Journal of the Scientific Agricultural Society of Finland Vol. 49; 1-106, 1977 Maataloustieteellinen Aikakauskirj a DER EINFLUSS VON VERRINGERTEN NITRIT- UND NITRATZUSÄTZEN AUF DIE EIGENSCHAFTEN DER ROHWURST Abstract: The effect of lowered addition of nitrite and nitrate on the properties of dry sausage Selostus: Alennettujen nitriitti- ja nitraattilisäyksien vaikutus kestomakka- ran ominaisuuksiin EERO PUOLANNE Institut ftir Fleischtechnologie, Universität Helsinki Viikki, 00710 Helsinki 71, Finnland WIRD MIX GeNEHMIGUNG DER LAND- UND FORST- WIRTSCHAFTLICHEN FäKULTÄT DER UnIVERSITÄT Helsinki am 25 März dm 12 Uhr im Auditorium XII ZUR ÖFFENTLICHEN VeRTEIDIGUNG VORGELEGT. SUOMEN MAATALOUSTIETEELLINEN SEURA HELSINKI https://www.c-info.fi/en/info/?token=ux8oeF59y8Q_gwuO.Zbc29B2IH7YROxlxd0AlWQ.hzILhQhHy-q93ZRyoK2TtAGwBvsE323czswx0uP7dW8rltbQWaStdJGiKjSnis-sRlr6FodGw56kMos3pZv18ymhZLNBmzgH876oITVgJicTC1C3obPcQUmi5qOJxs06-KcsaLa73J1LiSIG-f6G3q0lU3DOb4z69SL7 Vorwort Die vorliegende Untersuchung wurde im Institut fiir Fleischtechnologie der Universität Helsinki durchgefiihrt und iiberwiegend aus Mitteln der Akademie von Finnland finanziert. Bei der Durchfiihrung der Untersuchung fand ich von verschiedener Seite Unterstiitzung. Mein ganz besonderer Dank in dieser Beziehung gilt meinem Vorgesetzten, Herrn Prof. Dr. F. P. Niinivaara, der mich wahrend meiner Arbeit unermudlich anspornte und mit neuen Ideen in grossartiger Weise zum Gelingen derselben beitrug. Die Herren Professoren Dr. Esko Nurmi sowie Dr. L. Leistner und ihre Mitarbeiter Risteten mit ihren Ratschlägen wertvolle Hilfe, fiir die ich ihnen an dieser Stelle herzlich danke. Zu grossem Dank verpflichtet bin ich auch meiner langjährigen Mitarbeiterin, cand. d. Land- u. Forstwirtschaft Paula Törmä, die mir den Grossteil der technischen Arbeiten abnahm und die Versuchsergcbnisse mit grösster Sorgfalt in Diagrammform brachte, cand. d. Land- u. Forstwirtschaft Marita Liljemark, die die Bestimmungen durchfiihrte und in mannigfaltiger Weise beim Abfassen der Arbeit mithalf, und cand. d. Land- u. Forstwirtschaft Riitta Saarnio, welche die Stickoxidmyoglobingehalts-Bestimmungen ausfiihrte. Bei Lie. med. vet. Eija Seuna und Fleischermeister Pauli Hill bedanke ich mich fiir die Durchfiihrung der Salmonellenversuche, Cand. hum. Sirkka Viiliäinen leistete mir unschätzbare Hilfe indem sie die umfangreichen Schreibarbeiten libernahm und mit grösster Sorgfalt und Geduld ausfiihrte. Die Übersetzung ins Deutsche besorgte Dipl.-Ing. H. Hemmann. Ihnen heiden meinen besten Dank. Die in der Untersuchung verwendeten Bakterienkulturen stellte die Firma Rudolf Muller & Co zur Verfiigung, fiir deren wohlwollendes Verhalten gegeniiber meiner Arbeit ich sehr dankbar bin. Weiter möchte icb den zahlreichen in- und ausländischen Freunden und Kollegen danken, die mich mit ihrcn Ratschlägen in selbstloser Weise unterstiitzten. Zum Schluss erlaube ich mir, der Agrikulturwissenschaftlichen Gesellschaft in Finnland zu danken, die diese Arbeit in ihre Publikationsreihe aufgenommen hat. Helsinki, im Dezember 1976 Eero Puolanne INHALTSVERZEICHNIS Abstract 7 1. EINLEITUNG 7 2. LITERATURUBERBLICK 8 2.1 Nitrit- und Nitrat-Chemismus der Rohwurst 8 2.2 Technologic des Nitrit- und Nitrateinsatzes bei Rohwurst 16 2.3 Pathogene Bakterien in der Rohwurst 20 2.4 Nitrosamine in der Rohwurst 28 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN 32 3.1 Zweck der Untersuchungen 32 3.2 Versuchsanordnungen 32 3.3 Material und Verfahren 35 3.3.1 Rohstoffe und Herstellung der Versuchswiirste 35 3.3.2 Chemische Verfahren 36 3.3,3 Mikrobiologische Verfahren 37 3.3.4 Physikalische Verfahren 38 3.3.5 Organoleptische Methoden 38 3.3.6 Verarbeitung der Ergebnisse 39 3.4 Ergebnisse der Präliminarversuche 39 3.4.1 Nitrit- und Nitratzusatz 40 3.4.2 Starterkulturen und GdL 49 3.4.3 Askorbinverbindungen 53 3.4.4 Zucker 56 3.4.5 Temperatur 56 3.4.6 Alter des Fleisches 62 3.4.7 pH-Wert 63 3.5 Ergebnisse der vergleichenden Versuche 65 3.5.1 Chemische Zusammensetzung 66 3.5.2 Nitrit- und Nitratgehalt 66 3.5.3 Stickoxidmyoglobin-Gehalt 70 3.5.4 Mikrobiologiselle Ergebnisse 70 3.5.5 pH-Wert, a w-Wert, Konsistenz und Gewichtsverlust 72 3.5.6 Farbe 76 3.5,7 Geruchs-, Geschmacks- und Gesamtpunkte 78 3.5.8 Die zwischen Nitrit- und Nitratmenge sowie verschiedenen Eigenschaften der Rohwurst festgestellten Korrelationskoeffizienten 78 3.6 Einfluss von Nitrit und Nitrat auf das Wachstum von Salmonellan 79 4. DISKUSSION DER ERGEBNISSE 82 4.1 Präliminarversuche 82 4.2 Vergleichende Versuche 88 4.3 Salmonellenversuche 91 5. ZUSAMMENFASSUNG UND SCHLUSSFOLGERUNGEN 92 LITEKATUR 95 SELOSTUS 102 ABKURZUNGEN 103 FOTOS 105 7 JOURNAL OF THE SCIENTIFIC AGRICULTURAL SOCIETY OF FINLAND Voi. 49: 1-106, 1977 Maataloustieteellinen Aikakauskirja Puolanne, E. 1977. The effect of lowered addition of nitrite and nitrate on the properties of dry sausage. J. Scient. Agric. Soc. Finl. 49: 1 103. Abstract. In this study the effects of adding lowered amounts of nitrite and nitrate on the properties and ripening of dry sausage were investigated. This was done in order to ascertain the minimum amounts of additives necessary for the production of sausage that is safe with regard to both technologyand pathogenic bacteria. The follow- ing analyses were carried out on the sausages, depending on the sample: chemical composi- tion, nitrite and nitrate content, total bacterial count, lactobacilli, micrococci, faecal streptococci, coliform bacteria and yeasts, and pH, a w, consistency and weight loss. The sausages were prepared with starter cultures (Duploferment 66) or with glucono-delta- lactone (GdL). A total of 208 series of sausage were prepared. Preliminary experiments showed that a uniform lasting colour was obtained using 25 ppm NaNOa or 50 ppm KN0 3. However, the addition of less than 100 ppm nitrite or 125 ppm nitrate caused the pH to drop to too low a level because of overly rapid growth of bacteria. Dropping the ripening temperature from 26° C to 18° C caused slower reduction of nitrate and a higher final pH. Using GdL and lowering the addition of nitrite from 200 ppm to 100 ppm, there was no statistically significant effect on the aroma, taste, or surface colour, physical or microbiological properties or on the growth of Salmonella senftenhe.rg. Neither when using starter cultures were these properties influenced by lowering the addition of nitrate from 300 ppm to 150 ppm or replacing the nitrate with 50 ppm NaNOa and 75 ppm KN0 3. The residual nitrite content was accounted for by 10—l5 ppm NaNQ 2; the residual nitrate content, however, was three to five times greater (c. 100 ppm KNG 3 ) in GdL sausages than in the sausages containing starter culture (20 —2B ppm KN03). In all of the experiments the residual nitrite content did not decrease further once the pH had reached 5,0. This turning point in nitrate reduction came at pH 5,2—5,3. Based on this research and on a study of the related literature, we can say that from the point of view of technology and health, safe dry sausage can be prepared using 100 ppm NaNOa or 150 ppm KN0 3, or a mixture of 50 ppm NaNG 2 and 75 ppm KN0 3 . A condition for lowering the amounts of nitrite or nitrate is, however, that GdL and/or starter culture be used at the same time. Using these ensures a sufficiently rapid drop in pH to the desired value (pH 5,3—4,8). 1. Einleitung Nitrat und Nitrit werden bei Fleischerzeugnissen seit langem. zur Verbesse- rung der Farbbeständigkeit und Haltbarkeit verwendet. Die akute toxische Wirkung des Nitrits ist auch seit langem bekannt; es reagiert mit Hämoglobin und behindert so die Versorgung der Muskeln mit 8 Sauerstoff. In Tierversuchen hat sich eine Dosis von etwa 300 mg/kg als töd- lich erwiesen (Review: Tannenbaum 1976). Fiir den Menschen liegt die letale Dosis wesentlich niedriger. Die giftigen Wirkungen des Nitrats treten im wesentlichen erst nach seiner Reduktion zu Nitrit auf (FAO/WHO 1974). Gemiise enthält so hohe Mengen Nitrat, dass, kommt es zur Reduktion, die Gefahr einer Vergiftung gegeben ist, wie man sie bei Säuglingen auch bereits beobachtet hat (Review: Tannenbaum 1976). Das Risiko einer akuten Vergiftung durch Fleischwaren besteht nur im Falle von Herstellungsfehlern, etwa wenn die gesamte Salzmenge versehentlich in Form von Nitrit zugesetzt wird, wodurch Farbe, Geschmack und Konsistenz der Ware so verändert werden, dass diese nicht mehr fiir den menschlichen Genuss taugt. Später stellte man test, dass es bei der Umsetzung zwischen Nitrit und sekundären Aminen zur Bildung von teilweise stark karzinogenen Nitrosaminen kommt (Magee und Barnes 1967, Lijinsky und Epstein 1970). Unter den in Fleischwaren vorliegenden Bedingungen kann es beim Arbeiten mit iib- lichen Konzentrationen bereits während der Flerstellung und Lagerung zur Bildung geringer Nitrosaminmengen kommen. Ausserdem kann das Restnitrit oder nach der Reduktion das Restnitrat auch erst im Magen mit Aminen reagieren (Sander und Seif 1969). Nachdem Nitrosamin-Synthese und Karzinogenität von N-Nitrosoverbindungen durch Tierversuche einwandfrei aufgezeigt worden waren, war eine Neueinschätzung des Nitrit- und Nitratzusatzes in Fleischwaren fällig. Der Beweis, dass die in Fleischwaren enthaltenen Nitrosaminmengen beim Menschen Krebs verursachen, konnte freilich bisher nicht erbracht werden; ausserdem ist Nitrit bzw. Nitrat bei der Flerstellung heutiger Produkte unerlässlich. Ein Weg- lassen dieses Stoffes bzw. dieser Stoffe wiirde ein erhöhtes gesundheitliches Risiko durch pathogene Bakterien und ein schnelleres mikrobiologisches Ver- derben der Ware zur Folge haben. Die FAO/WHO (1974) empfiehlt als maximal zulässige Tagesdosis 0,2 mg/kg NaN0 2 und 5 mg/kg KN0 3 . Das im Speichel vorhandene, aus Nitrat reduzierte Nitrit fxihrt ausserdem zu einer kurzzeitigen Erhöhung der Nitrit- konzentration im Magen. Nach heutiger Erkenntnis können auch die in Fleisch- waren enthaltenen Nitrit-Derivate an der Synthese von N-Nitrosoverbindungen teilnehmen, so dass die in der Analyse als sog. »freies Nitrit» ausgewiesene Menge lediglich ein Teilbild von der tatsächlichen Krebsgefahr liefert (Proc. ISNMP 2. 1977). Es besteht somit aller Grund, eine Verringerung der Nitrit- und Nitratzusätze bei Fleischwaren anzustreben. 2. Literaturiiberblick 2, 1 Nitrit- und Nitrat-Chemismus in der Rohvvurst Nitrit ist die wichtigste chemische Verbindung im Hinblick auf Farbe, Haltbarkeit und zahlreiche andere technologische Eigenschaften der Roh- wurst. Nitrat wird erst nach seiner Reduktion zu Nitrit wirksam. Die Nitrit- umsetzung ist in der anorganischen und organischen Chemie viel untersucht 9 worden, u.a. auch im Hinblick auf die Belange der Fleischindustrie, wobei sowohl Modell- als auch Objektversuche durchgefiihrt wurden. Infolge des komplexen Charakters des Fleisches und des Vermögens der den Fleischwaren zugesetzten, relativ geringen Nitritmenge, mit sehr vielen verschiedenen Bestandteilen des Fleisches zu reagieren, kennen wir heute die chemischen, mikrobiologischen und toxikologischen Eigenschaften des Nitrits im Fleisch lediglich in ihren Hauptziigen. Je nach Tierart, -alter und verschiedenen anderen Faktoren enthält Muskel- fleisch 2—20 g/kg (0,1 —l,l mM) Myoglobin (Götse 1969, Bodwell und McClain 1971) und auch erhebliche Mengen an Hämoglobin (Review: Fox 1966). Bei der Wurstherstellung tritt das Myoglobin nicht nur als solches (Purpur), sondern auch als Oximyoglobin (Hellrot) und Metmyoglobin (Braun- grau) auf. Infolge Sauerstoffeinwirkung (Brooks 1938), der oxydierenden Wirkung des Nitrits (Fox 1966) und der Autoxydation (Snyder und Ayres 1961) werden Myoglobin und Oximyoglobin in Metmyoglobin umgewandelt. Gleichzeitig reagiert das Nitrit nach seiner Disproportionierung zu Stickstoff- trioxid mit den Reduktionsmitteln, wobei es zur Bildung eines Komplexes kommt, der zu schnellem Zerfall in seine Ausgangsstoffe oder teilweise in Reduktionsmittelradikal und Stickoxid neigt. Das Stickoxid verbindet sich mit Metmyoglobin zu Stickoxidmetmyoglobin (Graurot), das leicht zu Stick- oxidmyoglobin (belles Hellrot) reduziert wird (Fox und Thomson 1963). Fox und Thomson (1963) benutzten in ihren Versucben als Reduktions- mittel Askorbinsäure, jedoch lässt sich die entsprechende Reaktion auch mit anderen Reduktionsmitteln erzielen (Fox und Ackerman 1968, Mirna und Hofmann 1969, Fox und Nicholas 1974). Im Muskelfleisch sind insgesamt etwa 50 100 mM titrierbarereduzierend wirkende Verbindungen (Regier und Tappel 1956), darunter ca. 20 ppm endogene Askorbinsäure (Niinivaara und Antila 1972) enthalten. Der Rohwurst werden 100 500 ppm Askorbin- verbindungen zugesetzt (Wirth 1974). Auch Thiole spielen offensichtlich bei der Umrötung und dem Nitritabbau eine wesentliche Rolle (Mirna und Hof- mann 1969, Dilova u.a. 1976), jedoch verläuft nach Fox und Nicholas (1974) die Umsetzung langsamer als mit Askorbinverbindungen, und ausserdem ist im Fleisch gegenuber Nitrit und Myoglobin ein Oberschuss (21—25 mM) an freien SH-Gruppen vorhanden (Mirna und Hofmann 1969), ohne dass es jedoch zu einem vollständigen Nitritabbau oder einer vollständigen Stickoxid- myoglobin-Bildung kommt. Die Stickoxidmyoglobin-Bildung wurde sowohl als nichtenzymatischer (Koizumi und Brown 1971) als auch als enzymatischer (Walters u.a. 1968) Vorgang interpretiert. Diese Modelle und die Reaktionshypothese von Fox und Thomson (1963) ergänzen einander, wobei die entsprechenden Umset- zungen im Fleisch vielleicht auf verschiedene Weise erfolgen (Möhler 1974). Zur vollständigen Umsetzung des Fleisch-Myoglobins in Stickoxidmyoglobin sind etwa B—Bo ppm (0,1 —l,l mM) Nitrit erforderlich. Im allgemeinen werden 60—90 % des Gesamtmyoglobins in Stickoxidmyoglobin umgewandelt (Möhler 1959, Mirna 1973). Der Anteil des Muskelfleisches in der Wurst ist im all- gemeinen zu gering um die oben angegebene Myoglobinkonzentration von 20 g/kg zu erreichen. Ingram (1974) konstatiert, dass bei Fleischwaren eine 10 beständige Farbe sogar durch Zusatz von nur 20 ppm NaNO a erzielt wird. Nach Cassens u.a. (1976) werden fiir die Stickoxidmyoglobin-Bildung 7,5 22,5 ppm (5—15% der zugesetzten Menge) Nitrit verbraucht, wobei diese Menge jedoch von Fleischerzeugnis zu Fleischerzeugnis stark variiert. Fox und Thomson (1963) haben grlindliche Untersuchungen iiber den Umrötungsmechanismus sowie den Einfluss verschiedener Konzentrations- faktoren und des pH-Wertes auf die Stickoxidmyoglobin-Bildung bei 20° C angestellt. Hierbei ist jedoch zu bedenken, dass diese viel zitierten und erör- terten Ergebnisse die Reaktionsgeschwindigkeit in Lösungen angeben, so dass zumindest was die Rohwurst anbelangt bei der Einschätzung der definitiven Umrötung auch der Zeitfaktor in Rechnung zu stellen ist. Nach Fox und Thomson (1963) war die Stickoxidmyoglobin-Bildungs- geschwindigkeit bis zu einem Nitrit-Myoglobin-Molverhältnis von 5 : 1 direkt proportional zur Nitritkonzentration; danach wurde keine nennenswerte Zu- nahme der Reaktionsgeschwindigkeit mehr beobachtet. Reith und Szakaly (1967 a und b) erzielten die optimale Umrotungsgeschwindigkeit in Lösungen bei einem Molverhältnis von 1 : 1, in Fleisch bei 5:1. Hohe Nitritkonzentrationen haben andererseits die Oxydation des Myoglobins zu Cholemyoglobin (»nitrite burn») oder die Bildung von Metmyoglobinnitrit (Braunrot) zur Folge (Fox und Thomson 1964). Die Stickoxidmyoglobin-Bildungsgeschwindigkeit nahm direkt proportional zur Quadratwurzel des Askorbat-Metmyoglobin-Molverhältnisses zu. Zu bohe Askorbinsäurekonzentrationen (15 mM) verursachen allerdings Gasbildung (NO) und grune Pigmente. Der pH-Wert spielte jedoch die entscheidende Rolle in bezug auf die Stickoxidmyoglobin-Bildungsgeschwindigkeit (Bild 1). Nach Bild 1 verläuft die Stickoxidmyoglobin-Bildung bei pH 6—7 nur sehr zögernd; unterhalb von pH 6 nimmt jedoch die Reaktionsgeschwindigkeit rasch zu. Unterhalb von pH 4,5 ist eine schnelle Stickoxidmyochromogen-Bildung aus Farbstoff zu verzeichnen, und unterhalb von pH 4,0 entstehen griine Ver- bindungen (Fox und Thomson 1963). Nach Reith und Szakaly (1967 a) Bild 1. Geschwindigkeitskonstante 0. Ordnung der Stickoxidmyoglobin-Bil- dung in Abhängigkeit vom pH-Wert (Fox und Thomson 1963). 