدادنٚا ( . 1 ىً) ٍِح وٍٛس٠ذاٌوٛد٠َِٛٛمس ِٓ 1 – 0 Pseudomonasكرٔيبرٕكرافً انزجبدل األًٌَٕ نزُمٍخ إَسٌى انجرٔرٍٍس انًُزج يٍ انجكزرٌب . 1 شكمان fluorescens ISH ثإسزعًبل عًٕد انًجبدل أألًٌَٕ جٍ انطري انعرالً ، انًعسٔنخ يٍ انجDEAE- Sepharose(2.2×20 رًذ انًٕازَخ ثإسزعًبل يحهٕل انفٕسفبد انذارئ ثزركٍس سى ، )يٕالر 0.05 َفسّ ٔانًحزٕي عهى خ، ٔاسزردد األجساء انًررجطخ ثبنًجبدل ثًحهٕل انًٕازَ 7.0ٔرلى ٍْذرٔجًٍُ يم 2.5يم /سبعخ ٔثٕالع 20يٕالر ٔثسرعخ جرٌبٌ 1-0دٌٕو ثٍٍ رراكٍس يزذرجخ يٍ كهٕرٌذ انظٕ نهجسء انٕاحذ ٟ ظيضء في خر١شخ لّح عٔض١ّ٠يح سئ١غيح ٚاحيذجفمذ أعٔض١ّ٠ح ِفوٌٛح ، حلّاوصش ِٓ اٌٝ ٚظٛد ٔظش -92ٚلذ اعرّذخ اٌمّيح اٌّرّصٍيح فيٟ األٔات١ية )، حاٌالحمعرشداد ألظً ذىٍّح خطٛاخ اٌرٕم١ح ٚاٌرٛص١ز نا ٚحيذج/ٍِغُ 2317.5اٌغياٌة ثيادي األ٠يّٟٛٔتٍغد اٌفعا١ٌيح إٌٛع١يح تعيذ خطيٛج اٌرٕم١يح تلعيرعّاي اٌ . (103 % . 36.5اٌصو١ٍح انٔض١ّ٠ح ِشج ٚ 9.9د ِشاخ اٌرٕم١حف١ّا تٍغ عذ تشٚذ١ٓ فيٟ ظيضء اٌغغيً ذعيٛد عٌيٝ ٚخشظيد اٌرٟ ٌيُ ذيشذثظ تاٌّثيادي األ٠يٟٛٔ اٌغياٌة اٌثشٚذ١ٕ١ح أْ اٌمُّ ، اِيا سذثياط تاٌّثيادي األ٠يٟٛٔ اٌّشياتٗ ٌٙيا تاٌشيصٕح نً ِصويٍح يصٕح ِٛظثيح ِٕعرٙيا ِيٓ اذصّ تشٚذ١ٕاخ فأٙيا ذيشذثظ تاٌّثيادي تميٛج ذعرّيذ عٍيٝ اٌرٟ ذصًّ عٍٝ عطصٙا صٕاخ ِخاٌفح ٌشصٕح اٌّثادي اٌثشٚذ١ٕاخ عييرشداد ن افييٟ داساًٚتييزٌه ٠صريياض اٌييٝ ص٠ييادج ذشو١ييض اٌٍّييح اً سذثيياط ييذ٠ذنٚلييذ ٠ىييْٛ اصييافٟ ييصٕرٙا ، فوً ِصً ٘زٖ اٌثشٚذ١ٕاخ.ٌٍّغاعذج عٍٝ اٌرش ي١ح اٌغيىشٚص ( تلعيرعّاي طش٠ميح تعيذ ذشو١يضٖ تّيادجِصٍيٛي انٔيض٠ُ ) اعرىٍّد ع١ٍّح ذٕم١ح عيرشداد تّصٍيٛي فٛعيفاخ اٌويٛد٠َٛنذّيد ِٛاصٔيح اٌعّيٛد ٚا عر، Sephacryl S-200د اٌٙالِيٟ تعّيٛ . ِٛمس وٍٛس٠ذ اٌوٛد٠َٛ 0.2اٌّصرٛٞ عٍٝ 7.0ٚظ١ٕٟ ِٛمس ٚتشلُ ١٘ذس 0.05ترشو١ض اٌذاس اٌغذسج ٚاخشْٚ 2016، 39 - 26 ( : 1) 8ِعٍح د٠اٌٝ ٌٍعٍَٛ اٌضساع١ح ، 29 280عٔفوياي لّري١ٓ ٌٍثيشٚذ١ٓ عٕيذ ِراتعيح انِرواصي١ح عٍيٝ طيٛي ِيٛظٟ 2 الحع ِٓ اٌشيى٠ً ، عر 34- 28ٔأِٛرش ِع ظٙٛس لّح ٚاحذج ٌٍفعا١ٌح ذشوضخ فٟ لّح اٌثشٚذ١ٓ اٌصا١ٔح ِصوٛسج فٟ األظضاء ِييشج 18.6عييذد ِييشاخ ذٕم١ييحٚ ٚحييذج/ٍِغُ تييشٚذ4337.5ٓ١ذاس٘ا اظٙييشخ ٘ييزٖ األظييضاء فعا١ٌييح ٔٛع١ييح ِميي % . ١32.8ح عٔض٠ّحو١ٍح ٚ فعا١ٌيح لّيح ٚتيشٚذ١ٓ ريٟ ْ خطٛج اٌرٕم١ح تلعرعّاي اٌرش ي١ح اٌٙالِيٟ وأيد ِٛفميح فيٟ ععطياء لّع (.Whitaker ،1972أحذ أدٌح ٔماٚج انٔض٠ُ )ٚاحذج ِرطاتمح ِع لّح اٌثشٚذ١ٓ اٌصا١ٔح ، ٚ٘ٛ سى x 1.8 100ثبثعبد Sephacryl S-200كرٔيبرٕكرافً انزرشٍح انٓاليً فً عًٕد . 2 شكمان انًعسٔنخ يٍ انججٍ Pseudomonas fluorescens ISHنزُمٍخ إَسٌى انجرٔرٍٍس انًُزج يٍ انجكزرٌب يٕالر 0.05ثزركٍس انذارئ سزرداد ثًحهٕل فٕسفبد انظٕدٌٕوإلرًذ انًٕازَخ ٔاانطري انعرالً ، يم/سبعخ 12سرعخ جرٌبٌ ث يٕالر كهٕرٌذ انظٕدٌٕو 0.2ٔانًحزٕي عهى 7.0لى ٍْذرٔجًٍُ ٔثر يم نهجسء انٕاحذ. 2ثٕالع انزرحٍم انكٓرثبئًثٕسبطخ فحض َمبٔح اإلَسٌى عر ِٓ اٌضيشٚسٞ ، ح خطٛاخ اٌرٕم١ح ٠وفاأ١ّ٘ح وث١شج فٟ ذصذ٠ذ خطٛج فصص ٔماٚج انٔض٠ُ ذّرٍه ٚليذ ، ض٠ُ ألْ ٚظٛد ِٛاد أخيشٜ غاٌثياً ِيا ٠ييدٞ عٌيٝ ععطياء ٔريائط غ١يش دل١ميح عظشاؤ٘ا لثً ذٛص١ز انٔ ّٕٙا اٌرشح١ً اٌىٙشتائٟ .فٟ فصص ٔماٚج انٔض٠ّ عذج أعا١ٌة ععرعٍّد ، أظييشٞ اٌرشح١ييً اٌىٙشتييائٟ فييٟ ٘ييالَ ِرعييذد األوش٠ييً اِا٠ييذ تٛظييٛد اٌعٛاِييً اٌّاعييخح ٌٍثييشٚذ١ٓ ٚاٌّغيرخٍص انٔض٠ّيٟ ٍّغرخٍص انٔض٠ّٟ اٌخاَ ١ً اٌىٙشتائٟ ٌٔرائط ع١ٍّح اٌرشحأ ( – 3) ٠ث١ٓ اٌشىًٚ رصويً ّعضء اٌب ( ف١ّصً ٔرائط ع١ٍّح اٌرشح١ً اٌىٙشتائٟ ٌٍ – 3تعذ ع١ٍّح اٌرثادي األ٠ٟٛٔ ، اِا اٌشىً ) ، ٚ٘ٛ د١ًٌ عٍٝ ٔماٚج انٔض٠ُ ، ع١ٍٗ تعذ خطٛج اٌرش ١ح اٌٙالِٟ، عر ٠الحع ظٙٛس حضِح تشٚذ١ٕ١ح ِفشدج ح ع١ٍّياخ اٌرٕم١يح اٌٙادفيح ٌٍيرخٍص ِيٓ ويً اٌثشٚذ١ٕياخ اٌّشافميح ٌإلٔيض٠ُ فيٟ ا٠يوفذ ٘زا ِي شاً عٍٝ وّا ٠ع .