ابراهيم وعلوان 8023، 28 – 37(: عدد خاص)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 37 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ بطريقة النشر والطمر في L. Withania somniferaتأثير كثافات زراعة المعلقات الخلوية لنبات تكوين بادئات الكالس بتول محمد علوان 1مثنى محمد ابراهيم .، العراقجامعة ديالى ،كلية التربية للعلوم الصرفة sadeh1970@gmail.com المسؤول عن النشر: 2 المستخلص ات الفلقية لبادرنجحت الدراسة من إنشاء مزارع المعلقات الخلوية المشتقة من كالس السيقان تحت 1-لتر ملغم 3.0الصلب المضاف اليه MSالمستحث في وسط L. Withania somniferaنبات الوذانيا D-2,4 1-لتر ملغم 0.5متداخال مع Kin( 8.07, 2.39, 8..2, 2.0. وأظهرت زراعة كثافات مختلفة × ) الصلب MSمن هذه المعلقات بطريقة النشر وطريقة الطمر بطبقة االكار بوجود وسط 3-سم خلية 4 20 تفوقت طريقة الزراعة بالنشر على طريقة Kin 2-لتر ملغم D-2,4 +0.5 2-لتر ملغم 7.0المدعم بتراكيز المستعمراتد بلغت اعداد فق ،أعداد منشآت الكالس المتكون منهاالطمر في اعداد المستعمرات الخلوية و بالمقارنة مع كثافة األنشاء 7-سم خلية 4 20× 8.07عند زراعة الكثافة 2-طبق مستعمرة 00..83 الخلوية في حين بلغت اعداد هذه المستعمرات بطريقة الطمر ،في طريقة النشر 2-طبق مستعمرة .2.28التي بلغت 20.400نشاء التي بلغت ع كثافة اإلعند زراعة الكثافة ذاتها وبالمقارنة م 2-طبق مستعمرة 82.400 2.وتفوقت الكثافة العالية معنويا على باقي الكثافات وقد أعطت منشآت كالس بلغ عددها ،2-طبق مستعمرة من زراعة ايوم 25منشآ بعد .وبلغ عددها ،من زراعة الخاليا المعلقة بطريقة النشر ايوم 80منشآ بعد الخاليا المعلقة بطريقة الطمر. .Callus ,suspension Cell ,Withania somnifera:الكلمات المفتاحية المقدمة منتشرة في ،نوعا 3000جنسا والتي تشمل حوالي 84من Solanoaceaeتتألف العائلة الباذنجانية Withania( ومنها نبات الوذانيا Hunziker,2001جميع أنحاء العالم وعادة ما تكون شجيرات سنوية ) somnifera إوالذي يعرف ب( سم اشواجنداAdhikari وPant ،2013)، الذي يعد من النباتات الطبية وللنبات عدة ،سنة 3000المهمة التي استخدمت في الطب الهندي القديم من قبل السكان االصليين ألكثر من نتيجة تشابه الخصائص العالجية ما بين ،وأطلق عليها أسم الجينسنغ الهندي Winter chirryتسميات منها استخدم مستخلص األوراق في الطب و ،2009) ،وآخرون Mirjalili) جذور الجينسنغ وجذور االشواجندا كمضاد لألكسدة ومعزز للجهاز المناعي الى جنب ،( 2015 ،وآخرون Kanungoاأليورفيدي في الهند ) بة أشارت األبحاث الى أن هذه العشوقرار نسبة السكر في الدم وخفض مستويات الكولسترول. تعزيزه است ر وتحد من تدهو ،فعالة في زيادة الذاكرة وزيادة القدرة على االستيعاب وتحسين ردود األفعال الالإرادية هايمر والشلل كأمراض الز المرضية، حاالتاللذا فهي فعالة في المساعدة في عالج بعض ،خاليا المخ ب جانبية بالنسبة لألفراد الذين يعانون من التع ا وجد أن لها أثارو ،والرعاش والتدهور العقلي المرتبط بالسن Mir 2010; ،وآخرون Chimire 2004; ،وآخرون Siddiqueواإلجهاد أو األفكار السلبية المستمرة ) ويعزى الطعم المر والرائحة المميزة لنبات األشواجندا والتأثير الفسلجي الى وجود ،(2014 ،وآخرون (. وتتواجد ايضا في 2004 ،وآخرون Mohanty) Steroidal lactoneبعض األكتونات الستيرويدية والتي تعالج أمراض والم Somniferineو Withanineأوراق وجذور النبات العديد من القلويدات أهمها (.Shukla ،8028وShukla ) ورام والقرحة وغيرهااأل 9/11/6112استالم البحث: 62/6/6112قبول النشر: http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ mailto:sadeh1970@gmail.com ابراهيم وعلوان 8023، 28 – 37(: عدد