PIILO ITÄVYYTEEN LIITTYVÄN ENTSYYMITOIMINNAN VAIKUTUKSISTA OHRAN LAATUOMINAISUUKSIIN Ari Orko, A. J. A. Keränen ja Jyry Tikka Alkon Keskuslaboratorio ja Teknillinen Korkeakoulu, Helsinki Saapunut 10.6. 1965 Piiloitävyydellä tarkoitetaan sellaisia viljan itämiseen liittyvien entsyymitoi- mintojen jyvissä aiheuttamia muutoksia, jotka tapahtuvat piilossa jyvän ulompien kuorikerrosten alla aiheuttamatta normaalissa vilja-analyysissä havaittavia ulkonai- sia muutoksia (16). Tällä vaikeasti todettavissa olevalla itämisen esiasteella voi olla huomattava vaikutus viljan laatuominaisuuksiin. Vaikutuksen merkitsevyys riip- puu ensi sijassa viljan käyttötarkoituksesta ja sille asetettujen laatuvaatimusten ankaruudesta. Tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään piiloitävyyden vaiku- tusta ohran koostumukseen ja laatuominaisuuksiin, vertaamalla toisiinsa laadultaan moitteetonta ja toisaalta huonolaatuista ohraseosta laboratoriossa suoritettujen erilaisten koeidätysten avulla. Materiaali ja menetelmät Tutkimusmateriaalina käytettiin kahta laadullisesti täysin erilaista ohraa, nimittäin hyvälaatuista tanskalaista Proctoria ja Oy Lahden Polttimo Ab:ltä näytteeksi saatua huonolaatuista suomalaista ohraseosta. Kaksitahoinen Proctor oli vuoden 1962 satoa ja sen kosteuspitoisuus oli 12.1 %, 1000 jyvän paino 35.5 g (kuiva-ainetta) ja itämiskapasiteetti 97 %. Suomalainen ohraseos oli samoin vuoden 1962 satoa. Kyseisen syksyn erittäin huonoista sääoloista johtuen se oli laadultaan heikkoa. Seos sisälsi etupäässä suomalaisia päälajikkeita kaksitahoista Balderia ja kuusitahoista Pirkkaa. Ohraseoksen kosteuspitoisuus oli 11.9 %, 1000 jyvän paino 33.3 g (kuiva-ainetta) ja itämiskapasiteetti 85 %. Itämisen vaikutusta kahden laadullisesti täysin erilaisen tutkimusmateriaalin jyvien koostumukseen ja siten kyseisen ohran laatuun tutkittiin idättämällä jyviä Pilsner-tyyppisten maltaiden valmistuksessa käytettävää mallastuskaaviota nou- dattaen. Idätyksessä ei käytetty lainkaan lisäaineita. Kokonaisliotusaika oli 55 t, josta kuivaliotusta 32 tja märkäliotusta 23 t. Liotusaste oli yleensä 42 45%. Liotuslämpötila oli 11 l2°C. Idätyslämpötila oli jonkin verran edellistä korkeampi https://www.c-info.fi/en/info/?token=tJ7i456T2pQ5c_pF.0yp5gb5smT5dHdwlUoXRSQ.CG5oAny-JOuUnX9swQb7sazIMvJ5VSL5FTiNN8CoZtrIzHvnk90NIqPExk-9AK_5-8eDvsCuasw3jVHO626EIvFNo6r-6w0qG0PjakLTg4_3edZT-WwLUinE2mbQpIv59ik5gCVrN3BfwuaOsOLKr3uDPycE7sZYUIo_uI6aabpDMG4w1S6-PlDtmnV6gY2qKXIlnK4qktq6rgI 256 15 l6°C. Liotuksen jälkeinen idätys kesti 4 5 vrk ja kokonaisidätysajaksi tuli näin ollen 6 7 vrk. Jyvien kosteus pyrki idätyksen aikana alenemaan joten niitä kostutettiin tarpeen vaatiessa. Jyviä sekoitettiin käsin kerran vuorokaudessa sekä aina näytteenoton yhteydessä. Normaalin idätysprosessin ohella suoritettiin kaksoisidätyskokeita, jotka peri- aatteessa vastasivat Lingon kaksoismallastusmenetelmän idätysvaihetta (6). Tässä koejärjestelyssä idätettiin jo aikaisemmin idätettyjä jyviä, jotka oli välillä normaa- listi kuivattu ja joista