11 war die Farbe des entsprechenden Stickoxidmyoglobins nicht vom pH-Wert abhängig, wenngleich die Reaktionsgeschwindigkeit mit Sinken des pH-Werts zunahm. Nach Fox und Thomson (1963) ist oberhalb von pH 5,4 moglicherweise die Metmyoglobin-Reduktion die die Umrotungsgeschwindigkeit begrenzende Reaktion, unterhalb dieses pH-Wertes jedoch der Zerfall des vom Reduktions- mittel und Stickoxid gebildeten Komplexes. Nach Möhler (1958) nimmt mit sinkendem pH die sich bildende Stickoxidmyoglobin-Menge relativ zu und erreicht ihr Maximum bei 5,0. Auch nach Brooks (1937) nahm die Ge- schwindigkeit, mit der sich das Stickoxid ans Hämoglobin bindet, mit abneh- mendem pH in der Form zu, dass die Halbwertszeit bei pH 5,66 10 min, bei pH 5,38 4 min und bei pH 5,15 1 min betrug. Fox (1966) konstatierte, dass Myoglobin und Hämoglobin gewohnlich in etwa gleicher Weise reagieren, und dass lediglich die Reaktionsgeschwindigkeiten der heiden Stoffe variieren. Bei Rohwurst erfolgt die Reduktion von Nitrat im pH-Bereich 6,0 —5,6 (5,4), die Umrötung im Bereich 5,4 —5,0 (Niinivaara 1955). Die Bildung von Stickoxidrayoglobin erfolgt stets über die Zwischenstufe Metmyoglobin (Möhler 1970). Das Einfrieren von Fleisch, niedriger Sauer- stoffpartialdruck, niedriger pH, hohe Temperatur (Hamm und Schweiger 1964) sowie Zusatz von Nitrit und Kochsalz (Möhler 1970) bewirken Metmyo- globin-Bildung, was an sich im Hinblick auf die Stickoxidmyoglobin-Bildung nicht von Nachteil ist; jedoch haben diese gleichen Faktoren auch die Dena- turierung von Metmyoglobin zu Metmyochromogen (Grau) zur Folge (Review: Lawrie 1974), welches nur noch in geringem Masse roten Farbstoff hiidet (Reith und SzakÄly 1967 a). Ausserdem rutissen aber im Fleisch auch solche Verhältnisse vorliegen, dass eine Riickreduktion von Stickoxidmetmyoglobin in Stickoxidmyoglobin erfolgt, was im allgemeinen der Fall ist (Fox und Thomson 1963, Walters u.a. 1968, Koizumi und Brown 1971). Nitrit wird nicht nur fiir die Stickoxidmyoglobin-Bildung, sondern auch im Zusammenhang mit anderen Umsetzungen verbraucht. Nitrit bewirkt die Oxydation von Oxihämoglobin zu Methämoglobin und wird dabei selbst zu Nitrat oxydiert, das in einer zum gebildeten Methämoglobin äquimolaren Menge anfällt (Möhler 1970) (Gleichung 1): (1) Hb(o 2 )4 + 4HN02 + 2HaO JHb(OH) 4 + 4HNOs +O 2 Das Myoglobin reagiert offensichtlich in nahezu gleicher Weise (Möhler 1970). Auch im Zusammenhang mit anderen Umsetzungen hiidet sich aus Nitrit Nitrat (Review: Zatocil und Brun 1963). Nitrit reagiert mit SH-Gruppen der Proteine unter Bildung von Nitro- sothiolen oder Disulfiden, mit Aminoverbindungen unter Bildung von freiem Stickstoff oder N-Nitrosaminen. Auch durch die Umsetzungen mit Askorbin- säure, Amiden, Aminen, ungesättigten Fettsäuren, Schwefelwasserstoff u. dgl. reaktionsfähigen Verbindungen sowie mit anorganischen Stickstoffverbin- dungen kommt es zu einer Nitritabnahme (Review: Zatoöil und Bnun 1963, Mirna und Hofmann 1969, Cassens u.a. 1976). Allerdings weiss man noch nicht genau genug, in welchem Grade dieses umgesetzte Nitrit in Fleisch- 12 waren eine positive (Umrötung, Mikrobenhemmung, Geschmack, Aroma) oder eine negative, d.h. toxische Wirkung ausiibt. Die nach dem Herstellungs- prozess noch vorhandene Menge an freiem Nitrit ist freilich, verglichen an der zugesetzten Nitritmenge, nur noch von nachgeordneter Bedeutung (Proc. ISNMP 2. 1977). Nitrit wird im Fleisch gewohnlich erst in Form von salpetriger Säure wirk- sam. Die verfiigbare Menge an salpetriger Säure ist gemäss Gleichung (2) durch den pH-Wert festgelegt: , [HNOJlogi»ris7r pKa - pH pK a = Dissoziationskonstante d. Säure = 3.4 (2) Da es sich aber hier um eine normale Gleichgewichtsreaktion handelt, bleibt die relative Menge an salpetriger Säure in Abhängigkeit vom pH-Wert konstant, selbst dann, wenn bei der Gesamtmenge aus diesen oder jenen Griinden Verluste eintreten. Mit zunehmender Temperatur steigt allerdings der pKa-Wert rasch an (Anon. 1974). Nach Mirna (1971) kommt es bei Absinken des pH-Werts unter 5,8 zur Bindung von Stickoxid an die Fleischproteine, und im pH-Bereich 5,0 —5,8 ist ein wesentlicher Teil des Stickoxids auf diese Weise gebunden. Olsman (1977 b) hat beobachtet, dass in erhitztem Fleisch auch die an Proteine ge- bundene Nitritmenge mit abnehmendem pH steigt. Desgleichen konstatierte er, dass ein Teil des Nitrits labil zu einer nitrosierenden Verbindung (X —NO) gebunden wird, die später als Nitritspeicher fungiert (Olsman 1977 a). Ando u.a. (1971) stellten ferner einen Einfluss der niedermolekularen Verbindungen des Fleisches auf die Nitritabnahme fest. Nach Nordin (1969) erfolgte die Nitritabnahme im Fleisch nach folgender Gleichung (3): (3) log 10 (1/2 -Zeit) = 0,65 - 0,025 T (°C) + 0,35 pH Allerdings blieb der pH-Bereich unter 5,6 ausserhalb seiner Untersuchung, und die Versuchstemperaturen waren im Hinblick auf warmebehandelte Fleischerzeugnisse gewahlt worden. Nach Olsman und Krol (1972) folgte die Nitritabnahme bei pH 6,0 und dariiber der Kinetik einer Reaktion 1. Ordnung, unter pH 6.0 der Kinetik einer Reaktion 1. oder 2. Ordnung. Sie stellten auch fest, dass die Nitritabnahme mit wachsendem Fleisch- Wasser-Verhältnis an Geschwindigkeit verliert. Dies könnte von Bedeutung in bezug auf den Restnitritgehalt getrockneter Fleischwaren sein (Hill u.a. 1973). Nach Fox und Nicholas (1974) bestand zwischen Nitritabnahme und Stickoxidbildung eine Beziehung. Woolford u.a. (1976) betonen die Rolle, die die Proteine bei der Nitritabnahme spielen, denn sie vermochten 60 % des »verschwundenen>> Nitrits (pH 5,5, T + 20° C) unter Anwendung der 15N-Technik in den Proteinen nachzuweisen. Cassens u.a. (1977) haben eine Zusammenfassung der von mehreren Forscher-Teams unter Anwendung von Isotopentechnik ermittelten Ergebnisse tiber die Nitritverteilung ausge- arbeitet (Tabelle 1), in der sie konstatieren, dass sich nur 1— 5 % des Nitrits 13 Tabelle 1. Verteilung von 16N-markiertem Nitritstickstoff in Fleischwaren (Cassens u.a. 1976). Myosin 10— 20% Nitrat 1— 5 » Nitrit 5- 20 » Gas 1 5 » SH-Gruppen 5 15 » Lipide 1— 5 » Proteine 20- 30 » 43 100 % (gewohnlich 70 —BO %) verfliichtet haben wahrend der restliche Teil in einer Form vorliegt, die ein potentielles toxikologisches Risiko in sich schliesst. Die Stabilisierung der Fleischfarbe erfolgt durch die Denaturierung von Stickoxidmyoglobin zu Stickoxidmyochromogen (Hellrot). Herbeigefiihrt wird diese Reaktion durch Erhitzen und pH-Wert-Senkung (Fox und Thomson 1963, Reith und Szakaly 1967 b). Die pH-Abnahme in der Rohwurst ist somit ein farbstabilisierender Faktor (Niinivaara 1955). Tarlagdis (1962) hat eine Hypothese aufgestellt, der zufolge beim Stickoxidmyochromogen der Globinteil losgelöst ist und ans Ham zwei NO-Molektile angelagert sind. Cassens u.a. (1977) kamen zu der gleichen Ansicht, wohingegen Olsman und Krol (1972) hinter der allgemeineren Hypothese Bindung nur eines NO- Molektils stehen. Das Verbleichen der Farbe ist eine Folge der Luft- (Sauerstoff) und Lichtein- wirkung. Bei im Kaltverfahren hergestellten Fleischwaren bewirkt schon Sauerstoff allein einen Zerfall der Farbverbindung; bei erhitzter Ware ist hierzu ein Zusammenwirken von Sauerstoff und Licht erforderlich (Rhodes 1976, mundliche Information). Tarlagdis (1962) vertritt denn auch die Auf- fassung, dass bei nicht wärmebehandeltem Fleisch der Farbstoff je nach pH nur teilweise zu Chromogen denaturiert worden ist. Ein Teil des Fleischpigments kann ausserdem u.U. in Form von Stickoxid- metmyoglobin oder Metmyoglobin erhalten bleiben, das durch Denaturierung in graues Metmyochromogen umgewandelt wird. Walsh und Rose (1956) haben festgestellt, dass es im Dunkeln zu einer langsamen Oxydation von Stickoxidmyoglobin gemäss folgender Gleichung (4) kommt: V 1 NOMb + 1/2 0 2 J MMb + n°2 V 2 (4) Die Reaktionsgeschwindigkeit vx der Gleichung (4) ist unabhängig vom pH, nimmt aber mit steigender Temperatur zu. Durch Lichteinwirkung wird diese Umsetzung stark beschleunigt. Setzt man jedoch dem Reaktionsgemisch Nitrit zu, so verläuft die Oxydation im Dunkeln bis herunter zu pH 6,3 lang- sam, wird aber dann bei noch weiterem pH-Abfall stark beschleunigt. Unter Lichteinwirkung verläuft diese Reaktion auch bei hohen pH-Werten (Bild 2) sehr rasant. Der Einfluss des Nitritgehaltes ist aus Bild 3 ersichtlich (Walsh und Rose 1956). Allerdings ist zu beriicksichtigen, dass in der Rohwurst in- folge des niedrigen pH-Werts kein oder nur noch wenig freies Nitrit vorhanden ist (Mirna 1971) und der Grossteil des Farbstoffs in Chromogenform vorliegt (Niinivaara 1955). Aus dem Vorangehenden kann gefolgert werden, dass Rohwurst mit hohem pH wegen der geringeren Chromogenbildung eine schlech- tere Farbbeständigkeit als solche mit niedrigem pH aufweist (Bild 2 und 3). Die Stabilität des bereits gebildeten Stickoxidmyochromogens nimmt hingegen mit steigendem pH zu. Die Farbverblassung geschieht in zwei Phasen: Zunächst wird durch Lichteinwirkung das Stickoxid vom Häm ge- trennt, danach wird es vom Nitrit oder Sauerstoff oxydiert. In sauerstoff- freiem Milieu tritt keine Farbverblassung ein. Auch bei Einwirkung von Sauerstofl kann es, vorausgesetzt es sind Reduktionsmittel vorhanden, zu einer langsamen Farbneubildung kommen. Ist das Nitrit bzw. irgendein anderes Oxydationsmittel (z.B. Peroxid) in reichlicher Menge vorhanden, so wird das Pigment zu einem griinen Porphyrin-Ring oxydiert (Tarlagdis 1962, Fox und Thomson 1964, Review: Fox 1966). Die Geschwindigkeit des Verbleichens steigt mit sinkendem pH und zuneh- mendem Nitritgehalt, und zum Schluss kommt es u.U. zur Bildung farbloser oder gelblicher Verbindungen. Die griine Verbindung lässt sich nicht wieder in rote zuriickfuhren; bei Einwirkung von Reduktionsmitteln erfolgt ein Um- schlag in kräftigeres Oriin (Review: Fox 1966). Mit Hämochromen Hessen sich keine entsprechenden Versuche durchfiihren, jedoch kann vorausgesetzt werden, dass die Umsetzungen in etwa gleicher Weise erfolgen (Review: Lawrie 1974). Die Farbverblassung kann durch Reduktionsmittel und kleinen Nitrit- iiberschuss verzögert werden (Tarlagdis 1962, Reith und Szakaly 1967 b). Das Nitrit liegt hierbei offensichtlich als Stickoxid, gebunden oder als freie Nitrit-lonen vor. Salpetrige Säure wtirde den Farbstoff oxydieren. Bild 2. Einfluss des pH-Werts auf die Stickoxidmyoglobin-Oxydationsgeschwindig- keit bei und ohne Anwesenheit von Nitrit (Walsh und Rose 1956). Bild 3. Einfluss der Nitritkonzcntration auf die Stickoxidmyoglobin-Oxydationsgeschwindig- keit bei pH 5,6 (Walsh und Rose 1956). 14 15 Das in Fleischwaren enthaltene Nitrat muss, bevor es die gewiinschten Wirkungen ergibt, zu Nitrit reduziert werden (Niinivaara 1955). Da Fleisch keine nitratreduzierenden Enzyme enthält (Möhler 1974), muss die Reduktion auf bakterieller Basis erfolgen. Zahlreiche Vertreter z. B. der Gattungen Micro- coccus und Bacillus sowie viele gramnegative Bakterien reduzieren Nitrat zu Nitrit, jedoch lässt sich bei den einzelnen Gattungen in dieser Hinsicht keine deutliche Regelgebundenheit feststellen (Bergey’s Manual 1974). Wich- tig fiir die bei der Rohwurstherstellung verwendeten Starterkulturen ist ihr Nitratreduktionsvermögen (Pohja 1960), das sich auch beim Arbeiten mit Nitrit vorteilhaft auswirkt, weil ein Teil des Nitrits zu Nitrat oxydiert wird (Möhler 1970). Besonders wichtig ist das Nitratreduktionsvermögen beim Arbeiten mit verringerten Nitritzusätzen, da dann der relative Anteil an Nitrat so anwachsen kann, dass, wird das entstehende Nitrat im Laufe des Herstellungsprozesses nicht zu Nitrit zuriickreduziert, nicht mehr geniigend Nitrit fiir die Umrötung vorhanden ist. Ein Einsatz reiner Nitratreduktase oder auch nur roher Extrakte als Ersatz fiir lebende Organismen ist bei Roh- wurstbrat ohne Erfolg geblieben (Pfeil und Liepe 1973 a). Der im Hinblick auf das Nitratreduktionsvermögen der Bakterien optimale pH beträgt nach Schormuller und Schilling (1961 1 ), 19632)) 7,0, nach Pfeil und Liepe (1973 b 3)) 7,5, und die diesbeziigliche Aktivität nimmt diesen Autoren zufolge mit sinkendem pH-Wert rasch ab. Puolanne u.a. (1977 4)) ermittelten im Zusammenhang mit Lösungsversuchen den optimalen pH zu 6,0 und stellten auch unterhalb von pH 5,0 noch eine hohe Aktivität fest. Nach Niinivaara (1955) findet unterhalb von pH 5,4 weder in Bouillon noch in Wurst Nitratreduktion mehr statt. Im Lichte dieser Ergebnisse betrachtet ist offensichtlich, dass bei Rohwurst durch pH-Abfall andere das Reduktions- vermögen mitbestimmende Faktoren starker beeinflusst werden als die Nitrat- reduktase selbst (Pfeil und Liepe 1973 b, Puolanne u.a. 1977). Nach Puolanne u.a. (1977) ist das Nitratreduktionsvermögen von Micro- coccus sp. unterhalb 10° C schwach und steigt dann bis zu einer Temperatur von 44° C gleichmässig an; der Salzgehalt hat hingegen keinen entscheidenden Einfluss auf das Nitratreduktionsvermögen der Mikrokokken. Auch fanden sie, dass die K m-Werte der Nitratreduktase im Optimalbereich der einzelnen Faktoren (Temperatur, pH, Salzgehalt) zwischen 8,7 und 14,1 ppm NaN0 3 variierten. Die nahezu maximale Reduktionsgeschwindigkeit wird demzu- folge schon bei sehr niedriger Nitratkonzentration erreicht. Bei einer Nitrat- konzentration von 100 ppm (entspricht etwa 50 ppm bei Wurst mit 50 % Wassergehalt) beträgt die Nitratreduktionsgeschwindigkeit 87 % der Geschwin- digkeit bei 600 ppm. Daraus lässt sich schliessen, dass bei Rohwurst die Nitratkonzentration anfangs keinen wesentlichen Einfluss auf die Nitratreduktionsgeschwindigkeit hat, so dass zumindest in dieser Hinsicht einer Senkung der Nitratkonzentration nichts im Wege steht. *) Micrococcus caseolyticus lIIJ2. 2 ) Micrococcus epidermidis var. albus. 3) Micrococcus sp. (Baktoferment 61). 4 ) Micrococcus sp. 16 Bakterien vermögen auch Nitrit zu reduzieren (Bergey’s Manual 1974). Akashi (1974 a und b) stellte fest, dass die Stämme, die weniger NH 3 und mehr NO als die iibrigen Stämme produzierte im Zusammenhang mit dem Pokein von Fleischwaren eine giinstige Wirkung ausiibten. Auch nach Pfeil und Liepe (1974) wird Nitrit durch Starterkulturen reduziert. 2. 