Microsoft Word - 9.doc doi: 10.5599/admet.1.3.9  19  ADMET & DMPK 1(3) (2013) 19‐28; doi: 10.5599/admet.1.3.9    Open Access : ISSN : 1848‐7718      Perspective  What ADME tests should be conducted for preclinical studies?  Hong Wan  Shanghai Hengrui Pharmaceutical CO., LTD.    Dept. of DMPK/Tox, Shanghai, P.R. China  E‐mail: wanh@shhrp.com  Tel: +86(0)21‐54759066‐1313; Fax: +86(0)21‐54759072; Mobile: +86‐18036618308  Received: June 06th, 2013; Revised: July 01st, 2013; Published: July 03rd, 2013      Abstract  The pharmaceutical industry has been evolving in recent years, which made numerous CROs and biotech companies  conducting drug discovery and development programs and services in China. As a very comprehensive and important  technology  platform  bridging  efficacy  and  safety,  the  DMPK  has  become  a  mature  discovery  function  to  optimise  ADME properties in drug design and screening, and dramatically mitgate attrition rates during the last decades. In this  article, the author addresses several frequent questions associated with ADME/DMPK studies, e.g., what ADME tests  should be conducted for preclinical studies? What should a typical investigational new drug (IND) enabling package  cover? Which ADME/DMPK studies require good laboratory practice (GLP) or non‐GLP? What does a good PK profile  look like?    The author presents a straightforward overview of these basic questions from his many years’ experience  in both pharmaceutical research and CRO in supporting drug discovery projects and IND filing.  Keywords  DMPK, PK, toxicity, safety, screening cascade, metabolite, drug‐drug interaction, investigational new drug    1. DMPK/ADME: definition and study purpose  DMPK, or Drug Metabolism and Pharmacokinetics, is an important part of studies often referred to as  ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, and Elimination).    - Absorption (how much and how fast, often referred to as the absorbed fraction or bioavailability)  - Distribution (where the drug is distributed, how fast and how extensive)  - Metabolism (how fast, what mechanism/route, what metabolite is formed, and whether they are  active or toxic)  - Elimination (how fast, which route).  In the drug discovery process, early  in vitro ADME screening and  in vivo PK profiling provide a basis for  choosing new molecular entities (NMEs) and lead compounds that have desirable drug metabolism, PK or  safety  profiles,  necessary  for  drug  candidate  selection  (CS)  and  late‐stage  preclinical  and  clinical  development.  The  ADME  properties  of  a  drug  allow  the  drug  developer  to  understand  the  safety  and  efficacy data required for regulatory approval.    Wan    ADMET & DMPK 1(3) (2013) 19‐28  20    Today, DMPK studies performed in vitro and in vivo have become more standardised procedures across the  pharmaceutical  industry.  A  couple  of  typical  examples  include  the  most  commonly  used  in  vitro  ADME  studies, such as liver microsomes and the whole hepatocyte models for in vitro metabolism. Both models  contain  major  metabolism  enzymes,  such  as  CYP450  for  phase  I  metabolism  and  UDP‐glucuronosyltransferase (UGT) for phase II metabolism. These relevant in vitro models are also applied  to CYP  inhibition/induction studies as well as drug metabolite  identification and profiling across species.  Other  key  in  vitro  assays,  such  as  Caco‐2  or  MDCK  cell‐based  models  are  often  used  for  intestinal  permeability evaluation. For in vivo PK studies, Association for Assessment and Accreditation of Laboratory  Animal Care (AAALAC)‐accredited animals, such as mice, rats, dogs, and non‐human primates are employed  to generate in vivo PK data like drug clearance (CL), bioavailability (F%), exposure (AUC), half life (t1/2), and  distribution volume (L). Currently, almost all DMPK‐related assays are carried out by available automated  technology  platforms  combined  with  high‐throughput  liquid  chromatography‐mass  spectrometry  (LC/MS/MS) bioanalysis, which has considerably speeded up the ADME data generation for decision‐making  during the drug discovery and development process.    2. What ADME tests should be conducted for preclinical studies?      