<4D6963726F736F667420576F7264202D20E32E20DAE1EDC7C120E3DAE420DAC8CF20C7E1CDE3EDCF> آخرونو عبد الحميد 2013، 450 - 436 ) : 2( 5مجلة ديالى للعلوم الزراعية ، 436 Pseudomonas cepaciaمن العزالت المحلية لبكتريا Lipaseالاليبيز إنزيموتنقية إنتاج .ودراسة بعض الظروف المؤثرة في فعاليته ***مينا صباح فرمان ** محمد خليفة خضير *علياء معن عبد الحميد Alyaa.maan@homail.com. امعة ديالى ج –آلية العلوم –قسم علوم الحياة -مدرس* Mohammad.k @yahoo.com. جامعة ديالى –آلية العلوم –قسم علوم الحياة -أستاذ مساعد** Menia_aljubory@yahoo.com . جامعة االنبار –آلية العلوم –قسم علوم الحياة -مدرس *** المستخلص عينة بيئية 35من Pseudomonasالـ لبكتريا% 34عزلة محلية بنسبة 12تم الحصول على اختبرت قابلية .الموجودة في الحقول الزراعية لقضاء المقدادية مختلفة تضمنت المياه والتربة والنباتات وبمقارنتها مع عزلة قياسية إنتاجا األغزروانتخبت العزلة lipase ت على انتاج انزيم الاليبيز العزال . Pseudomonas cepacia شخصت على انها آان عند استخدام الوسط الزرعي إنتاج أفضل إنولوحظ اإلنتاجدرست الظروف المؤثرة في ساعة في 18وبمدة حضن م 40وبدرجة حرارة 7.5دروجيني وبرقم هي الكتانمن زيت % 5المضاف له بمرحلتين تضمنت الترسيب بكبريتات تمت تنقية االنزيم دقيقة ، \دورة 120زة بسرعة الحاضنة الهزا DEAE- Sephadex A25 يوني باستخدام المبادل االيونياالمونيوم وآروموتوغرافيا التبادل اال بعض االيونات تأثيردرس على التوالي ، مل \وحدة 35و 13 يبيزلال يةالنزيمفكانت الفعالية ا بترآيز +Ca 2ووجد ان ايون الكالسيوم المنقى جزئيا الفلزية والمذيبات العضوية في فعالية اإلنزيم دت آما ا %150حيث ارتفعت الفعالية االنزيمية الى على فعالية االنزيم تأثيرا ملي موالر اآثر 10 زيادة فعالية االنزيم حيث وصلت الى إلى ملي موالر 20بترآيز T ween80 معاملة االنزيم بمادة 145 . % ,Inhibitors Pseudomonas cepacia ,Lipase enzyme ,Characterization :الكلمات المفتاحية المقدمة ي بغة غرام يتراوح شكلها بين العصوي و العصو عصيات سالبة لص P. cepaciaتعتبر بكتريا م 45النمو في م فيما تكون ضعيفة ) 37-25( بدرجة حرارة وتنمو ،مايكرون طوال ) 3 -1.5(القصير ا مع ) . Jewell ،2000 ( وهي متحرآة باسواط قطبية هوائية المعيشة 6اعيد تصنيف هذه البكتري نسبة الى مكتشفها Burkholderia الى جنس جديد يسمى Pseudomonas انواع اخرى في جنس الـ اه تتواجد هذه البكتريا في البيئة الطبيعية مثل التربة واالنهار وسطوح النباتات وفي المياه المخزونة ومي (Matthew سيطة ومعقدة المجاري وقد ساهم هذا في انتشارها لقدرتها على النمو على مصادر غذائية ب ك بعض التقارير التي تشير الى ة اذ ان هناغير شائع ةممرض P. cepacia تعد بكتريا)2004،واخرون Selina (القدم انها تكون سبب اللتهاب شغاف القلب وتعفن الدم وااللتهابات الجلدية والحروق وتعفن اه الفضالت وآعامل ممرض للنباتات خاص ) 2012 ،واخرون ة آذلك تعتبر احد العوامل الملوثة لمي م ) Didier) ،2010النباتات الموجودة في البيوت الزجاجية وآذلك ممرضة لنبات البصل آما ت ا ). Doug ،2001 و Crystal violate ) Jennifer عزلها من محلول صبغة .P تمتاز بكتري cepacia ى بق ا عل اجابليته ن إنت د م اتاإلالعدي ل نزيم Lipaseو Betalactimaseمث ن Protase و LipaseAlginaseو ا م اتاإلوغيره ة نزيم ارج خلوي ة والخ Wigfield( الخلوي المجهرية آالبكتريا األحياءآبيرة من أعداداتمتلك ).2012، وآخرون Liew ؛ 2002، وآخرون ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ . 2012/ 5 / 17تاريخ استالم البحث . 2012/ 12/ 12تاريخ قبول النشر آخرونو عبد الحميد 2013، 450 - 436 ) : 2( 5مجلة ديالى للعلوم الزراعية ، 437 آبيرة بأهمية ولقد حظيت الاليبيزات البكتيرية ،الاليبيز إنزيم إلنتاج والخمائر واالعفان فعالية عالية لما لها من عالقة مباشرة في ظهور النكهة المتزنخة للحليب التي استفيد منها خاصة في المجال الصناعي وآذلك استخدم هذا االنزيم في صناعة المنظفات وفي الصناعات الدوائية مثل . ي انضاج االجبان ف آعامل P. cepaciaنتج من العزلة مواستخدم الاليبيز ال و التربينات ) (Alkalods لويدات القتصنيع ا ترول ل الكوليس يلتقلي دم ف رون (Acikel ال را ) .2011، وآخ ةنظ ات ح ألهمي ات الدراس ول انزيم من اجل الحصول على عزلة منتجة جاءت هذه الدراسة P. cepaciaالاليبيز المنتجة من سالالت بكتريا بعض الظروف وااليونات الفلزية تأثيروانتخاب الظروف المثلى المؤثرة على انتاجه ومعرفة لإلنزيم .