juuri-idut oli poistettu, uudelleen vastaavissa olosuhteissa. Molemmilla idätyskerroilla käytettiin täysin samaa idätyskaaviota. Näytteitä kui- vattiin 24 t 31°C:ssa. Loppukosteus oli tällöin 9 11 %. Kosteuspitoisuus määritet- tiin hienoksi jauhetuista näytteistä kuivaamalla jauhoja 1.5 t 130°C:ssa (12). Itämis- kapasiteettimääritykset suoritettiin idättämällä jyviä huoneenlämmössä, pimeässä 0.75 %:ssa vetysuperoksidiliuoksessa (15). a-Amylaasiaktiivisuuden määritys suoritettiin SANDSTEDxin, KNEENin ja BusHin mukaan (13). Määritykseen käytettiin United States Department of Agri- culture’n muunnelmaa (19). Menetelmässä mitataan aika, joka vaaditaan hydroly- soimaan /9-amylaasilla vakio-olosuhteissa käsitelty tärkkelys dekstriiniksi. Diastaat- tisen voiman määritys suoritettiin antamalla näytejaukoista valmistetun entsyymi- uutteen sokeroittaa puskuroitua tärkkelysliosta 30 min. 20°C:ssa (18). Ohran tärk- kelyksen pilkkoutumisen määrittämiseksi itämisen aikana suoritettiin amylografi- tutkimuksia. Sokerien identifioimiseksi paperikromatografisesti valmistettiin näytteistä uutteet ekstrahoimalla 10 g jauhoja 25 mldla 50 % etanolia 30 minuutin ajan. Seos sentrifugoitiin kirkkaaksi kylmäsentrifugissa ja alkoholi haihdutettiinpois. Sokerien erotus suoritettiin yksisuuntaisena ajona Whatman n:o 1 kromatografiapaperilla. Ajoliuoksena käytettiin n-butanoli/etikkahappo/vesi (4: 1:5) yläfaasia (11). Huo- neenlämmössä suoritettu 4 5 vuorokauden ajo riitti erottamaan kaikki vertailu- sokerit toisistaan ja kaksisuuntainen ajo osoitti, ettei mikään ohrauutteista syntynyt täplä koostunut useammasta komponentista. Pelkistävät sokerit todettiin Tre- VELYANin, PROCTERin ja HARRissoNin (17) mukaan emäksisellä hopeanitraatilla värjäämällä. Sokerien määrissä tapahtuneiden suhteellisten muutosten toteamiseksi paperikromatogrammit analysoitiin densitometrisesti. Proteolyyttisten entsyymien aktiivisuus määritettiin viskosimetrilla (8). Aminohappojen paperikromatografiseen erottamiseen käytettiin samoja ohra- uutteita sekä ajoliuosta kuin edellä sokerien määritykseen. Aminohappojen erotta- miseen huoneenlämmössä käytetty ajoaika oli 30 tuntia. Paperi värjättiin ninhydrii- nillä (4), kuivattiin ilmassa ja annettiin kehittyä 24 t pimeässä. Suhteellisen kvantita- tiivisen kuvan saamiseksi eri aminohappojen kehittymisestä ohran itäessä leikattiin täplät irti, niistä eluoitiin väriaine 5 mkaan metanolia ja kehittyneen värin intensi- teetti määritettiin spektrofotometrisesti. Tulokset Normaali idätys. Huonolaatuisen ohraseoksen a-amylaasiaktiivisuus oli jo ennen idätystä n. 3 diastaattista yksikköä (30°-D. U.). Liotuksen aikana tapahtuneen 257 alenemisen jälkeen a-amylaasiaktiivisuus alkoi tasaisesti kohota. Hyvälaatuisessa ohrassa todettiin a-amylaasia vasta noin vuorokauden liotuksen jälkeen, mutta aktiivisuuden lisääntyminen oli nopeampaa kuin huonolaatuisessa ohraseoksessa (kuva 1). Todettakoon, että hyvälaatuinen ohra saavutti vasta 2 vrk;n idätyksen jälkeen huonolaatuisen ohraseoksen a-amylaasiaktiivisuuden