Potency <100 nM Enzyme/cell based assays Solubility 7.4 > 1-10 µM (PBS buffer) Metabolic stability CLint (h, r, d, m) Caco-2 permeability > 0.3x 1E-6cm/s, efflux LogD7.4 (1.5-4.5) In vivo PK (m, r, d, m) F>20%, CL<50% BF, dose<100mg PPB (r, h, d, m) fu> 0.1-1% CYP inhibition (IC50) Major CYP>1-10 µM Reactive metabolite (GSH) Met ID, CYP ID Metabolism route PK/PD Dose response Solubility 6.5 >10 µM (FaSSIF) Hepatocytes (r, h) Blood/plasma ratio (r, h, d, m) Non-GLP tox (rodent, dog) GLP tox (safety package) CS (candidate selection) CYP Induction H it-to-Lead Lead-optim isation C andidate Transporter, P-gp etc Substrate/inhibition MDCK PAMAP hERG IC50 IND enabling (Candidate) Clinical Candidate (GLP) MTD (rodent) Human PK dose, PK/PD F CLCe(ss) Dose τ•• =   Figure 1: Typical ADME/PK screening cascade    Figure 1 highlights a typical ADME/DMPK screening cascade to support drug discovery programs from early  hit‐to‐lead, to  lead optimisation and candidate evaluations. As depicted  in Figure 1, a number of DMPK  studies  are  required  before  CS,  followed  by  non‐GLP  and  GLP  toxicology  studies  for  the  IND‐enabling  package  that  is  necessary  for  clinical  candidate  development.  Various  studies  and  assays  should  be  conducted at different stages to address ADME issues and meet specific criteria to enable the project to  ADMET & DMPK 1(3) (2013) 19‐28  ADME Tests for Preclinical Studies  doi: 10.5599/admet.1.3.9  21  move forward. It should be noted that these criteria, as exemplified in this cascade, are not fixed numbers  or  filters,  and  depend  on  other  parameters  as  well  as  the  specific  therapeutic  targets  of  different  drug  discovery  programs.  This  cascade  just  demonstrates  a  traditional  downstream  of  ADME/PK  tests  for  a  typical drug discovery programs before the IND‐enabling stage. Often, at the early stage of hit‐to‐lead, key  in vitro assays and studies, such as solubility,  liver microsomal stability, CYP  inhibition, and permeability  should  be  conducted  to  provide  key  data  for  chemists  to  select  the  more  metabolically  stable  and  active/potent compounds for further in vivo PK studies. Solubility and Log D data can serve as a basis to run  various in vitro assays as well as for drug stability assessment and selection of suitable formulations. Also, it  is  well  known  that  Log  D/Log  P  a  crucial  factor  governing  passive  membrane  partitioning,  influencing  permeability opposite to its effect on solubility. Moreover, if the in vitro metabolic stability data from phase  I  metabolism  cannot  predict  in  vivo  hepatic  plasma  clearance,  the  phase  II  in  vitro  metabolism  in  hepatocytes and even hepatic transporters such as OATP1B1 are then necessary to find the relevant in vitro  models for in vivo metabolism prediction to drive chemists to design and make more potent and selective  compounds  with  improved  PK  profiles.  Even  at  the  very  early  stage  of  hit‐to‐lead,  selective  in  vivo  PK  studies are valuable to confirm whether the applied in vitro assays (in vitro metabolism and absorption) can  serve as good predictive models for  in vivo PK  in terms of plasma clearance and bioavailability. In some  circumstances,  if  both  in  vitro  liver  microsomes  and  hepatocyte  models  might  not  predict  well  in  vivo  metabolism, more extensive in vivo PK studies have to be performed as a result of poor in vitro and in vivo  correlations based on evaluations by a simplified well‐stirred model. A clear structure‐activity relationship  (SAR)/ADME certainly facilitates the design of new compounds. For the drug absorption evaluations, there  are three commonly used models, such as PAMPA, and Caco‐2 and MDCK permeability. From the cost point  of view, the PAMPA membrane permeability assay  is the most cost‐effective among these three  in vitro  models,  with  a  fast  turnaround,  while  the  Caco‐2  and  MDCK‐MDR1  models  can  offer  more  accurate  absorption  prediction  as  well  as  allow  efflux  and  transporter  studies  for  substrate  and  inhibition  identification.      Traditionally, the CYP inhibition study is conducted at a late stage, e.g., from lead optimisation to CS. This  has  been  now  moved  to  earlier  stages,  even  hit‐to‐lead.  