والمواد االخرى في فعالية االنزيم المنقى ثبحالمواد وطرائق ال جمع العينات - 1 قضاء المقدادية في من مناطق مختلفة) زراعية( عينة تربة 15عينة بيئية تضمنت 35جمعت خذت العينات وابهذه البكتريا النباتات إلصابةوالتي يتوقع انها مصدر رئيسي في محافظة ديالى آذلك تم ،ومعقمة سم من سطح االرض ونقلت العينات في اآياس بالستيكية نظيفة 15من عمق عينات من نباتات مختلفة تضمنت اوراق وجذور البصل والباذنجان والحنطة والشعير 13جمع 7نفس القضاء ووضعت في عبوات معقمة واخذت في والذرة من مزارع وبيوت زجاجية تعود نوات ونقلت ومياه السواقي والق) ديالى ،الهارونية ، مهروت(ن المياه شملت مياه النهر عينات م .الى المختبر ومعقمة في قناني زجاجية نظيفة الى اجزاء صغيرة وتعليقها بالماء بعد تقطيعها (من النباتات و اغم مل من عينات المياه 1اخذ رشحت العينات بورق ). مل ماء مقطر 9غم تربة مع 1تعليق (مل من عالق التربة 1و) المقطر المعقم مل من ماء الببتون9مل من الراشح وعلق مع 1يتر ثم اخذ مايكرو م 0.45ترشيح بقطر .ساعة 18م لمدة 35ة حرارة جلغرض تنشيط العزالت البكتيرية وحضنت االنابيب بدر :تشخيص العزالت البكتيرية - 2 تم اجراء الفحوصات المجهرية والكيموحيوية لتشخيص العزالت البكتيرية اعتمادا على التي تم احضارها ومقارنتها بالعزلة القياسية المشخصة )2005، وآخرون Don(مصنف بيرآي .آلية العلوم \من الجامعة المستنصرية :دراسة الصفات المظهرية للبكتريا - أ ا ا وقوامه طحها وحافاته ا وس ة ولونه تعمرات النامي م المس منت حج ط تض ى وس عل Pseudomonas agar, اصطباغها بصبغة , دم ودراسة شكل الخاليا البكتيرية ار الواالآار المغذي واآ .وفحص الحرآة °م 42 لى النمو بدرجة آرام وقدرتها ع : الفحوصات الكيموحيوية - ب ديز والجيالتينيز واستخدام العدة التشخيصيةياالوآس إنزيم وإنتاجليز االكت إنزيم إنتاج تضمنت اختبار . Bio-Meraux المنتج من شرآة API 20 E :الاليبيز إلنزيمغربلة العزالت على اساس انتاجها - 3 قبل الموصوف من Rhan السائل الران االنتاج استخدم وسط : الوسط المستخدم - أ Kazlauskas وBornsche ) 2006( لعزالت على انتاج انزيم الاليبيزعن قابلية ا )NH4 )3 ( 1 PO4غرام من K2HPO4 ،5م من غرا5الوسط من مزج وحضر غرام 7H2O MgSO4.. 0.001غرام من CaCl2.6 H2O ،1 منغرام FeCl2.6H20 ، 0.001 غرام منNaCl تذاب المكونات في ,مل من زيت الزيتون 5و . ثم يعقم بالموصدة 7لتر من الماء المقطر ويعدل الرقم الهيدروجيني الى نشطت العزالت بتنميتها في وسط : Semi quantitative assayلغربلة شبه الكمية ا - ب مل من 0.1ساعة ثم اخذ 24م لمدة 35تربتكيز الصويا السائل وحضنت بدرجة حرارة .لملح الحامضالترسيب منطقة وقيس قطراللقاح وزرع على الوسط الصلب آخرونو عبد الحميد 2013، 450 - 436 ) : 2( 5مجلة ديالى للعلوم الزراعية ، 438 فس الخطوات اعاله باستثناء الزرع في وسط اجريت ن: اإلنزيم إلنتاجالغربلة الكمية -ج . مل لكل دورق 50مل بكمية 250الران السائل ثم تم وضع الوسط في دوارق سعة ::Stearic acid اعداد المنحني القياسي للحامض الدهني - د Kazlauskas تم تهيئة المنحني القياسي للحامض الدهني تبعا للطريقة الموصوفة من قبل . )1(شكل ) Bornsche ) 2006و 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 50 100 150 )مليليتر/ مايكروغرام ( الترآيز .المنحنى القياسي لحامض ستيريك الدهني .1 شكل :فعالية االنزيم تقدير - 4 لتقدير االحماض ) Bornsche ) 2006و Kazlauskas الطريقة الموصوفة من قبل استخدمت .الخام اإلنزيميطويلة السلسلة في المستخلص الدهنية : لإلنزيمتقدير البروتين وحساب الفعالية النوعية - 5 الخالي األنزيميلتقدير ترآيز البروتين في المستخلص ) Bradford )1976 استخدمت طريقة مايكرو مول 1التي تحرر يماإلنزآمية بأنهافي المللتر الواحد اإلنزيموتعرف فعالية ,من الخاليا .دقيقة تحت ظروف التجربة 45من الحمض الدهني خالل :العوامل المؤثرة في انتاج الاليبيز - 6 -:مدة الحضن تأثيردراسة -ا ساعة ثم لقح 18م لمدة 35نشطت العزلة المنتخبة في وسط مرق تربتون الصويا بدرجة حرارة ساعة ) 72-5(م لمدد زمنية مختلفة تراوحت بين 35ة حرارة وسط االنتاج السائل وحضن بدرج . ثم رسبت الخاليا وقيست الفعالية االنزيمية وترآيز البروتين وبواقع مكررين : الرقم الهيدروجيني في االنتاجية تأثيردراسة - ب ساعة ثم 18م لمدة 35نشطت العزلة المنتخبة في وسط مرق تربتون الصويا بدرجة حرارة ولقحت االوساط بالعزلة المنتخبة) 9.5-6(هيدروجينية مختلفة تراوحت بأرقامضر وسط االنتاجية ح بالنبذ المرآزي ساعة ثم رسبت الخاليا 18ة م لمد35وحضن بدرجة حرارة وبواقع مكررين .وقيست الفعالية االنزيمية وترآيز البروتيندقيقة \دورة 6000بسرعة ي وج م ول ط لى ع ص صا مت اال 44 0 تر مي نو نا آخرونو عبد الحميد 2013، 450 - 436 ) : 2( 5مجلة ديالى للعلوم الزراعية ، 439 : اإلنتاجيةارة في درجة الحر تأثير -ج (بدرجات حرارية تراوحت بين االنتاجي مع حضن الوسط اعاله اتبعت الخطوات الخاليا بالنبذ المرآزي ساعة ثم رسبت 18م وبواقع مكررين لمدة )40،37،30،25، 55،50،45 . وقيست الفعالية االنزيمية وترآيز البروتيندقيقة \دورة 6000بسرعة :بعض الزيوت الى وسط االنتاج في االنتاجية إضافة تأثير -د مل من 5آما ذآر سابقا مع استبدال زيت الزيتون بـ ) Rhan(حضر وسط االنتاج السائل زيت ,زيت الخروع ، زيت الذرة، زيت الكتان ، زيت عباد الشمس,زيت القطن( الزيوت التالية .ي االنتاج مع ثبات بقية مكونات الوسط االنتاجيلمعرفة االفضل ف) جوز الهند : اإلنزيمتنقية - 7 نسب اشباع تراوحت بين تمت تنقية االنزيم بخطوتين تضمنت الترسيب بكبريتات االمونيوم ب ابتداءتدريجيا معينة من آبريتات االمونيوم الى المستخلص الخام أوزان أضيفتحيث ،)% 25-50( 6000ثم نبذ المحلول بسرعة دقيقة 30ام ثلجي مع التحريك المستمر لمدة ووضع في حم% 25من تحت الظروف نفسها % 50دقيقة لمدة ربع ساعة وآررت العملية لتصل نسبة االشباع الى / دورة من المأخوذ اإلنزيمية الديلزة للمحلول يعمل أجريتثم ،رة تم قياس الفعالية االنزيمية وفي آل م يب مقابل الماء المقطر وقيست الفعالية االنزيمية بعد ذلك رآز المحلول بالسكروز و عمليات الترس والذي سبقت موازنته بمحلول DEAE-Sephadex A25مرر عبر عمود المبادل االيوني جمعت اجزاء . ساعة \مل 30وبسرعة جريان 8موالر وبرقم هيدروجيني 0.02الفوسفات الدارئ و استردت البروتينات المرتبطة بالعمود باستخدام تراآيز ملحية ، ل جزء مل لك 5بواقع الفصل موالر وبنفس سرعة الجريان وتم متابعة ترآيز ) 0.5- 0.05(تتراوح من NaClمتدرجة لملح .البروتين وفعالية االنزيم في االجزاء المنفصلة :استخالص االنزيم - 8 حيث نشطت ) Pepper) 2004و Gerba ة من قبلحسب الطريقة المتبع اإلنزيمتم استخالص 8ثم لقح وسط االنتاج المحضر برقم هيدروجيني الخاليا للعزلة المنتخبة بوسط مرق تربتون الصويا بعد ذلك تم ترسيب الخاليا بالنبذ المرآزي المبرد بسرعة ,ساعة 18م لمدة 25وبدرجة حرارة 0.2م بمرشح دقيق 4ائق وتم ترشيحه بدرجة حرارة دقيقة واخذ الر 30دقيقة لمدة \دورة 10.000 .النهائي للمنتجتم قياس الفعالية االنزيمية وترآيز البروتين و مايكروميتر : إنزيمبعض المواد في فعالية تأثير - 9 : المنقى بعض االيونات الفلزية في فعالية االنزيم تأثير -ا +Ni+2 ،1 Ca+2 K،Mg+2 ، Zn ( حضر المحلول الخزين لكلوريدات الفلزات ,+2Ba (ملي موالر ثم حضر منه التراآيز 20بترآيز) ملي موالر بعد تخفيف المحلول الخزين ) 10 حجم وحضن لمدة \حجم)1:1(ثم مزج محلول االنزيم المنقى مع محاليل المواد المذآورة اعاله بنسبة .عدها قدرت الفعالية االنزيمية المتبقيةم في حمام مائي ب25ساعة بدرجة :بعض المواد العضوية في فعالية االنزيم المنقى تأثير - ب Aceton,n- Hexan ,1-penatol ،Tween(استخدمت المذيبات العضوية التالية 80,EDTA ,DTT ( بتراآيز) ثم مزج آل مرآب لكل ترآيز مع لكل منها)% 40،30،20،10 م لمدة 25حجم وحضنت االنابيب بحمام مائي بدرجة \حجم) 1:1(المنقى بنسبة يمياإلنزالمحلول .ساعة وبعد ذلك قدرت الفعالية االنزيمية المتبقية شةالنتائج والمناق ميع هذه العزالت جوآانت Pseudomonasعزلة من بكتريا 12في هذه الدراسة تم انتقاء Donاوتة وانتخبت العزلة االآثر انتاجا وشخصت باالعتماد على الاليبيز بنسب متف إلنزيممنتجة ا القابلية على النمو بدرجة صوية سالبة لصبغة غرام متحرآة لهد انها بكتريا عجفو )2005(واخرون آخرونو عبد الحميد 2013، 450 - 436 ) : 2( 5مجلة ديالى للعلوم الزراعية ، 440 حمر بسبب الى اللون اال Pseudomonas. cepacia agarوتعمل على تحويل وسط م ،42 وزيادة قاعدية الوسط وتحول الكاشف الفينول االحمر Sodium pyruvateقابليتها على استهالك والجيالتينيز وموجبة لفحص االوآسيديز والكاتاليز) .Yu. ،2007وTan (الى اللون االحمر ، Wang (مائلة الى اللون الرمادي Pseudomonasوتكون المستعمرات شاحبة اللون على وسط قابلية العزالت على إنتاج الاليبيز ومن خالل قياس قطر بينت النتائج ان هنالك اختالفا في )2009 تم انتقاء العزلة االآثر انتاجا وشخصت آما ,التحلل للمستعمرات النامية على الوسط االنتاجي الصلب . P5واعطيت الرمز Pseudomonas. cepaciaعلى انها ومقارنة بالعزلة القياسية في اعاله :Quantitative and semi quantitative assay ةوالكمي الغربلة شبه الكمية تميزت اربع استنادا للقيم المستحصلة من قطر منطقة الترسيب المتكونة بفعل ملح الحامض الدهني P5ملم وآانت العزلة ) 3.5-3(ترسيب تتراوح بين أقطار أعطت إذ ، لإلنزيمالعالي بإنتاجهاعزالت واخضعت هذه العزالت للغربلة الكمية وقدرت