اٌّغرخٍص اٌخاَ ذعرّييذ حشوييح اٌثشٚذ١ٕيياخ فييٟ ٘ييالَ ِرعييذد األوش٠ييً عِا٠ييذ تٛظييٛد اٌعٛاِييً اٌّاعييخح عٍييٝ اٌييٛصْ ح ،اِا فيٟ حاٌيح غ١ياب ٔٙا اٌعض٠ي١اٚصاِع اً ِمذاس حشورٙا عىغ١، عر ٠رٕاعة ٌٙزٖ اٌثشٚذ١ٕاخفمظ اٌعض٠يٟ ٔريائط ٠ييدٞ اٌيٝ اعطياء لذفٟ حشوح اٌثشٚذ١ٕاخ ، األِش اٌزٞ ُِٙفغ١ىْٛ ٌٍشصٕح دٚس اٌعٛاًِ اٌّاعخح (.Lass ،1998ٌرشاتٗ أٚ ذماسب ِصوٍح اٌشصٕح ٌثعض اٌثشٚذ١ٕاخ )أح١أاً خاطيح اٌغذسج ٚاخشْٚ 2016، 39 - 26 ( : 1) 8ِعٍح د٠اٌٝ ٌٍعٍَٛ اٌضساع١ح ، 30 انزرشٍح انٓاليًرمذٌر انٕزٌ انجسٌئً ثطرٌمخ ٌىٛٔيٗ عرشداد ٌوثغح اٌذوغرشاْ األصسقنذع١١ٓ حعُ ا فٟ Sephacryl S-200ععرعًّ عّٛد وّييا ذييُ ذع١يي١ٓ حعييَٛ ععييرشداد اٌثشٚذ١ٕيياخ اٌم١اعيي١ح ، ( -Void Volume -Vo) ٠ّصييً حعييُ اٌفييشا عيييرشداد عٌيييٝ حعيييُ اٌفيييشا نحغيييثد ٔغيييثح حعيييُ ا .( -Elution Volume -Ve) اٌّغيييرخذِح (Ve/Vo)عرشداد عٌٝ حعُ اٌفشا ٌٍثشٚذ١ٕياخ اٌم١اعي١ح نحعُ ا١ٓ ٔغثح تاٌعاللح ٌىً تشٚذ١ٓ ، شُ سعّد س٠رُ اٌييٛصْ اٌعض٠ييٟ ٌإلٔيض٠ُ ليذ تٍييغ ا( ، ِٕٚيٗ ٠رضيح أْ ٌٛغي4ٌٙيا ) اٌشييىً ٌٚٛغياس٠رُ اٌيٛصْ أٌعض٠ييٟ و١ٍٛ داٌرْٛ عٕذ ذمذ٠شٖ تطش٠مح اٌرش ١ح اٌٙالِٟ . 47.2، ٚتٙزا فلْ اٌٛصْ اٌعض٠يٟ ٌٗ ٠ثٍغ 4.674 نزمذٌر انزٕزٌ انجسٌئزً إلَزسٌى انجرٔرٍٍزس انًُززج يزٍ انعسنزخ ٔيعبدنخ انزٕلع مٍبسً. انًُحُى ان 4شكم ان Pseudomonas fluorescens ISH ًعًٕد ثطرٌمخ انزرشٍح انٓاليً فSephacryl S-200. ) ة ( ) أ ( فزً ْزالو يزعزذد P. fluorescens ISHٍٍزس انًُززج يزٍ انعسنزخ انجرٔرانزرحٍم انكٓرثبئً إلَسٌى . 3شكم ان ، )أ( انًسززخهض انخزبو ٔثعزذ عًهٍزخ انزجزبدل األٌزًَٕ ، )ة( األكرٌم ايبٌذ ثٕجٕد انعٕايم انًبسخخ نهجزرٔرٍٍ ثعذ عًهٍخ انزرشٍح انٓاليً . اٌغذسج ٚاخشْٚ 2016، 39 - 26 ( : 1) 8ِعٍح د٠اٌٝ ٌٍعٍَٛ اٌضساع١ح ، 31 انرلى انٍٓذرٔجًٍُ األيثم نفعبنٍخ اإلَسٌى رحذٌذ عٕيذ أسلياَ ١٘ذسٚظ١ٕ١يح١يذ اٌذساعيح لاٌثشٚذ١١يض إٌّميٝ دسط ذهش١ش اٌشلُ ا١ٌٙيذسٚظ١ٕٟ فيٟ فعا١ٌيح ، 8.0 أْ اٌشلُ ا١ٌٙذسٚظ١ٕٟ األِصً ٌفعا١ٌح انٔض٠ُ وا5ْٚتفاسق ٔوز دسظح ، عر ٠ظٙش اٌشىً 10 – 5 عٕييذ األسليياَ ٔخفاضيياً عت١ّٕييا ييٙذخ اٌفعا١ٌييح انٔض١ّ٠ييح ٚحييذج/ًِ ، 183فمييذ تٍغييد اٌفعا١ٌييح انٔض١ّ٠ييح ، ٚتزٌه ٠ّىٓ انعرٕراض أْ اٌثشٚذ١١ض إٌّرط ِٓ اٌعضٌح 10 – 9ذ٠ح ٚاٌماع 6 – 5اٌصاِض١ح ا١ٌٙذسٚظ١ٕ١ح P. fluorescens ISH ِعّٛعح اٌثشٚذ١١ضاخ اٌماعذ٠ح اٌرٟ ذظٙش الوٝ فعا١ٌيح ٌٙيا فيٟ اٌّصي١ظ ِٓ ٛ٘ اٌماعذٞ ، ٟٚ٘ تزٌه ذشرشن ِع تشٚذ١١ضاخ اخشٜ ِٕرعح ِٓ اظٕاط ٚأٛا ِخرٍفح ِٓ األح١اء اٌّعٙش٠ح 8.5 – 8.0تي١ٓ P. fluorescens 114شلُ ا١ٌٙذسٚظ١ٕٟ األِصً ٌفعا١ٌح اٌثشٚذ١١ض إٌّرط ِيٓ ، عر واْ اٌ (Hamamoto ، ْٚٚٚظيييذ1994ٚاخيييش ، )Mu ( ْٚأْ اٌيييشلُ ا١ٌٙيييذسٚظ١ٕٟ األِصيييً 2009ٚاخيييش ) . 7.5لذ تٍغ P. fluorescens Rm12ٌفعا١ٌح اٌثشٚذ١١ض إٌّرط ِٓ نزززززرلى انٍٓزززززذرٔجًٍُ فزززززً فعبنٍزززززخ انجرٔرٍٍزززززس انًُززززززج يزززززٍ . رزززززأثٍر لزززززٍى يخزهفزززززخ يزززززٍ ا 5شزززززكم ان يبدح أسبشثٕطفّ ثإسزعًبل انكبزٌٍ Pseudomonas fluorescens ISHانعسنخ ( عٕييذ ذغ١ييش اٌييشلُ ا١ٌٙييذسٚظ١ٕٟ Conformationذعييأٟ انٔض٠ّيياخ ِييٓ ذغ١ييشاخ فييٟ ا١ٌٙيييح ) ٟ ذشو١ة انٔيض٠ُ ، ٚأيٗ عٕيذ ٚضيع تغثة ذغ١ش صٕاخ اٌّعّٛعاخ اٌعأث١ح ٌٍصٛاِض األ١ٕ١ِح اٌذاخٍح ف انٔض٠ُ فٟ ِصا١ًٌ راخ اسلاَ ١٘ذسٚظ١ٕ١ح ِرطشفح تع١ذج عٓ ٔمطح اٌرعيادي اٌىٙشتيائٟ ٌيٗ ذيضداد اٌرٕيافشاخ ٠ٓ هاألٌىرشٚعراذ١ى١ح ت١ٓ اٌشصٕاخ اٌّرشاتٙح ِيا ٠ييدٞ اٌيٝ فيرح انٌرفياف ، وّيا أْ اٌّعّٛعياخ اٌماتٍيح ٌٍري ٠يٟٛٔ ِالئيُ ٌٍصفياظ عٍيٝ ١٘ييح اٌّٛليع اٌفعياي أض٠ُ ٠عية أْ ذىيْٛ تشيىً اٌّٛظٛدج فٟ اٌّٛلع اٌفعياي ٌإلٔي ( .2000خشْٚ ، اٚ Murrayٚانسذثاط ِع اٌّادج األعاط ٚذصف١ض اٌرفاعً ) اإلَسٌى نثجبدانرلى انٍٓذرٔجًٍُ األيثم رحذٌذ اٞ 8.0 – 7.0سليياَ ١٘ذسٚظ١ٕ١ييح تيي١ٓ أأْ افضييً شثاذ١ييح ٌإلٔييض٠ُ وأييد فييٟ ٠6رثيي١ٓ ِييٓ اٌشييىً % ِٓ فعا١ٌرٗ 100 – 91اٌّرعادي اٌٝ اٌماعذٞ اٌضع١ز ، عر عحرفع تّا ِمذاسٖ ( ٌصثاذ١ييح 2009ٚاخييشْٚ ) Muذمييع ٘ييزٖ إٌرييائط ضييّٓ ِييذٜ األسليياَ ا١ٌٙذسٚظ١ٕ١ييح اٌييزٞ حييذدٖ وّيييا ٚظيييذ ، 9.0 – 6.0ٚاٌيييزٞ وييياْ تييي١ٓ P. fluorescens Rm12عٔيييض٠ُ اٌثشٚذ١١يييض إٌّيييرط ِيييٓ Illakkiam ( ْٚأْ عٔض٠ُ اٌثشٚذ١١ض إٌّرط ِٓ 2013ٚاخش )P. aeruginosa 80لذ عحرفع تصذٚد % فميذ p. putida AT، اِيا عٔيض٠ُ اٌثشٚذ١١يض إٌّيرط ِيٓ 9.0 – 5.0ِٓ فعا١ٌرٗ فٟ ِذٜ سلُ ١٘ذسٚظ١ٕٟ ٚاخيشْٚ ، Vijayaraghavan) 9.0 – 7.0% ِٓ فعا١ٌرٗ فيٟ ِيذٜ سليُ ١٘يذسٚظ١ٕٟ 80عحرفع تصذٚد 2014 . ) اٌغذسج ٚاخشْٚ 2016، 39 - 26 ( : 1) 8ِعٍح د٠اٌٝ ٌٍعٍَٛ اٌضساع١ح ، 32 . رأثٍر لٍى يخزهفخ يٍ انرلى انٍٓذرٔجًٍُ فً ثجبرٍخ انجرٔرٍٍس انمبعذي انًُزج يٍ انعسنخ 6شكم نا Pseudomonas fluorescens ISH و 35دلٍمخ ثذرجخ حرارح 30ثعذ انحضٍ يذح. ٠عييٛد عٔخفيياض فعا١ٌييح اٌثشٚذ١١ييض فييٟ األسليياَ ا١ٌٙذسٚظ١ٕ١ييح اٌصاِضيي١ح غ١ييش اٌّرطشفييح عٌييٝ ذييهش١ش ، ( Segel ،1976عـظ فٟ ذشو١ة انٔض٠ُ ٚذه٠ٓ اٌّعّٛعاخ اٌّٛظيٛدج فيٟ اٌّٛليع اٌفعياي )حّٛضح اٌٛ اِييييا عٔخفيييياض شثاذ١ييييح انٔييييض٠ُ عٕييييذ اٌميييي١ُ اٌصاِضيييي١ح ٚاٌماعذ٠ييييح اٌّرطشفييييح ف١صوييييً ٔر١عييييح ِغييييخ (Denaturation ًمعىغييٟ ٌعض٠يييح انٔييض٠ُ تغييثة اٌرغ١ييش اٌىث١ييش اٌييزٞ ٠طييشأ عٍييٝ ييصٕاخ اٌغالعيي ) ( اٌرشو١ية اٌصالشيٟ ٌعض٠ييح انٔيض٠ُ Disruptionاتٍح ٌٍره٠ٓ ، األِش اٌيزٞ ٠ييدٞ اٌيٝ ذصطي١ُ ) اٌعأث١ح اٌم ( Palmer ،1985فٟ اٌّٛلع اٌفعاي ٚتاٌراٌٟ فمذاْ اٌفعا١ٌيح ) اً وصش عشٛائ١ح ٚذغ١شأ١ٌٕشه تذمً ِٕٗ ذشو١ة . نفعبنٍخ اإلَسٌى رحذٌذ درجخ انحرارح انًثهى ٝ ٌرويً ألوي، اسذفا دسظح اٌصيشاسج ِع اٌفعا١ٌح انٔض١ّ٠ح دج فٟ حذٚز ص٠ا 7 اٌشىً ف٠ٟالحع ذيذ٘ٛسخ اٌريٟ ذّصيً دسظيح اٌصيشاسج اٌّصٍيٝ ٌٍفعا١ٌيح .َ 40عٕذ دسظح حيشاسج ٚحذج/ًِ 213فعا١ٌح ٟٚ٘ % ِيٓ اٌفعا١ٌيح اٌمويٜٛ ، شيُ 25ٚحذج/ًِ ٚ٘ٛ ِا٠شىً 54َ ٌرثٍغ 50فعا١ٌح اٌثشٚذ١١ض فٟ دسظح حشاسج َ ، ٠ٚعضٜ 60َ ١ٌفمذ انٔض٠ُ فعا١ٌرٗ عٕذ 55ِٓ اٌفعا١ٌح اٌموٜٛ عٕذ دسظح حشاسج % فمظ5ٚصٍد اٌٝ ( ٌإلٔض٠ُ اٌرٟ ذثٍغ ا ذ٘ا غاٌثاً فٟ دسظاخ حيشاسج تي١ٓ Self-digestion٘زا اٌٝ ظا٘شج اٌرصًٍ اٌزاذٟ ) Muشٚدج )َ ٚاٌرٟ ذعأٟ ِٕٙيا اغٍية اٌثشٚذ١١يضاخ إٌّرعيح ِيٓ ِعّٛعيح اٌثىرش٠يا اٌّرصٍّيح ٌٍثي65 – 50 ( . 2009ٚاخشْٚ ، Pseudomonasرأثٍر درجخ انحرارح فً فعبنٍخ انجرٔرٍٍس انمبعذي انًُزج يٍ انعسنخ. 7شكم ان fluorescens ISH ًٍُ7.5ثإسزعًبل انكبزٌٍ يبدح أسبش فً رلى ٍْذرٔج . اٌغذسج ٚاخشْٚ 2016، 39 - 26 ( : 1) 8ِعٍح د٠اٌٝ ٌٍعٍَٛ اٌضساع١ح ، 33 Kinetic)ٌصشو١ح ص٠ادج اٌطالح اعْ اصد٠اد اٌفعا١ٌح انٔض١ّ٠ح ِع اسذفا دسظح اٌصشاسج ٠عٛد اٌٝ energy ) ٚ ُّٙييا ص٠ييادج فييشت اٌروييادَ ت١ٕ، األِييش اٌييزٞ ٠رشذيية ع١ٍييٗ ١حّييادج األعاعيياٌٌىييً ِييٓ انٔييض٠ (Segel ،1976) ٍٝٚاصيش ا١ٌٙذسٚظ١ٕ١يح ِيا ٠ييشش ٌألوغش غ١صذز ف، اِا تعذ ذعاٚص دسظح اٌصشاسج اٌّص ١فميذِيع اسذفيا دسظيح اٌصيشاسج ٌ ٗ ِرىاِالً ترشو١ث، شُ ٠فمذ انٔض٠ُ لذسذٗ عٍٝ انحرفاظ فٟ ذشو١ة انٔض٠ُ Murray)خٛاصيٗ اٌطث١ع١يحأيٗ ٌٚفمذ ٌرشو١ية انٔيض٠ُ (Collapse) ١ٙٔياسعٚليذ ٠صيذز ذذس٠ع١اً ، فعا١ٌرٗ ( . 