ASKORBI INIHAPON JA DEHYDROASKORBIINIHAPON MÄÄRISTÄ MAIDOSSA ERI KÄSITTELY- JA SÄILYTYSVAI HEI SSA Helge Gyllenberg, Marjatta Rossander ja Paavo Roine Helsingin yliopiston ravintokemian laitos, Helsinki Saapunut 16, 5. 1953 Ensimmäiset maidon C-vitamiinipitoisuutta koskevat tutkimukset 1920- luvulla suoritettiin biologisia menetelmiä hyväksi käyttäen. Kun C-vitamiini-aktii- visuuden omaava yhdistys oli osoitettu askorbiinihapoksi, kehitettiin askorbiini- hapon pelkistämiskykyyn perustuvia, yksinkertaisesti suoritettavia kemiallisia määritysmenetelmiä. 1930-luvulla todettiin kuitenkin eroja kemiallisten ja bio- logisten menetelmien antamien tulosten välillä. Tämä osoittautui johtuvaksi siitä, että myös askorbiinihapon hapettunut muoto dehydroaskorbiinihappo, joka ei enää pelkistä määrityksessä tavallisimmin käytettyä 2,6-diklorfenolindo- fenolia on fysiologisesti aktiivinen, omaten saman C-vitamiinitehon kuin askor- biinihappo. Maitoa koskevissa tutkimuksissa kiinnittivät Washburn ja Kraus (24) eri- tyistä huomiota dehydroaskorbimihapon määrittämisen välttämättömyyteen askor- biinihapon ohella maidon totaalista C-vitamiinipitoisuutta tutkittaessa. Siitä läh- tien onkin maidon C-vitamiinipitoisuutta käsittelevissä tutkimuksissa kiinnitetty tähän seikkaan huomiota, joskin maidon dehydroaskorbiinihaposta on käytettävissä varsin vähän tietoja verrattuna siihen laajaan kirjallisuuteen, joka maidon askor- biinihappopitoisuudesta ja sen muutoksista eri käsittelyvaiheissa on julkaistu. Maidon dehydroaskorbiinihappopitoisuus on useimmissa tutkimuksissa mää- ritetty soveltamalla dehydroaskorbimihapon pelkistämistä rikkivedyllä. On kui- tenkin ilmeistä, että tätä menetelmää on pidettävä epävarmana, etenkin biologisiin materiaaleihin sovellettuna (vrt. esim. 2,7, 4). Tämä johtuu pääasiassa siitä, että rikkivetykäsittely johtaa muidenkin pelkistävien yhdistysten muodostumiseen, jotka häiritsevät askorbiinihapon määrittämistä. Kun nimenomaan Suomesta ei ole käytettävissä juuri lainkaan tietoja maidon dehydroaskorbiinihappopitoisuudesta ja sen suhteesta askorbiinihapon määrään, tullaan seuraavassa esittämään tätä seikkaa selvittävää tutkimusaineistoa. Vaikka aineisto onkin suhteellisen suppea eikä näin ollen oikeuta pitkälle meneviin johto- päätöksiin, se kuitenkin osaltaan valaisee tätä ravitsemuksen kannalta tärkeätä https://www.c-info.fi/en/info/?token=hwKaY5GiBTPQNp7L.EWtgblA52Tfv5vcwOxVxZw.Sr8muOQnS9yKT2QaFQDy_ezipCfGNzFUHJt-NDv8iRM6CR9rC7apZAE45DuJ6u8To4YgDtncATdjUVIUxhtJZcQiNtX64OeQ1OtFFasYzHwbPAYdKpfX2Cvlbw8dnWfGQZw_lWuthlckuZ2Hau8I5mBlODNBBiEkEqOEG3ZSB7p5vZw7cdIBn3AZkM1MnbTs9LmXp-vhhijEN41CP3ETkJc 100 HELGE GYLLENBERG, MARJATTA ROSSANDER JA PAAVO ROINE kysymystä. On myös syytä todeta, että esitettäviin tuloksiin on päädytty sovelta- malla dehydroaskorbiinihapon määrittämisessä ilmeisesti varsin tarkoituksenmu- kaista menetelmää. Tätä menetelmää selostetaan seuraavassa yksityiskohtaisesti. K irjallisuuskatsaus Vastalypsetyssä maidossa on C-vitamiinin yleensä todettu esiintyvän miltei täydellisesti askorbiinihappona. Kon ja Watson (15) sekä Hand (5) eivät toden- neet vastalypsetyssä maidossa lainkaan dehydroaskorbiinihappoa ja Knight ym. (13) vain poikkeuksellisesti pieniä määriä. Holmberg (10) totesi tunnin säilytyksen jälkeen pimeässä n. 10 % dehydroaskorbiinihappoa C-vitamiinin kokonaismäärästä. NiKKiLÄn (18) tulokset, joiden mukaan eräissä näytteissä oh heti lypsyn jälkeen jopa 20 mg/1 dehydroaskorbiinihappoa, siis lähes yhtä paljon kuin askorbiinihappoa- kin, johtunevat käytetyn rikkivety-menetelmän epävarmuudesta. Ilmeiseltä näyt- tää, että dehydroaskorbiinihappo syntyy maidossa vasta säilytyksen ja käsittelyn aikana askorbiimhapon hapettuessa. Askorbiinihapon hapettumista katalysoivat yleensä metallit (lähinnä kupari ja rauta), valo ja askorbiinihappo-oksidaasientsyymi. Maidossa tulevat kysymykseen vain metalli- ja valokatalyysi. Viimeksimainittuun katalyysiin liittyy olennaisena tekijänä riboflaviini-proteiini-kompleksi, jonka määrä maidossa kuitenkin on joten- sakin vakinainen, joten sen muutokset eivät muodostu fotolyysiä rajoittavaksi tai kiihdyttäväksi tekijäksi. Hapen läsnäolo on välttämätön sekä metalli- että valokatalyysissä. Sen vaikutus voidaan esittää seuraavalla yksinkertaisella kaavalla: Askorbiinihappo + Vz 02 = Dehydroaskorbiinihappo H.,0 Siten jokaisen askorbiinihappomolekyylin hapettamiseen dehydroaskorbiini- hapoksi kuluu 1 atomi happea. On kuitenkin todettu, että metallikatalyyttisessä hapettumisessa kuluu 1.19—1.67 atomia happea askorbiinihappomolekyyliä kohti ja fotolyyttisessä 1.57—2 atomia (6), mikä osoittaa, että dehydroaskorbiinihapon muodostumisen lisäksi tapahtuu muitakin hapettumisreaktioita. Näissä reaktioissa muodostuvilla yhdistyksillä, enempää kuin dehydroaskorbiinihaposta syntyvällä 2,3-diketogulonihapollakaan ei ole enää C-vitamiini-aktiivisuutta. Käytännössä voidaan metallien aiheuttama maidon C-vitamiinipitoisuuden alentuminen rajoittaa joterisakin merkityksettömäksi käyttämällä tarkoituksen- mukaisia säilytysastioita ja meijerikoneistoja. Ratkaiseviksi tekijöiksi C-vitamiinin säilymisen kannalta jäävät näin ollen maitoon liuenneen hapen määrä sekä valon vaikutus. Maidon happipitoisuudesta ei ole käytettävissä tietoja Suomesta. Ulkolaisten lähteiden mukaan (3, 9, 20) maito on utareessa miltei happivapaata. Lypsettäessä siihen kuitenkin sekoittuu ilmaa (4.7—5.8 mg 0?