الفعالية ) 1جدول (ترسيب ذات اعلى قطر لمنطقة ا ل ة زيمالنوعي ة لإلن ن العزل تج م ـ P5المن دة 5.8 ب روتين \وح م ب ة ملغ ة ببقي ة مقارن ى انتاجي ت اعل وآان وفي ضوء هذه ,ملغم بروتين \وحدة) 3.2-2.5(تراوحت بين لإلنزيمحيث اعطت فعالية نوعية العزالت من بقية العزالت في الوسط االنتاجي السائل والصلب لإلنزيماعتبرت العزلة اعاله اغزر انتاجية النتائج يعتبر تفاوت انتاج االنزيم في االوساط االنتاجية الى نوع ومكونات الغذاء الذي له اهمية آبيرة في انتاج , يات المتعددة غير المتايضة بعوامل بيئية مثل وجود مصدر الكربون ووجود السكر تتأثراالنزيمات آما .)1999 ،و اخرون (Jaeger وااليونات لإلنزيم ساعة من الحضن وآانت الفعالية النوعية 2الاليبيز يبدأ إنتاجيته بعد إنزيم إنالنتائج أظهرت ساعة من الحضن حيث بلغت 18بعد أقصاها بلغت أن إلى ملغم بروتين وازدادت تدريجيا \وحدة 1.0 ساعة من الحضن لتصل 72ملغم بروتين ثم بدأت باالنخفاض بعد \وحدة 3.7 لإلنزيمية النوعية الفعال يدخل أنتحصل بعد اإلنتاجية أن إلى أشارتاغلب الدراسات إن). 2شكل(ملغم بروتين \وحدة 0.8 إلى زيم ات اإلن ور الثب ن إن إذط ؤلة ع ات المس اجالجين زيم إنت ور اإلن ذا الط ز به و (Praveenتحف Yasuthisa،2011 (وهذه النتيجة .الاليبيز من مصادر مختلفة إلنزيملمنتجة ا .Pseudomonas sp عزالت بكتريا . 1 جدول رمز ت العزلة اقطار مناطق الترسيب المصدر االسم العلمي في وسط اآار Rhan)ملم( 1 P1 Pseudomonas sp. 2.5 تربة 2 P2 Pseudomonas sp 2.5 ةترب 3 P3 Pseudomonas sp 2.5 نبات البصل 4 P4 Pseudomonas sp 3.0 تربة 5 P5 Pseudomonas cepacia 3.5 ماء 6 P6 Pseudomonas sp 2.0 نبات البصل 7 P7 Pseudomonas sp 2.0 تربة 8 P8 Pseudomonas sp 2.5 تربة 9 P9 Pseudomonas cepacia 2.0 ماء 10 P10 Pseudomonas sp 2.0 )الثمرة(نبات الباذنجان 11 P11 Pseudomonas sp 2.5 ماء 12 P12 Pseudomonas sp 2.8 اوراق الذرة آخرونو عبد الحميد 2013، 450 - 436 ) : 2( 5مجلة ديالى للعلوم الزراعية ، 441 3.0الفعالية النوعية له فكانت .Pseudomonas sp من العزلة اإلنزيمنفس إلنتاجية مقاربة ).2001، وآخرون Lee( الحضنساعة من 18ملغم بروتين بعد \وحدة 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 5 18 24 48 72 دة وح ز يبي لال ة عي نو ال ية عال الف \ ين وت بر م ملغ )ساعة ( مدة الحضن P5 Pseudomonas cepacia من بكتريا الاليبيزتأثـير مـدة الحـضن في أنــتـاج . 2شكل آانت عند الرقم لإلنزيماظهرت ان اعلى انتاجية ) 3(في الشكل ان النتائج الموضحة الهيدروجيني في ثر الرقم يؤ. ملغم بروتين \وحدة 4.5اذ بلغت الفعالية النوعية له 7.5الهيدروجيني في الحالة االيونية للمادة وتأثيرهانتاج االنزيمات بسبب دوره في ذائبية المواد الغذائية في الوسط في نمو ثيرهوتأ ،في ثبات االنزيمات المنتجة تأثيرهفضال عن . االساس وجاهزيتها للكائن النامي الصفار تتفق النتيجة التي حصلنا عليها مع .)Sharma ، 2001 ( لإلنزيماتالبكتريا وانتاجها هو Serratia odoriferaالاليبيز من بكتريا إلنتاجالهيدروجيني االمثل حيث آان الرقم ,)2003( P. fluorescens 7.3 ) Gattiالاليبيز من العزلة إلنتاجآان الرقم الهيدروجيني االمثل . 7.5 Staphylococcusوالرقم الهيدروجينــي االفضل لفعالية االنــزيم المنتج من ) 2010، وآخرون sp. 7(وان االنزيم يمتلك فعالية تجاه مدى واســـع من االرقام الهيدروجينية 8.5-8.0يتراوح بين- 12() Christophe 2000، وآخرون.( آخرونو عبد الحميد 2013، 450 - 436 ) : 2( 5مجلة ديالى للعلوم الزراعية ، 442 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 الرقم الهيدروجيني ن) وتي بر م ملغ / دة وح ز( يبي لال ة عي نو ال ية عال الف .Pseudomonas cepacia P5من الاليبيزتأثير الرقم الهيدروجيني في أنتاج . 3 شكـل االنزيم تزداد بزيادة درجة الحرارة حيث انتاج ان فعالية ) 4(النتائج في الشكل أظهرتآما ملغم بروتين وآانت \وحدة 5.8 لإلنزيم م اذ بلغت الفعالية النوعية 40آانت اعلى انتاجية له عند درجة ملغم \وحدة 2.5ثم انخفضت تدريجيا بزيادة درجة الحرارة الى ان وصلت لإلنتاجيةهي الدرجة المثلى زط في انتاجية ا نزيم الاليبي ـمثب رتأثيلها ةئويم 8ان زيادة درجة الحرارة عن .م 55بروتين عند درجة تج زيم الاليبيز التثبيط سريعًا أل يكون ، في حين Ps. fragiو Ps. fluorescensمن المن ن Saxena ( ةمئوي درجة 20عند درجة B. subtilisالمنتج من (Subtitles)بوجود انزيم البروتييز رون ح . )Boris ،2010و Brain ; 1999، وآخ ا يتض ري أن أمم ز البكتي زيم الاليبي بن ود يث ط بوج و Claiver (ئوي م) 40-30(عند ارتفاع درجة الحرارة الى التأثيرد انزيمات البروتييزات ويزدا Gregory ،2001( ربما يعود الى عدم مالئمة درجة الحرارة لنمو لإلنزيمان انخفاض الفعالية النوعية عن المجهرية األحياء من اإلنزيم إنتاج مهم في لدرجة الحرارة دور إنحيث .