Table  1  shows  a  general  decision  tree  on  CYP  inhibition based on drug‐drug interaction (DDI) assessment, with an interpretation of potential for in vivo  inhibition (derived from FDA Guidance for Industry: Drug Interaction Studies – Study Design, Data Analysis,  Implications for Dosing, and Labeling Recommendations) [1]. An estimated [I]/Ki ratio of greater than 0.1 is  considered  positive  and  a  follow‐up  in  vivo  evaluation  is  recommended.  The  likelihood  of  an  in  vivo  interaction is projected based on the [I]/Ki ratio where [I] represents the mean steady‐state Cmax value for  total drug (bound plus unbound) following administration of the highest proposed clinical dose. As the ratio  increases, the likelihood of an interaction increases. Also, for CYP3A inhibition, two structurally unrelated  substrates should be evaluated in vitro. If one of the two evaluations suggests a potential interaction (i.e.,  [I]/Ki of more than 0.1), an in vivo evaluation should be carried out. At the earlier screening stage, IC50 by a  single‐point screening assay, which is a more cost‐effective approach with acceptably good correlation with  full  curve  IC50 assay, can  be  used for  initial DDI evaluation.  A full  curve  IC50 or Ki determination can be  utilised for DDI assessment at a late phase for candidates such as NMEs. Although quantitative predictions  of in vivo DDI from in vitro studies are not possible, rank order across the different CYP enzymes for the  same drug may help prioritise in vivo DDI assessment.    Wan    ADMET & DMPK 1(3) (2013) 19‐28  22      Table 1: Prediction of clinical relevance of competitive CYP inhibition  Likelihood  IC50 (μM) [I]/Ki [1].  Likely  < 1 > 1 Possible  1 < IC50 <10 0.1 <[I] /Ki <1  Unlikely  > 10 < 0.1 [I] is the concentration of inhibitor exposed to the active site of the enzyme in vivo,    Ki is the inhibition  constant, which can be obtained by a full curve IC50 assay, or roughly estimated from the IC50, i.e.,  Ki≈IC50/2    Similar studies associated with transporters are needed to identify whether the NMEs could be a potential  substrate or inhibitor for P‐gp or other important transporters for DDI as early as possible. More complex  decision‐making trees and recommended models for transporter‐mediated DDI assessment are outlined in  the FDA’s new guidance on drug interaction studies. It should be pointed out that the FDA has extended  DDI guidance from the 2006 draft, with 52 pages, to the current 75 pages (issued in 2012), reflecting the  importance and complexity of drug interaction studies among the DMPK [1,2]. This is attributed to the high  percentage of drug failures caused by DDI.    Another important aspect includes the drug metabolite identification and profiling as well as metabolism  pathways in connection with CYP metabolism enzyme identification (the so‐called CYP ID). Nowadays, the  rapid metabolite identification (MetID) at a very early stage has also become relatively easy, such as with  Metabolynx‐assisted  structure  identification  software,  which  is  especially  necessary  for  metabolically  unstable compounds, whose biotransformation can help chemists understand the site of metabolic liability,  for further structure modification for a desirable metabolism profile. With the issuance of the FDA’s final  guidance for industry on safety testing of drug metabolites (MIST), there is increased concern for obtaining  metabolite  data  as  early  as  possible  in  preclinical  studies.  The  discovery  of  disproportionate  drug  metabolites late in drug development can potentially cause development and market delays. As guided in  MIST published in 2008 as well as in the ICH M3 (R2) published in 2009 [3,4], if a metabolite is a unique  human metabolite, or more commonly, if a circulating metabolite is present at disproportionately higher  levels  in  humans  than  in  the  animal  species  used  in  toxicology  studies,  additional  non‐clinical  safety  assessment studies may be required. As exemplified in Figure 2, any metabolites found to be >10% (based  on systemic exposure at steady state) of total drug‐related material should then be monitored in repeating  dose animal toxicology studies to determine if they are present at higher  levels in other species as well.  