خاص)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 34 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ تمثل المعلقات الخلوية نظاما للمزارع الخلوية التي توجد في حالة عشوائية تماما عند زراعتها في تتكون من مجموعة خاليا تشتق من الكالس الهش او من النسيج المتوسط ،الوسط الغذائي السائل المتحرك كالس الهش ويفضل ال ،القدرة على النمو والقيام بالفعاليات االيضية المختلفة وتمتلك هذه الخاليا ،لألوراق غير المتماسك والسريع النمو في انشاء مزارع المعلقات الخلوية الن خالياه يسهل تفككها الى خاليا احادية كثافة الخاليا ويعتمد نجاح هذه التقانة على ،(2004 ،بواسطة التحريك في الوسط الغذائي السائل )الجواري (.2006 ،المزروعة ونوع الوسط الزراعي المستخدم )رشيد وقاسم تهدف الدراسة الحالية الى أنشاء مزارع المعلقات الخلوية المشتقة من الكالس وزراعتها بطريقتي النشر والطمر والحصول على الكالس المشتق من المعلقات الخلوية. ق البحثائالمواد وطر النباتيةالمادة بتركيز 3GAساعة في حامض الجبرلين 24لمدة Withania somniferaنقعت بذورنبات الوذانيا وعقمت سطحيا بغمر البذور في محلول ،(Siddiqui ،2014و Niyazلزيادة نسبة انباتها ) 1-لتر ملغم 500 حجم مادة معقمة: 1بنسبة %6القاصر في االسواق المحلية( بتركيز )NaOCl هايبوكلورايت الصوديوم دقائق 5ومن ثم غسلت البذور بالماء المعقم ثالث مرات بمعدل ،دقيقة مع الرج 15حجم ماء معقم لمدة 1 ( وجففت البذور المعقمة من الماء 2013 ،وآخرون Udayakumarزالة اثار المادة المعقمة )إل 2-مرة الصلب MSمل من وسط 20وزرعت البذور على سطح ،العالق بها بوضعها على ورق ترشيح معقم وحفظت العينات ،2-قنينة مل وبمعدل خمس بذور 250الخالي من منظمات النمو في قناني زجاجية حجم 8وء ضـة ـساع 16وء والظالم المتعاقب ـنبات نقلت الى نظام الضوعند بدأ اإل ،أيام 4في الظالم لمدة من البادرات المعقمة Hypocotylلوكس. فصلت السيقان تحت الفلقية 2000ضاءة إظالم وشدة 2-ساعة مل من وسط 20مل تحوي 100ثم نقلت الى قنان زجاجية حجم ،قطعة سم 1.0أسابيع وبطول 3بعمر اعتمادا على تجارب Kin 1-لتر ملغم D-2,4 +0.5 1-لتر ملغم 3.0المدعم بأفضل تركيز MSستحثاث اال غير منشورة(.ولية )نتائج أ تقة من كالس السيقان تحت الفلقيةمزارع المعلقات الخلوية المش مـملغ 7.0 المدعم بتراكيز MSاستخدم الكالس الهش المشتق من السيقان تحت الفلقية )على وسط غم تقريبا الى 1نشاء المعلقات الخلوية بنقل قطع الكالس بوزن ( إلKin 2-لتر ملغم D-2,4 +0.5 2-لتر المدعم بأفضل تداخل من منظمات MSمل من الوسط السائل 50مل تحوي 250دوارق زجاجية سعة وحضنت العينات في الحاضنة ،(Kin 1-لتر ملغم D-2,4 +0.5 1-لتر ملغم 3.0النمو ألستحثاث الكالس ) في ظروف ظالم تام مْ 28وبدرجة حرارة 2-دورة دقيقة 150بسرعة incubator Shakingالهزازة plan)امايكرومتر 46يعقبها امرار المزرعة المتكونة من منخل دقيق معقم حجم فتحاته ،ساعة 24لمدة Genet. Manipulation on Lab. Nott .U.K) لعزل الخاليا المفردة والتخلص من الكتل الخلوية , فس تراكيز منظمات النمو السابقة بعد واعيد تعليق هذه الخاليا في وسط غذائي جديد مدعم بن ،المتجمعة السماح بركود واستقرار خاليا المعلق الخلوي داخل كابينة الزرع لمدة ساعة والتخلص من الوسط السائل ( وأعيدت المزرعة الى الحاضنة لغرض نمو Dixon ,1985بسكبه بعناية دون فقد للخاليا الراكدة ) المزرعة بالظروف السابقة نفسها. http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ ابراهيم وعلوان 8023، 28 – 37(: عدد خاص)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 3. http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ كثافات مزارع المعلقات الخلوية رتقدي ساعة من التحضين 72و 48 و 24مل من مزرعة المعلقات الخلوية بعد مضي 1.0أخذت عينة بحجم .Lab. Wفضال عن كثافة االنشاء )المرحلة الصفرية( ووضعت على شريحة الهيموسايتوميتر ) Germany أعدادها مع عمر المزرعة ونشاط انقسامها وتحديد كثافة وزيادة( للتعرف على نمو الخاليا مل وتقدير العدد 1مزرعة المعلق الخلوي عند كل مرحلة عمرية وذلك من خالل حساب عدد الخاليا في .