اإلنزيم البكتريا وانتاج يؤدي الى زيادة الطاقة الحرآية مما ,في ذائبية االوآسجين والطاقة الحرآية للجزيئات تأثيرها ريق ط ـ األساسوالمادة لإلنزيم م يؤدي الى تحطيم 50ويزيد من سرعة التفاعل الكيميائي لكن زيادتها عن ال ان درجة تباط بالمادة االساس وبذلك يفقد قابليته على االر لإلنزيم شكل الثالثي لل االواصر التساهمية و Lee(م 50هي . Bacillus stearothermophilusالاليبيز من العزلة إلنتاج الحرارة المثلى Deininger ،2001 .( آخرونو عبد الحميد 2013، 450 - 436 ) : 2( 5مجلة ديالى للعلوم الزراعية ، 443 0 1 2 3 4 5 6 7 25 30 37 40 45 50 55 درجات الحرارة (م) ن) وتي بر م ملغ / دة وح ز( يبي لال ة عي نو ال ية عال الف Pseudomonas العزلة الاليبيز من تأثير درجات الحرارة المختلفة في إنتاج . 4شكـل cepacia P5 . ائج ة )2(دول جبينت النت ة لاليبيز من العزل .Pseudomonas cepacia p5الى ان افضل انتاجي د اضافة ة % 5تكون عن 5.5 لإلنزيممن زيت الكتان الى الوسط الزرعي حيث بلغت الفعالية النوعي يؤدي الى االسراع لاليض إن توفر المواد المغذية االسـاسية في الوسط وجاهزيتها ،ملغم بروتين \وحدة ـتفادة من المواد الغذائية ) . 1987الخفاجي ،( في النمو ولكي تســتطيع خاليا االحياء المجهرية االســـ دة االمعق وم فإنه اجتق ـو بإنت ـن النمـــ ا مــــ تمكن الخالي ي ت ة لك ات المحلل ن االنزيم ـديد م اجدي (الع س اقر، أثر ، )1987والب ة تت ز إنتاجي ا يمإن ة منه ل بيئي دة عوام ز بع ود ( الاليبي اربون ووج ادر الك مص أظهرت الزيوت النباتية لقد )1999، وآخرون Jaeger ()المتعددة غير المتايضة وااليوناتالسكريات و B. licheniformisط الاليبيز المنتج من يب ثدور في ت ) زيت الزبد و زيت الذرة وزيت الزيتون ( Staphylococcus sp. . زيت الزيوت وزيت بذور القطن( في حين تحفـــز ثالثي الكليسريدات ( . زيوت مختلفة الى وسط الران بدل زيت الزيتون على فعالية انزيم الاليبيز إضافة تأثير . 2 جدول اسم الزيت المضاف للوسط الزرعي الكمية )مل( بروتين ملغم \وحدة الفعالية النوعية لاليبيز عينة سيطرة oil Olive 5 4.5يتون الززيت Cotton oil 5 2.1زيت القطن مس اد الش ت عب زي Sunflower oil 5 3.6 Linseed oil 5 5.5زيت الكتان Castor oil 5 1.9زيت الخروع Coconut زيت جوز الهند oil 5 2.9 Corn oil 5 4.3 لذرةزيت ا آخرونو عبد الحميد 2013، 450 - 436 ) : 2( 5مجلة ديالى للعلوم الزراعية ، 444 في حين آان Ps. mephiticaالاليبيز المنتج من ) االوليك واللينوليك واللينولنيك (الدهنيــة واألحماض ا إنتاجيةفي األفضلزيت النخيل وزيت الزيتون Bacillus stearothermophilus الاليبيز من بكتري تبر وجود زيت الخردل عا ). Deininger2001 و Lee ( من الثاني أفضل إنتاجية األول وأعطى ا إنتاجفي األفضل اإلنتاجفي وسط إنزيمية فعالية أعطى حيث pseudomonas spالاليبيز من بكتري ) Rathi ،2000 ( الاليبيز إلنتاج حيث يوفر الظروف المالئمة .ملغم بروتين |وحدة 411.مقدارها وزيت عباد آما استخدم زيت الكتان وزيت الخردل وزيت جوز الهند وزيت الخروع وزيت النخيل زيت الخردل وأعطى Pseudomonas cepaciaالاليبيز من بكتريا إلنتاجالشمس وزيت فول الصويا ). 2010، وآخرون Syed( يليه زيت فول الصويا لإلنزيمفعالية أعلى مل \وحدة 13 ة مقدارها انزيمي ان الترسيب بكبريتات سجل فعالية ) 3(بينت النتائج في جدول استخدمت هذه الخطوة آخطوة اولية . مرة 2.9وبعدد مرات تنقية % 40.8يلة انزيمية مقدارها وبحص وتلت هذه الخطوة عملية الديلزة ثم Pseudomonas cepaciaلتنقية الاليبيز من العزلة البكتيرية عمود خطوة الترشيح الهالمي باستخدام بإضافةالترآيز بالسكروز واستكملت عملية تنقية االنزيم DEAE- Sephadex A25 حيث ترآزت الفعالية )5شكل (ونتج عن هذه الخطوة قمتان للبروتين % 36.6مرة وبحصيلة انزيمية 7.9وبعدد مرات تنقية مل \وحدة 35االنزيمية في القمة الثانية اذ بلغت ولقد ،االيوني دلان هذا يدل على ارتباط االنزيم الذي يحمل شحنة سالبة بالمجاميع الموجبة للمبا. وKazluskas (استخدم هذا المبادل لما يمتلكه من قدرة عالية على الفصل ولسهولة تحضيره Bornscheuer ،2006 ( ولقد أستخدمت عدة طرائق لتنقية أنزيم الاليبيز من مصادر مختلفة DEAE-Cellulose آل من آروماتوغرافيا التبادل االيوني استخداممن البكتريا ، تضمنت وباألخص . ) Sephadex G-150 .) Budhiraja،2004والترشيح الهالمي باستخدام عمود تأثيرهامع تراآيز معينة من ايونات لفلزات مختلفة، لوحظ تفاوت في اإلنزيمعند حضن ) 4( يبين جدول تأثيرتباين لىإالنتائج أشارتحيث Pseudomonas cepaciaP5 المنقى من العزلة اإلنزيمفي فعالية زيادة الفعالية إلى أدت Mg+2 ، Ca+2، Ba+2 ايونات أن إلىو لوحظ ، اإلنزيمااليونات في فعالية إلى Ni+2و Zn+2و +Kايونات أدتعلى التوالي بينما % 135، %150، % 130بنسبة اإلنزيمية ويمكن أن يعزى .