/l). Käsin lypsettäessä jonkin ver- ran enemmän kuin konelypsyssä. Maidon säilytyksen ja kuljetuksen aikana happi- pitoisuus edelleen lisääntyy ollen meijerin vaa’assa n. 7 mg/1. Herreid ja FRAN- CISin (9) mukaan tämä happimäärä säilyy maidossa siten, että pullotetussa maidossa \SKORSIINI HAPON JA DEHYUROASKORBI INIHAPON MÄÄRISTÄ MAIDOSSA 101 on suunnilleen sama happipitoisuus kuin meijeriin punnitussa. Meijerikäsittely aiheuttaa kuitenkin eräitä vaihteluja, joista mainittakoon pastöroinnin happi- pitoisuutta alentava vaikutus sekä homogenisoinnin ja jäähdytyksen kohottava vaikutus. Eräät tutkimukset käytännön olosuhteissa (3, 20) ovat osoittaneet, että maidon deaeroiminen, happipitoisuuden alentaminenoo.o.s mg:aan/l, on ratkai- sevasti edistänyt maidon askorbiinihapon säilyvyyttä. Valon suhteen tiedetään, ettei väritön lasi suojaa maitoa askorbiinihappo- häviöiltä (11). Vahalla impregnoidut paperiastiat suojaavat sitävastoin jo huomat- tavan hyvin (11) ja parhaan suojan tarjoavat värilliset lasiastiat (7, 22). Väril- lisistä laseista ovat punaiset ja ruskeat edullisimmat (11, 16, 17), kun sen sijaan vihreissä pulloissa tapahtuu melko nopeaa askorbiinihapon häviämistä (10, 11). Maidon kuumentamisen (pastöroinnin) vaikutus riippuu lähinnä hapettumis- reaktioiden lämpötilakertoimista, siis siitä missä määrin kohoava lämpötila kiihdyt- tää reaktioita. Woessner ym. (25) ovat esittäneet käsityksen, että askorbiini- hapon hapettumisen lämpötilakerroin olisi varsin alhainen, mutta sen sijaan dehydro- askorbiinihapon tuhoutumisen lämpötilakerroin korkea. Tämä käsitys on sopu- soinnussa sen yleisen havainnon kanssa, että pastöroiminen miltei totaalisesti tuhoaa dehydroaskorbiinihapon (5, 15, 25). On siten ilmeistä, että pastöroinnin vaikutus maidon C-vitamiinin häviämiseen lähinnä rajoittuu dehydroaskorbiinihapon tuhoa- miseen ja riippuu maidon dehydroaskorbiinihappopitoisuudestapastöroimishetkellä. Roine (19) ja Maxa (17) ovat kiinnittäneet huomiota käymisteitse valmistet- tujen maitotuotteiden merkitykseen maidon alkuperäisen C-vitamiinin säilyttämi- seksi. Näissä tuotteissa C-vitamiini esiintyy pääasiassa askorbiinihappona, johtuen siitä että maitohappobakteerit pelkistävät dehydroaskorbiinihappoa askorbiini- hapoksi. Kun labiilimpi dehydroaskorbiinihappo näin pelkistyy pysyvämmäksi askorbiinihapoksi on seurauksena, että maidon C-vitamiini kokonaisuudessaan on vähemmässä määrässä tuhoutumiselle altista. Hapetus-pelkistys-systeeminä aktiivisen dehydroaskorbiinihappo / askorbiini- happo-systeemin vaikutuksesta kulutusmaidon yleisen hapettumisvirheen, ns. talin maun, muodostumiseen on olemassa runsaasti kirjallisuutta. Tähän seikkaan ei kuitenkaan tässä yhteydessä ole syytä tarkemmin puuttua. Dehydroaskorbiinihapon määrittäminen Kohman ja Sanbornui (14) havaitseman eräiden kasviuutteiden dehydro- askorbiinihappoa pelkistävän vaikutuksen lisäksi on tunnettua, että myös eräät bakteerit aikaansaavat dehydroaskorbiinihapon pelkistymisen. Ensimmäisenä osoitti Tkachenko (23) tämän ilmiön eräillä Lactobacillus- lajeilla. Myöhemmin Esselen ja Fuller (1) totesivat eräiden Escherichia coli kantojen olevan erittäin aktiivisia dehydroaskorbiinihapon pelkistäjiä. Heidän havaintoaan ovat Gunsalus ja Hand (2) sekä Stewart ja Sharp (21) käyttäneet hyväksi menetelmän kehittä- miseksi dehydroaskorbiinihapon määrittämiseksi. Gunsalus ja Hand ovat sovel- taneet menetelmäänsä myös maitoon, ja näin ollen selostettavaa tutkimusta vai- 102 HELGE GYLLENBERC MARJATTA ROSSANDER JA PAAVO ROINE luisteltaessa päädytyinkin tämän menetelmän käyttöön. Kun menetelmä kuitenkin edellyttää kerrasta toiseen muuttuvan biologisen materiaalin käyttöä, suoritettiin aluksi seikkaperäinen tutkimus niiden olosuhteiden selvittämiseksi, jotka ovat edellytyksenä luotettavien tulosten saavuttamiseksi määrityksissä. Dehydroaskorbiinihapon määrittämismetodiin kohdistetuissa kokeissa käytet- tiin seuraavia yleisiä menetelmiä. Tarvittavat solususpensiot valmistettiin viljelemällä E. colia joko puskuroi- dussa glukoosi-peptoni-liuoksessa tai vastaavalla kiinteällä alustalla suurissa petri- maljoissa. Liuoksesta solut erotettiin sentrifugoimalla ja agarilta huuhtomalla steriilillä 0.9 % NaCl-liuoksella. Molemmissa tapauksissa solumassa