2 Technologie des Nitrit- und Nitrateinsatzes bei Rohwurst Nitrat gelangte ursprlinglich als Verunreinigung zusammen mit Kochsalz in die Fleischerzeugnisse (Lawrie 1974). Später ging man dann dazu liber, es mit Absicht und gleich in grossen Mengen bis zu 1 % zuzusetzen. Im allgemeinen lagen die zugesetzten Mengen zwischen 500 und 3 000 ppm (Braathen 1963). Farbfehler fiihrte man in der Regel auf ungleichmässige Salzverteilung und unzureichende Nitratkonzentration zurlick und versuchte entsprechend, mangelhafte Umrötung durch erhöhte Nitratzugabe auszu- gleichen. Da man inzwischen die aktive Rolle des Nitrits (Stickoxid) hei der Umrötung und die bakterielle Nitratreduktion zu Nitrit erkannt hatte, begann man den Fleischerzeugnissen auch Nitrit zuzusetzen (Brooks 1937, Lawrie 1974, Review: Binkert und Kolari 1975). Beim Obergang auf nitratreduzierende Starterkulturen bzw. direkten Nitritzusatz arbeitete man zunächst weiterhin mit grossen Zusatzstoffmen- gen und oft mit erhöhten Reifetemperaturen. Die Folge waren häufig auf zu hohe Nitritkonzentration und zu niedrigen pH zurlickzufiihrender Nitritbrand (»nitrite burn») (Fox und Thomson 1964) oder grline Farbfehler infolge zu hoher Anzahl Laktobazillen bzw. anderer peroxidbildender und katala- senegativer Bakterien (Nurmi 1966 a). Nachdem dann die Umrötungstheorie allgemeinen Eingang gefunden hatte, begann man die Nitrit- und Nitratzusätze zu verringern; technologische Nachteile ergaben sich daraus keine, im Gegenteil, die Nitritbrand-Gefahr schien eher abzunehmen. Gleichzeitig hatte man dabei auch die durch Nitrit und Nitrat gegebene akute Toxizitätsgefahr im Auge. Aus dieser Periode liegen nur ganz wenig Untersuchungsergebnisse iiber den Einfluss der zugesetzten Nitrit- und/oder Nitratmengen auf die Umrötung, dafiir aber zahlreiche Arbeiten liber die Wirkung dieser Stoffe auf das Wachstum pathogener Bakterien vor (Ingram 1974). In vielen Ländern ist der gleichzeitige Zusatz von Nitrit und Nitrat verhoten. Nitrit darf ausschliesslich als o,6prozentige NaCl-Mischung zugesetzt werden. Diese Einschränkung fiihrte allgemein zu einem Nitratzusatz von 500 ppm bzw. zu einer Nitritmenge von 150—180 ppm (Proc. ISNMP 1. 1974). Nach Bekanntwerden des Nitrosamin-Problems begann man in allerletzter Zeit erneut Untersuchungen liber die Mindestkonzentrationen anzustellen, mit denen sich noch einwandfreie Ware gewohnter Qualität herstellen lässt. Inzwischen war allerdings auch dank dem Einsatz von Starterkulturen, GdL und Askorbinverbindungen sowie verbesserter Hygiene und Reifungstechno- logie der Reifeprozess, namentlich was die Umrötung betrifft, leichter unter Kontrolle zu halten. Es zeigte sich nun, dass der begrenzende Faktor bei der Verringerung der Nitrit- bzw. Nitratzugabe nicht, wie frtiher angenommen, 17 die Umrötung, sondern vielmehr die Zunahme des mikrobiologischen Risikos ist (Leistner u.a. 1973 a und b, Wirth 1973). Bei der Diskussion von Farbfehlern ging man allgemein von der Zusammen- setzung der Mikrobenflora aus friiher die einzige Möglichkeit, an dieses Problem heranzugehen, da die verwendeten Nitrit- oder Nitratmengen auf jeden Fall fiir die Umrötung ausreichten. Nach Niinivaara (1955) ist bei ungeniigender oder fehlender bakterieller Nitratreduktion eine unvollständige Umrötung die Folge. Eine zu heftige Reduktion wiederum fiihrt zu Nitritbrand- Erscheinungen (Bacus und Deibel 1972). Gewisse Milchsäurebakterien erzeugen Wasserstoffperoxid, welches Myoglobin zu griinen Porphyrinverbin- dungen oxydiert (Greyer und Schuddenboom 1958). Das in der Rohwurst enthaltene Nitrit hemmt die Katalasen in Hirer Aktivität, und mit sinkendem pH-Wert nimmt diese Hemmwirkung zu, wie im allgemeinen im Zusammenhang mit Hämverbindungen (Walters u.a. 1974). Weiter ist auch bei Riickgang des pH-Wertes (Optimum pH 8,0) und bei Zunahme des Salzgehaltes eine Abnahme der Katalasenaktivität des Fleisches zu beobachten. Der optimale pH-Wert fiir Mikrobenkatalasen beträgt 5,0, wodurch der Abfall der Fleisch- Katalasenaktivität teilweise kompensiert wird (Rozier 1971). Farbfehler werden u.a. von Lactobacillus viridescens, Lactobacillus plantarum sowie von zahlreichen anderen Lactobacillus- und Streptococcus-Arten verursacht (Review; Nurmi 1966 a). Nurmi (1966 a) stellte fest, dass beim Arbeiten mit Nitrat (468 ppm) Laktobazillen 1) allein Farb- (griin) und Geschmacksfehler bewirkten, die mit wachsender Laktobazillenzahl immer ausgeprägter wurden. Bei ausschliesslichem Zusatz von Mikrokokken2) war die Folge eine bräunliche Färbung, wohingegen mit einem Laktobazillen-Mikrokokken-Gemisch (1:1, ca. 107 Keime/g) eine gute, beständige Farbe erzielt wurde und die Wiirste innerhalb kurzer Zeit Konsistenz und Aroma reifer Ware erreichten. Beim Arbeiten mit Nitrit (200 ppm) traten auch bei der Laktobazillen-Wurst keine Farbfehler auf, wohl aber Geschmacksfehler. Bei Wurst vom amerikanischen Typ wird meist Nitrit in Verbindung mit Laktobazillen-Starterkulturen einge- setzt, seltener hingegen Nitrat (Deibel 1974). Von Reuter (1972) liegt eine umfangreiche Studie iiber den Einsatz von Bakterienreinkulturen in erster Linie von Laktobazillenstämmen sowie von GdL zusammen mit Nitrit und Nitrat bei der Wurstherstellung vor. Die Mikrokokken2 ) verhinderten beim Arbeiten mit Nitrat und GdL die Bildung von Farbfehlern. Reuter konstatierte allerdings, dass, gehören die in der Wurst enthaltenen Laktobazillen nicht zu den farbfehlerverursachenden Arten, die Mikrokokken keine deutliche Farbverbesserung bewirken. Die mit Mikro- kokken-Starterkulturen hergestellten Wtirste wiesen im allgemeinen ein dunkleres Rot als die Vergleichswurste auf. GdL eignete sich am besten im Zusammenhang mit Nitrit, und durch Zusatz von Mikrokokken-Starterkulturen Hessen sich die mangelhafte Abrundung und Stabilität der GdL-Wiirste zum Teil verbessern. Weiter stellte Reuter fest, dass sich durch Wahl eines fiir Rohwurst geeigneten Laktobazillen-Stammes Geschmacks- und Farbfehler 1) Lactobacillus plantarum. 2) Micrococcus sp. 18 vermeiden lassen, denn seinen Darlegungen zufolge scheiden nur gewisse heterofermentative Stämme Peroxid ab. Er kommt somit im Gegensatz zu Nurmi (1966 a) zu dem Schluss, dass die Peroxidbildung hier von untergeord- neter Bedeutung ist. Lawrowa u.a. (1967) haben Untersuchungen iiber die zur Erzielung einer beständigen Farbe bei Rohwurst erforderlichen Mindestkonzentrationen angestellt. Ihren Ausflihrungen zufolge gentigte flii Wurst vom Summer- Sausage-Typ ein Nitritzusatz von 75 ppm; der Restnitritgehalt betrug dann 30 ppm, d.h. 1/s—l/10 der damals in der Sowjetunion üblichen Menge. Tjaberg u.a. (1969) setzten der Rohwurst verschiedenartige Farbstoffe zu; trotzdem verursachten die Laktobazillen Farbfehler. Bei gleichzeitigem Einsatz von Laktobazillen1), Mikrokokken2), Nitrit und Nitrat sowie Farbstoff traten keine Farbfehler auf. Mirna (1973) untersuchte die Eigenschaften von Rohvvurst mit iiblichem (126 ppm NaN0 2 ) und mit verringertem (31,5 ppm NaN0 2 ) Nitritpökelsalz- Zusatz. Beim Arbeiten mit der üblichen Menge betrug der Gehalt an freiem Restnitrit nur 3 ppm und die Gesamtnitritmenge (gebundenes Nitrit + Nitrat) 24 ppm; vom Myoglobin entfielen 73 % auf Stickoxidmyoglobin. Bei der Wurst mit dem verringerten Nitritzusatz lauteten die entsprechenden Werte: 2 ppm, 10 ppm und 64 %. Bei Zugabe von Askorbat (500 ppm) oder GdL (5 000 ppm) ging bei der letzteren Wurst die Restnitritmenge kaum noch zuriick, dafiir kam es zu einem kräftigen Anstieg der Nitratmenge. Der relative Stickoxidmyoglobin-Anteil betrug 78 % (Askorbat-Wurst) bzw. 81 % (GdL-Wurst). Daraus ergab sich die Feststellung, dass sich bei Einsatz von Askorbat oder GdL auch mit geringem Nitritzusatz eine ausgezeichnete Umrötung erzielen lässt. Nach Möhler (1959) liegt bei Rohwurst, bedingt durch den niedrigeren pH, der Stickoxidmyoglobin-Anteil höher als bei Briihwurst. In seinen Versuchen betrug der Stickoxidmyoglobin-Anteil je nach Wursttyp zwischen 74 und 93 %. Durch Einsatz von Askorbinsäure wurde ein geringfiigig besseres Ergebnis erzielt. Pfeil und Liepe (1973 b) fanden, dass sowohl bei Nitrit- als auch bei Nitrat- Einsatz durch Zusatz von Starterkultur2) eine Verringerung des Restnitrit- bzw. Restnitratgehalts erzielt wurde. Verringerte man den Nitratzusatz von 500 ppm auf 200 ppm, so sank der Restnitritgehalt auf unter die Hälfte. Bei Einsatz von 200 ppm Nitrat und Starterkultur lag der Nitritgehalt vrährend der gesamten Versuchsdauer niedriger als bei den mit 500 ppm Nitrat oder 180 ppm Nitrit hergestellten Wiirsten. Gerhard und Haller (1973) untersuchten den Einfluss von GdL auf die Restnitrit- und -nitratmengen und auf den Stickstoffoxidmyoglobin,-Anted bei verschieden grossen Nitrit- und Nitratzusätzen; sie verwendeten dabei keine Starterkulturen. Wie sie feststellten, blieb der Stickoxidmyoglobin-Anteil bei Einsatz von GdL und Zusatz von 10—28 g/kg Nitritpökelsalz (theoretischer Wert 55—154 ppm NaN02 ) praktisch konstant. Durch Zusatz von Askorbin- *) Lactobacillus plantarum. 2) Micrococcus sp. (Baktoferment 61). 19 säure wurde keine weitere Farbbildung erzielt. Bei den GdL-freien Nitrat- Wiirsten (500 ppm KN0 3) und Nitrit-Wiirsten (154 ppm NaN0 2 ) lag der Stickoxidmyoglobin-Anted um 10—15 Prozentpunkte niedriger als bei den GdL-Wiirsten. Letztere Wiirste wiesen trotz verschieden grossen Nitritzusätzen beziiglich der Restnitrit- und -nitratmenge keine erheblichen Unterschiede auf, enthielten aber durchweg weniger Restnitrit und -nitrat als die ohne GdL- Zusatz hergestellten Wiirste. Detmers u.a. (1975) setzten Thiiringer-Wurst zusammen mit Starterkultu- ren 1) 0—125 ppm NaN0 2 und o—lsoo ppm KN0 3 zu und stellten fest, dass der Nitrit- und Nitratgehalt wahrend der Lagerung zuriickging. Die Nitrat- abnahme war bei hoher Temperatur (+27° C) ausgeprägter als bei niedriger (+7,5° C); auf den Nitritschwund hatte die Temperatur keinen Einfluss. Nach Skjelkväle u.a. (1974) wiesen Wiirste mit 0 ppm und 164 ppm Nitrit keine signifikanten geschmacklichen Unterschiede auf sofern die Her- stellung unter Einsatz von Starterkulturen2) oder GdL erfolgte. Beim Arbeiten ohne Starterkulturen und GdL wurde zwischen den Wiirsten mit 164 ppm und 0 ppm NaN0 2 ein signifikanter Unterschied festgestellt, nicht mehr aber zwischen den Wiirsten mit 82 ppm und 0 ppm NaN0 2 . Detmers u.a. (1975) hingegen konstatierten, dass ohne Nitrit- und Nitratzusatz hergestellte Wiirste deutlich einen fehlerhaften, ranzigen Geschmack aufwiesen, dass aber schon durch Zugabe von 50 ppm NaN0 2 oder 500 ppm KN0 3 diese Fehler vermieden wurden. Die gleichen Zusatzstoffmengen bewirkten ausserdem eine signifikante Verbesserung des Geschmacks und Aussehens der Ware. Durch Erhöhung des Nitritzusatzes auf 100 oder 150 ppm wurden organoleptisch beurteilt noch geringfiigig bessere Eigenschaften erzielt; zusätzliche Nitratzugabe fiihrte hingegen zu keinem giinstigeren Resultat. Nestorov u.a. (1975) stellten bei Zusatz von 1 000 ppm KN0 3 , 250 ppm KNO s oder 80 ppm NaN0 2 zusammen mit Starterkulturen3 ) beziiglich der Stickoxidmyoglobin-Menge keine wesentlichen Unterschiede fest. Die grösste Stickoxidmyoglobin-Menge wurde bei gleichzeitigem Einsatz von 80 ppm NaN0 2 und 500 ppm Askorbat erreicht. Die Nitrat-Wiirste hatten keinen Askorbatzusatz erhalten. Petäjä (1977) hat eine urafangreiche Arbeit iiber die Verwendung von gram- negativen Bakterien als Starterkulturen in der Rohwurst durchgefuhrt. Er hat insgesamt 138 Versuchswurstposten mit einem Zusatz von nur 200 ppm KN03 hergestellt, und in keinem Falle wurden durch diesen niedrigen Nitrat- zusatz Farbfehler verursacht. Der Nitritgehalt der Wiirste lag gewohnlich unter 10 ppm; in drei Tage alten Wiirsten variierte er jedoch je nach Starter- kulturen zwischen 9 und 57 ppm. Der niedrigste Wert wurde durch Ver- wendung von Aeromonas sp. und Lactobacillus plantarum 4 ) als Starter- kulturen, der höchste Wert mit einem anderen Aeromonas-Stamm erreicht. *) Lactobacillus plantarum und Pediococcus cerevisiae (Lactacel MC). 2) Lactobacillus plantarum und Micrococcus sp. (Duploferment 66) 3 ) Micrococcus P4. 4) Aus Duploferment 66 20 Nach Meinung des Verfassers beruht dies darauf, dass der erstgenannte Aeromonas-St'dmm ein schwacher Nitratreduzierer ist, und ausserdem durch Einsatz von Laktobazillen das Nitratgehalts-Maximum gesenkt wurde. Nach 21 Tagen waren die Unterschiede zwischen den Wiirsten unbedeutend. Wirth (1973, 1974) stellt zusammenfassend iiber seine Untersuchungen fest, dass eine Rohwurstherstellung ohne Nitrit oder Nitrat nicht möglich ist, und dass eine gute, beständige Farbe durch Zusatz von 60—BO ppm NaN02 oder 200 ppm KN0 3 erreicht wird. Als Mindestmengen gibt er 40 ppm NaNO a und 150 ppm KN0 3 an, wobei es nach seiner Auffassung in der industriellen Produktion bereits zu vereinzelten Farbfehler-Fällen kommen kann. Beim Arbeiten mit Nitrit sichern 300 500 ppm Askorbat, beim Arbeiten mit Nitrat 100—200 ppm Askorbat die Umrötung. In geschmacklicher Hinsicht gestaltet sich hingegen ein niedriger Nitritzusatz giinstiger, und sogar 30 ppm ergeben den fiir Rohwurst typischen Geschmack. Gewohnlich ergaben jedoch 30 ppm einen sauren Geschmack. Die Restnitrit- und -nitratgehalte lagen in seinen Untersuchungen sehr niedrig. Die Geschmacksverbesserung fiihrt man auf die höhere Aktivität der aromabildenden Bakterien bei niedrigen Nitritkonzen- trationen zuriick. Mirna und Coretti (1974) konnten mit 156 und 15,6 ppm schwarzem Roussin’schem Salz (sRS) eine braunrötliche Farbe auf Rohwurst erreichen. In Kulturversuchen zeigte sRS starke bakteriostatische Wirkung gegen Mikro- kokken und Enterobacter-Keime, aber der Hemmeffekt wurde in Anwesenheit von Fleischproteinen teilweise wieder aufgehoben. 2. 3 Pathogene Bakterien in der Rohwurst Rödel u.a. (1975) haben ein Verfahren zur Einteilung von Fleischwaren in Haltbarkeitsgruppen auf Grund ihres aw- und pH-Wertes dargelegt, dem- zufolge Fleischwaren mit einem aw-Wert < 0,95 und einem pH-Wert < 5,2 oder einem aw-Wert < 0,91 oder einem pH-Wert < 5,0 auch ohne Kaltlagerung haltbar sind. Die Haltbarkeit von Fleischerzeugnissen wird von zahlreichen Faktoren mitbestimmt, die bei der Festlegung der oben angefiihrten Grenzwerte zum Grossteil indirekt Beriicksichtigung fanden. Allerdings gelten diese Grenzwerte nur fiir den bakteriellen, nicht aber fur den chemischen sowie den durch Schimmelpilze und Hefen bedingten Verderb, der auf andere Weise unter Kontrolle gehalten werden muss. Rohwurst erflillt im allgemeinen die o.g. Bedingungen, wobei freilich im Hinblick auf das Pathogenitätsrisiko zwei Einschränkungen zu machen sind. In der Arbeit von Rödel u.a. (1975) ging es ausschliesslich um den Verderb der Ware, und abnormal starke Kontaminationen durch pathogene Bakterien wurden in den Versuchen offensichtlich nicht festgestellt. Nahrungsmittel- vergiftung ist stets durch Abweichung vom Normalen bedingt; bei Rohwurst kommt als solche in erster Linie eine starke Anfangskontamination in Frage, denn die iibrigen Einflussfaktoren können als konstant oder nur beschränkt variabel betrachtet werden. Nun herrschen bei der Rohwurstherstellung je nach Wursttyp und Technologie mehrere Tage lang Verhältnisse, unter denen sich pathogene Bakterien vermehren und auch Toxine bilden können, und in 21 dieser Periode rutissen auch verschiedene andere Einflussfaktoren als Variable beriicksichtigt werden, darunter der Nitritgehalt. Entscheidend in dieser dynamischen Phase der Produktion ist die gemeinsame Wirkung aller eine bestimmte Eigenschaft beeinflussenden Faktoren, so dass also, wenn einer dieser Faktoren in seiner Wirkung nachlässt (beispielsweise bei Verringerung des Nitritzusatzes), der Anteil der iibrigen Begrenzungsfaktoren entsprechend erhöht werden muss (Hiirdeneffekt, Rödel u.a. 1975). Was die pathogenen Bakterien in derRohwurst betrifft, so handelt es sich um eine Risikoeinschätzung, bei der die wahrscheinliche Anfangskontamination und die Variationsmöglich- keiten der Verfahrenstechnik zu beriicksichtigen sind. Gegenwärtig sind all- gemeine Bestrebungen im Gange, den Nitritzusatz zu senken und den Anteil der iibrigen Begrenzungsfaktoren zu erhöhen ohne jedoch das Pathogenitätsrisiko zu stark anwachsen zu lassen und die Qualität des Endprodukts zu beeinträch- tigen. Salmonellen Salmonellen werden bin und wieder auch in Rohwurst festgestellt (Marazza und Crespi 1963, Ortmann 1967, Takacs und Simonffy 1970, Tarnay 1975); der wichtigste Faktor bei der Begrenzung ihres Wachstums ist der pH. Nach einer Studie von Goepfert und Chung (1970) beeinflussten sowohl der pH als auch der Salzgehalt das Wachstum von Salmonella typhimurium\ Nitrit zeigte weder allein noch zusammen mit Salz bakterizide Wirkung. Eine pH- Senkung auf 4,3 hatte hingegen ein schnelles (24 Stdn.) Absterben der Salmo- nellen zur Folge. Zahlreiche Forscher haben die Vernichtung der Salmonellen als Folge des durch Starterkulturen bedingten pH-Abfalls konstatiert (Coep- fert und Chung 19701), Gilliland und Speck 19722), Leistner u.a. 1973 b 3), Smith u.a. 1975 a 4), Sirviö u.a. 19775)). Auch die Säure, die den pH-Riick- gang bewirkt, ist bei der Hemmung des Salmonellenwachstums von Bedeu- tung (Chung und Goepfert 1970). Lösungsversuche ergaben beim Arbeiten mit Essigsäure fiir das Wachstum von Salmonellan einen pH-Mindestwert von 5,40; fiir Milch- und Salzsäure betrugen die entsprechenden Werte 4,40 bzw. 4,05. Nach Leistner u.a. (1973 b) hemmte auch GdL das Wachstum von Salmonellan und bewirkte zusammen mit Nitrit deren Absterben, was auf die vom GdL verursachte pH- Abnahme zuriickzufuhren war. Durch Räuchern und Trocknen der Wurst- oberfläche werden die auf letzterer befindlichen Salmonellen abgetötet (Scheib- NER 1969). Nach Takacs und Simonffy (1970) werden die Salmonellan in der ungari- schen Salami durch den hohen Salzgehalt nicht vollständig abgetötet, sondern es ist wegen des hohen pH-Wertes (5,8 —6,0 am Ende des Reifeprozesses) stets eine gewisse Gefahr latenter Salmonelleninfektion vorhanden. 