مع عينة السيطرة على التوالي مقارنة% 5و %25و% 10 إلى اإلنزيميةتثبيط الفعالية والبوتاسيوم) (Zn+2االيونات الفلزية المكونة للملح آالخارصين تأثير إلىاالنخفاض في فعالية الاليبيز K) ( إذ تتفاعل االيونات الموجبـة الثقيلة مع مجاميع السلفهايدرل الحرة اإلنزيم، في ترآيب(-SH) لنشاطه اإلنزيممما ينتج عنه فقدان لإلنزيمي الموقع الفعال ومجاميع االميدازول والكاربوآسيل ف Budhiraja) ، 2004 . ( . Pseudomonas cepaciaالمنتج من خاليا العزلة المحلية الاليبيز خطوات تنقية أنزيم 3 .جدول آخرونو عبد الحميد 2013، 450 - 436 ) : 2( 5مجلة ديالى للعلوم الزراعية ، 445 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 2 4 6 8 10 12 14 ي وج لم ل ا طو ال لى ع ص صا مت اال 50 0 ر ميت نو نا - ة مي زي ألن ة ا الي فع ال ) ة حد و / تر ليل م ي ) وج لم ل ا طو ال لى ع ص صا مت اال 28 0 تر مي نو نا ) ين وت بر ( رقم الجزء المنفصل ترآيز البروتين Pseudomonasمن بكتريا الاليبيز آروماتوآرافيا التبادل األيوني لتنقية أنزيم . 5 شكل cepaciaP5 عمود التبادل األيونيباستخدام DEAE sephadex A25 (15 × 1.5) سم ثم االسترداد (8.6)الفوسفات ذي الرقم الهيدروجيني دارئمولر (0.02)الذي تمت موازنته بمحلول مولر برقم Step wiseبطريقة الـ ) 0.4، 0.2،0.3، 0.1 ،0.05محاليل متدرجة القوة األيونية ب .) مللتر 5: حجم الجزء. ( ساعة / مللتر 30سرعة الجريان , (8.6)هيدروجيني ، فااليون قد يغير من االتجاه لإلنزيمالتي تعمل بها االيونات الموجبة والسالبة المنشطة وتختلف اآللية ) 2000 ،المنسي والشريدة ( ساس واالنزيم بين مادة االالفراغي للبروتين لكي يسمح لالرتباط الصحيح تزداد بمقدار اربع مرات دلالمحلل لزيت الخر Ps. aeruginosaإن فعالية أنزيم الاليبيز المنتج من . الى زيادة الفعالية االنزيمية Ba +2لقد ادت ايونات . ) 2010،واخرون Syed ( ايون الكالسيومبوجود الى تثبيط 2Zn Cu +2+على حين ادت ايونات Burkholderia spيبيز المنقى من العزلة الال إلنزيم .) Armk ، 2003 و(Pseudomonas sp . Diaz.فعالية الاليبيز المنقى من العزلة Pseudomonas تأثير األيونات الفلزية في فعالية االاليبيز المنقى جزئيا من العزلة . 4جدول cepacia P5 . %الفعالية المتبقية )ملي موالر(الترآيز المادة 130 10 MgSO4 135 10 BaCl2 150 10 CaCl2 10 10 KCl 25 10 ZnSO4 5 10 NiCl2 عند حضنه مع مرآب الية انزيم الاليبيز قيد الدراسةفع انخفاض) 5(وتبين نتائج الجدول pentanol و DTT ,Acetone على التوالي)% 35و10و10.2 (ملي موالري الى 20بترآيز آخرونو عبد الحميد 2013، 450 - 436 ) : 2( 5مجلة ديالى للعلوم الزراعية ، 446 على حين زادت n-Hexanو EDTA ملي موالر من 20بينما احتفظ بكامل فعاليته عند حضنه مع العوامل تأثيرويمكن تفسير . Tween80 عند حضنه مع نفس الترآيز من مرآب% 145فعاليته الى وذلك عن طريق آسرها (S-S)ثنائية الكبريتيد لألواصر اختزالهاالمختزلة في فعالية االنزيم من خالل عند معاملته اإلنزيم تأثيرأن عدم . )Budhiraja، 2004 ( وتغير ترآيب االنزيم وبالتالي فقدان فعاليته والتي تمتاز بأن أيون الفلز (metalloenzyme)يؤآد أنه ليس من االنزيمات الفلزية EDTAبالـ عليه في فعاليته ، حيث تقوم العوامل الكالبية عند يعتمد لإلنزيمأساسيًا في الموقع الفعال يشكل مرآبا وآخرون Colla (.فعالية االنزيماضافتها بتكوين معقدات مع ايون الفلز وازالته مما يؤدي الى تثبيط Staphylococcusأن الاليبيز المنتج من بكتريا إلى ) 2004( Yuو Tanلقد توصل،)2009، aureus فعاليته عند اضافة تتأثر الEDTA تدل هذه النتائج على أن االنزيم يحتوي الى وسط التفاعل بالمواد المختزلة أي انه من أنزيمات الاليبيزات الثايولية ولتأثره (SH-)على مجموعة السلفهايدريل (Thio Lipases) . زات المنتجة من الاليبي إنزيمات تأثر أخرىوقد أثبتت دراسات Staphylococcus. aureus عند ) اثيون مرآبتوأيثانول والسستاين والكلوت( بالعوامل المختزلة مثل . 2012) ، وآخرون ( Tembhurkar %5بترآيز استخدامها حضن االنزيم مع العوامل الكالبية والمختزلة في فعالية االنزيم المنقى بعض ر تأثي. 5 جدول . تجاه زيت الكتان وقدرت الفعاليةدقيقة 20 مئوي لمدة 40ادة التفاعل بدرجة محلول م المصادر Leuconostocتطوير أنتاج الدآستران من بكتريا . 