لى مسار نموهاالكلي للخاليا في المزرعة بكاملها وتمت متابعة هذه المزارع للتعرف ع عة المعلقات الخلويةزرا المعلقات الخلوية بكثافات مختلفة نفذت تجربة بسيطة بالتصميم العشوائي الكامل وبعشرة لزراعة جراء مقارنة الفروق بين المعامالت وفقا الختبار دنكن إة خلوية من الخاليا المعلقة وتم مكررات لكل كثاف للزراعة كل استخدمت طريقتان، و(.Felipe، 800و Victor) .0.0متعدد الحدود عند مستوى احتمال ال على حدة هما: Cell plating method طريقة النشر ( مع بعض التحوير على أطباق 1960) Bedrgmannاستعملت طريقة النشر الموصوفة من قبل إذ ،Kin 1-لتر ملغم D-2,4 +0.5 1-لتر ملغم 3.0الصلب المدعم بتركيز MSبتري حاوية على وسط 1.52و 104 × 1.0 بكثافات مل من مزارع المعلقات الخلوية المشتقة من كالس السيقان تحت الفلقية 10أخذ مل وزرع 1.0وسحب منها بواسطة ماصة معقمة حجم ،3-خلية سم 104× 2.03 و 104 × 1.79 و 104× المدعم بالتراكيز اعاله والموزع بشكل طبقة رقيقة في اطباق بتري بالستيكية حجم MSبنشره على وسط سم. غطيت االطباق بأغطيتها وحركت بشكل دائري على سطح المنضدة لضمان توزيع المعلق بشكل 9 م وغطيت بورق 25متساوي على سطح الوسط ثم سدت بالبارافيلم وحفظت في غرفة النمو بدرجة حرارة غرض تقليل شدة االضاءة. أبيض ل Array methodطريقة الطمر مل من مزرعة المعلق 10( إذ أخذ Dixon ،1985استعملت طريقة الطمر الموصوفة من قبل ) . 3-سم خلية 104 × 2.03 و 104 × 1.79 و 104× 1.52 و 104 × 1.0الخلوي للسيقان تحت الفلقية بكثافة وأخذ الراسب من الخاليا ومزج بعناية مع 2-دورة دقيقة 1000رسبت الخاليا بطردها مركزيا عند سرعة كار والمصلب باآل Kin 1-لتر ملغم D-2,4 +0.5 1-لتر ملغم 3.0المدعم بتركيز MSمل من وسط 10 ،مْ 45والمعقم مسبقا والمحافظ عليه بحالته السائلة بوضعه في حمام مائي بدرجة حرارة %3بتركيز سم بشكل 9مزج المعلق الخلوي والوسط مزجا جيدا ثم صب الوسط بعناية في اطباق بتري بالستيكية قطر ا وسدت هطبقة رقيقة وتركت االطباق في كابينة الزراعة لحين تصلب الوسط ثم غطيت االطباق بأغطيت م ْ 25بالبارافيلم وغطيت بورق أبيض لغرض تقليل شدة االضاءة وحفظت في غرفة النمو بدرجة حرارة ظالم. 2-ساعة 8ساعة ضوء 16وبتعاقب ضوئي 24فحصت خاليا المعلقات الخلوية المزروعة في األطباق لكل من طريقة النشر وطريقة الطمر بعد المجهر الضوئي االعتيادي لتحديد بداية دخول الخاليا في انقسامها األول ستخدام اساعة من زراعتها ب سجيل البيانات ،نقسام حتى تكوين المستعمرات البنوية التي تعطي الحقا منشآت الكالسومتابعة مواصلتها لإل كن يم لسلعدد المستعمرات الخلوية وعدد منشآت الكالس ومتابعتها حتى تطورها الى قطع صغيرة من الكا . مشاهدتها بالعين المجردة http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ ابراهيم وعلوان 8023، 28 – 37(: عدد خاص)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 3. http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ نقل منشآت الكالس وادامتها ها حجما الطمر( عند بلوغالنشر وريقتين )نقلت قطع الكالس المتكونة من زراعة المعلقات الخلوية بالط المدعم MSمل من الوسط الغذائي الصلب 25بقدر حجم حبة العدس( بواسطة ملقط معقم الى سطح مناسبا ) مل لغرض نموه 500في قناني زجاجية بحجم Kin 1-لتر ملغم D-2,4 +0.5 1-لتر ملغم 3.0بتركيز تم تسجيل اعداد القطع التي