1) Lactobacillus sp. und Pediococcus sp. 2 ) Streptococcus 3) Lactobacillus sp. 4 ) Lactobacillus plantarum und Pediococcus cerevisiae (Lactacel MC). 5) Lactobacillus plantarum und Micrococcus sp. {Duploferment 66 und Baktoferment 61). 22 Leistner u.a. (1973 b) haben das Verhalten der Salmonellen in Rohwurst hauptsächlich in Abhängigkeit vom Nitrit eingehend untersucht. Dabei arbeiteten sie mit einer Mischung aus zehn verschiedenen Salmonella-Stämmen. Als Variable fungierten Nitritkonzentration, GdL, Starterkulturen 1) und Umfang des Salmonellenzusatzes. Im Gegensatz zu Goepfert und Chung (1970) stellten Leistner u.a. (1973 b) fest, dass Nitrit eine wachstumshemmende Wirkung auf Salmonellen ausiibt: Ein Nitritzusatz von 135 bzw. 101 ppm hatte bei hohem Salmonellen- Zusatz (10 6 Keime/g) eine Hemmung deren Wachstums, bei niedrigem Salmo- nellen-Zusatz (10 2 Keime/g) deren Absterben zur Folge. Auch Sirviö u.a. (1977) konstatierten eine wachstumshemmende Wirkung des Nitrits auf Salmonellen. Bei Nitrat war ein solcher Effekt nur im Zusammenhang mit Starterkulturen zu beobachten. Falls bei der Rohwurstherstellung nicht mit Nitrit oder Nitrat gearbeitet und gleichzeitig fiir pH-Senkung, hohen Salzgehalt und Räuchern gesorgt wird, ist die Möglichkeit einer raschen Vermehrung der Salmonellen durchaus gegeben (Leistner u.a. 1973 b, Sirviö u.a. 1977). Bei der Einschätzung des durch Salmonellen bedingten Risikos auf der Basis der verfiigbaren Untersu- chungsergebnisse sind eine ganze Anzahl der obcn aufgezählten Faktoren (Salmo- nella-Stamm, Ausmass der Kontamination, Nitrit- bzw. Nitratkonzentration, Salzgehalt, Zuckergehalt, Reifetemperatur, Einsatz von Laktobazillen- Starterkultur und GdL sowie anderen Zusatzstoffen) zu beriicksichtigen. Zusammenfassend kann hierzu festgestellt werden, dass bei Rohwurst ein Zusatz von wenigstens 100 ppm Nitrit und eine Senkung des pH-Wertes durch Starterkulturen oder GdL auf 5,2 oder darunter erforderlich sind (Leistner u.a. 1973 b). Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus ist zwar in Rohwurst häufig anzutreffen (Barber und Deibel 1972), aber in den allerraeisten Fällen in so geringen Mengen, dass keine Gefahr einer Lebensmittelvergiftung besteht (Riemann u.a. 1972, Nis- kanen und Nurmi 1976). Trotzdem sind Fälle von Staphylokokken-Vergiftung durch Rohwurstverzehr bekannt (NCDC 1971 a und b). Bei Rohwurst reicht selten ein Einzelfaktor aus, um Wachstum oder Toxinbildung von S. aureus zu verhindern, so dass durch Versuche, die nur einen Teil der Einflussfaktoren beriicksichtigen (Review: Riemann u.a. 1972, Buchanan und Sohlberg 1972, Genigeorgis u.a. 1971, Troller und Stinson 1975), lediglich diejenigen Umstände klargestellt werden, unter denen Wachstum bzw. Toxinbildung in der Rohwurst als gehemmt vorausgesetzt werden kann. Das Wachstum bzw. Absterben und die Toxinbildung von 5. aureus warden gleichzeitig von wenigstens folgenden Faktoren beeinflusst, die wahrend des Rohwurst-Herstellungsprozesses ausserdem ständigen Änderungen un- terworfen sind: *) Lactobacillus sp. 23 Staphylococcus-Stamm Toxin (A, B oder C) pH-Wert Temperatur Redox-Potential Ausmass der Kontamination Salzgehalt Nitrit- und Nitratgehalt Räuchern sonstige Zusatzstoffe (vor allem GdL) Starterkulturen und endogene Flora Im neutralen pH-Bereich bewirkt eine Abnahme des a w-Wertes bis herunter zu aw = 0,92 bei S. aureus eine geringfiigige Wachstumsverlangsamung; unterhalb des angefiihrten Wertes nimmt die Hemmwirkung zu, und unterhalb von aw =0,90 ist bereits eine deutliche Hemmung festzustellen (Genigeorgis u.a. 1971, Troller und Stinson 1975). Als Mindestwerte fiir das Wachstum werden 0,83 (Hill 1973) und 0,86 (Scott 1957) angegeben. Enterotoxin bildet sich bei aw-Werten liber 0,93 (Troller und Stinson 1975). Wenn die Ver- mehrungsgeschwindigkeit von S. aureus durch pH-Senkung auch vermindert wird, so gedeiht er doch in einem breiten Bereich bis pH 4,0 und produziert Toxine (Review: Riemann u.a. 1972). Anaerobe Verhältnisse bewirken eine Verzögerung sowohl des Wachstums (Genigeorgis u.a. 1971, Buchanan und Sohlberg 1972) als auch der Toxinbildung (Barber und Deibel 1972) von S. aureus. Fiir das Wachstum dieses Organismus ist eine Mindesttemperatur von 6,7° C erforderlich; zur Toxinbildung kann es unter anaeroben Verhältnissen noch bei 10° C kommen. Mit steigender Temperatur nehmen Wachstum und Toxinbildung an Geschwindigkeit zu und kommen dann bei 45°—46° C zum Erliegen (Review: Riemann u.a. 1972). Zur Toxinbildung sind 1—4‘ 107 Keime/g erforderlich. In der Oberflächenschicht der Wurst werden koagula- sepositive Staphylokokken oft in Mengen von 104 —l06 Keimen/g festgestellt, im Kern hingegen gewohnlich in Mengen von weniger als 100 Keimen/g (Barber und Deibel 1972). Nitrit hemmt das Wachstum von S. aureus unter aeroben Verhältnissen nur geringfiigig, unter anaeroben Verhältnissen im sauren pH-Bereich hingegen sehr stark (Castellani und Niven 1955, Buchanan and Sohlberg 1972). Nitrat wird erst nach seiner Reduktion zu Nitrit /Lechowich u.a. 1956) oder in Verbindung mit letzterem (Jedlicka u.a. 1975) wirksam. McLean u.a. (1968) fanden, dass bei Ansteigen des Salzgehalts die Bildung von Staphylokokken-Enterotoxin B stärker als das Wachstum des Organismus gehemmt wird. Eine starke Minderung des Toxinbildungsvermögens trat ab einem Salzgehalt von 2 % ein. Bei Zusatz von Nitrit und Senkung der Temperatur von 37° C auf 20° C zeigte sich lediglich eine additive Hemmwirkung dieser beiden Faktoren. Nitrit allein hatte keine grosse Wirkung. Wachstum und Toxinbildung der Staphylokokken in der Rohwurst werden somit im wesentlichen von anderen Faktoren als vom Nitrit oder Nitrat be- stimmt (Bild 4) (Riemann u.a. 1972). Jedoch Jedlicka u.a. (1975) fanden, dass bei Beriicksichtigung sämtlicher Endprodukt-Eigenschaften 100 ppm NaN0 3 und 75 ppm NaN0 2 die optimale Kombination im Hinblick auf die Hemmung der Staphylokokken daistellen. Die inhibitorische Wirkung des Nitrits schien insbesondere unter anaeroben Verhältnissen eher additiver Natur zu sein. Der Einfluss der Nitritkonzentration auf die Toxinbildung wurde von ihnen nicht untersucht. Barber und Deibel (1972) beobachteten bei Verwendung von Starter- kulturen 1 ) ein Wachstum von Staphylokokken auf der Wurstoberflache, auf der aerobe Verhältnisse vorliegen. Unter anaeroben Bedingungen wurde nur eine schwache oder überhaupt keine Toxinbildung festgestellt. Durch 1,5 % GdL wurde das Wachstum der Staphylokokken sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Verhältnissen verhindert; Wachstum fand unter aeroben Verhältnissen bei 1,3 % GdL, unter anaeroben Verhältnissen bei 1,0 % GdL statt. Unterhalb von pH 5,7 vermochten die meisten Stämme bei anaeroben Verhältnissen kein Toxin zu bilden; unter aeroben Verhältnissen lag diese Grenze dagegen bei pH 5,1. Daly u.a. (1973) fanden, dass unter simulierten Rohwurstverhaltnissen auch Starterkulturen2 ) das Staphylokokken-Wachstum stark hemmen. In ihren Versuchen kam es, warden keine Starterkulturen zugesetzt, in den ersten 50 Stunden zu einer sehr heftigen Vermehrung der Staphylokokken. Lakto- bazillen allein batten eine geringere Hemmwirkung als ein Laktobazillen- J) Pediococcus cerevisiae. 2 ) Pediococcus cerevisiae (Lactacel), Pediococcus cerevisiae -f- L. plantarum (Lactacel MC) und Lactobacillus plantarum (Lactacel DS). Bild 4. pH-\Vert-Salz-Kombinationen, bei denen auf kiinstlichem Nährboden cine aerobe Bildung (oberhalb der Kur- ven) oder keine aerobe Bildung (unter- halb der Kurven) von Staphylokokken- Enterotoxin A, B und C stattfand. Beimpfung mit 107 Keimen/g ( ) oder 108 Keimen/g (- ); (Review: Riemann u.a. 1972). 24 25 Pediokokken-Gemisch. Chemisches Säuern (Einsatz von GdL) allein be- wirkte keine wesentliche Hemmung des Staphylokokken-Wachstums, ergab aber kombiniert mit Starterkulturen einen starken Effekt. Bei hohen Tempe- raturen (37° C und 30° C) wurde die Säurebildung der Starterkulturen be- schleunigt; die Hemmung der Staphylokokken war entsprechend intensiver als bei niedriger Temperatur (21° C). Daly u.a. arbeiteten in ihren Versuchen mit einer ziemlich niedrigen Nitratmenge (100 ppm), was vielleicht einer der Griinde fur das schnelle Wachstum der Staphylokokken in den Kontrollwiirsten war. Niskan,en und Nurmi (1976) konstatierten, dass bei typisch finnischer Rohwurst, deren Reifetemperatur anfangs höchstens 24° C beträgt und inner- halb von einigen Tagen auf etwa 20° C gesenkt wird, eine hohe Anzahl Sta- phylococcus aureus nur in den allerseltensten Fällen möglich lit. Sie sind der Auffassung, dass der pH durch Einsatz von Starterkulturen1) oder GdL gesenkt werden miisse, um das diesbeziigliche Risiko so klein wie möglich zu halten. Bei starker Kontamination mit S. aureus (10° Keime/g) kam es ohne Starter- kultur-Zusatz zur Bildung von Enterotoxin A, nicht aber bei Einsatz von Starterkultur. Bei sehr starker Staphylokokken-Kontamination bildete sich innerhalb der ersten drei Tage selbst bei Einsatz von Mikrokokken-Starter- kultur Enterotoxin C, das allerdings am siebten Tag nicht mehr nachzuweisen war. Zur Bildung von Enterotoxin B kam es hingegen nicht. Durch Mikro- kokken-Starterkultur wurde die Toxinbildung stets dann verhindert, wenn mehr Mikrokokken als Staphylokokken vorhanden waren. Durch Laktobazillen- Starterkultur wurde das Wachstum der Staphylokokken durchweg gehemmt. Tätini u.a. (1976) haben ermittelt, dass durch Räuchern das Wachstum der Staphylokokken in Rohwurst (Pepperoni) gehemmt wird. Allerdings kam es in ihren Versuchen selbst bei der Kontrollwurst mit einem Staphylokokken- gehalt von 4 • 10 7 Keimen/g nicht zur Bildung von Enterotoxin. Nach Tatini und seinen Mitarbeitern birgt Wurst vom Pepperoni-Typ, was die Staphylo- kokken betrifft, kein gesundheitliches Risiko in sich. Labots (1977) fand, dass durch Erhöhung des Nitritzusatzes von 0 auf 120 ppm bei nassgepökelter Rohwurst das Wachstum von S. aureus gehemmt wurde. Ohne Nitritzugabe nahm dieser Organismus in der Oberflächenschicht von 103 auf 108 , im Kern auf 104 Keime/g zu. Bei den niedrigeren Nitrit- zusätzen (bis 60 ppm) vermehrte sich S. aureus anfänglich, begann aber dann abzusterben. Das Absterben setzte mit steigender Nitritkonzentration friiher ein. Bei Zusatz von 120 ppm NaN0 2 fand iiberhaupt keine Vermehrung mehr statt. Bei sämtlichen Nitritkonzentrationen lag der Gehalt an 5. aureus im Kern der Wurst wesentlich niedriger als in der Oberflächenschicht. In entsprechenden luftgetrockneten, ungeräucherten Rohwursten nahm S. aureus an der Oberfläche zahlenmässig stark zu, und der Nitritzusatz (30 180 ppm NaN0 2) hatte keinen Einfluss auf das Wachstum der Staphylo- kokken. Im Kern der Wurst lag die S. aureus -Konzentration beträchtlich niedriger, eine entscheidende Wirkung hatte der Nitritgehalt aber auch hier nicht. Der pH-Wert zeigte deutliche Auswirkungen auf das Wachstum von *) Lactobacillus plantarum und Micrococcus sp. (Duploferment 66). 26 S. aureus. Bei Verringerung des Nitritzusatzes von 60 ppm auf 30 ppm nahm der pH um so viel ab, dass bei der niedrigeren Nitritkonzentration ein schnelleres Absterben von S. aureus stattfand, dem allerdings eine dcut- liche Vermehrungsphase voranging. (Labots 1977). Clostridium botulinum Riemann u.a. (1972) äussern in ihrem umfangreichen Aufsatz die Vermu- tung, dass in den USA Clostridium botulinum gelegentlich in Fleischwaren- Rohmaterial auftritt. Nach Roberts und Ingram (1977) enthält in England das Schweinefleisch im Durchschnitt 2 Keime/kg C. botulinum. Da die Klo- stridien mit Ausnahme hohen Redox-Potentials alle beim Herstellungsprozess auftretenden Verhältnisse ausgezeichnet vertragen, ist auch bei der Produktion von Röhwurst Sorge dafiir zu tragen, dass es nicht zu einer Vermehrung und Toxinbildung von C. botulinum kommt. Nach Niinivaara (1955) haben die Lebensfunktionen der in der Wurst enthaltenen Bakterien die Tendenz, das Redox-Potential in den fiir die Ver- mehrung der anaeroben Bakterien giinstigen Bereich herabzusetzen. Nitrat- zusatz stabilisiert in gewissem Masse diese Veränderungen. Die Verwendung von Starterkulturen fiihrt zur Reduktion des Nitrats zu Nitrit und weiter zu Stickstoffoxid. Besonders diese Reaktionen erhöhen das Redox-Potential und stabilisieren weitgehend seine Veränderungen. Dies hat zur Folge, dass die Tätigkeit der anaeroben Bakterien in der Wurst geschwächt wird. Die proteolytischen Stämme zeigen unterhalb von 10°—l2° C kein Wachstum mehr; einige nichtproteolytische Stämme gedeihen jedoch sogar noch bei 3° C. Die Toxinbildung kommt im allgemeinen eher als das Wachstum zum Stillstand. C. botulinum gedeiht bei ziemlich niedrigen pH-Werten (4,8—5,0) (Riemann u.a. 1972). Mit sinkender Temperatur steigt jedoch der fiir das Wachstum der sechs Stämme von C. botulinum erforderliche Mindest-pH; bei 29° C beträgt er 5,0 —5,4, bei 16° C 5,4, bei 8° C 5,7 —5,9 und bei 5° C 6,2 (Emodi und Lechowich 1969). Die Ergebnisse sind von Stamm zu Stamm verschieden. Bei Laborversuchen hatte der Salzgehalt keinen Einfluss auf den fiir das Wachstum erforderlichen Mindest-pH (Review: Riemann u.a. 1972). Bild 5 zeigt das Wachstum von C. botulinum in Abhängigkeit vom pH und vom Salzgehalt. Der Nitritgehalt blieb unberiicksichtigt. Bild 5. pH-Wert-Salz-Kombi- nationen, bei denen Wachstum und Toxinbildung (oberhlb der Kurven) bzw. kein Wachstum und keine Toxinbildung (un- terhalb der Kurven) stattfand. Clostridium botulinum Typ A und B ( ) sowie Typ E ( ) (Riemann u.a 1972). 