1997. الخزرجي ، سندس لطيف mesenteroides جامعة بغداد . آلية العلوم . رسالة ماجستير . المعزولة محليًا . . و البحث العلمي وزارة التعليم العالي .الفعاليات الحيوية للبكتريا . 1987 .لخفاجي ، زهرة محمود ا .دجامعة بغدا ا نتاج وتوصيف انزيم الاليبيز من عزالت محلية لبكتريا. 2003 .الصفار ، منتهى عبدا لكريم Serratia odoriferia .جامعة بغداد. آلية العلوم .راه دآتو اطروحة. آخرونو عبد الحميد 2013، 450 - 436 ) : 2( 5مجلة ديالى للعلوم الزراعية ، 447 الجــزء ( المايكروبايولوجي الصناعي . 1987 . ساجدي ، عادل جورج و الباقر ، عالء يحيى .مطبعة جامعة البصرة . أساسيات التخمرات الصناعية ) االول وزارة. )1(ـــاء الحيوية مقدمة في الكيمي. 2000 .المنسي ، عرسـان ارشد والشريدة ، محمد شريف .مطبعة جامعة الموصل. والبحث العلمي التعليم العالي Adham.M.A.2003.Purification and partial characterization of psychotrophic Serratia marcescens lipase .Diary Science . 70:248-250. Acikel,U.M. , M. and M. Ersan.2011.Effects of composition growth medium and fermentation conditions on producer lipase by Rizopus delemar .Turk Biol. 35:33-45. Bradford ,M.M. 1976 . A rapid and Sensitive Method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding . Analytical Biochemistry 72:248-254. Brain,W. and,H. Boris .2010. Colorimetric quantitative of lipid from algal culture .Microbiol .methods 80:(3).262-266. Bornsche,T and J Kazlauskas.2006. Hydrolyses in organic synthesis 2nd ed .Wiley-VC verlag .ISBN.-527-531. Budhiraja,R.P.2004.Separation chemistry ,New age international(P) Ltd.ISBN.13:978-98 . Christophe,M., M. Angela and T. Keith. 2000. Identification of second lipase gene in E.coli and Staphylococcus epidermidis .Microbio.146(6): 1419-1427. Claivre ,V. and,Z. Gregore, . 2001. Hyper thermophilic enzymes :source, uses and molecular mechanisms for thermo stability .Microbiol. and Molecular. 65(1):1-43. Colla, M.,C.S.Rezzadori, J.Debon,M.Tibolla and J.Costa .2009. A solid state bioprocess for selection lipase- producing filamentous fungi .National institute of health Pup- med .Index of medline. David,N. and,C Mechael. 2004. Principle of biochemistry 4th ed .Prentice Hall .New York. Didier ,R. 2010. Cltematic bainical microbiology and infection. Microbiol. 17(107). Diaz,B .and ,J.P. Arm.2003. Several other types of lipase activities exist in nature .Enzymology .531(2):38-46. Don,J.B.,R.K.,Noel and T.S. James. 2005. Berge's manual of systematic bacteriology 2nd ed Press Hall .New York. Dura, M.A.,M.Flores and F. Toldera.2002.Purification and characterization of glutaminase from Debaromyces sp. J. Food Microbiology.76:117- 126. آخرونو عبد الحميد 2013، 450 - 436 ) : 2( 5مجلة ديالى للعلوم الزراعية ، 448 Gatti,L.P.,A.R. Natalello and M. Lotti .2010. Evolution of stability in ocold – active enzyme elitics specificity relaxation and high lighted substrate related effects on temperature adaptation .Bacteriology. and Bioscience .2(1):212-216. Gerba,C.P. and I.L .Pepper. 2004. Environmental microbiology. MICR Press.USA. Jan,W.,F.A.Simons and H.Adams .2004. The lipase from Staphylococcus aureus .Biotechnol.242(3): 760- 769. Jennifer, L.P. and G.S .Doug . 2001. Diversity of the Burkholderla cepacia complex and implications for flask assessment of biological control strains . J.annurev.phyto.39:225-258. Jewell,S. N. 2000 . Purification and characterization of novel protease from B urkholderia strain 2.2Nmaster thesis submitted to the department of biology,state university ,Blacksburg,VA . Jaeger, K.E., B.W. Dijkstra and M.T. Reetz. 1999 . Bacterial Biocatalysts: Molecular Biology., Three Dimensional Structure and Biotechnological Applications of lipases. Annu. Rev. Microbiol. 53: 315-351 . Kulkarni, N. and R.V. Gadre.1999 . A novel alkaline . thermostable, protease . free lipase from Pseudomonas sp. Biotechnology Letters. 21(10): 897-899. Lee ,J.and R.A .Deininger.2004.Rapid detection microbes methods in beach water .J. Luminescence.19:31-36. Matthew,A.R.,C.Wolfgang and J.J. Mekalanos. 