lähtöarvon. Tulokset vastasivat hyvin aikaisemmin saatuja tuloksia (6). Idättämättömän huonolaatuisen ohraseoksen a-amylaasiaktiivisuus on osoitus siinä alkuunpäässeistä itämiseen liit- Diastaattisessa aktiivisuudessa liotuksen aikana tapahtuneen pienenemisen jäl- keen — joka huonolaatuisessa ohraseoksessa oli jyrkempi kuin hyvälaatuisessa - hyvälaatuisen ohran diastaattisten entsyymien aktiivisuus kasvoi hieman nopeam- min kuin huonolaatuisen ohraseoksen niin, että oltuaan aluksi n. 20 % alhaisempi se joneljän vuorokauden idätyksen jälkeen oli lähes yhtä suuri (kuva 2). Hyvälaatui- sen ohran proteolyyttinen aktiivisuus oli ennen laboratorioidätystä vajaa puolet huonolaatuisen ohraseoksen aktiivisuudesta. Idätyksen edistyessä molempien aktiivisuus lisääntyi jokseenkin samalla nopeudella (kuva 3). Kuva 1. Ohranäytteiden a-amylaasiaktiivisuu- det idätysajan funktiona (hyvälaatuinen ohra O O, huonolaatuinen ohraseos % 0) Kuva 2. Ohranäytteiden diastaattiset aktiivisuu- det idätysajan funktiona (hyvälaatuinen ohra O O, huonolaatuinen ohraseos % 9) Amylografitutkimuksissa ilmeni, ettäamylolyyttisten entsyymien aiheut- tama tärkkelyksen pilkkoutuminen tuli havaittavaksi n. 12 t liotuksen jälkeen. Liotuksen alussa tapahtui hyvälaatui- sen ohran amylolyyttisten entsyymien aktiivisuudessa pienenemistä, kuten vastaavat diastaattisen aktiivisuuden arvotkin osoittivat (taulukko 1). Vuo- rokauden kuluttua liotuksen alkami- sesta oli maksimiviskositeetti Braben- der-yksiköissä (B. U.) ainoastaan neljäs- osa alkuperäisestä. Tärkkelyksen pilk- koutuessa ja maksimiviskositeetin alen- tuessa alenivat myös vastaavat liiste- röitymislämpötilat. Kromatogrammien perusteella pys- tyttiin molemmista idättämättömistä ohrista toteamaan maltoosi, glukoosi ja fruktoosi. Lisäksi esiintyi jälkiä muuta- mista muista sokereista, kuten malto- trioosi, isomaltoosi, arabinoosi ja ksy- loosi. Lähtörintaman ja maltoosin vä- lillä esiintyi edellisten lisäksi vielä joi- takin täpliä, joita ei heikon erottumi- sen vuoksi kyetty identifioimaan. Idättämättömässä huonolaatuisessa ohraseok- sessa maltoosin määrä oli suurempi kuin hyvälaatuisessa ohrassa osoittaen, että kosteissa korjuuolosuhteissa amylolyyttisten entsyymien toiminta oli päässyt al- kuun. Hyvälaatuisessa ohrassa maltoosin lisääntyminen oli taas idätyksen aikana voi- makkaampaa, niin että sen maltoosipitoisuus runsaan 4 vrk:n idätyksen jälkeen oli noin kaksinkertainen huonolaatuiseen ohraan verrattuna. Maltoosin lisääntyminen Taulukko 1. Hyvälaatuisen ohran maksimiviskositeetin muuttuminen laboratorioidätyksen aikana amylografisesti määritettynä. Vertailun vuoksi on taulukkoon liitetty vastaavat diastaattisen aktii- visuuden arvot. Idätysaika Maksimi- Vastaava Diastaattincn (T) viskositeetti lämpötila aktiivisuus (B. U.) (°C) (°W.