27 Bei einem Salzgehalt der Wasserphasen von 6,3—9,0 °/0 wurde Toxinbildung beobachtet (Review: Riemann u.a. 1972). Mit steigendem Salzgehalt, sinken- dem pH, steigendem Nitritgehalt und abnehmender Temperatur wird das Wachstum von C. hotulinum gehemmt; in der Rohwurst ist die Gesamtwirkung dieser Faktoren so beträchtlich, dass eine Vermehrung von C. hotulinum im Bereich des Unwahrscheinlichen liegt (Review: Riemann u.a. 1972, Roberts und Ingram 1977). Aus diesem Grunde wurde die durch Rohwurst gegebene Botulismus-Gefahr bisher auch nur sehr wenig untersucht. Christiansen u.a. (1975) haben hingegen eine sehr ausgedehnte Untersuchung iiber die Toxin- bildungsfähigkeit von C. hotulinum unter verschiedenartigen Bedingungen durchgefiihrt. Als Versuchswurst diente Summer Sausage, die bei 32° C mit oder ohne Starterkulturen 1) fermentiert wurde. Die Fermentation wurde durch Erhitzen auf 58,3° C abgebrochen, jedoch können aus den Ergebnissen Schliisse gezogen werden, die auch hinsichtlich anderer Rohwursttypen Giiltigkeit haben dtirften. Die Toxinbildung wurde durch Lagerung der Wiirste bei 27° C verfolgt. Die Bedeutung des pH-Wertes trat in sämtlichen Stadien des Versuchs sehr deutlich in Erscheinung. Durch Zugabe von Glukose wurde die Mög- lichkeit ftir eine pH-Abnahme geschaffen, und bei Zusatz von Starterkultur sank der pH rasch auf einen ausreichend niedrigen Wert. Nitrat verhinderte die Toxinbildung, sofern es rechtzeitig vor dem pH-Abfall zu Nitrit reduziert wurde. Bei Wurst mit Glukosezusatz geniigten 50 ppm NaN0 2 um die Toxin- bildung zu unterbinden, bei glukosefreier Wurst waren hierzu 150 ppm er- forderlich. Zahlenmässig blieb C. hotulinum während der gesamten Versuchs- dauer (112 Tage) und bei sämtlichen erprobten Zusatzstoff-Kombinationen praktisch konstant, so dass also nicht die Bakterienzahl sondern die Toxinbil- dung der ausschlaggebende Faktor ist (Christiansen u.a. 1975). Mit Toxinbildung in kontaminierter Wurst ist also dann zu rechnen, wenn weder Nitrit noch Glukose noch Starterkultur noch GdL zugesetzt wird eine in der Praxis undenkbare Situation. Von einer nennenswerten Botulismus- Gefahr kann bei Rohwurst deshalb nicht die Rede sein. Clostridium perfringens Zyss u.a. (1967) konstatierten, dass Clostridium perfringens den Rohwurst- Herstellungsprozess u.U. iiberstand, jedoch innerhalb der ersten drei Tage zahlenmässig stark zurilckging. Die Absterbequote nahm mit steigender Tem- peratur zu. Durch Erhöhung des Salz- und Nitritgehalts wurde zwar das Wachstum dieses Organismus gehemmt, kam aber in Laborversuchen auch bei 8 % NaCl und 200 ppm NaN0 2 noch nicht völlig zum Erliegen. Andere Arbeiten iiber das Wachstum von C. perfringens unter Rohwurst-Verlmltnissen liegen kaum vor, und aus den mit rohem Eleisch oder erhitzten Produkten durchgeftihrten Versuchen können keine Schliisse beziiglich Rohwurst gezogen werden. Auf Rohwurst zuriickzufiihrende C. /lez/zmge-ws-Nahrungsmittelver- giftungen werden nur selten festgestellt. Roberts und Ingram (1977) haben ausgefiihrt, dass zwar verschiedene Klostridien in nicht warmebehandeltem ') Lactobacillus plantarum und Pediococcus cerevisiae (Lactacel MC). 28 Schinkenspeck unter gewissen Verhältnissen gediehen, dass aber C. perjringens in keinem einzigen Falle Wachstum zeigte. Bacillus cereus Nach Raevuori (Review 1976) wurde Bacillus cereus im Rahmen mehrerer verschiedener Forschungsarbeiten in 2—77 % der insgesamt untersuchten Lebensmittelproben und in 26 —5B % der untersuchten Fleisch- und Fleisch- warenproben festgestellt. In finnischer Rohwurst ist B. cereus nur äusserst selten und auch dann nur in geringer Zahl anzutreffen (Pohja 1976, rmind- liche Information). Als Mindestwachstumsbedingungen fordert dieser Orga- nismus pH 4,5, 10° C und aw 0,95. Östlund und Regner (1968) konstatierten, dass B. cereus sich in der Rohwurst gut vermehren kann. In ihrer Untersuchung ging der Gehalt an B. cereus jedoch sehr schnell wieder zuriick. Bei Abweichung mehrerer Faktoren vom Optimum und Anwesenheit von Nitrit und eventuell Erythorbat ist sein Wachstum weitgehend gehemmt. Pohja und Niinivaara (1957) haben auch festgestellt, dass Micrococcus Ms3eine antagonistische Wir- kung auf die den Familien Achromobacteriaceae, Enterohacteriaceae und Bacillaceae angehörenden Arten ausiibt. B. cereus wurde auch schwach gehemmt. B. cerews-Nahrungsmittelvergiftung infolge Rohwurstverzehrs ist deshalb höchst unwahrscheinlich, und bisher sind auch keine derartigen Fälle bekannt (Review: Raevuori 1976). 2. 4 Nitrosamine in der Rohwurst Auch die Rohwurst hat man in die Nitrosamin-Forschung einbezogen. Mit Ausnahme des Summer-Sausage-Typs wurde Rohwurst bei der Herstellung nicht erhitzt. Wärmebehandlung, insbesondere Braten, hat ein Ansteigen der Nitrosaminbildung zur Folge. Allerdings ist der niedrige pH der Rohwurst gerade der Bildung stark karzinogener Nitrosaraine förderlich. Auch bei Zimmertemperatur und darunter können sich Nitrosamine bilden (Review: Crosby und Sawyer 1976). In Tabelle 2 sind die von verschiedenen Forschern in einigen Rohwurst- sorten festgestellten Nitrosaminmengen zusammengestellt. Die Angaben war- den unabhängig von der Art des jeweiligen Nitrosamins in ppb gemacht. Zur Vermittlung eines eindeutigen Bildes wäre eine umfangreiche Tabelle erforder- lich, wobei die durch die Analysensysteme bedingten Unterschiede trotzdem bestehenbleiben wlirden. Die Analysenverfahren sind noch mit beträchtlichen Unsicherheitsfaktoren behaftet, wodurch die generelle Erfassung des Nitrosamin- Problems sehr erschwert wird (Proc. ISNMP 2. 1977). Die Geschwindigkeit der Umsetzung zwischen Nitrit und Aminen ist vom pH abhängig. Es handelt sich dabei um folgende Reaktionen (Gleichungen 5 8): (5) 2 HN0 2 5 N 20 3 + H2 O (6) R 2NH + N 20 3 2 R 2N •NO + HN02 (7) Geschwindigkeit = k x [R 2 NH] [HNO 2 ]2 (8) Geschwindigkeit =k2 [Amin] [Nitrit] 2 29 Tabelle 2. Auftreten von Nitrosaminen in der Rohwurst. Wursttyp Nitrosamin (ppb) Analysenverfahren Forscher Pepperoni (l) 1) 3 GC Fazio et al. 1971 Salami (2) 1-2 » » Thiiringer (2) 2 » » Salami (6) 51) : NB 2 ), 1:1-4 GC +MS Grosby et al. 1972 Salami ( ) 3) 2:20-80 GC + (MS) Sen 1972 Dry sausage ( )3 ) 3 : 10-20 » » Salami (12) 7 : NB, 5 : 3-5 GC Panalaks et al. 1973 Salami (4) NB GC + (MS) Panalaks et al. 1974 Mettwurst (21) 12: NB, 9:2-112 GC + (MS) Panalaks et al. 1974 NB=negativer Befund *) Anzahl der Proben GC=Gaschromatographie 2 ) Nitrosamingehalt MS =Massenspektrometrie 3) Nicht angeben Die Geschwindigkeitskonstante k t in Gleichung (7) ist vom pH-Wert nnabhängig; schreibt man jedoch die Gleichung (7) in der Form (8), so hat der pH-Wert Einfluss auf den Betrag der Geschwindigkeitskonstante k 2. Das Amin reagiert bei dieser Umsetzung nur in freier Form. Der pH-Einfluss im pH-Bereich 9 5 ist in der Form definiert, dass bei Riickgang des pH- Wertes das nichtionisierte Amin mengenmässig auf ein Zehntel sinkt und die salpetrige Säure um das Zehnfache zunimmt. Da in Gleichung (7) die Kon- zentration der salpetrigen Säure im Quadrat erscheint, ergibt sich als Netto- effekt ein Anstieg der Reaktionsgeschwindigkeitskonstante auf das Zehnfache. Im pH-Bereich nahe dem pK der salpetrigen Säuren (pH = 3,4) liegt praktisch schon das gesamte Nitrit als salpetrige Säure vor; der Einfluss des pH-Wertes auf die Reaktionsgeschwindigkeitskonstante basiert im wesent- lichen nur auf der mengenmässigen Abnahme von R 2NH (Review: Mirvish 1975, Crosby und Sawyer 1976). Die Amine werden um so leichter nitrosiert je weniger basisch sie sind. Die Bildung von Nitrosaminen kann auch en- zymatisch erfolgen, wobei sich dann die Kinetik von Fall zu Fall ändert; die Reaktionsgeschwindigkeit ist hierbei jedoch im allgemeinen direkt proportional zur Nitritkonzentration (Review: Mirvish 1975). Desgleichen werden die langkettigen und aromatischen Amine leichter nitrosiert als die hydrophilen und stärker karzinogenen Amine. N-Nitrosoverbindungen können sich noch im Verdauungsapparat aus freiem Nitrit und Aminen bilden, wobei dann auch die im Magen stattfindende bakterielle Nitratreduktion (Sander und Seif 1969) sowie die im Speichel erfolgende Reduktion von Nitrat in Nitrit (Tannenbaum u.a. 1974) mit ins Spiel kommen. Die Nitrosamine sind dabei keinesfalls die einzigen alkylierenden Nitrit-Umsetzungsprodukte, sondern Nitrit vermag auch mit zahlreichen anderen Verbindungen zu reagieren. Es wäre wohl richtiger, von karzinogenen N-Nitrosoverbindungen allgemein zu sprechen, aber die Forschung war bisher hauptsächlich auf die Nitrosamine konzentriert (Proc. ISNMP 2. 1977). Die mit diesem Sachkomplex verbun- denen chemischen, analytischen und toxikologischen Betrachtungen gehen allerdings schon iiber den Rahmen dieser Arbeit hinaus. 30 Unter Berticksichtigung der obigen Ausfiihrungen besteht also wirklich aller Grund, den Nitritzusatz der Rohwurst zu senken, da der pH-Wert nach der Fermentation bzw. dem chemischen Säuern abgenommen hat und die Wurst sekundäre Amine enthält. Kueper und Trelease (1974) haben eine Zusammenfassung iiber eine grossangelegte Untersuchung betreffend den Einsatz von Nitrit und Nitrat mit oder ohne Starterkulturen 1) bei der Rohwurstfabrikation veröffentlicht. In dieser Untersuchung wurden bei keiner einzigen Versuchswurst des Thiiringer- Typs Nitrosamine festgestellt. Die Versuchsbedingungen waren folgende; 1) 0 150 ppm NaN02 2) 0 1500 ppm KN0 3 3) Fermentationstemperaturen: 18° C und 40° C 4) Lagertemperaturen: 18° C, 15° C und 34° C 5) Lagerzeit: o—B Wochen 6) In Scheiben geschnitten, gebraten Nagata und Mirna (1974) haben eine griindliche Untersuchung iiber den Nitrosamingehalt in der Bundesrepublik Deutschland hergestellter Fleisch- waren angestellt. Sie ermittelten, dass Salami bei Einsatz von Nitrat einen etwas geringeren Nitrosamingehalt aufwies als beim Arbeiten mit einer Nitrat- Nitrit-Salz-Mischung. Der Unterschied war jedoch unbedeutend. Durch Zusatz von Mikrokokken-Starterkultur hingegen konnte der Nitrosamingehalt deutlich gesenkt werden (Tabelle 3). Der Einsatz von Askorbinverbindungen bei der Rohwurstherstellung fiihrte jedoch zu widersprtichlichen Ergebnissen: Die Wirkung war von der Konzentration des Nitrits und der Askorbinver- bindung abhängig und hatte fiir die einzelnen Nitrosamine und in den ein- zelnen Versuchen unterschiedliche Richtung. In den meisten Fällen fiihrten die Askorbinverbindungen (100—1000 ppm) allerdings zu einem Anstieg des Nitrosamingehalts, und nach Nagata und Mirna wiirde erst eine Konzentration > 1500 ppm eine senkende Wirkung haben. Die Wirkung des GdL war ebenso indifferent. Die Nitrosopyrrolidin-Menge stieg bei Zusatz von GdL an, während die iibrigen untersuchten Nitrosamine (Tabelle 3) mengenmässig zuriickgingen. Allerdings arbeiteten die heiden Forscher nur mit 1/10 des bei Rohwurst iib- lichen GdL-Zusatzes, jedoch mit normaler Nitritmenge. Nagata und Mirna konstatieren, dass durch Senkung des Nitritgehaltes und Einsatz anderer Zusatzstoffe keine völlig nitrosaminfreien Fleischwaren erzielt werden, empfehlen aber trotzdem das Arbeiten mit verringerten Nitrit- und Nitratzusätzen. Gleichzeitig weisen sie darauf hin, dass es vorteilhaft ist, ein Nitrit-Nitrat-Gemisch (2 : 1) zuzusetzen, da im Fleisch ja auf jeden Fall ein Teil des Nitrits in Nitrat umgewandelt und zu Beginn durch die An- wesenheit von Nitrat das Gleichgewicht in Richtung Nitrit verschoben wird. Palumbo u.a. (1974) untersuchten im industriellen und im halbtechnischen Massstab ahne oder mit Starterkulturen2) hergestellte Lebanon-bologna-Wiirste auf sechs verschiedene Nitrosamine. Keine einzige Piobe ergab positiven l ) Lactobacillus plantarum und Pediococcus cerevisiae. 2 ) Lactobacillus plantarum und Pediococcus cerevisiae (Lactacel MC). 31 Tabelle 3. Einfluss der Lagerzeit und des Zusatzes von Nitrat und Baktofermenten bzw. von Nitrit-Nitrat-Gemischen auf den Gehalt an Nitrosaminen in Teewurst (2.6 % NaCl) (Nagata und Mirna 1974). Lagerzeit Zusatz von PP m Rest ppb (Tage) NaNO z KN03 DMNA DANA NPIP NPYR 7 600 ppm KNO, Baktoferment 72 101 < 2 <2 <2 5 65 ppm NaN02 50 ppm KN0 3 14 10 3 <2 <2 15 14 600 ppm KNO, Baktoferment 30 94 <2<2<2<2 65 ppm NaNOj 50 ppm KNO3 8 11 17 <2 <2 22 DMNA = Dimethylennitrosamin DÄNA = Diäthylnitrosamin NPIP = Nitrosopiperidin NPYR Nitrosopyrrolidin Befund, was nach Ansicht der Forscher auf den verschwindend geringen Gehalt des Fleisches an sekundären Aminen zuruckzufiihren war, wodurch die Nitros- aminbildung verhindert wurde. Verschiedene Bakterien fördern die Nitrosaminbildung, und zwar durch Senkung des pH-Werts und vorläufig noch ungeklärte biologische Aktivierung der Nitrosamin-Synthese (Sander 1968, Sander und Schweisberg 1972, Collins-Thompson u.a. 1972). Auch im Speichel erfolgt eine Umwandlung von Nitrat in Nitrit (Tannenbaum u.a. 1974), wodurch die Nitrosamin-Synthese im Magen bei niedrigem pH ermöglicht wird (Sander u.a. 1968, Lane u.a. 1974). Auch diese Faktoren sind bei der Einschätzung des durch Rohwurst gegebenen Gesamtrisikos in Rechnung zu stellen (Nagata und Mirna 1974). Obgleich erwiesenermassen gewisse Bakterien die Nitrosamin-Synthese fördern, haben Pälumbo u.a. (1974) in ihrer Untersuchung auch in den Proben keine Nitrosamine festgestellt, die unter Einsatz von Starterkulturen hergestellt worden waren. Möhler und Flallenmeyer (1974) haben keine im Zusammen- hang mit der von Bacillus cercus oder von Mikrokokken bewirkten Nitrat- reduktion auftretende bakterielle Nitrosaminbildung beobachtet. Freilich sind nicht alle Bakterien der Nitrosamin-Synthese förderlich (Collins-Thompson u.a. 1972), und durch Einsatz von Starterkulturen lässt sich der Nitrosamin- gehalt sogar senken (Tabelle 3, Nagata und Mirna 1974). Das Vorkommen von N-Nitrosoverbindungen ist eine äusserst schwierig zu klärende Angelegenheit. Infolge der komplizierten Analytik haben, wie aus obigem Text hervorgeht, die einzelnen Forscher deutlich voneinander abweichende Ergebnisse erhalten, wobei allerdings nicht vergessen werden darf, dass sich ihre Untersuchungen auch hinsichtlich der Zusatzstoffmengen, der Fleischwarenart, der Verfahrenstechnik, der Rohstoffe und der mikro- biologischen Faktoren unterschieden. Trotzdem kann auch unter Beriicksichti- gung ali dieser Umstände konstatiert werden, dass die Rohwurst bezuglich N-Nitrosoverbindungen etwa der gleichen Gefahr wie die iibrigen Fleischwaren ausgesetzt ist. Ein wie grosses Risiko diese Verbindungen bei Fleischwaren allgemein genommen darstellen, harrt noch der Klärung. 32 3. Eigene Untersuchungen 3. 1 Zweck der Untersuchungen Mit der vorliegenden Untersuchung wurde bezweckt, die Nitrit- und Nitrat- Mindestkonzentrationen zu ermitteln, die ausreichen, um den heutigen hy- gienischen und technischen Anforderungen entsprechende Rohwurst herzu- stellen. Ausgehend von dieser Zielsetzung wurde der Einfluss von Starter- kulturen, verschiedenen Zusatzstoffen und unterschiedlichen Verfahrenstech- niken auf die Restnitrit- und -nitratmengen sowie auf die Eigenschaften der Rohwurst bei verschieden grossen Nitrit- und/oder Nitratzusätzen untersucht. 3. 2 Versuchsanordnungen Die Untersuchung gliederte sich in drei Teile: 1) Präliminarversuche, in denen der Einfluss verschiedener Faktoren auf den Nitrit- und Nitratgehalt sowie auf die Eigenschaften der Rohwurst geklärt wurde (Versuchsreihen I —XVI). 2) Vergleichende Versuche, in denen die Wirkung auf Grund von Teil 1) ge- wählter verminderter Nitrit- und Nitratzusätze an der Wirkung der heute in der Industrie allgemein tiblichen Nitrit- und Nitratzusätze verglichen wurde (Versuchsreihen VI —V6). 3) Salmonellenversuche, in denen das Wachstum von Salmonellen bei den im Teil 2) verwendeten verschiedenen Nitrit- und Nitratgehalten verglichen wurde (Versuchsreihen SI—S2). Der Zweck der Präliminarversuche, die in ihnen verwendeten Zusatzmittel- mengen sowie Starterkulturen betreffende Angaben sind in Tabelle 4 zusam- mengestellt. In die Spalte »Bemerkungen» sind eventuelle Abweichungen vom Grundherstellungsverfahren eingetragen (siehe Abschnitt 3. 