2000ٚاخشْٚ ، نإلَسٌى انثجبد انحراري رحذٌذ خ ، ٚاظٙييشدل١مييح 10ِييذج َ 100 – 30ذشاٚحيد تيي١ٓ ذسظاخ حشاس٠ييح ِخرٍفييح تييحضيٓ انٔييض٠ُ تفعا١ٌريٗ واٍِيح Pseudomonas fluorescens ISHاٌثشٚذ١١يض إٌّيرط ِيٓ اٌعضٌيح ظ عٔض٠ُ اعحرفإٌرائط ح اٌصيشاسج ، عم اسذفا دسظيِع تعذ٘ا اٌفعا١ٌح ذذس٠ع١اً َ ، ٚأخفضد 40- 30تعذ حضٕٗ تذسظاخ حشاسج َ عر عحيرفع تّيا ِميذاسٖ 100تعضء ِٕٙا حرٝ فٟ دسظح حشاسج أْ انٔض٠ُ ٌُ ٠فمذ فعا١ٌرٗ ذّاِاً ٚأّا احرفع ( . 8% ِٓ فعا١ٌرٗ ) اٌشىً 8 ذذي إٌرائط أعيالٖ عٍيٝ أْ اٌثشٚذ١١يض اٌماعيذٞ ل١يذ اٌذساعيح ٘يٛ ِيٓ انٔض٠ّياخ اٌّماِٚيح ٌٍصيشاسج (Heat-stable ٚتييزٌه ، )وص١ييشاً فييٟ صييٕاعح األٌثيياْ ، عر م ٠رييهشش اٌّّٙييحانٔض٠ّيياخ ذثييشص أ١ّ٘رييٗ وهحييذ % ِيٓ فعا١ٌريٗ تعيذ حضيٕٗ تذسظيح حيشاسج 50تاٌّعاِالخ اٌصشاس٠ح اٌّغرعٍّح واٌثغرشج عر عحرفع تصيٛاٌٟ .األظثاْ اٌصاصً فٟ ِٕرعاخ األٌثاْ ٚمع١ّا ٌثشٚذ١ٕٟ اِعظُ اٌرصًٍ ا١ٌٙا ٠ٜعض اٌزَ ، 70 Pseudomonasسنززخرززأثٍر درجززخ انحززرارح فززً ثجززبد انجرٔرٍٍززس انمبعززذي انًُزززج يززٍ انع. 8 شززكمان fluorescens ISH دلٍمززخ ، ثززى لززذرد انفعبنٍززخ 10، حضززٍ اإلَززسٌى ثززذرجبد حرارٌززخ يخزهفززخ يززذح اإلَسًٌٍخ ثإسزعًبل انكبزٌٍ يبدح أسبش . فً فعبنٍخ اإلَسٌىٔثعض انًٕاد انكًٍٍبئٍخ رأثٍر األٌَٕبد انفهسٌخ رحذٌذ اٌثشٚذ١١يييض إٌّيييرط ِيييٓ اٌعضٌيييح١ٌيييح فعا فيييٟاٌى١ّ١ائ١يييح تعيييض اٌّيييٛادهش١ش ذييي ٠2ٛضيييح اٌعيييذٚي P. fluorescens ISH ُتياٌّصثظ ، عر ٌيُ ٠ريهشش انٔيض٠Pepstatin A اٌّرخويص ترصثي١ظ اٌثشٚذ١١يضاخ ِا ٠ذي عٍٝ أْ انٔيض٠ُ ل١يذ اٌذساعيح ، عحرفع تىاًِ فعا١ٌرٗ ٚ ( Aspartic acid proteasesاألعثاسذ١ح ) ٚ aprotininويييزٌه ٌيييُ ٠الحيييع أٞ ذيييهش١ش ٌٍّصيييثظ، اٌثشٚذ١١يييضاخ ٓ ِيييّعّٛعيييح ٘يييزٖ اٌم ٠ٕرّيييٟ عٌيييٝ PMSF ِٚصييثظ فييٛي اٌويي٠ٛا (SBTI)ِٟصثطيياخ ِرخووييح ، ٚ٘ييزٖ اٌّييٛاد ٘ييٟ اٌفعا١ٌييح انٔض١ّ٠ييح فيي ٌيٝ ِعّٛعيح اٌثشٚذ١١يضاخ اٌغي١ش١ٕ٠حم٠ٕرّيٟ أيض٠ُ انعرٕراض أْ نِا ٠مٛد عٌٝ ا، تاٌثشٚذ١١ضاخ اٌغ١ش١ٕ٠ح اٌغذسج ٚاخشْٚ 2016، 39 - 26 ( : 1) 8ِعٍح د٠اٌٝ ٌٍعٍَٛ اٌضساع١ح ، 34 (Serine proteases ، ) ٌّيادج وّا ٌُ ٠الحع أٞ ذهش١شE64 ِٓصثطياخ اٌثشٚذ١١يضاخ اٌغ١غير١ٕ١حٚ٘يٟ ِي (Cysteine proteasesٟفييي ) ُِيييٓ عّٛعيييح ٘يييزٖ اٌّم ٠عييٛد عٌيييٝ ِٗيييا ٠يييذي عٍيييٝ أٔييي، فعا١ٌيييح انٔييض٠ Chelating-ٍِٟ ِٛمس ) ٟٚ٘ ِٓ اٌّٛاد اٌىالت١ح 1ترشو١ض EDTAأدٜ ععرعّاي اٌّادج اٌثشٚذ١١ضاخ agents ) ٍُِيٟ 5% ِيٓ فعا١ٌريٗ ، شيُ ١ٌفميذ فعا١ٌريٗ تاٌىاِيً عٕيذ ص٠يادج اٌرشو١يض اٌيٝ 92اٌٝ فمذاْ انٔيض٠ ( اٌريٟ ٠شيىً Metalloproteasesِٛمس ، ِا ٠يوذ عٔرّاء انٔض٠ُ اٌيٝ ِعّٛعيح اٌثشٚذ١١يضاخ اٌّعذ١ٔيح ) اٌّيٛاد اٌىالت١يح ترى٠ٕٛٙييا ِيٓ اٌّٛليع اٌفعياي ٌإلٔيض٠ُ ، عر ذر١ّيض ١اً ف١ٙيا أحيذ األ٠ٛٔياخ اٌّعذ١ٔيح ظيضءاً أعاعي ِشوثاخ ِعمذج ِع األ٠ٛٔاخ اٌّٛظٛدج فٟ ظض٠يح انٔض٠ُ ِٚٓ شُ ذصث١طٗ . ٘يٟ ِيادج والت١يح ِرخوويح Phenanthroline-1,10( أْ 2000) Koka ٚWeimer روش ٛمس ، ٍِيٟ ِي 1تانسذثاط تاٌضٔه ، ٌزٌه أخرثش ذهش١ش٘ا عٍٝ اٌثشٚذ١١ض ل١ذ اٌذساعيح ، عر ععيرعٍّد ترشو١يض ٚليذ ادخ اٌيٝ اٌرصثي١ظ اٌىاِييً ٌإلٔيض٠ُ ٚ٘يٛ د١ٌيً عٍييٝ ٚظيٛد اٌضٔيه فيٟ اٌّٛلييع اٌفعياي ، ٚتٕياءاً عٍيٝ ٘ييزٖ اٌّعط١اخ فلْ انٔض٠ُ ٠ّىٓ أْ ٠وٕز ِٓ ِعّٛعح اٌثشٚذ١١ضاخ اٌّعذ١ٔح اٌصا٠ٚح عٍٝ اٌضٔه فٟ ِٛلعٙيا فٟ ُِٙراد أْ ٠ىْٛ ٌٍىاٌغ١َٛ دٚس ( ، ٚذعذس ان اسج اٌٝ أٔٗ ِٓ اٌّع zinc metalloproteaseاٌفعاي ) ( . Schokker ،1997فعا١ٌح ٚذصث١د اٌرشو١ة فٟ ٘زا إٌٛ ِٓ انٔض٠ّاخ ) ا٠ضاً ذهش١ش تعض األ٠ٛٔاخ اٌفٍض٠ح فٟ فعا١ٌح اٌثشٚذ١١ض اٌماعذٞ إٌّرط ِيٓ اٌعضٌيح ٠2ث١ٓ اٌعذٚي P. fluorescens ISH انٔض١ّ٠يح ، عر اصدادخ اٌفعا١ٌيح ، ِٕٚيٗ ٠رضيح دٚس اٌىاٌغي١َٛ فيٟ ص٠يادج اٌفعا١ٌيح ٍِٟ ِٛمس ِٓ ا٠ٛٔاخ اٌىاٌغ١َٛ . 