تم نقلها ومعدالت نمو الكالس وعدد العينات الميته والصفات الوصفية ،واكثاره بعد شهر من الزراعة. المشتملة على اللون والقوامية النتائج والمناقشة النموذجية المستحثة من كالس السيقان تحت الفلقية المعلقات الخلوية Kin 1-لتر ملغم D-2,4 +0.5 1-لتر ملغم 3.0السائل + MSأكدت النتائج أن وسط األستحثاث أظهر مالئمته إلنشاء مزارع المعلقات الخلوية المشتقة من كالس السيقان تحت الفلقية إذ أحتوت مزارع حو فقد شجع هذا الوسط على ن ،المعلقات الخلوية على أعداد كبيرة من الخاليا المفردة وغياب الكتل الخلوي ق وزيادة كثافة مزرعة المعلق الخلوي ساعة من التعلي 24نقسام األول بعد واضح نمو خالياها ومباشرتها اإل ( 1نقساماتها متخذة نمطا تدريجيا في نموها )شكلإلتواصل ،(3-سم خلية 4 10× 1.0قياسا الى كثافة إنشائها ) في اليوم الرابع من إنشائها. 7-سم ( خلية4 10× 2.03إذ بلغت كثافتها ) Withania منحنى نمو خاليا المعلقات الخلوية المشتقة من الكالس الهش للسيقان تحت الفلقية لنبات .1 الشكل somnifera سلوك المعلقات الخلوية ونواتجها عند زراعتها بطريقة النشر أظهرت نتائج زراعة كثافات متباينة من المعلقات الخلوية المشتقة من كالس السيقان تحت الفلقية تباينا في ،Kin 1-لتر ملغم D-2,4 +0.5 1-لتر ملغم 3.0المدعم بإضافة MSالنشر بوجود وسط بطريقة 2.03إذ سجلت زراعة الكثافة (1الجدول )أعداد المستعمرات الخلوية المتكونة ونواتجها من منشآت الكالس ممثلة أعلى المعدالت 2-طبق مستعمرة 27.600أعلى معدل لعدد المستعمرات والبالغ 3-سم خلية 4 10× × 1.0بالمقارنة مع أعدادها الناتجة من زراعة كثافة اإلنشاء 2-طبق المعنوية ألعداد المستعمرات الخلوية معنويا على باقي الكثافات 104× 2.03تفوقت الكثافة العالية و ،2-طبق مستعمرة 8.125التي بلغت 104 في حين بلغ أعداد منشآت ،من زراعة الخاليا المعلقة ايوم 15بعد 58وقد أعطت منشآت كالس بلغ عددها بينما فشلت باقي ،3-سم خلية 4 10× 1.79من زراعة الخاليا المعلقة عند كثافة ايوم 15بعد 26الكالس في التطور الى منشآت 3-سم خلية 4 10× 1.52وكثافة 104× 1.0 المستعمرات الخلوية في كثافة االنشاء 48نقسامها األول بعد اوتشير فحوصات المجهر الضوئي أن خاليا المعلقات المزروعة باشرت بالكالس. ستمرت بمواصلة أنقساماتها المتعاقبة بصورة نمطية منتجة ا( وA 2ساعة مكونة الخلية البنوية )شكل: 0 0.5 1 1.5 2 2.5 1 2 3 4 ي و خل ال ق عل لم ا فة ثا ك ( × 4 1 0 ية خل / سم 3 ) (يوم)مدة التحضين http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ ابراهيم وعلوان 8023، 28 – 37(: عدد خاص)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 33 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ وتطورها الحقا الى ،يوما 10 ( بعدB 2المستعمرات الخلوية المؤلفة من أعداد كبيرة من الخاليا )شكل: منشآت الكالس التي ظهرت بهيئة قطع نسيجية دقيقة بيضاء اللون صغيرة الحجم ترى بالعين المجردة على يوما. 20( بعد C 2سطح الوسط )شكل: تكوين منشآت الكالس من زراعة كثافات متباينة من المعلقات الخلوية المشتقة من كالس قطع السيقان تحت . 1 الجدول 1-لتر ملغم D-2,4 +0.5 1-لتر ملغم 3.0الصلب المدعم بأضافة MSفي وسط W. somniferaالفلقية لنبات الوذانيا Kin بطريقة النشر الكثافة المزروعة (3-سم خلية 104)× أعداد المستعمرات معدالت 2-طبق الخلوية 20أعداد منشآت الكالس بعد يوما C 0 8.125 )كثافة األنشاء( 1.0 1.52 12.900 CB 0 1.79 16.500 B 26 2.03 27.600 A 58 بطريقة Withania somnifera زراعة المعلقات الخلوية المشتقة من كالس السيقان تحت الفلقية لنبات .2 الشكل MS +3.0ساعة للخاليا المعلقة المزروعة في وسط ) 48(: الخاليا البنوية الناتجة من االنقسام األول بعد (Aالنشر (: المستعمرة