3. 1). Sämtliche Präliminarversuche wurden komplett zweimal durchgefiihrt, so dass sich in diesem Teil der Untersuchung insgesamt 168 Versuchsposten ergaben (Tabelle 4). Die in den vergleichenden und in den Salmonellenversuchen verwendeten Zusatzmittelmengen sowie Starterkulturen betreffende Angaben sind in Ta- holle 5 zusammengestellt. Statt Wurstposten x wird im Text die Bezeichnung Wurst x verwendet. Die Wtirste wurden im Institut fur Fleischtechnologie der Universität Helsinki hergestellt. Die Herstellung der Wurstmassen fiir die Salmonellen- versuche erfolgte im Institut fiir Fleischtechnologie, die Zugabe der Salmo- nellen und das Reifen der Wtirste in der Versuchsfabrik des Instituts fiir Lebensmittelhygiene der Veterinärmedizinischen Hochschule. Die mit den Salmonellenversuchen verbundenen Bestimmungen wurden beim Staatlichen Veterinärmedizinischen Institut in Auftrag gegeben. Tabelle 4. Versuchsanordnungen der Präliminarversuche, Versuchsreihen I— XVJ. /week des Wurst- NaNO, KNOa GdL Mikro- Lakto- Askorb.- Versuch Versuchs posteri ppm ppm % kokken bazillen Verb. Bemerkung Keime/g Keime/g % I Gegenseitiger Ver- 1 500 0,5 2,5 • 107 0.2 Askorbinsäure gleich verschie- 2 500 0,5 • 0,2 Na-Erythorbat dener Askorbin- 3 500 0,5 » 0,2 Na-Askorbat verbindungen 4 500 0,5 » 0,2 Askorbinsäure: Na-Erythorbat 1:1 II Untersuchung der 1 200 0,5 7,0 • 107 - Wirknng der Sen- 2 500 0,5 » - kung des Nitrat- 3 250 0,5 » 111 Vergleich zwischen 1 200 0,5 8,0 -10» Laktobazillen-und 2 500 0,5 • GdL-Zusatz 3 500 - » 3,0 • 105 IV VersuchUl unter 1 100 - 0,5 8,0 • 106 - - verringertem 2 250 0,5 » Nitratzusatz 3 250 » 1,0 • 107 V Versuch IV bei 1 50 - 0,5 7,0 • 106 - - noch niedrigerem 2 100 0,5 • Nitratzusatz, Un- 3 - 100 - • 3,5 • 107 - tersuchungder 4 100 » » 0,2 Na-Erythorbat Wirkung von Erythorbat-Zusatz VI Untersuchung der 1 34 - 1,0 • 108 4,0 • 10s - MNaN02 'MKN0 3 = 34^50 Wirkung von au- 2 34 » » 0,2 Na-Erythorbat sserordentlich ge- 3 50 » » ringem Nitrat- und 4 50 » I 0,2 Na-Erythorbat VII Untersuchung des 1 - - - 1,2 • 10s 2,0 • 107 Einflusses der 2 62,5 » » Nitratkonzen- 3 125 » » l zJi z i : z VIII Untersuchung des 1 2,0 • 106 1,0 • 107 Eini'lusscs der 2 25 » » Nitritkonzen- 3 50 » * Wirkung von 2 - - - 1,0 • 107 5,0 • 106 - extrem niedrigem 4 25 » t 0,05 Na-Erythorbat und bei iiblichem 5 200 » » Nitritzusatz 6 200 » » 0,05 Na-Erythorbat Wirkung von 2 8,0 • 107 1,3 • 107 extrem niedrigem 4 50 » » 0,05 Na-Erythorbat und bei iiblichem 5 250 » » Nitratzusatz 6 250 - » » 0,05 Na-Erythorbat 33 Zweck des Wurst- NaNO a KNO a GdL Mikro- Lakto- Askorb. Versuch Versuchs posten ppm ppm % kokken bazillen Verb. Bemerkung Keime/g Keime/g % XI Untersuchung des 1 Einflusses der 2 100 Starterkultur- 3 - 150 - - Konzcntration 4 100 - 1,5 • 10' 4,3 • 106 - 5 - 150 - 1,5-10' 4,3-10" - 6 100 - - 1,3 • 10s 4,3 • 10' - 7 - 150 - 1,3 • 10s 4,3 • 10' - XII Untersuchung des 1 250 Einflusses der 2 250 3,6 • 106 Lyophilisiert Starterkultur- 3 250 - 2,4 • 106 Tiefgefroren Behandlungsweise 3 250 7,2 ■ 106 Vegetativ 5 - 250 - 3,6 • 106 1,2 • 10' - Lyophilisiert 6 _ 250 2,4 • 106 1,2 • 10' Tiefgefroren 7 250 - 7,2 • 106 2,8 • 10' - Vegetativ XIII Untersuchung des 1 250 - 3,7-10' 1,0-10' - \ 2 Tage/26° -2/24° - 2/22° Temperaturein- 2 171 » » - / 1 Tag /20° - /15° flusses 3 250 - »> »> - \ 2 Tage/24° - 2/22°-2/20° 4 171 I ») - / ITag /18°- /15° 5 _ 250 - » • - \ 2 Tage/22° 2/20° -3/18° 6 171 - » » - / —/15° 7 - 250 - » » - | 2 Tage/20° -* 5/18° 8 171 • l - / -/15° 9 - 250 - » » 7 Tagc/18° /15° 10 171 - - » • - XIV Untersuchung des 1 - 2,5-10' 6,0 • 106 - M ~, 171/2«lNitrit-Nitrat- 2 0 250 - I » - NaNO./ KNO a Verhältnisses 3 25 213 » » XV Einfluss der 1 50 177 - 2,6 • 10' 2,0 • 107 2 Tage) Kiihlhauslage- Fleisch- 2 50 177 » » 9 » > rung des Lagerungsdauer 3 50 177 » » 16 » | Eleisches nach der Schlach- tung XVI Einfluss des 1 - 150 - 1,2 • 10' 1,4 • 10' - 0,0 % Glukose Glukosegehalts 2 150 » » 0,2 % I 5 - 150 - t » - 0,8 % » Tabelle 5. Die variierenden Zusatzmittelmengen und Starterkulturen in den vergleichenden Versuchen (Versuchsreihen VI V6) und in den Salmonellenversuchen (Versuchsreihen SI —S2). Wurst- NaNO, KNO a GdL Glukose Na-Erythorb. Mikrokokken Laktobazillen posten ppm PP m % % % Keime/g Keime/g 1 100 - 0,6 0,3 0,05 - - 2 200 - 0,6 0,3 0,05 - - 3 - 150 - 0,5 0,05 1,0 • 107 1,0-10' 4 - 300 0,5 0,05 1,0-10' 1,0-10' 5 50 75 0,5 0,05 1,0-10' 1,0-10' 34 35 3.3 Material und Verfahren 3.3. 7 Rohstoffe und Herstellung der Versuchswiirste Im folgenden werden die Grundrezeptur und das Herstellungsverfahren der Wlirste beschrieben, die dann im Rahmen der Versuche auf die in den Tabellen 4 und 5 dargelegte Weise modifiziert wurden. Die Grundrezeptur der Versuchswiirste geht aus Tabelle 6 herver. Tabelle 6. Grundrezeptur der Versuchswiirste. Menge g/kg Kind 1) 660 Speck 1) 290 NaCl 30 Glukosc 5 I'fcffcr, weiss2 ) 3 988 h siehe Text 2) Firma Wiberg, Salzburg, Österreich Als Rindfleisch wurde entsehntes Kuhfleisch mit einem Fettgehalt < 15 % verarbeitet; als Speck diente fester Riickenspeck vora Schwein. Die Fleisch- sorten waren in der Versuchsfabrik des Instituts flir Fleischtechnologie der Universität Helsinki zerlegt und eingefroren worden. Je nach Versuchsanordnung wurde die in Tabelle 6 zusammengestellte Grundmenge mit Starterkulturen, GdL oder Wasser auf 1 000 g aufgefiillt. Nitrit, Nitrat und Askorbinverbindungen wurden bei der Berechnung der Brätzusammensetzung mengenmässig nicht beriicksichtigt. In den Versuchs- reihen I — VI betrug der Salzgehalt 35 g/kg; da dies verglichen am allgemein- iiblichen Wert eine grosse Menge ist, wurden in den librigen Versuchen nur 30 g/kg zugesetzt. In Veibindung mit Nitrit wurden die Askorbinverbindungen separat eingewogen, so dass sie erst beim Kuttern mit ersterem zu reagieren vermoehten. Zur Herstellung der Wurstmasse wurde das Rindfleisch zwanzig Stunden vor dem Kuttern aus einem Raum von —lB° C in einen Raum von +2° C gebracht. Am Herstellungstag wurden das Fleisch und der Speck mit einer Bandsäge zerkleinert. Vor dem Kuttern des ersten Postens wurde der Kutter (Seydelmann Rasant K-40, Flersteller Fa. Seydelmann, Stuttgart, Bundesre- publik Deutschland) mit einem Salz-Eis-Gemisch gekiihlt. Das Fleisch wurde zunächst drei Umdrehungen bei niedriger Drehzahl gekuttert; dabei wurden die Zusatzmittel und Starterkulturen zugesetzt. VVährend der folgenden zwei Umdrehungen erfolgte die Speckzugabe, und zum Abschluss wurde das Erät noch fiin f Umdrehungen im Schnellgang gekuttert. Bei Beendigung des Kutterns hatte das Brät eine Temperatur zwischen —l° und +l° C. Das Brät wurde zu etwa 600 g schweren Wiirsten, 36 pro Posten 6—B Wurste, in Naturin-Darm, 0 68 mm, (Hersteller AB Schaub & Co., Stockholm, Schweden) gcfirllt. Nach dem Waschen wurden die Wlirste in die Reifekammer (Heisteller Autotherm, Waxweiler, Bundesrepublik Deutschland) gebracht, wo sie zweeks Stabilisierens und Abtrocknens der Oberfläche 68 Stdn. ohne Heizung und Befeuchtung belassen wurden (He- chelmann 1973, mtindliche Information, Rödel 1973). Danach wurde die Reifekammer auf eine Temperatur von 20° C und eine Feuchte von 96 % rF eingestellt. Nach zwei Tagen wurde die Feuchte auf 94 % rF gesenkt und mit dem Rauchern begonnen. Im Alter von sieben Tagen kamen die Wiirste ins Nachreifelager, das eine Temperatur von 15° C und eine Feuchte von 83 % rF aufwies. In den vergleichenden Versuchen und Salmonellenversuchtn betrug die Temperatur in den ersten beiden Tagen 22° C; danach entsprach das Tempera- turprogramm dem obigen. Die höheren Temperaturen sind besser im Zusam- menhang mit GdL geeignet, jedoch werden neuerdings bei Einsatz von Starter- kulturen auch höhere Temperaturen gefahren (Coretti 1975). Diese r Umstand Hess sich bei der Auswertung der Ergebnisse lediglich in der Form beriicksichtigen, dass Vf rgleiche der Einfiiisse zu untersuchender Faktoren im wesentlichen nur innerhalb der einzelnen Versuchsreihe angestellt wurden. In den Versuchsreihen I —XII kamen selbstgeziichtete Starterkulturen zum Einsatz; die Stämme waren die gleichen wie in den handclsiiblichen Starterkultur-Präparaten (Duploferment 66, Hersteller Rudolf Muller & Co., Giessen, Bundesrepublik Deutschland). Die Starterkultur bestand aus Micro- coccus sp. (Niinivaara 1955) und Lactobacillus plantarum im Verhaltnis 1:1. Die zugesetzte Bakterienzahl betrug 107 Keime/g (Nurmi 1966 a). Die Ziich- tung der Mikrokokken begann durch Beimpfung von 50 ml Nährlösung (Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland, Nr. 7882) mit einer Kolonie des betreffenden Organismus und 20stiindiges Bebriiten der Lösung bei 30° C. Danach wurde diese Lösung in eine grössere Menge (I—2 1) der gleichen Nähr- lösung gegeben und 48 Stunden inkubiert. Nach dem Zentrifugieren und Waschen wurde die Suspension eingefroren. Die Ziichtung der Laktobazillen erfolgte in analoger Weise untei Verwendung von SL-Briihe (Merck Nr. 5413 ohne Agar-Agar). In den iibrigen Versuchsreihen fanden vom Duploferment-Hersteller gelieferte gefriergetrocknete Mikrokokken und Laktobazillen Verwendung. Beim GdL und den Askorbinverbindungen handelte es sich um technische Qualitäten (Hersteller; Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Japan). 3. 3. 2 Chemische Verfahren Vorbehandhmg der Probe: Etwa 300 g Erät oder Wurst wurden zweimal durch den Wolf (Hersteller: Koneteollisuus Oy, Helsinki Finnland) gedreht. Bei der Stickoxidmyoglobin-Bestimmung erfolgte das Zerkleinern in einem verdunkelten Raum. Wassergeha.lt: Etwa 3 g Probe wurden in einen tarierten Aluminiumtiegel eingewogen und anderthalb Stunden auf 135° C gehalten. Aus der Gewichts- abnahme wurde der Wassergehalt berechnet. 37 FeUgehalt: Die Bestimmung dcs Fettgehaltes erfolgte nach dem Verfahren von Gerber unter Verwendung eines 5-g-Butyrometers. Salzgehalt: Die Bestimmung des Salzgehalts erfolgte durch AgN0 3-Titration unter Verwendung von K 2Cr 20 ;-Lösung als Ind'kator. Nilrit- und Nitratgehalt: Die Bestimmung des Nitiit- und Nitratgehalts erfolgte nach dem von Stoya (1969) modifizierten Verfahren von Grau und Mirna (1957). In den vergleichenden Versuchen wurden der Probe jeweils 2,5 ml Sprozentige HgCl2-Lösung zugesetzt um eine durch die Askorbinsäure bewirkte Abnahme der Nitritmenge während der Analyse zu verhindern (Mirna und Schutz 1970). Von jeder Wurst wurden zwei Proben entnommen; in der Farbreaktions- Phase wurden flir jede Lösung zwei Parallelbestimmungen durchgefuhrt. Jede Einzelbestimmung erfolgte unter Einbeziehung des Nitritstandards und des Nitratstandards, an Hand deren zum einen der vvährend der Reduktion eingetretene Nitritschwund, zum anderen die Intensität der Nitratreduktion berechnet wurden. Auf der Basis der von den Standardlösungen gelieferten Korrekturfaktoren wurde dann der Nitrat- und Nitritgehalt derProbe berechnet. Als Spektralphotometer diente ein Hitachi 191 Digital (Hersteller; Hitachi Ltd., Tokio, Japan). In den Versuchsreihen I — VI wurde lediglich der Nitrit- gehalt, in den tibrigen Versuchsreihen der Nitrit- und Nitratgehalt bestimmt. Stickoxidmyoglobin und -myochromogen: Die Stickoxidmyoglobin- und -myochromogen-Konzentration wurde als Summenwert nach der von Mirna und Schutz (1972) au.s dem Verfahren von Hornsey (1956) entwickelten Methode bestimmt. Zur Homogenisicrung der Proben diente ein Ultra- Turrax-Gerät (Hersteller: Janke et Kunkel, Staufen i. Br., Bundesrepublik Deutschland). Nach der Azetonextraktion wurde die Probe erst durch acht Filterpapiere (Whatman Nr. 4) und dann noch einmal durch sechs Filterpapiere (Schleicher et Schiill, Nr. 1575) hindurch filtriert. Die Extinktion der Pro- belösung wurde mit einem Spektralphotometer Hitachi 191 gemessen; das Ergebnis gibt die Summenkonzentration von Stickoxidmyoglobin und Stick- oxidmyochromogen an. Eine solche Bestimmung erfolgte in den Präliminar- versuchsreihen IV VII und in den vergleichenden Versuchsreihen VI —V6. 3. 3. 3 Mikrobiologiselle Verfahren Die verwendeten Nährböden sowie die Inkubationstemperaturen und -zeiten gehen aus Tabelle 7 hervor. Als Probe wurden 10 g Erät bzw. Wurst in 90 ml physiologische Kochsalz- lösung gegeben und im Ultra-Turrax-Homogenisator eine Minute lang homo- genisiert. Von jeder Probe wurden zwei Parallelbestimmungen durchgefuhrt. Beim Salmonellenversuch hatte die Probe ein Volumen von 5 g/45 ml; an ihr wurde nur eine Bestimmung durchgefuhrt. Im SL-Nährboden (Rogosa-Agar) gedeihen auch gewisse Organismen der Gattungen Pediococcus, Leuconostoc und Streptococcus (Kitchell und Shaw 1975). Der Chapman-Nährboden dient eigentlich zur Feststellung pathogener Staphylokokken, jedoch wachsen auf ihm auch nichtpathogene Staphylokokken und Mikrokokken (Niskanen und Nurmi 1976). Die auf Flattenkulturen gediehenen Bakterien wurden jedoch nicht näher identifiziert. 38 Tabelle 7. Nährboden sowie Inkubationstemperaturen und -zeiten. Mikrobengruppe Nährboden Hersteller temperatur und -zeit Gesamtbakterienzahl Plate-count-Agar Merck no. 5463 (Merck, Darmstadt) 30° C/4 Tage Laktobazillen Rogosa (SL) Merck no. 5413 30° C/4 Tage Mikrokokken Chapman Agar Difco no. 0297 30° C/2 Tage Staphylococcus medium no. 110 Fäkale Strepto- Slanetz- und Orion Oy, 37° C/l Tag kokki-n Bartley-Agar Helsinki Kolibakterien 1) VRB Difco no. 0012-01 37° C/l Tag Hefen und Sabouraud- Orion Oy, 25° C/4 Tage Schimmelpilze Maltose-Agar Helsinki Salmonellen 2 ) Bromtymolblau- Orion Oy, 35° C/l Tag I.aktose-Agar Helsinki ') nur in den vergleiclienden Versuchen 2 ) nur in den Salmoncllenversuchen 3. 3. 4 Physikalische Verfahren pH-Wert: Der pH-Wert wurde unmittelbar an der Wurst mit einem pH- Messgerät Findip 555 A (Hersteller: Prolab Oy, Helsinki, Finnland) mit Kom- binationselektrode gemessen. aw-Wert: Zur Bestimmung des a w-Wertes diente ein aw-Messgerät Sinä AMT (Hersteller: Sina AG, Zurich, Schweiz). An jeder Probe wurden zwei Parallelbestimmungen durchgefiihrt. Die vom Geiät angezeigten Ergebnisse wurden fiir beide Fiihler getrennt an Hand der von gesättigter KN0 3-Lösung gelieferten Ablesung (theoretischer Wert 0.920) korrigiert. Konsistenz: Die Konsistenz wurde mit einem Gerät Instron Universal Testing Machine TM-M (Hersteller: Instron Ltd., High Wycombe, England) gemessen. Der Worst wuide hierzu ein 6 cm langes Stuck entnommen und mit einem Kolben, 0 60 mm, senkrecht zu seiner Längsachse um 1 cm zusammen- gepresst. Dieser Pressvorgang wurde dreimal durchgefiihrt; del Konsistenz- weit (kg) wurde als Mittelwert aus diesen Einzelmessungen berechnet. Gewichtsverlust: Von jedem Wurstposten warden zwei Wiirste auf 1 g genau gewogen und an den Stichtagen auf ihr Gewicht kontrolliert. Photos: An den Analysentagen warden von den Wursten mit einer Canon Canoflex (Hersteller: Canon Camera Co., Japan) unter Verwendung von Kine- film Kodak Ektachrome-x 19 DIN and zwei Elektronenblitzgeräten Farb- aufnahmen gemacht. 3.3. 5 Organoleptische Methoden Oberflächenfarbe, Schnittflächenfarbe, Konsistenz, Geruch und Geschmack der Wiirste der vergleichenden Versuchsreihen warden nach dem in Tabelle 8 dargelegten Punktbewertungssystem beurteilt. Fiir den Zeitpunkt 14 Tage nach Versuchsbeginn warden ferner gewogene Gesamtpunktwerte berechnet, 39 wobei der maximale Punktwert der Farbe 6, der des Geschmacks 4. der der Konsistenz und des Geruchs jedoch nur 2 betrug. Die Farbbeständigkeit wurde an Hand einer Rangordnungspriifung durch Vergleich von ein, zwei und drei Stunden alten, unter Lichteinwirkung gelagerten Schnittflächen mit frischer Schnittfläche geschätzt. An der Beurteilung nahmen jeweils 6—9 Personen teil. Tabelle 8. Punktsystem der organoleptischen Beurteilung. Oberflächen- und „ . ~.