Exceptions might be possible for lower‐risk metabolites, such as most phase II conjugated metabolites. If  the major metabolite exposure  in at  least one species  is greater than  in the human, then no additional  safety studies of the metabolite are needed. It should be noted that the metabolite decision tree shown in  Figure  2  is  only  a  suggestion  or  recommendation,  with  an  approximate  10%  cut‐off,  which  does  not  necessarily  mean  a  metabolite  testing  safety  guarantee.  For  instance,  if  a  drug  shows  a  low  predicted  efficacy dose (10 mg or lower), a metabolite found to be over 10% of total drug‐related material might not  require further safety tests. In contrast, for a highly dosed compound, even if a metabolite is lower than  10% of total drug‐related material, it could be toxic, especially with accumulation of the metabolite. Also, a  reactive metabolite might be toxic at a very low concentration. Overall, a metabolite safety testing decision  should consider many factors, such as in vitro‐in vivo correlations and especially in vivo animal toxicology  findings, e.g., abnormalities or even animal deaths with repeat doses on animal studies. In this case, it is  essential to identify the biotransformed metabolites to understand whether the observed toxicity is due to  the accumulation of parent exposure or toxic metabolites, as even metabolites at a level lower than 10%  ADMET & DMPK 1(3) (2013) 19‐28  ADME Tests for Preclinical Studies  doi: 10.5599/admet.1.3.9  23  can  accumulate.  Such  additional  toxicity  testing  of  the  major  metabolite  can  be  informative  to  confirm  whether the cause of toxicity is the metabolite or not. In this case, for rodent or acute rat toxicology, the  identification and profiling of drug metabolites using toxicokinetic plasma samples can be used. In short,  relevant studies must be carried out to determine if human metabolites are adequately evaluated during  non‐clinical safety studies.                                                          Figure 2: FDA suggested metabolite decision tree flow diagram    In addition to the CYP inhibition/induction and transporter studies associated with DDI, other safety‐related  studies,  such  as  reactive  metabolism  and  hERG  should  be  performed  as  early  as  possible.  The  hERG  inhibition  test  for  cardiotoxicity  has  been  shown  to  predict  increased  risk  of  arrhythmia,  which  can  be  initially evaluated under non‐GLP condition by in vitro approaches that are cost‐effective and have a fast  turnaround, and later confirmed using QT interval prolongation measurements according to FDA guidelines  [5]. Another important in vivo study is basic safety tests that are most commonly performed on rats and  dogs, e.g., non‐GLP acute toxicology (7‐day or 14‐day rat and dog repeat dose) for oral drugs, which usually  include body weight, clinical chemistries, haematology, and histopathology (high dose and control only if no  Disproportionate Drug Metabolite >10% parent  systemic exposure  �AUC� ≤10% parent  systemic exposure  �AUC� Formed in any animal test  No  further  testing  needed  Yes How much?  No Exposure in animal studies  does  approach  human exposure  Exposure in animal studies  does  not  approach  human exposure  No further testing  needed  Nonclinical testing of the drug metabolite  Wan    ADMET & DMPK 1(3) (2013) 19‐28  24    pathology  is  seen  at  the  high  dose).  This  study  should  be  designed  to  establish  a  dose  that  induces  a  minimal toxic effect, or alternatively, to establish a safety margin (e.g., 10–100x depending on the different  therapeutic  targets).  The  selection  of  dose  levels  for  repeat  oral  dose  in  toxicology  studies  is  generally  based  on  the  minimum  efficacy  dose  (MED)  and  the  maximum  tolerated  dose  (MTD).  Based  on  the  measured  AUC  (exposures)  and  toxicokinetic  data,  an  approximate  safety  margin  and  compound  accumulation characteristics can be known, which are paramount for the decision‐making on whether to  follow up a GLP‐tox design or not. Such non‐GLP studies help to identify more accurate dose level design for  the subsequent GLP studies.    In  summary,  a  comprehensive  nonclinical  ADME/PK  package,  including  key  toxicity  data,  should  be  generally complete by the time of CS. The ultimate goals of all ADME/PK/tox studies before the CS stage are  to better understand the compound’s metabolite‐mediated toxicity and safety profile to make a concrete  decision for the purpose of enabling IND, which is a crucial part of the drug approval process.  