-K.) 0 970 90 205 12 >ICOO >9O 188 24 280 sr, 188 55 50 67 210 79 30 56 250 Kuva 3. Ohranäytteiden proteolyyttiset aktiivi- uudet idätysajan funktiona (hyvälaatuinen ohra O O, huonolaatuinen ohraseos 9 9) 258 259 kiihtyi huomattavasti 3 vrk:n idätyksen jälkeen. Glukoosimäärän kasvu oli voima- kasta 4 vrk:n idätyksen jälkeen. McLeod et ai. (7) ovat analysoineet ohran sokereita ja tutkineet niiden määrissä itämisen aikana tapahtuvia muutoksia. Heidän käyt- tämänsä menetelmät eroavat tosin jonkin verran tässä työssä käytetyistä. Saadut tulokset ovat kuitenkin pääpiirteissään yhdenmukaisia. Molempien tutkimuskohteina käytettyjen ohrien uutteissa voitiin paperikro- matografisen erotuksen perusteella todeta joukko vapaita aminohappoja. Leusiini ja isoleusiini eivät erottuneet toisistaan käytetyllä ajoliuoksella. Leusiineja esiintyi sekä idättämättömässä huonolaatuisessa ohraseoksessa että hyvälaatuisessa ohrassa. Fenylalaniinia, valiinia, tyrosiinia, a-alaniinia, seriiniä ja glysiiniä esiintyi jo idät- tämättömissä jyvissä, samoin proliinia. Oksiproliinia ei todettu. Asparagiinihappoa ja glutamiinihappoa esiintyi myös jo idättämättömistä jyvistä valmistetuissa uut- teissä samoinkuin y-aminovoihappoakin; asparagiinia ja glutamiinia todettiin vä- häisessä määrin. Kystiiniä sekä kysteiiniä esiintyi molemmissa ohranäytteissä jo idättämättömissä jyvissä. Vapaiden aminohappojen määrissä itämisen aikana tapahtuvat muutokset todettiin molemmissa ohralaaduissa hyvin samankaltaisiksi. Hyvälaatuisessa ohrassa (kuva 4a) esiintyi aminohappoja 4 vrk:n idätyksen jälkeen Kuva 4a ja 4b. Huonolaatuisen ohraseoksen (4a) ja hyvälaatuisen ohran (4b) aminohappojen määrissä itämisen aikana tapahtuneet muutokset. Määritys on suoritettu analysoimalla spektroiotometrillä aminohappojen paperikromatografisessa erotuksessa saatujen täplien eluaatit 5 ml:ssa metanolia. Määritetyt aminohapot olivat seuraavat: 2 ja 3. asparagiini, glysiini ja glutamiini, 4. asparagiinihappo, 5. seriini, 6. glutamiinihappo, 7. a-alaniini, 9. y-aminovoihappo, 10. tyrosiini, 11. väliini, 12. fenyl- alaniini ja 13. leusiini ja isoleusiini. 260 jonkin verran runsaammin kuin huonolaatuisessa ohraseoksessa (kuva 4b). Merkille- pantavaa oli molemmissa ohranäytteissä esiintynyt suuri asparagiinihapon ja/tai seriinin määrä idätyksen lopussa. Aminohappojen määrissä itämisen aikana tapah- tuneet muutokset olivat yhtäpitäviä ScßißANin (14) saamien tulosten kanssa. Kaksoisidätys. Kaksoisidätyskokeissa todettiin, että huonolaatuisen ohraseok- sen diastaattinen aktiivisuus lisääntyi toisella idätyskerralla jyrkemmin kuin ensim- mäisellä ja molemmilla kerroilla nopeammin kuin hyvälaatuisen ohran. Molempien ohranäytteiden diastaattisten entsyymien aktiivisuudet olivat toisella idätysker- ralla 3 vrk:n kuluttua noin kaksinkertaiset ensimmäiseen idätykseen verrattuna. Taulukko 2. Hyvälaatuisen ohran maksimiviskositeetin muuttuminen kaksoisidätyksen aikana amylo- grafisesti määritettynä. Näytteestä käytetty merkintä esim. 3 vrk/5 vrk tarkoittaa, että kyseistä näytettä on idätetty ensimmäisellä kerralla 3 vrk ja toisella 5 vrk. Näyte Maksimi- Vastaava Diastaattinen viskositeetti lämpötila aktiivisuus (B. U.) (°C) (°W,K.) 1 vrk/- 280 86 211 3 vrk/- 20 «3 252 5 vrk/-