„.. , , . i, Konsistenz Geruch GeschmackSchnittflachenfarbe*) 6: dunkelrot, 2: fest 2: frisch, 4: aromatisch, hell aromatisch frisch 0: grau, 0: roh, 0: Geruchs- 0: Geschmacks- farblos wcich fchlcr, fehler, roh roh *) Fehler; ungleichmässige, graue oder braune Farbe 3.3. 6 Verarheitung der Ergebnisse Auf der Basis der Mittelwerte der in den vergleichenden Versuchsreihen fiir die einzelnen Wurstposten erhaltenen Ergebnisse wurde fiir die Zeitpunkte drei und 14 Tage je eine Varianzanalyse durchgefiihrt. Die Gesamtmittelwerte von sechs Versuchen wurden nach der Methode von Tukey miteinander ver- glichen. In den Tabellen sind die Signifikanz des Unterschieds (S.d.U.) sowie der kleinste signifikante Unterschied (k.s.U.) angegeben. Die Resultate der Rangordnungspriifung wurden an Hand der Tabellen von Kramer (Kahav u.a. 1973) getestet. Insbesondere was die organoleptischen Beurteilungen betrifft, ist also zu bemerken, dass die Varianzanalyse auf der Grundlage von Mittelwerten duichge- fiihrt wurde, wobei der einzelne Tabellenwert 6—9 Beurteilungs-Ergebnisse und der Gesamtmittelwert somit 36—54 Einzelergebnisse repräsentierte, was eine Sicherung der Signifikanz der Ergebnisse bedeutet. 3. 4 Ergebnisse der Präliminarversuche Durch die vorbereitenden Versuchsreihen sollten zum einen die Nitrit- und Nitratkonzentrationen fiir die dann folgenden vergleichenden und Salmo- nellenversuchsreihen ermittelt werden, zum anderen selite aber auch der Einfluss verschiedener technologischer Verfahrensweisen nicht nur auf die Restnitrit- und -nitratmengen, sondern auch auf die Eigenschaften der Roh- wurst im allgemeinen klargestellt werden. Da alle Versuche doppelt ausgefiihrt und im Rahmen jedes Einzelversuchs mehrere der im Abschnitt 3.3. aufge- fiihrten Bestimmungen durchgefiihrt wurden, fiel Ergebnismaterial im Umfang von etwa 500 Tabellen an. Da es wenig sinnvoll erschien, diese umfangreichen Unterlagen hier in ihrer Gesamtheit wiederzugeben, enthält die vorliegende Arbeit nur die wichtigsten Ergebnisse, dargeboten entweder in graphischer, tabellarischer oder verbaler Form. 3.4. 1 Nitrit- und Nitratzusatz Der Einfluss des Nitritzusatzes wurde in der Ver- suchsreihe VIII, der Einfluss des Nitratzusatzes in der Versuchsreihe VII untersucht. Audi bei den Versuchsreihen lI—VI, IX, X und XIV lagen innerhalb der gleichen Versuchsreihe verschiedene Nitrit- und Nitratzusätze vor. In den iibrigen Versuchen lagen die Nitrit- und Nitratzusätze zwar unter dem iiblichen Welt, eine eigentliche Untersuchung ihrer Auswirkungen unter- blieb hier jedoch. Nach den Ergebnissen der Versuchsreihe VIII hatte der Nitritzusatz sehr starken Einfluss auf die Bakterienflora der Wurste. Da letzteren Starter- kulturen zugesetzt worden waren, folgte die Gesamtbakterienzahl (Bild 6) weitgehend den quantitativen Schwankungen der Laktobazillen und Mikrokok- ken. Hinsichtlich der Laktobazillen gliederten sich die Wurste in drei Gruppen (Bild 7). Bei den Wiirsten 1, 2 und 3 stieg die Laktobazillenzahl rasch und auf Bild 6. Einfluss der zugesetzten Nitritmenge auf die Gesamtbakterienzahl. Versuchsreihe VIII B. Bild 7. Einfluss der zugesetzten Nitrit- menge auf die Laktobazillenzahl. Ver- suchsreihe VIII B. 40 einen hohen Wert an, wenngleich bei der Wurst 3 gegeniiber der Wurst 2 eine geringfiigige Hemmwirkung zu beobachten war. Bei den Wiirsten 4—6 stieg die Laktobazillenzahl anfangs an, blieb aber unter den Werten der vorangehenden Gruppe. Danach kam das Wachstum zum Erliegen. Der höchste Nitritzusatz (Wurst 7) bewirkte bereits eine recht starke Abnahme der Laktobazillenzahl. Bei den Mikrokokken (Bild 8) kara es zu keiner eigentlichen Vermehrungs- periode; ihre zahlenmässige Abnahme war je nach Nitritzusatz verschieden. Das konsequenteste sichtbare Ergebnis nach Bild 8 war, dass bei dem höchsten Nitritzusatz am. meisten Mikrokokken vernichtet wurden. Die Resultate der iibrigen Wiirste waren, was den Nitritzusatz betrifft, derart inkonsequent, dass es sich bei den zahlenmässigen Änderungen der Mikrokokken offensichtlich um indirekte, vorwiegend liber die Laktobazillen wirksam gewordene pH- Wert-Einfliisse handelte. Bei den Wiirsten 35 sank die Mikrokokkenzahl in der gleichen Reihenfolge wie der pH-Wert (Bild 10), wahrend bei den Wiirsten I, 2 und 6 die Mikrokokkenzahl eine eher indifferente Resultierende aus den Wirkungen von pH-Wert und Nitritzusatz darstellte. Bild 8. Einfluss der zugesetzten Nitritmenge auf die Mikrokokken- zahl. Versuchsreihe VIII B. 41 42 ' T Die fäkalen Streptokokken erreichten in, den Wiirsten 1 und 2 zahlenmässig einen ziemlich hohen Wert (10 3 104 Keime/g). Im Versuch B hatte auch die Wurst 3 die ganze Zeit tiber einen hohen Gehalt an fäkalen Streptokokken (etwa 103 Keime/g). Bei den iibrigen Wiirsten bewegte sich der entsprechende Wert um etwa 100 Keime/g. Den Auszählungsergebnissen zufolge wurde das Wachstum der Hefen durch Nitrit freilich nur leicht gehemmt. Allerdings war in heiden Versuchsreihen der Hefegehalt zu Beginn so gering, dass eine eventuelle Wirkung des Nitrits nicht zum Tragen kommen konnte. Der Nitritgehalt (Bild 9) ging bei alien Nitritzusätzen rasch zuriick. Bei den Wiirsten 6 und 7 blieb ein ziemlich hoher Restnitritgehalt bestehen. Der Korrelationskoeffizient zwischen zugesetztem und Restnitrit betrug r = +0,992. Der Nitratgehalt erreichte vor allem bei der Wurst 7, aber auch bei der Wurst 6 (Tabelle 9) einen recht hohen Wert. Das entstandene Nitrat wurde dann kaum noch zu Nitrit reduziert. Der deutlichste Einfluss des Nitritzusatzes zeigte sich bei der Entwicklung des pH-Werts. Der End-pH folgte grob gesehen der Reihenfolge der Nitrit- Bild 9. Einfluss der zugesetzten Nitritmenge auf den Restnitritge- halt. Versuchsreihe VIII B. Tabelle 9. Nitratgehalte der Wurste der Versuchsreihe VIII B (ppm). Wurstposten 2 ) Zeit (Tage) 2 3 4 5 6 7 0 0,0 0,0 10,4 79,2 116,3 1 0,0 13,4 41,3 87,8 197,3 268,9 9 17,7 28,9 39,9 94,3 224,5 22 13,7 13,1 14,5 24,0 92,9 230,6 l) Siehe Tabelle 4 zusätze (Bild 10). Bei den Wursten 1 und 2 lag der End-pH sehr niedrig, bei den Wursten 36 etwa im normalen Bereich und bei der Wurst 7 zu hocb. Die Elektrode des pH-Messgeräts war beim Versuch B an den ersten beiden Stichtagen defekt; aus diesem Grunde fehlen in Bild 10 diese Ergebnisse. Versuch A lieferte gleichartige Ergebnisse wie Versuch B, jedoch waren die Unterschiede bei ersterem geringer. Am Ende des Versuchs wurden die niedrigsten pH-Werte bei den Wursten 1 (4,70) und 2 (4,75), die höchsten pH- Werte bei den Wursten 6 (4,92) und 7 (5,00) festgestellt. Die Wlirste 25 hatten bereits am zweiten Tag eine leuchtendrote Farbe. Bei den Wursten 6 und 7 war die Farbe triiber, ausserdem wiesen sie Bild 10. Einfluss der zugesetzten Nitritmenge auf den pH-Wert. Versuchsreihe VIII B. 43 eine dicke graue Oberflächenschicht auf. Zum Versuchsende hin erfolgte auch in dieser Oberflächenschicht eine Umrötung, die Kernfarbe blieb jedoch matt. Bei Zusatz von Nitrit war diese graue Oberflächenschicht in sämtlichen Ver- suchsreihen dieser Untersuchung zu beobachten. Die iibrigen Wiirste hatten eine einwandfreie Farbe. Der Einfluss des Nitratzusatzes wuide in der Versuchsreihe VII untersucht. Hinsichtlich der Gesamt- bakterienzahl unterschieden sich die Wiirste 1 und 2 deutlich von den librigen Wursten. Neun Tage nach Versuchsbeginn setzte ein steiler Anstieg der Bakterienzahl ein (Bild 11). Bei den Wursten 5 und 6 ist eine die Gesamtbakte- rienzahl senkende Wirkung des Nitrats zu erkennen. In SL-Nährboden (Bild 12) wurden deutlichere systematische Unterschiede als in PC-Nährboden (Bild 11) beobachtet. Zwischen dem ersten und zweiten Tag fand in den Wursten 1 und 2 eine rege Bakterienvermehrung statt. Ein Vergleich der Bilder 11 und 12 zeigt, dass nicht alle Laktobazillen in PC-Agar gediehen, denn in SL- Nährboden entwickelten sich, vor allem was die Wiirste 1 und 2 betrifft, mehr Bakterien als in PC-Agar. Die Vermehrung der Laktobazillen in den Wiirsten 1 und 2 lief parallel zu schnellem pH-Weit-Abfall (Bild 16). Bei Versuchsende batten die Wiirste Bild 11. Einfluss der zugesetzten Nitratmenge auf die Gesamtbakterienzahl. Versuchsreihe VII B. Bild 12. Einfluss der zugesetzten Nitratmenge auf die Laktobazil- lenzahl. Versuchsreihe VII B. 44 45 1 und 2 einen etwa hundertmal höheren Laktobazillengehalt als die iibrigen Wiirste; bei den Wursten 3 5 waren die Differenzen gering und schienen auf Zufälligkeit zu beruhen. Die Wurst 6 hatte hingegen einen niedrigen Bakterien- gehalt. Die gewahlte Nitratkonzentration hatte somit auf das Laktobazillen- Wachstum eine klare inhibitorische Wirkung, die besonders ausgeprägt beim Arbeiten mit ungewohnlich geringen (keine Hemmwirkung) und ungewohnlich hohen (deutliche Hemmwirkung) Nitratzusätzen zum Ausdruck kam. Im Anfangsstadium des Versuchs kam es zu einer sehr raschen Nitritbildung; in den Wursten 46 stieg der Nitritgehalt auf iiber 100 ppm (Bild 13), in der Wurst 6 blieb er während der gesamten Versuchsdauer auf einem hohen Niveau, und bei der Wurst 5 sank er auf die Hälfte seines Maximums. Bei den tibrigen Wursten sank der Nitritgehalt innerhalb der ersten zwei Tage auf ein Niveau von etwa 10 ppm und blieb dann bis Versuchsende nahezu unverändert. Der Korrelationskoeffizient zwischen zugesetzter Nitratmenge und Restnitritmenge hatte einen Betrag von r = -j-0,991. In den ersten zwei bis drei Tagen war eine rasche Nitratreduktion zu ver- zeichnen, danach ging die Reduktionsgeschwindigkeit zuriick (Bild 14). Die Restnitratmenge war direkt proportional zur zugesetzten Nitratmenge; der Korrelationskoeffizient betrug r = +0,986. Der Nitritschwund verlief nach einem schnellen Beginn sehr langsam, und zwar unabhängig vom pH-Endwert. Nach dem vierten Tag nahm die Bild 13. Einfluss der zugesetzten Nitratmenge auf den Restnitritge- halt. Versuchsreihc VII B. Bild 14. Einfluss der zugesetzten Nitratmenge auf den Restnitratgehalt. Versuchsreihe VII B. 46 Gesamtmenge an Nitrit und Nitrat, als Nitrat gerechnet, nur in der Wurst 6 deutlich ab (Bild 15). Im Versuch A erfolgte der pH-Abfall bei den Wursten 3—6 in gleicher Weise; wesentliche Unterschiede wurden nicht festgestellt (Bild 16). Bei der Wurst 1 sank der pH sehr rasch und auf einen niedrigen Wert, wdhrend er bei der Wurst 2 anfangs nur etwas schneller als bei den Wursten 3—6, dafiir aber auch zwischen dem vierten und siebten Tag weiter abnahm und einen sehr niedrigen Endwert erreichte. Im Versuch B zeigte die Wurst 1 die grösste pH-Abnahmegeschwindigkeit. Bei der Wurst 2 verlief der pH-Abfall etwas rascher als bei den Wursten 36. Bei den pH-Endwerten traten keine so grossen Differenzen wie im Versuch A auf, und die pH-Werte befanden sich zu Versuchsende in keiner Richtung in der den zugesetzten Nitratmengen entsprechenden Reihenfolge. Die pH-Endwerte lagen im Versuch B zwischen 4,85 und 5,04. Eine Nitratzugabe von wenigstens 125 ppm reichte sorait aus, die pH- Abfallgeschwindigkeit und den End-pH im normalen Bereiche zu halten, wobei das Ergebnis allerdings offensichtlich auch stark von der Eigenbakterien- flora des verarbeiteten Fleisches mit beeinflusst wurde. Bei den Wursten der Versuchsreihe VII wurde auch der NO-Myoglobinge- lialt (NOMb) bestimmt (Bild 17). Die Wurst 2 wies vor allem zu Versuchsende die niedrigste NOMb-Konzentration auf, jedoch war der Unterschied gegenliber den restlichen Wursten, die alle gleichgrossen NOMb-Gehalt hatten, gering. Die Wurst 2 hatte auch organoleptisch beurteilt eine hellere Farbe als die restlichen Wiirste. Die Versuchsreihen lI—VI hatten, was den Nitrit- und Nitratzusatz anbelangt, präliminaren Charakter und werden deshalb an dieser Stelle nicht näher behandelt. Das gleiche gilt fiir die Versuchsreihen IX und X, die haupt- sächlich der Untersuchung des Askorbinsäure-Einflusses dienten. Bild 15. Einfluss der zugesetzten Nitratmenge au f den Gesamtgehalt an Rcstnitrit und -nitrat. Nitrit umgerechnet in KN0 3 . Yersuchsreihc VII B. In der Versuch sreihe XIV wurde das Mengenver- hältnis Nitrit/Nitrat so variiert, dass die Gesamt- menge, gerechnet als Nitrit-Äquivalent, konstant bli e b. Um eventuelle Differenzen deutlich sichtbar zu machen, wurde mit einer verhältnismässig grossen Nitrit-/Nitrat-Menge gearbeitet. Der Versuch zeigte in augenfälliger Weise, dass bei Zusatz von Nitrat und Nitrit lediglich wahrend der ersten vier Tage Unterschiede auftraten (Tabelle 10). Diese Analogie war also bei alien drei Faktoren (Nitrit, Nitrat und Nitrit- Nitrat-Gesamtmenge) zu beobachten. Am Herstellungstag entsprachen die Unterschiede ganz den Zusätzen; im Laufe der ersten 24 Stunden ging der Nitritgehalt der Wiirste 36 zuriick, aber schon am zweiten Tag kam es— offensichtlich infolge der Tätigkeit nitratreduzierender Bakterien zu eincm Stillstand der Nitritabnahme oder zu einem Anstieg der Nitritmenge. Die Nitrat- menge stieg im Laufe des ersten Tages in den nitrithaltigen Wiirsten auch noch nach der ersten Analyse, was ein Anzeichen dafiir ist, dass die Nitrit- oxydation nicht sofort vollständig erfolgte. Hinsichtlich der Nitrit-Nitrat- Gesamtmenge zeigten die einzelnen Wiirste keine Unterschiede. Der pH-VVert lag bei der Kontrollwurst eindeutig niedriger als bei den iibrigen Wiirsten. Es war eine allerdings sehr schwache Tendenz zu erkennen, Bild 16. Einfluss derzugesetzten Nitrat- mengc auf den pH-Wert. Vcrsuchsrcihe VII A. Bild 17. Hinfluss der zugesetzten Nitratmenge auf den Stickoxidmyoglobin-Gchalt. Vcrsuchsrcihe VIIB. 47 48 Tabelle 10. Nitrit- und Nitratgehalte beim Arbeiten mit in unterschiedlichem Verhältnis zusammengesetzten Nitrit-Nitrat-Mischungen. Versuchsreihe XIV. Wurstpasten1 ) Zeit (Tage) 2 3 4 5 6 NaN0 2 (ppm) 0 0,1 10,9 30,6 71,3 117,3 1 7,0 19,3 24,0 57,6 94,1 2 81,1 82,3 65,4 76,0 84,0 4 60,1 60,1 49,4 57,0 50,8 7 17,9 19,8 17,1 17,1 20,9 9 21,1 20,7 18,3 19,3 17,6 11 20,0 18,4 18,4 18,0 17,8 22 15,4 16,1 14,2 13,7 16,3 KNO s (ppm) 0 214,7 188,7 172,8 124,6 71,6 1 200,8 181,3 202,0 149,5 83,3 2 60,3 83,2 97,3 81,3 66,5 4 30,6 28,1 29,6 43,7 33,5 7 35,2 33,4 32,8 28,9 39,1 9 31,1 27,5 26,7 34,0 33,4 11 24,5 24,9 25,6 26,9 25,6 22 22,3 21,1 20,2 21,8 20,6 ') Siehe Tabelle 4 dass bei Wiirsten, die zu Beginn weniger Nitrit enthielten, der pH-Wert schneller sank als bei Wiirsten, die zu Beginn mehr Nitrit enthielten. Die Unterschiede waren bescheidener Grössenordnung, so dass sie keinen ausschlaggebenden Einfluss hatten. Nach Ablaut von 24 Stunden batten mit Ausnahme der Kontrollwurst sämtliche Wiirste eine graue Oberfläche und einen roten Kern. Die Wiirste 5 und 6 zeigten an der Oberfläche deutlich einen grauen Ring. Am vierten Tag waren sämtliche Wiirste mit Ausnahme der Kontrollwurst durchgehend rot gefärbt. Bezuglich der Schnittflächenfarbe zeigten die Wiirste keine grossen Unterschiede. Lediglich die Wurst 5 hatte in heiden Versuchen eine signifikant bessere Schnittflächenfarbe (Rangordnungsprtifung) als die iibrigen Wiirste. Die Wiirste 4 und 6 zeigten gleichgute Schnittflächenfarbe, wohin- gegen die Oberflächenfarbe bei der Wurst 4 deutlich besser als bei den Wiirsten 5 und 6 war. Hinsichtlich des Bakteriengehaltes wiesen die Wiirste der Versuchsreihe XIV im allgemeinen nur geringfiigige quantitative Unterschiede auf; bei den höheren Nitritgehalten wurde die Vermehrung der Laktobazillen und damit auch die pH-Abnahme etwas verzögert. Was die Farbgiite betrifft, erwiesen sich die Konzentrationen 50 ppm NaN0 2 und 177 ppm KN0 3 (Wurst 4) als giinstigste Werte. 