3. IND‐enabling package for GLP or non‐GLP?  What preclinical studies should be conducted to enable an IND? Should all studies be performed  in GLP  laboratories for IND filing? Some researchers are mis‐communicating that at IND stage, all studies should be  conducted in GLP laboratories. Actually, the FDA requires GLP documentation only for safety‐related in vivo  studies like GLP‐tox. In other words, in vitro ADME and in vivo PK studies do not need to be performed in  GLP labs. In fact, from a bioanalytical data quality point of view, there is no apparent discrepancy between  non‐GLP  and  GLP  laboratories  regarding  bioanalytical  procedures,  because  most  non‐GLP  bioanalysis  methods are performed according to FDA bioanalysis guidance [6]. The major difference can be in the study  design, e.g., a typical non‐GLP tox study utilises a small group of animals (three or four per group), while a  GLP‐tox  study  usually  utilises  more  than  10  animals  per  group  with  half  males  and  half  females  in  one  study. In addition, more strict documentation must be recorded for the purpose of regulatory compliance.  Obviously, the GLP study has much higher costs than a similar non‐GLP study, which is not recommended  before CS for the IND‐enabling package. Key components of the IND data package include pharmacology,  toxicology and safety pharmacology, ADME and chemistry, and the manufacturing and control sections of  the  submission.  A  typical  IND‐enabling  ADME  package  contains  data  from  the  following  studies:  bioanalytical  method  validation  in  one  rodent  and  one  or  more  non‐rodent  species;  single‐  and  multiple‐dose  PK;  dose  proportionality  and  absolute  bioavailability  in  one  rodent  and  one  or  more  non‐rodent species; and  in vitro CYP  inhibition/induction  in human  liver microsomes for DDI assessment  (including likely transporter studies). Other data, such as mass balance and routes of excretion in rodents,  including bilary excretion in rats, metabolite profiling and identification in rodents and non‐rodents, tissue  distribution using radio‐labelled compound by quantitative whole‐body autoradiography (QWBA) form part  of  the  surrogate  end‐points,  although  these  studies  are  not  required  for  submission.  Overall,  complete  ADME and toxicology data can make the submission package more compelling to move a compound into  phase I clinical studies. Knowing the objectives, expectations, and processes of assembling and filing an IND  is the key factor not only for a successful filing, but it can also accelerate a promising clinical development  path forward. More detailed  information on the general requirements and strategies for successful  IND  filings can be found in FDA’s guidance [7], which is beyond the scope of the current main topic. In order to  reduce the potential development cost, exploratory IND (eIND) preclinical studies are recommended by the  FDA [8]. Such eIND studies are conducted prior to the traditional dose escalation, safety, and tolerance  studies that ordinarily initiate a clinical development program, which is less extensive than for traditional  IND  studies.  Overall,  eIND  studies  provide  the  opportunity  to  already  obtain  human  data  in  the  drug  discovery phase, such as important information on PK, PK/PD, and basic toxicology data for a key decision  ADMET & DMPK 1(3) (2013) 19‐28  ADME Tests for Preclinical Studies  doi: 10.5599/admet.1.3.9  25  for selecting  the most promising  lead  product. Even a microdose approach (e.g., <100 μg, or <1/100 of  MED)  in  a  human  study,  using  an  advanced  technology  such  as  accelerator  mass  spectrometry  (AMS)  combined with radio‐labelled compound can be very beneficial to gain human PK information as early as  possible for IND enabling [9].  4. What is a good PK profile?  Another frequent question asked by drug discovery scientists is ‘Is this compound’s PK good?’ Ideally, the  desirable PK profiles of a preclinical candidate that is being considered for taking into development should:  • have acceptable solubility for development;  • be completely absorbed, preferably via passive absorption;  • have high bioavailability (e.g., F>50%) for oral drug;  • have  a  low  plasma  clearance  CL  (e.g,  <30%  blood  flow),  long  half‐life  (t1/2)  (e.g.,  >6  hrs),  and  acceptable distribution volume;  • have a linear kinetics, i.e., exposure proportional to dose and a clear PK/PD correlation;  • be eliminated by several pathways, i.e., renal excretion and hepatic metabolism, also metabolised  preferably by more than one enzyme for de‐risking DDI;  • have a simple metabolite profile, with no reactive metabolite;  • have no obvious CYP and major transporters like P‐gp inhibition or induction or low DDI potential;  and  • have a sufficient or at least acceptable safety margin (safety margin >10x, depending on different  therapeutic targets).    In  reality,  we  can  readily  rank  which  compound’s  PK  is  better  than  others  from  the  same  series  of  compounds during the screening. However, we should not rule out a compound by only looking at its PK  data, especially for those with super potent NMEs. As long as their potencies and mechanism are attractive,  they should be tested in in vivo efficacy models despite poor PK profiles. Indeed, a number of marketed  drugs have shown poor PK profiles but have still become the top ever selling drug – Lipitor (Atorvastatin),  with absolute bioavailability of 5% and 14% in rat and human, respectively [10,11]. As illustrated in Figure 3,  in an analysis of 600 market drugs [12], more than 30% of them have relatively low bioavailability (F <30%),  and  22%  of  the  drugs  have  even  lower  bioavailability  (F  <10  %).  Nearly  50%  of  the  drugs  have  moderate‐to‐high clearance, and 17% show high clearance, or extremely high clearance (even over blood  flow).  As  mentioned  above,  some  of  these  top  selling  drugs  have  many  undesirable  properties  in  terms  of  physicochemical  properties,  such  as  solubility,  Log  D,  in  vitro  microsomal  stability  (Clint),  and  permeability/efflux data, as well as high in vivo clearance or low bioavailability. If we use only PK data to  screen  the  compounds,  some  potential  drug‐like  compounds  might  be  discarded.  In  other  words,  the  Atorvastatin‐like compounds would never have become good drugs from the sole view of PK profiles. These  examples  suggest  that  a  better  understanding  of  in  vitro‐in  vivo  correlation  and  frontloading  PK/PD  is  crucial for compound selection even at an early stage. Obviously, a super PD can save a poor PK as long as  the PD effect is notable.    Wan    ADMET & DMPK 1(3) (2013) 19‐28  26        Figure 3: Distribution of human clearance and bioavailability of market drugs      5. Concluding remarks  Drug discovery and development are a high‐risk, high‐cost but highly rewarding business. Many resources  are invested, and thus wasted on, candidate products that are subsequently found to have unacceptable  profiles when evaluated in human – only less than 10% of INDs from NMEs progress beyond the submission  of new drug application (NDA) according to the FDA’s report [8]. As a very comprehensive and important  science and technology platform bridging efficacy and safety, DMPK has become a discovery function to  optimise ADME properties in drug design, to reduce attrition rates. Recent studies have demonstrated that  it  is  viable  to  implement  high‐throughput  cutting‐edge  technologies  and  cost‐effective  ADME/DMPK  screening  assays,  and  design  relevant  studies  to  address  various  ADME  issues  at  different  stages  for  de‐risking the investment and avoiding development mistakes early.    Apparently, at drug discovery stage, a better understanding of SAR and  in vitro‐in vivo correlations, and  more input on drug design can be anticipated. Moreover, frontloading PK/PD for a better understanding of  the  efficacy‐exposure  relationship  and  dose  prediction  as  early  as  possible  can  benefit  projects.  The  integration of in vitro and in vivo drug metabolism data with physicochemical properties as well as PK and  PD  data  is  highly  recommended  for  safety  and  toxicity  liability  evaluation,  e.g.,  are  there  any  drug  accumulations? Are there any potential toxic metabolites? Are there any likely DDIs? Are estimated safety  margins enough? These safety‐related questions have to be answered as early and clearly as possible to  de‐risk the drug discovery projects. Another concern is risk assessment associated with hERG, CYP inhibition  and  induction,  metabolite  profiling  and  safety,  transporter  substrate  and  inhibition,  safety  margin,  etc.,  which  is of ultimate  importance for CS and decision‐making for the IND‐enabling package. Future ADME  studies will continue to focus on P450 enzymes and transporters’ impact on safe drug delivery as well as  accurate prediction of human PK, PK/PD modeling and optimum clinical dosage.      