الخلوية الناتجة من B) (40xبير ( بطريقة النشر )قوة تكKin 1-لتر ملغم D-2,4 +0.5 1-لتر ملغم 20(: منشآت الكالس بعد C) (40x)قوة تكبير أيام 10بطريقة النشر بعد A)االنقسامات المتعاقبة للخاليا البنوية )في ايوم واتجها عند زراعتها بطريقة الطمرسلوك المعلقات الخلوية ون أظهرت نتائج زراعة كثافات متباينة من المعلقات الخلوية المشتقة من كالس السيقان تحت الفلقية تباينا في ،Kin 1-لتر ملغم D-2,4 +0.5 1-لتر ملغم 3.0المدعم بإضافة MSبطريقة الطمر بوجود وسط واظهرت نشوء المستعمرات (،2 الجدول)أعداد المستعمرات الخلوية المتكونة ونواتجها من منشآت الكالس http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ ابراهيم وعلوان 8023، 28 – 37(: عدد خاص)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 32 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ أعلى المعدالت 3-سم خلية 4 10× 2.03إذ سجلت زراعة الكثافة ،الخلوية عالقة طردية مع كثافة الزراعة بالمقارنة مع أعدادها الناتجة من زراعة كثافة 2-طبق مستعمرة 21.400ألعداد المستعمرات الخلوية بلغت . وتفوقت معنويا على باقي الكثافات وقد أعطت منشآت كالس 2-طبق مستعمرة 10.400اإلنشاء التي بلغت في حين لم تتطور المستعمرات الخلوية في باقي من زراعة الخاليا المعلقة ايوم 25بعد 6بلغ عددها الكثافات الى منشآت الكالس. وتشير فحوصات المجهر الضوئي أن خاليا المعلقات المزروعة باشرت ( وأستمرت بمواصلة أنقساماتها المتعاقبة A 3ساعة مكونة الخلية البنوية )شكل 72بأنقسامها األول بعد ،يوما 15( بعد B 3بصورة نمطية منتجة المستعمرات الخلوية المؤلفة من أعداد كبيرة من الخاليا )شكل الحجم رة لون صغيوتطور بعضها الحقا الى منشآت الكالس التي ظهرت بهيئة قطع نسيجية دقيقة صفراء ال يوما. 25( بعد C 3 شكلعلى سطح الوسط ) تكوين منشآت الكالس من زراعة كثافات متباينة من المعلقات الخلوية المشتقة من كالس قطع السيقان تحت .2 الجدول 1-لتر ملغم D-2,4 +0.5 1-لتر ملغم 3.0الصلب المدعم بإضافة MSفي وسط W. somniferaالفلقية لنبات الوذانيا Kin بطريقة الطمر بطريقة Withania somnifera زراعة المعلقات الخلوية المشتقة من كالس السيقان تحت الفلقية لنبات .3 الشكل MS +3.0المعلقة المزروعة في وسط ) ساعة للخاليا 72(: الخاليا البنوية الناتجة من األنقسام األول بعد (Aالطمر (: المستعمرة الخلوية الناتجة من B) (40x( بطريقة الطمر )قوة تكبير Kin 1-لتر ملغم D-2,4 +0.5 1-لتر ملغم 25(: منشآت الكالس بعد 40x(.)C)قوة تكبير ايوم 15بطريقة الطمر بعد A)االنقسامات المتعاقبة للخاليا البنوية )في ايوم خلية 4 10)×الكثافةالمزروعة (3-سم معدالت أعداد المستعمرات 2-طبق الخلوية .8أعداد منشآت الكالس بعد يوما C 0 10.400 )كثافة اإلنشاء( 1.0 1.52 12.000 C 0 1.79 B 16.111 0 2.03 21.400 A 6 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ ابراهيم وعلوان 8023، 28 – 37(: عدد خاص)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 39 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ دامة الدورية لمنشآت الكالساإل الناتج من زراعة المعلقات الخلوية بكل من طريقة النشر والطمر بقوامه الهش ولونه امتاز الكالس دامة الدورية لمنشآت الكالس المتكونة من زراعة المعلقات ستمرار اإلاوأدى ،االصفر المائل الى البني الفاتح غم بعد شهر من 5.592ه الخلوية للسيقان تحت الفلقية بكال الطريقتين الى زيادة أحجامها إذ بلغ معدل وزن مل من نفس الوسط في 20الزراعة إذ التقطت هذه القطع الصغيرة عند بلوغها حجم حبة العدس ونقلت الى واتصف الكالس المشتق من زراعة منشآت الكالس ،وعاء زجاجي لتستمر في نموها مكونة مزارع الكالس القوام ومنه ما كان لونه أخضر غامق حبيبي القوام المتكونة بتباين الوانه فمنه ما كان ذا لون ابيض حبيبي . 