2004.Effect of metabolic of. imbalance on gene type III secretion genes in Pseudomonas aeruginosa J.Infection and Immunol.72(3):1383-1390. Praveen,K.and A.Yasuthisa.2011.Strategies for discovery and improve of enzyme function :state of art and opportunities J.Microbiol.Technol.5(33):1-18. Rathi,P., R.K.Saena, R.Gupta . 2001 . Ahyperthermostable ,alkaline lipase from lipase from Pseudomonas cepacia with the property of thermal activation . Biotechnol..Lett.22:495-498. Saxena, R.K., P.K., R. W. , Davidson, S. Bradoo and R. Gulati. 1999 . Microbial Lipases: Potential Biocatalysts for the future industry. Current Science. 77(1): 101-151. Selina,S.C.,M.D. Chen and W.Russell .2012. Pseudomonas sp. infection. Microbiol.18(20). Sharma, S. and Gupta, M.N. 2001 . Alginate as a macroaffinity ligand and an additive for enhanced activity and thermostability of lipases. Biotechnol. Appl. Biochem. 33(part 3): 161-165. Singer,B.G. and ,P.M Skarina. 2008 . Functional and structure characterization of four Glutaminase from E coli and Bacillus subtilis. J.Chem.Biol.1:75-86. آخرونو عبد الحميد 2013، 450 - 436 ) : 2( 5مجلة ديالى للعلوم الزراعية ، 449 Syed,M.N., S.B. Iqbal,S.,Bano,S.Khan and A.Shah .2010. Purification and characterization of 60 KD lipase linked with chaperonin from Pseudomonase aeruginosa BN-1. African J. Biotehnol. 9(45):7724-7732 Tan T. and M. Yu . 2007 . Purification and characterization of extracellular lipase Lip2 fromYarrowia lipolytica .Process Biochemistry . 42(3):38- 391. Tembhurkar,V.R.,M.B. Kulkarni . and S.A. Peshwe . 2012 . Optimization of lipase production by Pseudomonas spp. Submerged batch process in shake flask culture. Since .Research report .2(1):46-50. Venil,C.K.2009. Statistical optimization on medium component for the producer of lipase by Serratia marcescens Microbiol.7(1)498-506. Wang X, Yu X ,Xu .2009 . Homologous expression ,purification and characterization of novel high alkaline and thermal stabile lipasefrom Burkholderia cepacia ATCC 25416 .J.Enzmol Microbiol.Technol.45(2):94-102) Wigfield ,S.M., G.P.Rigg,M.Kavari, . andJ.P. Burine 2002 . Identification of immunodominat Drug efflux pump in Pseudomonas cepacia .J.Antimicrob.AGE.Chem.49:619-62. Yuan,L.,I.Kurek, J.Engilish and K.Robert .2005. Laboratory directed protein evolution .Microbiol.anaMolecul.69(3):373-392. آخرونو عبد الحميد 2013، 450 - 436 ) : 2( 5مجلة ديالى للعلوم الزراعية ، 450 PRODUCTION AND PURIFICATION OF EXTRA CELLULAR LIPASE FROM PSEUDOMONAS CEPACIA AND STUDY THE PARTIALCHARACTERIZATION . Alyaa M.Abdelhameed* Mohamed K. Kither * Minna.S.Farmman** *Biology Dept. - College of Science - University of Diyala- Republic of Iraq. **Biology Dept. - College of Science - University of Anbar - Republic of Iraq. ABSTRACT Twelve isolates of Pseudomonas were obtained from thirty five(34%) from different species soil ,plants and river s water in al Muqdadia fields .Ability of lipase production by these isolates was screened Pseudomonas P5 was highest lipase producer identified as Pseudomonas cepacia . Lipase production conditions were studied .the highest production of lipase was observed when mineral medium containing 5% linseed oil inculcated with bacterial cells e ,ph 7.5 and incubated at40 c in shaking incubator120 r.p.m for 18 hr. Lipase was purified from bacterial cells by two steps including precipitation with ammonium sulfate and Ion exchange chromatography by DEAE- Sephadex-A25, fold of purification was 35 U\ml with 36.5% enzyme recovery . The effect of some metal ions on lipase activity was studied .The Ca+2 increased lipase activity to 150%. The effect of specific substances on enzyme activity was investigated ,The result showed that Tween80 raised lipase activity to 145%. Key words : Inhibitors Pseudomonas cepacia ,Lipase enzyme ,Characterization,