pestiin sentri- fugissa NaCl-liuoksella ja resuspendoitiin sen jälkeen toiseen erään tätä liuosta. Suspensiota säilytettiin jääkaapissa. Gunsalus ja Hand (2) ilmoittavat solusus- pension näin menetellen säilyttävän aktiivisuutensa ainakin kuukauden, mutta kokeissamme osoittautui, että käytetyn E. coli-kannan solususpensiot alkoivat menettää aktiivisuuttaan jo viikon säilytyksen jälkeen. Kokeissa käytetyt dehydroaskorbiinihappoliuokset valmistettiin Kohman ja SANBORNin (14) mukaan hapettamalla askorbiinihappoa ekvivalentilla määrällä jodiliuosta. Koeliuoksen pH säädettiin s.9:ksi 0.1 M fosfaattipuskurilla. Niissä kokeissa, joissa glukoosia tai laktoosia käytettiin substraattina, valmistettiin näistä sokereista 1 %:nen liuos fosfaattipuskuriin. 30 mhaan tätä liuosta lisättiin 10 ml solusus- pensiota ja inkuboitiin 30 min. 37°:ssa. Tämän jälkeen pH säädettiin uudelleen NaOH-lisäyksellä s.9:ksi ja lisättiin 10 ml dehydroaskorbiinihappoliuosta. Koe- liuoksen dehydroaskorbiinihappopitoisuus oh tämän jälkeen 40—50 (jg ml. Inku- bointia 37°:ssa jatkettiin ja määrätyin aikavälein (5—10 minuuttia) otettiin näyt- teet (5 ml) askorbiinihapon määrittämiseksi. Näytteeseen lisättiin 5 ml 2 % oksaali- happoa ja määritys suoritettiin titraamalla 2,6-diklorfenolindofenolilla. Alunperin tutkituista kolmesta E. co//-kannasta vain yksi, »coli 9», pelkisti dehydroaskorbiinihappoa. Tätä kantaa käytettiin kaikissa myöhemmissä kokeissa. Gunsalus ja Hand (2) ovat todenneet, että parhaat tulokset saavutetaan nuorista viljelmistä valmistetuilla solususpensioilla. Tätä seikkaa tutkittiin kannan »coli 9» suhteen, jolloin osoittautui että nuoresta viljelmästä (24 tuntia) valmistetun solu- suspension käyttäminen on ratkaiseva edellytys dehydroaskorbiinihapon pelkisty- miselle. Vanhemmista viljelmistä valmistetut suspensiot olivat kokonaan vailla aktiivisuutta (piirros 1). Aikaisemmin on todettu, että sellaisen hiilihydraatin lisääminen koeliuokseen, jota ko. bakteerikanta pystyy käyttämään, kiihdyttää dehydroaskorbiinihapon pelkistymistä (ks. 2). Meidän tutkimamme kannan solususpensiot eivät pelkistä- neet dehydroaskorbiinihappoa juuri lainkaan pelkässä puskuriliuoksessa. Sen sijaan glukoosipitoisessa liuoksessa pelkistyminen oli hyvin nopeaa. Nopea pelkistyminen edellytti kuitenkin edellä selostettua esi-inkubointia. Mikäli dehydroaskorbiini- happo lisättiin koeliuokseen heti, oh sen pelkistyminen huomattavasti hitaampaa (piirros 2). Mikäli koeliuokseen lisättiin laktoosia glukoosin asemesta ja esi-inku- bointia ei suoritettu, oli todettavissa selvä viipymisvaihe (»lag») ennen pelkis- tymisen alkamista. Tämä on selitettävissä siten, että glukoosipitoisessa alustassa kasvaneet solut tarvitsevat tietyn ajan sopeutuakseen käyttämään laktoosia (vrt. 12). Selostettu ilmiö viittaa myös siihen, että sokerin käyminen on edellytyksenä dehydroaskorbiinihapon pelkistymiselle. Samaa osoittavat myös eräiden kokeiden tulokset, joissa koeliuokseen lisätjm glukoosin käyminen ehkäistiin monojodetikka- hapolla tai natriumfluoridilla. Tämä johti myös dehydroaskorbiinihapon pelkisty- misen inhiboitumiseen. Dehydroaskorbiinihapon pelkistymisen nopeus näytti myös hyvin suuressa määrässä riippuvan koeliuoksen pH:sta. Stewart ja Sharp (21) ovat ilmoittaneet pH 5.9 optimaaliseksi dehydroaskorbiinihapon pelkistymiselle. Suorittamamme koe osoitti tämän havainnon oikeaksi, sillä pH;n kohottaminen 6.2:een hidasti jo huomat- tavasti pelkistymistä (piirros 3). Eräissä lisäkokeissa tutkittiin myös kuparin ja raudan vaikutusta dehydro- askorbiinihapon pelkistymiseen. Kuten piirros 4 osoittaa, on raudan ehkäisevä vaikutus vielä konsentraatiossa 13 [xg/ml melko vähäinen, kun sen sijaan kupari jo konsentraatiossa 1.5 gg/ml hidastaa pelkistymistä, ja ehkäisee sen konsentraa- tiossa 6 pg/ml kokonaan. Raudan läsnäolo lisää kuparin ehkäisevää vaikutusta. Piirros 1. Bakteeriviljelmän iän vaikutus siitä valmistetun solususpension aktiivisuuteen. Fig. 1. Effect of the age of the E. coli culture on the activity of the cell suspension. 1. Suspensio 24 tunnin ikäisestä viljelmästä Suspension from a 24 hrs old culture. 2. Suspensio 48 tunnin ikäisestä viljelmästä Suspension from a 48 hrs old culture. Piirros 2. Esi-inkuboinnin vaikutus solususpension aktiivisuuteen. Fig. 2. Effect of pre-incubation on the activity of the cell suspension. 1. Esi-inkuboitu solususpensio Pre-incubated suspension. 2. Ilman esi-inkubointia No pre-incubation. 