On the other hand, from the point of view of regulatory review, the FDA has been becoming increasingly  conservative than ever, except for oncology and life‐threatening diseases where a risk‐benefit assessment  can be considered. If a drug is toxic at clinically relevant doses, the IND may never go forward. Therefore, a  complete study/data package including as much detailed toxicity information as possible can facilitate IND  filing  and  increase  the  clinical  trial  success  rate,  which  should  cover  pharmacology  (efficacy  and  animal  ADMET & DMPK 1(3) (2013) 19‐28  ADME Tests for Preclinical Studies  doi: 10.5599/admet.1.3.9  27  proof of principle) studies, a rodent general toxicology study of at least a 14‐day duration, a non‐rodent  general toxicology study of at least a 14‐day duration, genotoxicity studies, safety pharmacology studies,  ADME/PK  as  well  as  bioanalytical  validations,  etc.  In  the  end,  we  must  clearly  answer  these  two  key  questions:    (1) Is the preclinical candidate safe enough to take into humans?    (2) Is the preclinical candidate effective in patients?    Acknowledgements: The author would like to thank Dr. Kin Tam for proofreading this article with valuable  comments.  Declaration:  This  article  reflects  the  author’s  personal  opinions.  The  author  declares  that  he  has  no  competing financial interests.    References  [1] FDA: Draft Guidance for Industry: Drug Interaction Studies – Study Design, Data Analysis,  Implications for dosing, and Labeling Recommendation, (Sept. 2006)  [2] FDA: Guidance for Industry: Drug Interaction Studies – Study Design, Data Analysis, Implications for  dosing, and Labeling Recommendation (February 2012)  [3] FDA: Guidance for Industry: Safety testing of drug metabolites (February 2008)  [4] ICH M3(R2): Guidance on nonclinical safety studies for the conduct of human clinical trials and  marketing authorization for pharmaceuticals (June 2009)  [5] FDA: Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular  Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals (2005)  [6] FDA: Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation (2001)  [7] FDA: Guidance for Industry Content and Format of Investigational New Drug Applications (INDs) for  Phase 1 Studies of Drugs, Including Well‐Characterized, Therapeutic, Biotechnology‐derived  Products (1997)  [8] FDA: Guidance for Industry, Investigators, and Reviewers ‐ Exploratory IND Studies (Jan 2006)  [9] G. Lappin, M. Seymour, Bioanalysis 2 (2010) 1315‐1324.  [10] Y.Y. Lau, H. Okochi, Y. Huang and L.Z. Benet, Drug Metabolism and Disposition 34 (2006) 1175‐1181.  [11] H. Lennernas, Clinical Pharmacokinetics 42 (2003) 1141‐1160.  [12] L.S. Goodman, A. Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw‐Hill Publishers, New  York, USA, 2006.    Abbreviations  ADME      Absorption Distribution Metabolism Excretion  CRO       Contact Research Organization  DMPK      Drug Metabolism and Pharmacokinetics  PK        Pharmacokinetics  Wan    ADMET & DMPK 1(3) (2013) 19‐28  28    CYP450      Cytochrome P450  MDCK      Madin‐Darby canine kidney cells  PPB       Plasma Protein Binding  hERG      human Ether‐a‐go‐go Related Gene  MetID      Metabolite Identification  PD        Pharmacodynamics  P‐gp       P‐glycoprotein  MTD      Maximum Tolerated Dose  IND        Investigational New Drug  GLP        Good Lab Practice  CL        Clearance  F        Absolute bioavailability  Ce(ss)      Effective plasma concentration at steady stage  τ        Dose interval  CS        Candidate Selection  PMAPA      Parallel Artificial Membrane Permeability Assay  NMEs      New Molecular Entities      ©2013 by the authors; licensee IAPC, Zagreb, Croatia. This article is an open‐access article distributed under the terms and  conditions of the Creative Commons Attribution license (http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)