5% عٕذ ِعاٍِح انٔض٠ُ ترشو١ض 11انٔض٠ُ . رأثٍر ثعض انًٕاد انكًٍٍبئٍخ فً فعبنٍخ إَسٌى انجرٔرٍٍس انمبعذي انًُزج يٍ انعسنخ 2جذٔل ان P. fluorescens ISH جمٍخ %انفعبنٍخ انًز انزركٍس خئٍانًبدح انكًٍٍب د 1 Pepstatin A 1mM 100 2 Aprotinin 10 µM 100 3 PMSF 5 mM 100 4 Soy Bean Trypsin Inhibitor 0.1 mg/ml 100 5 E 64 5 mM 100 6 EDTA 1 mM 5 mM 8 0 7 1,10-Phenanthroline 1 mM 0 8 CaCl2 1mM 5mM 100 110 9 CoCl2 1mM 5mM 100 94 10 MnCl2 1mM 5mM 100 97 11 HgCl2 1mM 5mM 43 0 12 CuCl2 1mM 5mM 64 19 13 AgCl2 1mM 5mM 86 74 14 ZnCl2 1mM 5mM 89 79 15 NiCl2 1mM 5mM 83 72 اٌغذسج ٚاخشْٚ 2016، 39 - 26 ( : 1) 8ِعٍح د٠اٌٝ ٌٍعٍَٛ اٌضساع١ح ، 35 ( دٚس اٌىاٌغ١َٛ فٟ ص٠ادج اٌفعا١ٌح انٔض١ّ٠ح ِيٓ خيالي دٚسٖ 1976ٚاخشْٚ ) Vordouwفغش ( ف١ٙيا ، ِيٓ conformational changesث١يح )فٟ ذصث١د ذشو١ة ظض٠يح انٔض٠ُ ِٕٚعيٗ ٌٍرغ١يشاخ اٌرشو١ ( 2009ٚاخيشْٚ ) Nadeemخالي دٚسٖ فٟ ذم٠ٛح انسذثاطاخ األ١ٔٛ٠ح ضّٓ ذشو١ة انٔض٠ُ ، وّا روش فٟ حّا٠يح انٔيض٠ُ ِيٓ ذغ١يش ا١ٌٙييح ) اٌّغيخ ( ٚاٌّصافظيح عٍيٝ اٌرٛص٠يع اٌفشاغيٟ اً ٘اِ اً أْ ٌٍىاٌغ١َٛ دٚس عْ دٚس اٌىاٌغ١َٛ فٟ ص٠ادج اٌصثاذ١ح اٌصشاس٠ح ٚاٌفعا١ٌح اٌرص١ٍٍيح اٌعا١ٌح .ٌٍّٛلع اٌفعاي فٟ دسظاخ اٌصشاسج ٌيُ ذييشش ا٠ٛٔياخ اٌىٛتٍيد ٚإٌّغ١ٕيض فيٟ فعا١ٌيح ( . 2003ٚاخيشْٚ ) Ghorbelٌإلٔض٠ُ ٠رفك ِع ِياروشٖ % ٚ 6ٔض٠ُ ٍِٟ ِٛمس، فٟ ح١ٓ فمذ ان 1اٌثشٚذ١١ض وص١شاً ، عر عحرفع انٔض٠ُ تفعا١ٌرٗ عٕذ ِعاٍِرٗ ترشو١ض ٍِٟ ِٛمس ِٓ ا٠ٛٔاخ اٌىٛتٍد ٚإٌّغ١ٕض عٍٝ اٌرشذ١ة . 5% ِٓ فعا١ٌرٗ عٕذ ِعاٍِرٗ ترشو١ض 3 % ِيٓ 57ٌٛحع عٔخفاض وث١ش فٟ فعا١ٌح انٔيض٠ُ عٕيذ ِعاٍِريٗ ته٠ٛٔياخ اٌضئثيك ، عر فميذ انٔيض٠ُ ٍِيٟ 5ذشو١ض ا٠ٛٔاخ اٌضئثك اٌيٝ ٍِٟ ِٛمس ، ١ٌفمذ فعا١ٌرٗ ذّاِاً عٕذ ص٠ادج 1فعا١ٌرٗ عٕذ ِعاٍِرٗ ترشو١ض ٍِييٟ ِييٛمس اٌييٝ فمييذاْ 1ِييٛمس . ٚويياْ ٌٍٕصيياط ذييهش١ش ِشيياتٗ ذمش٠ثيياً ٌٍضئثييك ، عر ادٜ ععييرعّاٌٗ ترشو١ييض ٍِيٟ ِيٛمس فميذ ادٜ اٌيٝ فميذاْ انٔيض٠ُ 5% ِٓ فعا١ٌرٗ ، اِا ص٠ادج ذشو١يض ا٠يْٛ إٌصياط اٌيٝ 36انٔض٠ُ ضٔه ٚا١ٌٕىً فمذ واْ ذهش١ش٘ا ِرٛعطاً فيٟ فعا١ٌيح انٔيض٠ُ ، عر فميذ % ِٓ فعا١ٌرٗ . أِا أ٠ٛٔاخ اٌفضح ٚا81ٌ ٍِٟ ِٛمس ِٓ األ٠ٛٔاخ أعالٖ عٍيٝ اٌرشذ١ية 1% ِٓ فعا١ٌرٗ عٕذ ِعاٍِرٗ ترشو١ض 17ٚ 11ٚ 14انٔض٠ُ ٍِيٟ ِيٛمس أل٠ٛٔياخ 5% عٕيذ ص٠يادج اٌرشو١يض اٌيٝ 28ٚ 21ٚ 26، ٚاصداد اٌفمذاْ فٟ اٌفعا١ٌح ١ٌوً اٌٝ فٟ فعا١ٌح انٔض٠ُ اً ذهش١شذذي إٌرائط أعالٖ عٍٝ أْ ٌأل٠ٛٔاخ اٌّعذ١ٔح اٌضٔه ٚا١ٌٕىً عٍٝ اٌرشذ١ة.اٌفضح ٚ ٠خرٍز تلخرالف أٔٛاعٙا ٚذشاو١ض٘ا ، ٚغاٌثاً ِا٠ضداد ذهش١ش األ٠ٛٔاخ ِع ص٠ادج ذشو١ض٘ا ، ٠ّٚىٓ أْ ٠عضٜ ذاخٍييح فييٟ ذشو١ية انٔييض٠ُ عييٛاء رٌيه اٌييٝ ذىي٠ٛٓ ِعمييذاخ ِييع اٌّعّٛعياخ اٌعأث١ييح ٌٍصييٛاِض األ١ٕ١ِيح اٌ اٌّٛظٛدج فيٟ اٌّٛليع اٌفعياي اٚتياٌمشب ِٕيٗ ، اٚ اٌّٛظيٛدج فيٟ ِٛاليع اخيشٜ ٠ّٚىيٓ أْ ذييدٞ اٌيٝ ععاليح اسذثيياط انٔييض٠ُ تاٌّييادج األعيياط ، وّييا عْ تعييض أ٠ٛٔيياخ اٌّعييادْ اٌصم١ٍييح ذّرٍييه ذييهش١ش اٌّصييثظ اٌالذٕافغييٟ ( Mahler ٚCordes ،1991ٌإلٔض٠ُ ) إلَسٌى يٍ انحٕايض األيٍٍُخرركٍت ا ألظيً ذفغي١ش ِّٙيحذعذ ع١ٍّح اٌرعشف عٍٝ اٌصٛاِض األ١ٕ١ِح اٌذاخٍح فٟ ذشو١ية انٔيض٠ُ خطيٛج تعض اٌخوائص اٌرٟ ٠ر١ّض تٙا انٔض٠ُ . إٌغثح اٌّي٠ٛح ٌىً حاِض ا١ِٕٟ فٟ ذشو١ة عٔض٠ُ اٌثشٚذ١١ض اٌماعذٞ إٌّرط ِٓ ٠3ٛضح اٌعذٚي ، ِع ان اسج اٌٝ أْ عذَ ظٙٛس اٌصاِض األ١ِٕٟ اٌرشترٛفاْ فٟ اٌعيذٚي P. fluorescens ISHاٌعضٌح اظٙشخ إٌرائط عحرٛاء