103AISKORBIINIHAPON JA DEHYDROASKORBIINIHAPON MÄÄRISTÄ MAIDOSSA HELGE GYLLENBERG, MARJATTA ROSSANDER JA PAAVO ILOINE104 Rutiinimenetelmänä käytettynä dehydroaskorbiinihapon määritys maidosta suoritettiin seuraavasti: E. coli-massa valmistettiin kuten yllä on selostettu. Solut suspendoitiin steriiliin 0.9 % NaCl-liuokseen. Yhdistettiin yhtä suuret määrät solususpensiota ja 0.1 M fosfaattipuskuria (pH 5.9), joka sisälsi 1 % glukoosia. Tätä seosta inkuboitiin 30—45 minuuttia 37°:ssa. pH säädettiin uudelleen s.9:ksi. 5 inkaan tutkittavaa maitoa lisättiin 5 ml esi-inkuboitua substraattiliuosta, ja tätä seosta inkuboitiin edelleen 20—30 minuuttia 37°:ssa. Sen jälkeen näyte huuhdot- tiin 10 mklla 2 % oksaalihappoa dekantterilasiin ja tiirattiin välittömästi 2,6- diklorfenolindofenolilla. Samasta maitonäytteestä oli askorbiinihappo sillä välin määritetty suoralla diklorfenolindofenoli-titrauksella. Molemmissa titrauksissa saa- tujen arvojen erotus ilmaisee dehydroaskorbiinihapon määrän. Kunkin analyysisarjan yhteydessä suoritettiin tarkistusmäärityksiä käyttä- mällä tunnettua dehydroaskorbiinihappoliuosta bakteerisuspension aktiivisuuden kontrolloimiseksi. Puhtaassa dehydroaskorbiinihappoliuoksessapelkistyi 95 — 98% lasketusta dehydroaskorbiinihappomäärästä askorbiinihapoksi. Kun maitoon lisät- tiin tunnettuja dehydroaskorbiinihappomääriä, voitiin todeta dehydroaskorbiini- hapon pelkistymisen maidossa olevan samaa suuruusluokkaa. Piirros 3. Koe-liuoksen pH:n vaikutus dehydro- askorbiinihapon pelkistymiseen. Fig. 3. Effect of the pH of the solution on the reduc- tion of dehydroascorbic acid. 1. pH 5.6. 2. pH 5.9. 3. pH 6.2. Piirros 4. Kuparin ja raudan vaikutus dehydro- askorbiinihapon pelkistymiseen. Fig. 4. Effect of copper and iron on the reduction of dehydroascorbic acid. 1.1.5 /ig Cu/ml. 2. 3 /ig Cu/ml. 3. 6 ug Cu/ml. 4. 5 /-g Fe/ml. 5. 13 /ig Fe/ml. 6. 3 /ig Cu + 2.5 /ig Fe/ml. ASKORBIINIHAPON JA DEHYDROASKORBIINIHAPON MÄÄRISTÄ MAIDOSSA 105 Taulukko 1. Valon ja ilman vaikutus askorbiinihapon ja dehydroaskorbiinihapon häviämiseen maidossa. Table 1. Effect of light and air on the losses of ascorbic acid and dehydroascorbic acid in milk. Kok.-C- Askor- Dehydro- Askorbiini- Hävinnyt vitamiini biini askor- happo %:ina 2 tunnissa, % happo biini- kokonais happo C-vitamii- Lost in 2 hours, nista per cent Valottaminen Exposure Askorbii- Kok.- nihappo C-vita- Total Ascor- Dehydro Ascorbic acid, miinivitamin C bic ascorbic %of the Ascorbic Total acid acid total vitamin C acid vita- min C H-g/ml p-g/ml pg/ml Ei valotettu 22.6 21.9 0.7 97.0 No exposure 2 tuntia varj. päivänvalossa 2 hrs in shaded daylight Väritön pullo 20.4 11.8 8.6 58.0 46 10 Colourless bottle Ruskea pullo 20.9 15.6 5.3 74.7 29 8 Brown bottle 2 tuntia varj. päivänvalossa ravistettu 2 hrs in shaded daylight, shaked Väritön pullo 20.1 10.2 9.9 50.9 53 11 Colourless bottle Ruskea pullo 20.6 13.7 6.9 66.5 37 9 Brown bottle 2 tuntia auringonvalossa 2 hrs in sunlight Väritön pullo 6.3 1.4 4.9 22.3 94 72 Colourless bottle Ruskea pullo 17.8 9.7 8.1 55.2 56 21 Brown bottle 2 tuntia auringonvalossa laakeassa maljassa 5.51.1 4.420.0 95 76 2 hrs in sunlight in a white dish Valon ja hapen vaikutus askorbiinihapon ja dehydroaskorbiinihapon määriin maidossa Laboratoriomittakaavassa suoritettiin eräitä kokeita, joiden tarkoituksena oli valaista, miten maidon asettaminen valolle alttiiksi ja ilman sekoittaminen siihen vaikuttaa askorbiinihapon ja dehydroaskorbiinihapon määriin. Kokeissa käytettiin sekamaitoa, joka oli lypsetty n. 12 tuntia aikaisemmin ja sen jälkeen välittömästi jäähdytetty o°:seen. 300 ml maitoa lisättiin 500 ml:n reagenssipulloihin, joita oli kahta laatua; värittömiä ja ruskeita. Yksi pullo kumpaa- kin lajia asetettiin kahdeksi tunniksi auringonvaloon (ikkunalaudalle; aamupäivä; toukokuu), yksi pullo varjostettuun päivänvaloon (varjonpuoleinen huone) ja yhtä pulloa ravisteltiin 2 tuntia varjostetussa päivänvalossa ravistelukoneessa. Sen lisäksi vastaavaa maitomäärää valotettiin auringonvalossa laakeassa porsliini- maljassa. Kokeen päätyttyä määritettiin askorbiimhappo ja dehydroaskprbiini- happo kaikista pulloista kuten yllä on selostettu. Kokeen tulokset on esitetty taulukossa 1. Tulosten yhdistelmistä käy ilmi, että maidon asettaminen alttiiksi varjoste- tulle päivänvalolle on koeajan kuluessa aiheuttanut vain n. 10 %:iin nousevan häviön C-vitamiinin kokonaismäärässä, ja että ruskea lasi on vain vähäisessä mää- rässä pienentänyt tätä häviötä. Askorbiinihapon ja dehydroaskorbiinihapon määriä näissä tapauksissa erikseen tarkasteltaessa toteaa kuitenkin, että askorbiinihapon määrä värittömissä pulloissa on alentunut huomattavasti nopeammin, joten askor- biinihapon suhteellinen osuus kokonais-C-vitamiinipitoisuudesta on näissä säilytys- astioissa supistunut vähäisemmäksi kuin ruskeissa pulloissa. Näissä koe-olosuhteissa on siis askorbiinihappo pääasiassa hapettunut dehydroaskorbiinihapoksi, jota tapah- tumaa ruskea lasi on selvästi ehkäissyt, ja dehydroaskorbiinihapon edelleen muut- tumista on tapahtunut melko vähäisessä määrässä. Maidon ravistaminen kokeen kuluessa on jonkin verran edistänyt askorbiinihapon hapettumista molemmissa säilytysastioissa. Auringonvalossa