4 شكل ،صلب ولبعضه لون اخضر فاتح صلب القوام الصلب المدعم MSعلى وسط Withania somniferaالكالس المشتق من زراعة منشآت الكالس لنبات .4 الشكل : كالس ذو لون ابيض (B) (: منشأ كالس بعد اعادة زراعتهاA) Kin 1-لتر ملغم D-2,4 +0.5 1-لتر ملغم 3.0بتركيز (: كالس ذو لون أخضر فاتح حبيبي القوام بعد ثالثين D(: كالس ذو لون أخضر غامق صلب القوام )(C حبيبي القوام عادة الزراعةإيوما من بوصفها النبات ان استخدام مزارع المعلقات الخلوية تمثل اتجاها حديثا في مجال التقانات الحيوية في قسام ناانظمة انموذجية ليس من اجل الحصول على الكالس فحسب بل في توفيرها مجاال كبيرا لمتابعة عتماد تقانة انشاء المعلقات ان الدافع في إ(. 2006 ،رشيد وقاسمدة وتوسعها وتخصصها )الخاليا المفر شارت هذه فقد ا ،الالزمة النقسام الخاليا ونموهاالخلوية المشتقة من الكالس تكمن في تحديد الكثافة الحرجة 1-لتر ملغم D-2,4 +0.5 1-لتر ملغم 3.0السائل المدعم بتركيز MSالدراسة الى نجاح استخدام وسط Kin ومن المؤكد ان قوام الكالس الهش وكميتة كانت ،في إنشاء المعلقات الخلوية واحتفاظ الخاليا بحيويتها وهذا يفسر نشاط ،هذه المزارع واحتوائها على اعداد كبيرة من الخاليا المفردة احد عوامل نجاح إنشاء وتواصلها حتى تكوينها قطع صغيرة من الكالس ويحتمل ان يعزى هذا الى الفعل النشط ةاالنقسامات الخلوي http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ ابراهيم وعلوان 8023، 28 – 37(: عدد خاص)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 20 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ الوسط ( وعلى تركيب Bottino,1982و Cuddihy) الحاصل بين المجاميع الكبيرة من الخاليا المفردة مع الحركة المستمرة لضمان توزيع الخاليا وعدم تكتلها في مكان واحد حيث تنفصل خاليا الكالس المنقول ويكون معدل انقسام الخاليا في مزارع الخلية ،عن بعضها خالل الحركة المستمرة لينتج عنها معلقا خلويا الكالس ف ،(Ramawat ,2008) الكالس المعلقة خالل الطور األسي من النمو اعلى من معدل انقسام خاليا الذي تم الحصول عليه في هذه الدراسة بواسطة زراعة المعلقات الخلوية بطريقة النشر والطمر (Bedrgmann,;1960 Dixon, 1985 ابدى مسارا اعتياديا في نموه وتمكن من الزيادة في الحجم من ) وبات وان التغلب على الصع ،لمشتق من الجزء النباتيسوداد التي ترافق الكالس ادون ان يعاني من ظاهرة اإل ستحثاث الكالس قد تفسر بأن هذا الكالس المشتق من المعلقات الخلوية يختلف في سلوكه عن االتي صاحبت سلوك الكالس المتكون من األجزاء النباتية بسبب نشأته المتوقعة من خاليا مفردة او من كتلة من هذه الخاليا ستحثاث التي قد تختلف عن الخاليا المتخصصة الموجودة في الجزء النباتي المستخدم الغير المتخصصة ( بداللة اختالف الوان الكالس واشكاله وقوامه الناتجة من اعادة 1999 ،وآخرون Morris) الكالس منه ح زراعة زراعة منشآت الكالس الناتجة من زراعة المعلقات الخلوية. وهناك دراسات عديدة اشارت الى نجا المعلقات الخلوية المستحثة من الكالس بطريقة الطمر في االكار فقد تمكنت المعلقات الخلوية المستحثة من من أستحثاث D-2,4المدعم بأضافة UMالنامية على وسط Medicago sativaكالس أوراق الجت أسابيع من نقله الى أوساط 5الكالس الذي أمتاز بلونه األصفر وقوامه الهش وقدرته على التمايز خالل (. وتمكنت خاليا المعلقات الخلوية Davey ,1980و Cocking) HFMSخاصة للتمايز مثل وسط NAAضافات إالمدعم ب MSوالمزروعة في وسط Cyamopsis tetragonolobaالمشتقة من نبات الوسط المستخدم بجهد نقسام بعد يومين من زراعتها. وأتصفبطريقة الطمر في االكار من اإل D-2,4و تناضحي واطئ شجع تكوين المستعمرات الخلوية التي