انٔض٠ُ عٍيٝ ٠عٛد اٌٝ ذصطّٗ اشٕاء اٌٙضُ اٌصاِضٟ عٕذ اعذاد األّٔٛرض ٌٍرص١ًٍ. ٔغييثح عا١ٌييح ِييٓ اٌصييٛاِض األ١ٕ١ِييح اٌىاس٘ييح ٌٍّيياء ٚ٘ييٟ األمٔيي١ٓ ٚاٌفييا١ٌٓ ٚا١ٌٍٛعيي١ٓ ٚاأل٠ض١ٌٚٛعيي١ٓ % ِٓ ِعّٛ اٌصٛاِض األ١ٕ١ِح ، ٚ٘ٛ ِا ٠ضفٟ 37.6ٚاٌثش١ٌٚٓ ٚاٌف١ًٕ ام١ٔٓ ٚاٌّص١ٔٛ١ٓ ٚتّا ٠شىً فٟ اضيفاء اٌصثياخ عٍيٝ اً أعاع اٌصثاخ عٍٝ اٌرشو١ة إٌّطٛٞ ٌإلٔض٠ُ ٌىْٛ ٘زٖ اٌصٛاِض األ١ٕ١ِح عاِالً ١ٕ١ييح اٌذاخٍييح فييٟ ذشو١يية % ِييٓ اٌصييٛاِض األ٠14.4ِشييىً اٌثييش١ٌٚٓ اٌرشاو١يية إٌّط٠ٛييح ٌٍثشٚذ١ٕيياخ . ٌٙييزا اٌصيياِض األ١ِٕييٟ الييً ِييٓ تييالٟ اٌصييٛاِض structural entropyانٔييض٠ُ ، ِٚييٓ اٌّعييشٚف أْ األ١ٕ١ِح ، ٌزا فّٓ اٌغًٙ أْ ٠غثة عٔطٛاء ٌٍغٍغٍح اٌثشٚذ١ٕ١ح ، وّا أٔٗ ٠صراض اٌٝ طالح اوثش ٌفرح انٔطٛاء (Watanabe ، ْٚ1994ٚاخش.) ٖ عٍٝ ٔغثح عا١ٌح ِٓ اٌصاِض األ١ِٕٟ اٌغغيري١ٓ ؤل١ذ اٌذساعح ٘ٛ عحرٛا عْ أُ٘ صفاخ اٌثشٚذ١١ض % ، ٚتاٌراٌٟ عحرّا١ٌح ٚظٛد اٌعغيٛس اٌىثش٠ر١يح تٕغيثح عا١ٌيح ، األِيش اٌيزٞ ٠ّىيٓ أْ ٠عيذ 6.8ٚاٌرٟ تٍغد أحذ أعثاب اٌصثاذ١ح اٌصشاس٠ح ٌٙزا انٔض٠ُ . % ِيٓ ٠20غ١ٓ ٚاألم١ٔٓ ( ِا٠مياسب ّٕخفضح اٌٛصْ اٌعض٠يٟ ) اٌىالاٌ ىٍد اٌصٛاِض األ١ٕ١ِح ِعّٛ اٌصٛاِض األ١ٕ١ِح اٌذاخٍح فيٟ ذشو١ية انٔيض٠ُ ، ٚأْ اٌّصريٜٛ اٌعياٌٟ ٌٙيزا إٌيٛ ِيٓ اٌصيٛاِض األ١ٕ١ِح لذ ٠ىْٛ أحذ أعثاب ذّرع انٔض٠ُ توفح اٌصثاخ اٌصشاسٞ ، ألٔٙا راخ ِعّٛعاخ ظأث١ح صغ١شج ِا ( ٌإلٔيض٠ُ structural flexibility( ِعط١اً ِشٚٔيح ذشو١ث١يح ) ٠steric hindranceمًٍ عائك اٌفشاغ١ح ) (Malik ٚMathur ،1984 . ) اٌغذسج ٚاخشْٚ 2016، 39 - 26 ( : 1) 8ِعٍح د٠اٌٝ ٌٍعٍَٛ اٌضساع١ح ، 36 : انُسجخ انًئٌٕخ نهحٕايض األيٍٍُخ انذاخهخ فً رركٍت إَسٌى انجرٔرٍٍس انمبعذي انًُزج يٍ 3جذٔل ان P. fluorescens ISHانعسنخ انحبيض األيًٍُ انُسجخ انًئٌٕخ ) % ( ( Ala) األالٍٍَ 8.1 ( Argاألرجٍٍُ ) 2.1 ( Asxحبيض األسجبررٍك ٔاألسجبررٍٍ ) 8.2 ( Cysانسسزئٍٍ ) 6.8 ( Glxحبيض انكهٕربيٍك ٔانكهٕربيٍٍ ) 13.1 ( Glyانكالٌسٍٍ ) 11.6 ( Hisانٓسزذٌٍ ) 4.0 ( Ileاألٌسٔنٍٕسٍٍ ) 2.7 ( Leuانهٍٕسٍٍ ) 4.2 ( Lysانالٌسٍٍ ) 3.9 ( Metٍٍَٕ )انًٍثٍ 2.2 ( Pheانفٍُم االٍٍَ ) 2.1 ( Proانجرٔنٍٍ ) 14.4 ( Serانسٍرٌٍ ) 5.2 ( Thrانثرٌٍٍَٕ ) 3.2 ( Tyrانزبٌرٔسٍٍ ) 3.9 ( Valانفبنٍٍ ) 3.9 رأثٍر انجرٔرٍٍس فً ثرٔرٍُبد انحهٍت P. fluorescens ISHفعا١ٌح عٔض٠ُ اٌثشٚذ١١ض اٌماعذٞ إٌّرط ِٓ اٌعضٌح اٌّص١ٍح ٠9ظٙش اٌشىً عر تٍغيد اٌفعا١ٌيح β-casein، ِٕٚٗ ٠الحع األٌفيح اٌعا١ٌيح ٌإلٔيض٠ُ ذعياٖ sα ٚβ ٚkذعاٖ واص٠ٕاخ اٌص١ٍة ٚ 25ٚ 20ٚ 15ٚ 10ٚ 5ٚحذج/ًِ تعذ ِيشٚس 239ٚ 232ٚ 206ٚ 185ٚ 139ٚ 99انٔض١ّ٠ح دل١مح عٍٝ اٌرشذ١ة . 30 رجزبِ كبزٌُزبد P. fluorescens ISHنمبعزذي انًُززج يزٍ انعسنزخ . فعبنٍزخ إَزسٌى انجرٔرٍٍزس ا 9شزكم ان ٔ M 0.05يهغى/يم نكم يُٓب فزً يحهزٕل انفٕسزفبد انزذارئ 5انًحضرح ثزركٍس sα ٔβ ٔkانحهٍت pH 7.5 و 40حرارح ثذرجخيبٌكرٔنزر إَسٌى/يم 100، ثإسزعًبل. اٌغذسج ٚاخشْٚ 2016، 39 - 26 ( : 1) 8ِعٍح د٠اٌٝ ٌٍعٍَٛ اٌضساع١ح ، 37 ٚ 91، عر تٍغيد ٠αs-casein ٚk-caseinرث١ٓ ِٓ اٌشىً ا٠ضاً ذماسب لي١ُ فعا١ٌيح انٔيض٠ُ ذعياٖ ٚ 91ٚ 79ٚ 71ٚ 66، وّيا تٍغيد αs-caseinٚحذج / ِيً ذعياٖ 145ٚ 136ٚ 129ٚ 115ٚ 108 دل١ميييح عٍيييٝ 30ٚ 25ٚ 20ٚ 15ٚ 10ٚ 5تعيييذ ِيييشٚس k-caseinٚحيييذج / ِيييً ذعييياٖ 117ٚ 102 .