oh C-vitamiinin kokonaishäviö sekä värittömässä pullossa että avonaisessa maljassa yli 70 %. Askorbiinihappo on hapettunut miltei kvantita- tiivisesti, ja sen osuus kokonais-C-vitamiinimäärästä on supistunut n. 20 %:ksi. Samanaikaisesti on myös runsaasti dehydroaskorbiinihappoa hajonnut edelleen. Ruskeassa pullossa on vielä yli puolet askorbiinihaposta säilynyt, joten ruskea lasi on tässäkin tapauksessa ehkäissyt varsinaista askorbiinihapon hapettumista. Myös dehydroaskorbiinihapon häviäminen on ollut ruskeassa pullossa huomattavasti hitaampaa kuin värittömässä pullossa. Kauppamaitoa koskevat tutkimukset Kauppamaitoon kohdistuneissa tutkimuksissa meneteltiin seuraavasti: Näytteet hankittiin muutamista Helsingin maitokaupoista, jotka oh valittu siten, että ne edustivat eri meijereiden maitoa. Näytteet otettiin ruskeisiin pulloi- hin ja kuljetettiin laboratorioon, missä analyysit suoritettiin välittömästi. Ensim- mäinen tutkimusjakso suoritettiin kesäkuussa (1952) ja vastaavat määritykset uusittiin marraskuussa (1952) ja helmikuussa (1953). Kesäkuussa tutkittiin vertailu- mielessä myös muutamilta maatiloilta saatuja vastalypsettyä maitoa edustavia näytteitä. Määritysten tulokset on esitetty taulukossa 2. Käytettävissä olevan aineiston pienuus tekee sen tilastollisessa mielessä epäluotettavaksi, mutta kuitenkin esitetyt tulokset oikeuttavat päätelmään, että askorbiinihapon osuus kauppamaiden koko- nais-C-vitamiinipitoisuudesta on valoisana ja lämpimänä vuodenaikana huomat- tavasti vähäisempi kuin pimeänä ja kylmänä vuodenaikana. Vastalypsettyä ja 106 HELGE GYLLENBERG, MARJATTA ROSSANDER JA PAAVO ROINE ASKORBIINIHAPON JA DEHYDROASKORBIINI HAPON MÄÄRISTÄ MAIDOSSA 107 I aulukko 2. Kauppamaidon kokonais-C-vitamiini- ja askorbiinihappopitoisuus eri vuodenaikoina. 7 able 2. I itämin C and ascorbic acid content of market milk in different seasons. Kokonais-C-vitamiini Askorbünihappo Askorbiini- Näytteiden Total vitamin C Ascorbic acid happo %ina lukumäärä Keskim. Vaihtelu- Keskim. Vaihtelu- kok 2C: vlta ' Numberof average rai at avera Ze ralat . m“nlsta .j . Ascorbic acid,samples limits of limits of o, 0 f the total variation variation mtamln c pg/ml pg/ml pg/ml pg/ml Vastalypsetty maito, kesäkuu 8 22.1 18.7—25.8 20.9 17.7—25.5 94.5 Freshly drawn milk, June Kauppamaito, kesäk. .. 30 15.1 12.7—17.1 10,9 8.0—12.6 72.3 Market milk, June Kauppamaito, marrask. 15 16.4 14.6—17.9 14.5 13.0—15.7 88.7 Market milk, November Kauppamaito. helmik. . . ll 16.8 15.4—17.8 16.1 14.7—17.5 95,9 Market milk, February kauppamaitoa edustavat luvut eivät ole suoraan vertailukelpoisia, mutta todetta- koon kuitenkin että kauppamaidon askorbiinihappopitoisuus on vain noin puolet (10.9 mg 1) vastaavasta määrästä vastalypsetyssä maidossa (20.9 mg/1), kun sen sijaan kokonais-C-vitamiinista vain vajaa kolmannes näyttää tuhoutuneen. Tämä on sopusoinnussa edellä selostettujen laboratoriokokeissa tehtyjen havaintojen kanssa päivänvalon vaikutuksesta maidon askorbiini- ja dehydroaskorbiinihappo- pitoisuuteen. Edelleen taulukko 2 osoittaa, että kauppamaidon kokonais-C-vita- miinipitoisuus on melko stabiili vuodenajasta riippumatta. On kuitenkin muistet- tava, että suurempi labiilimman dehydroaskorbiinihapon määrä saattaa nopeasti johtaa myös kokonais-C-vitamiinipitoisuuden alentumiseen. Kauppamaidon suhteen tutkittiin myös askorbiinihapon ja dehydroaskorbiini- hapon määrien muutoksia vuorokauden kestävän säilytyksen aikana. Näytteet säilytettiin ruskeissa pulloissa pimeässä. Tutkittiin kahta säilytyslämpötilaa, O ja 18°. Tämän kokeen tulokset on esitetty taulukossa 3. Taulukosta ilmenee, että säilytyslämpötilan ollessa 0° on kokonais-C-vitamiini- häviö ollut 2.6 mg 1. Samanaikaisesti aleni askorbiinihapon määrä 4.4 mg/1. Erotus, 1.8 mg/1, on todettavissa dehydroaskorbiinihapon lisääntymisenä. Siten myös askorbiinihapon suhteellinen osuus kokonais-C-vitamiinista on huomattavasti alen- tunut ja dehydroaskorbiinihapon vastaavasti noussut. Näyttää siten siltä, että alhainen säilytyslämpötila ei ehkäise askorbiinihapon hapettumista dehydroaskor- biinihapoksi, mutta että viimeksi mainittu yhdistys on näissä olosuhteissa melko pysyvä. Maitoa huoneen lämpötilassa säilytettäessä kuva on täysin toisenlainen. C-vita- miinin kokonaishäviö on tosin jonkin verran suurempi, 4.2 mg/1, mutta suurin osa HELGE GYLLENBERG, MARJATTA ROSSANDER JA PAAVO ROINE108 Taulukko 3. Kauppamaidon askorbiinihappo- ja dehydroaskorbiinihappopitoisuuden muutokset vuorokauden säilytyksen aikana. Table 3. Changes in the ascorbic acid and dehydroascorbic acid contents of market milk during storage for 24 hrs. Kok.-C- Askorbiinihappo Dehydroaskorbiinihappo vitamiini A scoybic udd Dehydvouscovbic udd Total ’ " “ " ~ . \ vitamin C % :a kok ;- % :a kok - C-vitamn- C-vita- nista miinista % of the % of the total vita- total min C vitamin C ng/ml ug/ml l^g/ml I. Säilytyslämpötila 0° Stored at O°C Kokeen alkaessa .... 