تطورت الى كالس تمكن من التمايز وتكوين االفرع (. وقد يفسر صعوبة تمايز الكالس الناتج من زراعة الخاليا المعلقة 1982وآخرون, Saxenaالخضرية ) – Sheايتوبالزمية وأخرى نووية في النبات )المشتق من كالس السيقان تحت الفلقية الى وجود تأثيرات س Gong وFuxiong ,2000.) المصادر . الزراعة المرافقة للمعلقات الخلوية المشتقة من كالس السيقان 2004سهلة محمد زيدان شعيب. ،الجواري اطروحة المحولة وراثيا. .Vicia faba Lفي الحصول على نباتات الباقالء Riمع بالزميدات جامعة الموصل. ،كلية التربية ،دكتوراه . دور المعاملة الحرارية في تحضير االنقسام الخلوي وتكوين 2006جميلة هزاع ووجدان سالم قاسم. ،رشيد في قطرات Helianthus annuusالكالس من زراعة المعلقات الخلوية لنباتات زهرة الشمس .89-88(: 2)34 .مجلة زراعة الرافديناالكار المتعددة. Adhikari, S. R. and B. Pant. 2013. Induction and proliferation of in vitro mass of callus of Withania somnifera L. Dunal. Res. in plant Sci., 1(3): 58-61. Bedrgmann, L. 1960. Growth and division of single cells of higher plants in vitro. J. Gen. physiol., 43: 841-851. Chimire, K., E. S. Seong, E. H. Kim, K. Lamsal, C. Y. Yu, and I. M. Chung. 2010. Direct shoot organogenesis from petiole and leaf discs of Withania somnifera L. Dunal. Afr. J. of Biotech., 9(44): 7453-7461. http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ ابراهيم وعلوان 8023، 28 – 37(: عدد خاص)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 22 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ Cocking, E. C. and M. R. Davey. 1980. Organogenesis and somatic embryogenesis in tissues derived from leaf protoplasts and leaf explants of Medicago sativa. Z. Pflanzenphysiol. Bd., 99: 261-270. Cuddihy, A. E. and P. J. Bottino. 1982. Winged-bean protoplasts: Isolation and culture to callus. Plant cell tiss. & Org.Cult., 1: 201-209. Dixon, R. A.1985. Plant Cell Cultures. A Practical Approach. IRL Press, Oxford, U.K. Gong-She, L. and W. Fuxiong. 2000. Bud regeneration by suspension culture of sunflower. J. Plant. Bio., 49: 212-216. Hunziker, A. T. 2001. Genera Solanacearum: the genera of the Solanaceae illustrated, argraned according to a new system; Gantner Verlag: Ruggell, Liechtenstein. Kanungo, S., M. Kumari and S. L. Sahoo. 2015. Application of Antioxidant Enzyme Activity and Biochemical Characterization in Static and Suspension Cultures of Withania somnifera L. Applied food Technology, 2(2): 15-22. Mir, B. A., J. Khazir, K. R. Hakeem, S. Koul and D. A. Cowan. 2014. Enhanced production of Withaferin-A in shoot cultures of Withania somnifera L. Dunal. Department of Genetics, University of Pretoria, 1-9. Mirjalili, M. H., E. Moyano, M. Bonfill, R. M. C. Cusido and J. Palazon. 2009. Steroidal Lactones from Withania somnifera, an Ancient Plant for Novel Medicine. www.mdpi. Com/journal/molecules, 14: 2373-2393. Mohanty, I., S. K. Gupta, K. K. Talwar, A. Dinda, S. Joshi, P. Bansal, A. Saxena and D. S. Arya. 2004. Cardioprotection from ischemia and reperfusion injury by Withania somnifera: a hemodynamic, biochemical and histopathological assessment. Mol. Cell Biochem., 260: 39-47. Morris, P., K. J. Webb, M. P. Robbins and B. Jorgensen. 