اٌرشذ١ة ٠ّىيٓ أْ ذعيضٜ اٌيٝ عحريٛاء ٘يزا β-caseinذعاٖ عْ األٌفح اٌعا١ٌح ٌٍثشٚذ١١ض اٌماعذٞ ل١ذ اٌذساعح اٌىاص٠ٓ عٍٝ ٔغثح اعٍٝ ِٓ األٚاصش اٌثثر١ذ٠ح اٌصغاعح ٌفعيً انٔيض٠ُ تاٌّماسٔيح ِيع اٌىاص٠ٕياخ األخيشٜ ، ( ٌٙييزا اٌىيياص٠ٓ عييٓ Conformational differencesوّييا أْ انخرالفيياخ فييٟ ا١ٌٙيييح اٌرشو١ث١ييح ) تريذاخً ظض٠ياذيٗ ِيع تعضيٙا ٌيزٌه αs-casein، عر ٠ر١ّض ذفغ١شاً اخش اٌىاص٠ٕاخ األخشٜ ٠ّىٓ أْ ذعطٟ ( تيييً ذرعّيييع ِيييع تعضيييٙا اٌيييثعض ٚذريييشاتظ تهٚاصيييش Monomerمذٛظيييذ تويييٛسج ظض٠يييياخ أحاد٠يييح ) ٗ عٍٝ ٔغثح عا١ٌح ِٓ اٌصياِض ئحرٛاا١٘ذسٚظ١ٕ١ح ٚأٚاصش غ١ش لطث١ح ٚغ١ش٘ا ، وّا ٠ر١ّض ٘زا اٌىاص٠ٓ ت عٍيٝ k-caseinذىي٠ٛٓ ا١ٌٙييح اٌصٍض١ٔٚيح إٌّرظّيح . ِيٓ ظٙيح اخيشٜ فيلْ عحريٛاء األ١ِٕٟ اٌثش١ٌٚٓ ذّٕع ، McSweeney ٚFoxاألٚاصش شٕائ١ح اٌىثش٠د ٠ّىٓ أْ ٠عط١يٗ ذشو١ثياً اوصيش شثاذياً ذعياٖ فعيً انٔيض٠ُ ) 2009 . ) ا ( حييٛي األٌفييح اٌعا١ٌييح اٌرييٟ أتييذا٘ 1989) Mitchell ٚMarshallذرفييك إٌرييائط ِييع ِيياروشٖ -αsِماسٔيح ِيع β-caseinذعياٖ P. fluorescens P27اٌثشٚذ١١ض اٌّماَٚ ٌٍصشاسج إٌّيرط ِيٓ اٌثىرش٠يا casein ٚk-casein فٟ ح١ٓ اوذ .Gebre-Egziabher ( ْٚأْ اٌثشٚذ١١ض إٌّيرط ِيٓ 1980ٚاخش ) pseudomonas ٖواْ اوصش فعا١ٌح ذعاβ-casein ٚk-casein تاٌّماسٔح ِع فعا١ٌرٗ ذعا ٖαs-casein. انًظبدر Bayoumi, R.A. and A.S.Bahobil.2011. Production of thermoalkaliphilic proteasebyShewanella putrefaciens-EGKSA21 under optimal conditions forapplication in biodetergent technology. J. Basic Appl.Sci. Res. 1: 95- 107. Bisswanger, H. 2008. Enzyme Kinetics: Principles and Methods. 2 nd ed. wiley. Germany. Devaraj, V.R. andN.H.Manjunatha.1999. Purification and characterization of a proteinase inhibitor from field bean, Dolichos lablab perpureus. J. Protein Chem. 18. 47–54. Gebre-Egziabher,A.;E.S. Humbertand G. Blankenagel.1980. Hydrolysis of milk proteins by microbial enzymes. J. Food Prot. 43:709–712. Ghorbel, B.; A. Sellami-Kamounand M.Nasri.2003. Stability studies of protease from Bacillus cereus BG1. Enzyme Microbial Technol. 32:5. 513-518. Hamamoto, T.; M. Kaneda; K. Horikoshi and T. Kudo.1994. Characterization of a protease from a psychrotroph, Pseudomonas fluorescens 114. Appl. Environ. Microbiol. 60:10. 3878-3880. Illakkiam, D.; N. Anuj; P. Ponraj; M. Shankar; J. Rajendhran and P. Gunasekaran.2013. Proteolytic enzyme mediated antagonistic potential of Pseudomonas aeruginosa against Macrophominaphaseolina. Indian J. Experimental Biology. 51: 1024-1031. Koka, R. and B.C. Weimer. 2000. Isolation and characterization of a protease from Pseudomonas fluorescens RO98. J. Applied Microbiology. 89: 280- 288. اٌغذسج ٚاخشْٚ 2016، 39 - 26 ( : 1) 8ِعٍح د٠اٌٝ ٌٍعٍَٛ اٌضساع١ح ، 38 Laemmli, U.K.1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature. 22: 827-835. Lass, T.1998.Electrophoresis in gels. In: protein purification. (Janson, J. C. and Ryden, L. eds.). 463 - 495. Mahler, H. R. andE.H. Cordes. 1991. Biological Chemistry. 2 nd ed. Harper and Row. New York. Malik, R.K. and D. K. Mathur.1984. Purification andcharacterization of a heat-stable protease from Pseudomonas sp. B-25. J. Dairy Sci. 67: 522- 530. McSweeney,P. L.and P. F. Fox. 2009. Advanced Dairy Chemistry. 3 rd ed.Springer. Mitchell, S. L. and R. T. Marshall.1989. Properties of heat-stable proteases of pseudomonas fluorescens: characterization and hydrolysis of milk proteins. J. Dairy Sci. 72: 864-874. Mu, Z.; M. Duand Y. Bai.2009. Purification and properties of a heat-stable enzyme of Pseudomonas fluorescens Rm12 from raw milk. Eur. Food Res. Technol. 