15.2 10.9 71.9 4.3 28.1 At the beginning Kokeen päättyessä .. 12.6 6.5 51.1 6.1 48.9 At the end Muutos kokeen aikana —2.6 (—l7 %) —4.4 (—4l %) +l.B (+42 %) Change during storage 11. Säilytyslämpötila 18° Stored at 18°C Kokeen alkaessa .... 15.210.7 70.24.5 29.8 At the beginning Kokeen päättyessä .. 11.09.1 82.71.9 1i 2 At the end Muutos kokeen aikana —4.2 ( —28 %) —1.6 (—l5 %) —2.6 ( 58 %) Change during storage tästä häviöstä tulee dehydroaskorbiiuihapon osalle, 2.6 mg 1. Siten on askorbiini- hapon suhteellinen osuus kokonais-C-vitamiinipitoisuudesta noussut (70.2 resp. 82.7 %). Huoneenlämpötilassa askorbiinihappo on siis sangen pysyvää, mutta korkea säilytyslämpötila näyttää sen sijaan edistävän dehydroaskorbiiuihapon häviämistä. Askorbiinihapon pysyvyyteen korkeassa säilytyslämpötilassa on bakteeritoiminnalla, joka aiheuttaa muodostuvan dehydroaskorbiiuihapon osittaisen jälleenpelkistymisen askorbiinihapoksi, ilmeisesti ollut suuri osuus. Kauppamaitoon kohdistetussa tutkimuksessa kiinnitettiin myös huomiota nii- hin muutoksiin maidon askorbiinihapon ja dehydroaskorbiinihapon keskinäisissä suhteissa, joita meijerikäsittely mahdollisesti aiheuttaisi. Näitä kokeita, jotka suoritettiin eräässä Helsingin kaupunkimeijerissä, vaikeutti meijeriin saapuvan maidon heterogeenisuus. Saapuvan maidon eri erät, jotka olivat eri tavoin käsi- teltyjä ja kuljetettuja, sekoittuivat meijerissä, joten kunkin erän vastaista kulkua oli mahdoton seurata. Meijeriin saapuvan maidon kokonais-C-vitamiinipitoisuus oli suunnilleen sama (18.5—19.0 mg/1) sekä suoraan maatiloilta että maaseutumeijereistä autoilla saapu- ASKORBIINIHAPON JA DEHYDROASKORBIINIHAPON MÄÄRISTÄ MAIDOSSA 109 vassa maidossa. Sen sijaan junalla maaseutumeijereistä kuljetetun maidon C- vitamiinipitoisuus oh huomattavasti alhaisempi (15.4 mg/1). Suoraan maatiloilta saapuvan maidon suhteellinen dehydroaskorbiinihappopitoisuus oh jonkin verran korkeampi kuin maaseutumeijereistä autoilla kuljetetun maidon (9 resp. 7 % C- vitamiinin kokonaismäärästä). Tämä johtunee siitä, että jälkimmäisessä maidossa oli pastöroituja maitoeriä, joista dehydroaskorbiinihappo on pastöroitaessa tuhoutu- nut. Kuljetuksen aikana vallinneissa olosuhteissa on siten askorbiinihappo vain melko vähäisessä määrässä ehtinyt hapettua dehydroaskorbiinihapoksi. Hidas junakuljetus oh kuitenkin johtanut myös dehydroaskorbiinihapon suhteellisen määrän lisääntymiseen maaseutumeijereistä saapuvassa maidossa (11 % C-vita- miinin kokonaismäärästä). Meijereistä jakeluun lähtevän maidon C-vitamiinin kokonaismäärä oli käytän- nöllisesti katsoen sama kuin saapuvan maidon. Sitävastoin oh jakeluun lähtevän maidon askorbiinihappopitoisuus jonkin verran alhaisempi kuin meijeriin saapuvan maidon (15.9 resp. 16.6 mg/1). Vastaavasti oli dehydroaskorbiinihapon suhteellinen määrä jakeluun lähtevässä maidossa korkeampi kuin meijeriin saapuvassa maidossa (11.3 resp. 7.5 % C-vitamiinin kokonaismäärästä). Maidon käsittely ja säilytys meijerissä on siten johtanut vähäiseen maidon dehydroaskorbiinihappopitoisuuden kohoamiseen, C-vitamiinin kokonaismäärän säilyessä muuttumattomana. Dehydro- askorbiinihapon määrän lisääntyminen on katsottava niin vähäiseksi, ettei se välit- tömästi osoita maidon C-vitamiinin säilyvyyden alentuneen meijerikäsittelyn ja -säilytyksen seurauksena. Y hteenveto Tutkimuksen tarkoituksena oh selvittää maidon askorbiinihapon ja dehydro- askorbiinihapon määriä ja keskinäisiä suhteita sekä niiden muutoksia etenkin sel- laisissa olosuhteissa, jotka tulevat kysymykseen kauppamaiden eri käsittely- vaiheissa. Maidon dehydroaskorbiinihappopitoisuus määritettiin pelkistämällä dehydro- askorbiinihappo titrimetrisesti määritettäväksi askorbiinihapoksi Escherichia colin lepäävien solujen suspensiolla. Tähän menetelmään erikseen kohdistetussa kokeissa todettiin maksimaalisen pelkistymistuloksen riippuvan seuraavista tekijöistä: 1. Bakteerikannasta. Kaikki E. coli-kannat eivät pelkistä dehydroaskorbiini- happoa. 2. Solususpension valmistamiseen käytetyn viljelmän iästä. Ko. viljel- män pitää olla 24 tunnin ikäinen tai sitä nuorempi. 3. Solususpension iästä. Viikkoa kauemmin säilytettyä solususpensiota ei ole tarkoituksenmukaista käyt- tää. 4. Koeliuoksen pH:sta. Dehydroaskorbiinihapon pelkistymisen pH-optimi on 5.9—6.0. 5. Koeliuoksen kokoomuksesta. Koeliuoksen pitää sisältää käytet- tävälle bakteerikannalle käyttökelpoista hiilihydraattia. Koetulokset vhttaavat siihen, että sokerin käyminen on ratkaiseva edellytys dehydroaskorbiinihapon pelkistymiselle. Koeliuoksen (ja maidon) kupari- ja rautapitoisuus vaikuttaa myös pelkistymistulokseen. Jo 1.5 gg Cu/ml hidastaa pelkistymistä. Raudan vaikutus 110 HELGE GYLLENBERC MARJATTA ROSSANDER JA PAAVO ROINE on huomattavasti vähäisempi, mutta rauta lisää kuparin vaikutusta. 