1999. Application of biotechnology to lotus breeding. News Lett. Sci. and Techn., 28: 199-228. Niyaz, A. and E. N. Siddiqui. 2014. Seed germination of Withania somnifera L. Dunal. European. J. of Med. plants, 4(8): 920-926. Ramawat, K. G. 2008. Plant Biotechnology. Printed in India. PP: 1-265. Saxena, K. P., R. Gill, A. Rashid and S. C. Maheshwari. 1982. Colony formation by Cotyledonary protoplast of Cyamopsis tetragonoloba L. Plants physiol., 106: 277-280. Shukla, H. Y. and P. K. Shukla. 2012. Effect of stand geometry and plant growth regulators on root yield and alkaliod content of Ashwagandha (Withania somnifera Dunal). Int. J. Med. Arom. plants, 2(3): 390-395. http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ http://www.mdpi/ ابراهيم وعلوان 8023، 28 – 37(: عدد خاص)9مجلة ديالى للعلوم الزراعية، 28 http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ Siddique, N. A., M. A. Bari, S. Shahnewaz, M. H. Rahman, M. R. Hasan, M. S. I. Khan and M. S. Islam. 2004. Plant regeneration of Withania somnifera (L.) Dunal (Ashwagandha) from nodal segments derived callus an endangered medicinal plant in Bangladesh. J. of Biolog. Sci., 4(2): 219-223. Victor, M. L. and V. Felipe. 2006. Plant Cell Culture Protocols. 2Ed., Humana Press Int., Totowa, N. J. Udayakumar, R., C. W. Choi, K. T. Kim, S. Kasthurirengan, T. S. Mariashibu, J. J. S. Rayan and A. Ganapathi. 2013. In vitro plant regeneration from epicotyl explant of Withania somnifera (L.) Dunal. J. M. P. R., 7(1): 43-52. THE EFFECT OF DENSITIES CULTURE OF CELL SUSPENSION PLANT Withania somnifera L. IN CELL PLATING AND ARRAY METHOD IN THE FORMATION OF CALLUS PRIMORDIAS Muthana M. Al-Mahdawe1 Batoul. M. Alwan Dept. of Biology-College of Education pure sciences-University of Diyala, Iraq. sadeh1970@gmail.com Corresponding author:1 ABSTRACT This study succeeded in establish cell suspension derived from callus hypocotyle Withania somnifera L. seedlings, induced in MS solid medium supplemented with 3.0 mg l-1 2,4-D Intertwined with 0.5 mg.L-1 Kin. Detection culture different densities (1.0, 1.52, 1.79, 2.03) ×104 cell cm-3 of these suspensions of plating and array method of agar-solidified MS medium in the presence of concentrations 3.0 mg l-1 2,4-D + 0.5 mg l-1 Kin. Culture method by plating was exceeding the array method in the number of cellular colonies. It has reached the 27.600 colony dish-1 at the culture density 2.03 ×104 cell cm-3 compared with the initiation density which amounted to 8.125 colony dish-1 in plating method, while the number of these colonies by array method was 21.400 colony dish-1 using the same culture density compared with the initiation density which amounted to 10.400 colony dish-1. Moral high density excelled significantelly on the rest of the densities opals giving 58 callus primordial after 20 days of culture of cells suspension using plating method, and giving 6 callus primordial after 25 days of culturing on cell suspension when array method was used. Key words: Callus, Suspension cell, Withania somnifera. http://www.agriculmag.uodiyala.edu.iq/ mailto:sadeh1970@gmail.com