228: 725–734. Murray, R. k.; H. K. Granner; P. A. Mayes and V. W. Rodwell.2000. Harper's Biochemistry. 25 th ed. Appleton and Lange. Nadeem, M.; J. I. Qazi and S. Baig.2009. Effect of aeration and agitation rates onalkaline protease production by Bacilluslicheniformis UV-9mutant. Turkish J. Biochemistry. 34: 89-96. Palmer, T.1985. Understanding Enzymes.2 nd ed. Ellis Harwood Limited. Schokker, E. P. 1997. Kinetics of Heat Inactivation of the Extracellular Proteinase From Pseudomonas fluorescens 22F. Ph.D. thesis.University of Wageningen.Wageningen. Netherlands. Segel, I. H. 1976. Biochemical Calculation.Jon Wiley and Sons.Inc. New York. Vijayaraghavan, P.; S. Saranya and S. G. Vincent.2014. Cow Dung substrate for the potential production of alkaline proteases by pseudomonas putida AT in solid-state fermentation. Chinese J. Biology. 14: 1-7. Vordouw, G.; C. Milo and R. S. Roche.1976. The role of bound calcium ions in thermostable proteolytic enzymes. Separation of intrinsic and calcium ions contribution to the kinetic thermal stability.Biochemistry. 15: 3716–3723. Vyletelova, M. and O. Hanus.2000. Effect of contamination by Pseudomonas fluorescens on principal components and technological parameters of pasteurized milk during storage. Czech J. Food Sci. 18: 224–234. Watanabe, K.; T. Masuda; H. Ohashi; H. Mihara and Y. Suzuki.1994. Multiple Proline Substitutions Cumulatively ThermostabilizeBacillus Cereus ATCC7064 Oligo-1,6-Glucosidase. Eur. J. Biochem. 226: 277–283. Whitaker, J. R.1972. Principles of Enzymology for the Food Science. Marcel Dekker, Inc. New York. اٌغذسج ٚاخشْٚ 2016، 39 - 26 ( : 1) 8ِعٍح د٠اٌٝ ٌٍعٍَٛ اٌضساع١ح ، 39 EXTRACTION, PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF PROTEASE OF Pseudomonas fluorescens ISH AND IT’S ROLE IN DETERIORATION OF IRAQI SOFT CHEESE 2- EXTRACTION, PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF PROTEASE OF P. fluorescens ISHAND EFFECT OF IT ON MILK PROTEINS ZIAD T. SEDRAH * AMER M.A. SALIH ** GHAZI M. AZIZ *** * Collage of Agriculture _ Diyala University- ziadsedrah@gmail.com. ** Collage of Agriculture_Baghdad University_ Salih1943@yahoo.com. *** Collage of Sciences_Baghdad University_ Ghazi_m56@yahoo.com. ABSTRACT The enzyme was purified by 30-80% saturation of ammonium sulphate precipitation, ion exchange chromatography on DEAE-Sepharose column and by gel filtration on Sephacryl S-200, with 18.5 fold and 32.8% recovery. The results of the enzyme characterization showed that it’sestimated molecular weight was 47.2 kD. The optimum pH of activity was 8.0 and it’soptimum pH of stability was 7.5. The optimum temperature for the activity was 40 O C, and the enzyme was retained its original activity after incubation for 10 minutes at temperatures ranging from 30-40 O C. The protease was metalloprotease because it was affected by the chelating agent EDTA. The protease showed high affinity toward β-casein, compared with its activity towards αs-casein and k-casein. Keywords: Pseudomonas fluorescens, Psychrotrophic bacteria, proteases, soft cheese. mailto:ziadsedrah@gmail.com mailto:Salih1943@yahoo.com mailto:Ghazi_m56@yahoo.com