6. Pel- kistämisajan pituudesta. Optimaalinen pelkistämisaika on 20 minuuttia. Pidempi aika johtaa muodostuneen askorbiinihapon uudelleen hapettumiseen. ■—- 7. Solujen aktiivisuudesta pelkistämisen alkaessa. Solujen aktiivisuutta voidaan lisätä suorit- tamalla esi-inkuboiminen puskuroidussa glukoosiliuoksessa ennen tutkittavan maito- näytteen lisäämistä. Saavutetut tulokset ovat pääkohdiltaan yhtäpitäviä Gunsalus ja Handui (2) sekä Stewart ja SnARPin (21) aikaisemmin esittämien tietojen kanssa. Solusus- pension aktiivisuuden säilymisen, koeliuoksen kokoomuksen ja esi-inkuboinnin välttämättömyyden suhteen tulokset kuitenkin poikkesivat aikaisemmin saaduista. Kuparin ja raudan vaikutuksesta bakteerien aiheuttamaan dehydroaskorbiini- hapon pelkistymiseen ei kirjallisuudessa esiinny tietoja. Vastalypsetyssä maidossa on C-vitamiini käytännöllisesti katsoen kvantita- tiivisesti askorbiinihappomuodossa. Tämä havainto vahvistaa aikaisempien tutki- joiden esittämiä tietoja. Tutkittaessa valon vaikutusta askorbiinihapon ja dehydroaskorbiinihapon määriin maidossa todettiin varjostetun päivänvalon aiheuttavan pääasiassa askor- biinihapon hapettumista dehydroaskorbiinihapoksi, kokonais-C-vitamimipitoisuu- den säilyessä lähes muuttumattomana. Dehydroaskorbiinihappo on siis näissä olosuhteissa sangen pysyvä. Ruskea lasi hidastaa askorbiinihapon hapettumista. Suorassa auringonvalossa tuhoutuu myös dehydroaskorbiinihappo nopeasti joskin ruskea lasi hidastaa jonkin verran tätäkin tapahtumaa. Ilman sekoittaminen mai- toon (säilytysastian ravistaminen) kiihdyttää jonkin verran askorbiinihapon hapet- tumista, mutta ei suljetussa astiassa vaikuta sanottavasti kokonais-C-vitamiini- pitoisuuteen. Kauppamaidon kokonais-C-vitamiinipitoisuus todettiin suunnilleen samaksi kaikkina vuodenaikoina. Askorbiinihappopitoisuus on sen sijaan kesällä huomat- tavasti alhaisempi kuin syksyllä ja talvella. Säilytettäessä kauppamaitoa o°:ssa todettiin huomattavaa askorbiinihapon hapettumista. Dehydroaskorbiinihappo todettiin sen sijaan tässä lämpötilassa melko pysyväksi. 18°:ssa suurin osa dehydroaskorbiinihaposta tuhoutuu, mutta askorbiinihappohäviöt ovat vähäiset. Maidon käsittely ja säilytys meijerissä ei aiheuta varsinaisia C-vitamiini- tappioita, mutta askorbiinihapon hapettumista dehydroaskorbiinihapoksi tapahtuu vähäisessä määrässä. KIRJALLISUUSLUETTELO (1) Esselen, W. B. jaFuller, J. E., 1939. The oxidation of ascorbic acid as influenced by intestinal bacteria. J. Bact., 37, 501—521. (2) Gunsalus, I. C. ja Hand, D. 8., 1941. Use of bacteria in the chemical determination of total vitamin C. J. Biol. Chem., 141, 853—858. ASKORBI INIHAPON JA DEH YDROASKORBI INIHAPON MÄÄRISTÄ MAIDOSSA 111 (3) Guthrie, E. S., 1946. The results of deaeration on the oxygen, vitamin C, and the oxidized flavors of milk. J. Dairy Sei., 29, 359—369. (4) György, P. ja Rubin, S. H,, 1950, Chemical methods of vitamin assay (in Vitamin Methods, vol. I, ed. by P. György, New York, Academic Press). (5) Hand, D. 8., 1943. Reduced and total vitamin Cin milk. J. Dairy Sei., 26, 7 12, (6) Hand, D. B. ja Greisen, E. C,, 1942. Oxidation and reduction of vitamin C. J. Amer. Chem. Soc., 64. 358—361. (7) Hawk, P. 8., Oser, B. L. ja Summerson, W. H., 1948. Practical Physiological Chemistry, 12th ed. Philadelphia, The Blakiston Company, (8) Henderson, J. L., Foord, D. C. ja Roadhouse, C. L., 1940. Influence of sunlight on flavor and ascorbic acid content of milk exposed in three different types of paper containers. Food Res., 5. 153—159. (9) Herreid, E. O. ja Francis, J., 1949. The effect of handling and processing milk on its oxygen content. J. Dairy Sei., 32, 202—208. (10) Holmberg C. G., 1938. The effect of pasteurization on the vitamin C content of winter milk. Kgl. Fysiograf. Sällskap. Lund, Förh. 7, 105—110. Ref. C.A., 34. 2477*, 1940. (11) Houston, J., Kon, S. K. ja Thompson, S. Y., 1939. The effect of light on the vitamin C of milk in different containers. J. Dairy Res., 10, 471—474. (12) Karström, H., 1930. Über die Enzymbildung in Bakterien und über einige physiologische Eigen- schaften der untersuchten Bakterien. Ann. Acad. Sei. Fen., A, 33: 2. (13) Knight, S. A., Dutcher, R. A. ja Guerrant, N. 8., 1939. The quantitative determination of vitamin C in milk. Science, 89, 183—185. (14) Kohman, E. F. ja Sanborn, N. H., 1937. Vegetal reduction of dehydroascorbic acid, Ind. Eng. Chem. 29. 1195—1199. (15) Kon, S. K, ja Watson, M. 8., 1936. The effect of light on the vitamin C content of milk. Biochem, J., 30, 2273—2290. (16) Kroner, F., 1938. Über das vitamin C in Kuh- und Frauenmilch und die Möglichkeit der Her- stellung einer vitamin C-Milch. Milchw. Forsch., 19, 318—337. (17) Maxa, V., 1949. The decreases of vitamin C during some treatments of milk. Int. Dairy Congr. XII, Stockholm, 2, 208. (18) Nikkilä, O. E., 1948. Talin maku maidossa. Meijeritiet. aikakausk., X, 109—118. (19) Roine, P., 1948. Effect of oxidation-reduction potential on the stability of ascorbic acid in milk and in fermented milk. Acta Chem. Scand., 2, 97—108. (20) Sharp, P. F., Hand, D. B. ja Guthrie, E. S., 1942. Experimental work on deaeration of milk. Assoc. Bull. (Intern. Assoc. Milk Delaers) 34, 365—375. (21) Stewart, A. P. ja Sharp, P. F., 1945. Determination of vitamin C in the presence of interfering reducing substances. Selective oxidationreduction method. Ind. Eng. Chem. Anal. Ed., 17, 373—376. (22) —»— 1946. Vitamin C content of market milk, evaporated milk, and powdered whole milk. J. Nutr., 31, 161—173. (23) Tkachenko, E. S., 1936. Biokhimija 1, 579—582. Ref. C.A., 31, 7461, 1937. (24) Washbltrn, R. G. ja Krauss, W. E., 1938. The vitamin C content of milk. Ohio Agr. Exp. Sta., 56th Ann.rept. (in Bull. 592), 85—86. (25) Woessner, W. W., Weckel, K. G. ja Schuette, H. A., 1940. The effect of commercial practices on ascorbic acid and dehydroascorbic acid (vitamin C) in milk. J. Dairy Sei., 23, 1131 1 141. HELGE GYLLENBERG, MARJATTA ROSSANDER JA PAAVO ROINE112 SUMMARY ON THE AMOUNTS OF ASCORBIC ACID AND DEHYDROASCORBIC ACID IN MILK UNDER DIFFERENT HANDLING AND STORAGE CONDITIONS Helge Gyllenberg, Marjatta Rossander and Paavo Roini Department of Nutritional Chemistry, University of Helsinki Investigations were carried out to establish the actual and relative amounts of ascorbic acid and dehydroascorbic acid in milk, especially under the conditions prevailing in the marketing of milk in Finland. Dedydroascorbic acid was determined titrimetrically after its previous reduction to ascorbic acid by means of resting cell suspensions of Escherichia coli. Special attention was paid to the conditions under which this method gives reliable results. The extent and rate of the reduction were found to depend on the following factors. 1. The strain of E. coli; not all strains are capable of reducing ascorbic acid. 2. The age of the culture from which the cell suspension is prepared; cultures over 24 hours old cannot be used. 3. The age of the cell suspension; suspensions stored longer than one week must not be used. 4. The pH of the solution; the optimal pH for the reduction of dehydroascorbic acid is 5.9 to 6.0. 5. The composition of the solution; the solution must contain fermentable carbohydrates, e.g. glucose, in addition to buf- fering agents (phosphates). The results obtained indicate that the reduction of dehydroascorbic acid is contingent on the fermentation of carbohydrates. The reduction is influenced by small amounts of copper, 1.5 /ig/ml. being a distinctly inhibiting concentration. Iron is not as effective, but it increases the effect of copper. 6. The time of incubation; the optimal time is 20 minutes. A longer incubation results in reoxidation of ascorbic acid. 7. The activity of the bacterial cells; the activity can be increased by preincubation of the bacteria in a buffered glucose solution, prior to the addition of the milk sample. The results obtained agree in most respects with those reported by Gunsalus and Hand (2) and Stewart and Sharp (21). As regards the changes in activity of the cell suspensions during storage, composition of the test solution, and importance of preincubation, our results differ from those recorded by earlier authors. The vitamin C of freshly drawn milk was found to occur practically quantitatively in the form of ascorbic acid, a finding made earlier by other investigators. The exposure of milk to diffuse daylight leads to a marked oxidation of ascorbic acid to dehydro- ascorbic acid. The latter compound, however, is fairly stable in these conditions. The total vitamin C content is thus only slightly affected. Exposure to direct sunlight, on the other hand, causes a rapid disappearance of dehydroascorbic acid, and, accordingly, an abrupt fall in the vitamin C potency. Aeration of milk (shaking the bottle) accelerates the oxidation of ascorbic acid but, in a closed bottle, has no influence on the total vitamin C content. The total vitamin C content of market milk was found to be about the same in summer, autumn and winter. The percentage of ascorbic acid, however, was distinctly lower in summer than in autumn and winter. Storing of market milk at O°C, caused a marked oxidation of ascorbic acid to dehydroascorbic acid, the latter compound being relatively stable. At 18°, on the other hand, most of the dehydro- ascorbic acid disappeared, while only small losses of ascorbic acid occurred. Handling and storage of milk in the dairy causes only insignificant losses in the total vitamin C potency, but slight oxidation of ascorbic acid to dehydroascorbic acid does take place.