49 3. 4. 2 Starterkulturen und GdL Der Einfluss der Starterkulturen wurde in den Versuchsreihen lIIV: XI und XII untersucht. In den Versuchsreihen 111 V wurden bei vermin- derten Nitratkonzentrationen Vergleiche zwischen Starterkulturen und GdL angestellt. Allerdings ist zu berticksichtigen, dass säratliche Wiirste Mikrokokken- Starterkultur enthielten, was einen Ausgleich der Ergebnisse bewirkte. Anderen- falls hätte die Verwendung von Nitrat zusammen mit GdL ihrer Grundlage entbehrt (Nurmi 1966 b). In Tabelle 11 sind fiir die Wiirste der Versuchsreihen lII—V die Nitrit- konzentration, der pH und die Konsistenz aus der letzten Bestimmung zu- sammengestellt. Wie aus den Tabellenwerten hervorgeht, bewirkte die zu- gesetzte GdL-Menge (0,5 %) keinen besonders starken pH-Abfall, wohl aber die zugesetzten Laktobazillen. Tabelle 11. Restnitritmenge, pH-Wert und Konsistenz der Wiirste der Versuchsreihen 111 —V am letzten Bestimmungstag. Wurstposten 2 ) Restnitrit (ppm) pH-Wert Konsistenz (kg) 200 ppm NaNOa + GdL 18,5 5,06 5,4 500 » KN0 3 + GdL 28,5 5,11 4,2 500 1 KNOj +Lb 30,4 4,80 8,0 100 ppm NaN0 2 + GdL 10,5 5,13 4,7 250 » KNO3 + GdL 12,4 5,19 4,7 250 1 KNO3 +Lb 8,3 4,63 9,6 50 ppm NaNO, + GdL 7,6 4,98 4,4 100 • KNO3 + GdL 9,1 ' 5,11 4,9 100 1 KNO3 +Lb 5,9 4,52 8,8 *) Siehe Tabclle 4 Die mit GdL hergestellten Wiirste batten bei den niedrigeren Nitratkonzen- trationen einen höheren Restnitritgehalt; diesen grossen relativen Unterschieden diirfte jedoch keine praktische Bedeutung zukommen. Als wichtigster Ein- flussfaktor beziiglich der Restnitritmenge ist die zugesetzte Nitrit- und Nitrat- menge zu nennen. Der Korrelationskoeffizient zwischen zugesetztem Nitrit und Restnitrit betrug bei den Nitrit-GdL-Wiirsten r = + 0,997, zwischen zugesetztem Nitrat und Restnitrit bei den Nitrat-GdL-Wiirsten r = + 0,976 und bei den Nitrat-Lb-Wiirsten r = +0,960. Die Wiirste wiesen ausnahmslos eine rote Farbe auf, wobei jedoch zwischen den GdL- und Lb-Wiirsten gewisse Unterschiede bestanden. Die GdL-Wiirste waren von Anfang an tiefrot mit sinem Stich ins Bläuliche. Bei den Lb-Wiirsten vollzog sich die Umrötung langsamer, und ihre Schnittflächen batten eine bräunliche Tönung. Letztere war um so starker je mehr Nitrat zugesetzt worden war, verier sich aber innerhalb von drei bis sieben Tagen. Bei sehr tiefem Absinken des pH-Wertes, wie dies bei den Lb-Wiirsten mitunter der Fall war, verier die Farbe an Intensität, blieb aber rot. Der oben umrissene Umrötungsablauf war sehr typisch fUr diese Wiirste und wiederholte sich in sämtlichen Versuchsreihen der Untersuchung. Der Umstand, dass die GdL- Wiirste tiefrote Farbe mit einem Stich ins Bläuliche, die Lb-Wiirste dagegen ein deutlich helleres Rot aufwiesen, erschwerte namentlich die organoleptische Beurteilung der Umrötung in den einzelnen Stadien. In den Präliminarver- suchen wurde denn auch ohne Hinzuziehung einer Beurteiler-Gruppe lediglich konstatiert, ob die Wiirste eine rote Schnitt- und Oberfläche batten oder nicht. Allerdings wurde die Umrötung durch Farbaufnahmen dokumentiert. In der Versuchsreihe XI wurde der Einfluss der Starterkultur-Konzentration auf die Nitrit- und Nitratmengen und auf die Eigenschaften der Roh- wurst untersucht. Der Umstand, dass dabei unbeabsichtigt mit ungewohnlich hohen Bakteriengehalten (Tabelle 5) gearbeitet wurde, be- einträchtigt den praktischen Wert der Ergebnisse. Bei den Nitrit-Wiirsten war die Starterkultur-Konzentration im Hinblick auf den Nitritgehalt ohne Belang. Dagegen zeigte sich bei den Nitrat-Wiirsten, dass die mit grösserem Starterkultur-Zusatz hergestellte Wurst ein höheres Nitritgehalts-Maximum und dieses schneller als Wiirste mit geringerem Starter- kultur-Zusatz oder die Kontrollwurst erreichte (Bild 18). Bild 18. Einfluss der Starterkultur-Konzentra- tion auf den Restnitritgehalt bei Einsatz von Nitrit oder Nitrat. Versuchsreihe XI. Bild 19. Einfluss der Starterkultur- Konzentration au f den Restnitrat- gehalt bei Einsatz von Nitrit oder Nitrat. Versuchsreihe XII. 50 51 Die Nitratmenge nahm bei den Nitrat-Wiirsten in der gleichen Reihen- folge ab, in der die zugesetzte Starterkultur-Menge stieg. Die Reduktion ver- lief am schnellsten in der Wurst 7, beinahe ebenso schnell in der Wurst 5 and am langsamsten in der Wurst 3; letztere hatte als einzige einen abweichenden Restnitratgehalt. Bei den Nitrit-Wiirsten hatte die Wurst 2 zu Versuchsen- de einen beträchtlich höheren Nitratgehalt als die Wiirste 4 und 6 (Bild 19). Die Summe aus Nitrit- und Nitratgehalt lag bei der Wurst 3 in beiden Versuchen zu Versuchsende am höchsten; an zweiter Stelle lag im Versuch B die Wurst 2. Zwischen den Wiirsten 47 bestanden am Ende des Versuchs in dieser Beziehung keine wesentlichen Unterschiede. Der pH-Abfall erfolgte am schnellsten bei den Wiirsten mit der höheren Starterkultur-Konzentration, deutlich langsamer hingegen bei den Wiirsten mit der geringeren Konzentration. Gleichzeitig wiederholte sich die Erschei- nung: Je schneller der pH-Abfall, desto niedriger der End-pH. Bei den Nitrat- Wiirsten sank der pH-Wert etwas schneller und tiefer als bei den Nitrit-Wiirsten. In beiden Versuchen hatte die ohne Starterkultur-Zusatz hergestellte Nitrit- Wurst einen höheren End-pH als die Kontrollwurst. Nach Ablauf von 24 Stunden hatten die Nitrit-Wiirste einen roten Kern, jedoch ausnahmslos eine graue Oberfläche. Nach vier Tagen hatten sämt- liche Wiirste eine rote Farbe, die mit zunehmender Starterkultur-Konzen- tration an Tiefe gewann, was insbesondere in einer Verbesserung der Ober- flächenfarbe zum Ausdruck kam. Die Nitrat-Wiirste entwickelten die bessere Oberflächenfarbe. Nach elf Tagen hatten sich die Farbunterschiede ausge- glichen. Nach 22 Tagen hatten sämtliche Wiirste etwa gleiche Farbe; deutliche Unterschiede zwischen Nitrit- und Nitrat-Wiirsten und zwischen Wiirsten mit verschiedener Starterkultur-Konzentration waren nicht mehr festzustellen. In der Versuchsreihe XII wurden Vergleiche zwi- schen den Einfliissen von vegetative n, tiefgekiihlten und lyophilisierten Starterkulturen auf die Rest- nit ri t- und -nitratmengen sowie auf die Eigenschaf- ten der Rohwurst angestellt. Damit sollte in erster Linie geklärt werden, ob Tiefkiihlen oder insbesondere Lyophilisieren die Aktivität der Starterkulturen, verglichen an der Vegetativform, beeinträchtigt. Erschwert wurde der Vergleich in diesem Versuch dadurch, dass die tief- gekiihlten und die gefriergetrockneten Starterkulturen zum einen und die Vegetativzellen zum anderen von zwei verschiedenen Zuchtungs-Chargen stammten. Diese Verfahrensweise war insofern notwendig als man anderen- falls eine Oberalterung der Vegetativzellen hätte in Kauf nehmen miissen. Die Bakterienmengen der miteinander zu vergleichenden Wiirste waren des- halb nicht genau gleichgross (Tabelle 4). Die einen Tag alte Vegetativkultur wurde einschliesslich ihres Nährbodens direkt dem Brät zugesetzt. Die einzelnen Behandlungsmethoden hatten keine grossen Differenzen im Nitritgehalt zur Folge (Bild 20). Allerdings wies die unter Zusatz von lyophilisierter Starterkultur hergestellte Wurst 2 den niedrigsten Nitritgehalt auf. Ein sehr augenfälliger Unterschied bestand hingegen am ersten Tag zwischen den Laktobazillen-Mikrokokken-Wiirsten (5—7) und den Mikro- kokken-Wtirsten (2—4). Die Mikrokokken-Wtirste hatten nach drei Tagen 52 einen beträchtlich höheren Nitritgehalt, nach sieben Tagen batten sich jedoch dann die Unterschiede weitgehend ausgeglichen. Allerdings lagen die Nitrit- mengen bis zum Ende des Versuchs bei den Mikrokokken-Wursten höher als bei den Laktobazillen-Mikrokokken-Wiirsten. Der Grund fiir diesen Unter- schied ist wahrscheinlich im pH-Wert zu suchen, der bei den drei Tage alten Laktobazillen-Mikrokokken-Wiirsten im Versuch A im Mittel 0,7, im Versuch B (4 Tage) 0,3 Einheiten niedriger als bei den Mikrokokken-Wursten lag. Die Nitratgehaltsdifferenzen waren nicht bedeutend. Die Kontrollwurst hingegen enthielt vom vierten Tag an eindeutig mehr Nitrat. Die besagten Differenzen waren auch aus den Nitrit-Nitrat-Gesamtmengen- kurven ersichtlich. Die ausschliesslich mit Mikrokokken-Zusatz hergestellten Wiirste ergaben höhere Gesamtmengen als die Laktobazillen-Wiirste. Bei den Mikrokokken-Wursten wurde bei der Wurst 2 (gefriergetrocknete Starter- kultur) eine höhere Gesamtmenge als bei den iibrigen Wiirsten festgestellt. Die pH-Wert-Änderungen schienen in diesem Versuch von der zugesetzten Bakterienmenge abhängig zu sein (Tabelle 4), wodurch die Interpretation der Ergebnisse erschwert wurde. Auf jeden Fall bewirkten die in Vegetativform zugesetzten Laktobazillen den schnellsten pH-Abfall, wenngleich dabei zu beriicksichtigen ist, dass es sich dabei um die mengenmässig stärkste Beimp- Bild 20. Einfluss von vegetativen, tiefgefro- renen und lyophili- sierten Starterkulturcn auf den Restnitritge- halt. VersuchsreiheXII. 53 fung handelte. Die pH-Wert-Entwicklung der Mikrokokken-Wiirste entsprach der der Kontrollwurst. Am dritten Tag wies die Kontrollwurst eine graue Oberflächenfarbe auf; die Schnittfläche zeigte eine breite rote Zone, der Kern war jedoch wieder grau. Zwischen den Wiirsten 2—4 (Mikrokokken-Wiirste) wurden in dieser Beziehung keine Unterschiede festgestellt; das gleiche trifft fiir die Wurste 57 (Mikrokokken-Laktobazillen-Wiirste) zu. Die Mikrokokken-Wiirste zeigten deutlich einen Stich ins Bräunliche, und die sowohl Mikrokokken als auch Laktobazillen enthaltenden Wurste Fatten eine ansprechende rote Farbe. Zwischen dem siebten und elften Tag kam es zu einem Ausgleich der Farbton- differenzen, jedoch Fatten die Wiirste 57, verglichen an den Wiirsten 2—4, eine hellere, ja sogar zu helle Färbung. Am 22. Tag waren auch diese Unterschiede verschwunden; lediglich die Kontrollwurst hatte eine dunklere Farbe als die tibrigen Wiirste. 3. 4. 3 Askorbinverbindungen Der Einfluss von Askorbinverbindungen wurde in den Versuchsreihen I, V, VI, IX und X untersucht. In der Versuchsreihe I wurden Vergleiche iiber den Einfluss verse hiedener Askorbinverbind ungen auf die Rohwursteigenschaften angestellt. Bei diesen Verbindungen handelte es sich um Askorbinsäure, Natriuraerythorbat, Natrium- askorbat und um eine Askorbinsäure-Natriumerythorbat-Mischung 1 : 1. Um eventuelle Unterschiede deutlich sichtbar zu machen wurden die Askorbin- verbindungen in hohen Konzentrationen verwendet. Ausserdem wurden den Wiirsten Nitrat, GdL und Mikrokokken-Starterkultur zugesetzt. Dem GdL und der hohen Askorbinverbindungs-Konzentration war es offensichtlich zuzuschreiben, dass die Wurste, was ihre mikrobiologischen, chemischen, physikalischen und auch ihre organoleptisch zu beurteilenden Eigenschaften betraf, keine wesentlichen Unterschiede aufwiesen. Sämtliche Wurste zeigten eine gute Umrötung. In den Versuchsreihen V und VI wurde der Ein- fluss der Askorbinsäure bei niedriger Nitrit- und Nitratkonzentration und gleichzeitiger Verwendung von Starterkulturen untersucht. In Tabelle 12 sind die Nitiit- gehalte der Wiirste nach drei Tagen und am Ende des Versuchs zusammen- gestellt. Nach Tabelle 12 ergaben sich, wurde Askorbinsäure zugesetzt, kleinere Nitritgehalte als im gegenteiligen Fall. In dieser Phase der Untersuchung erfolgten die Bestimmungen ohne Einsatz von Quecksilberchlorid, welches die nitritzerstörende Wirkung der Askorbinsäure aufhebt, was sich durchaus in Form kleinerer Nitritgehaltswerte bei den askorbinsäurehaltigen Wiirsten niedergeschlagen haben könnte. Allerdings kommt diesen Unterschieden bei so geringen Restnitritmengen keine praktiselle Bedeutung zu. Die Farbe der GdL-Wiirste war sowohl bei als auch ohne Nitritzusatz bläulichrot. Die Laktobazillen-Wiirste wiederum wiesen eine bräunliche Tönung 54 Tabelle 12. Restnitritmengen beim Arbeiten ohne bzw. mit Askorbinsäure. Wurstreihe: NaN02 (ppm) Zugesetzte Mengen Wurstposten3) 3 Tage 17 Tage (V:3) 9.51) 5,9 100 ppm KN03 (VI: 4) 0,4 2,6 » + AS ») 4 Tage 2) AS = 0,2 % Askorbinsäure 3) Siehe Tabelle 4 auf, die bei den askorbinsäurehaltigen Wiirsten starker ausgeprägt war. Aufs Versuchsende zu stellte sich ein Ausgleich der Farbunterschiede ein, und die bräunliche Tönung der Laktobazillen-Wiirste verschwand völlig. Im tibrigen entsprachen die Umrötungsergebnisse etwa denen der Versuchsreihen IX und X. In den Versuchsreihen IX und X wurde der Ein- fluss einer Askorbinverbindung bei verminderten und bei normalen Nitrit- und Nitratzusätzen unter- suc h t. Als Askorbinverbindung diente Natriumerythorbat in der in der Industrie tiblichen Konzentration (0,05 %). In der Versuchsreihe IX bewirkte die Erhöhung des Nitritzusatzes von 25 ppm auf 200 ppm einen Riickgang der Gesamtbakterienzahl um durchschnitt- lich 1 logarithmische Einheit. Das Erythorbat bewirkte eine Abnahme der Gesamtbakterienzahl um durchschnittlich 0,3 logarithmische Einheiten. Fur Laktobazillen lauteten die entsprechenden Werte 1,1 bzw. 0,4 logarithmische Einheiten. Die Erhöhung der Nitritkonzentration hatte kaum Auswirkungen auf die Mikrokokken, wohl aber auf die fäkalen Streptokokken, die bei der höheren Nitritkonzentration zahlenmässig schwacher vertreten waren. Bei Zusatz von Starterkulturen nahm in der Kontrollwurst die Zahl der fäkalen Streptokokken urn ein geringes ab; Erythorbat zeigte hingegen keine diesbeziigliche Wirkung. Beziiglich der Hefemenge sohien keinem der verwendeten Zusatzstoffe grosse Bedeutung zuzukommen. Lediglich die starterkulturfreie Kontrollwurst hatte einen etwas höheren Hefegehalt. Der Nitritgehalt ging in sämtlichen Fallen sehr rasch zuriick (Bild 21). Die erythorbathaltigen Wiirste enthielten eindeutig weniger Nitrit, was jedoch teilweise auf wahrend der Analyse aufgetretene Verluste zuriickzufuhren sein diirfte. Der Nitratgehalt lag anfangs sehr hoch (Bild 22), in den erythorbat- haltigen Wiirsten teilweise sogar höher als in der entsprechenden erythorbat- freien Wurst. Die Nitrit-Nitrat-Gesamtmenge blieb bei der niedrigeren Nitrit- konzentration die ganze Zeit iiber nahezu konstant, wohingegen bei den Wiirsten mit der höheren Nitritkonzentration ein steiler Abfall zu beobachten war. Bei pH 5,0 zeigte der Nitritschwund eine Knickstelle. Die pH-Entwicklung zeigte bei den einzelnen Nitritkonzentrationen einen unterschiedlichen Verlauf. Zwischen der nitritfreien Wurst 2 und den Wiirsten mit der niedrigeren Nitritkonzentration bestand kein Unterschied. In der starterkulturfreien Wurst nahm der pH langsam ab und blieb auf einem höheren Endwert als bei den iibrigen Wiirsten. Die Erhöhung des Nitrit- zusatzes von 25 ppm auf 200 ppm hatte eine Zunahme des End-pH um 0,1 0,3 pH-Einheiten zur Folge. Bei den erythorbathaltigen Wiirsten stellte sich bereits nach einem Tag eine rote Oberflächen- und Schnittflächenfarbe ein, wahrend bei den ery- thorbatfreienWiirsten hierzu zwei bis vier Tage erforderlich waren, ohne dass die gleiche Farbintensität erreicht wurde. Bei der niedrigeren Nitritkonzen- tration hatte die erythorbatfreie Wurst 3 eine mangelhafte Oberflächenfarbe. Nach elf Tagen wiesen alle nitrithaltigen Wiirste schlechte Oberflächenfarbe, aber rote Schnittflächenfarbe auf. Die ohne Erythorbatzusatz hergestellten Wiirste hatten vor allem was ihre Oberfläche betrifft eine etwas hellere Farbe. Nach Ablauf von 22 Tagen hatte die Kontrolhvurst braungraue Schnitt- flächenfarbe, während die iibrigen Wiirste von satter Farbe waren. Die ohne Nitritzusatz hergestellte Starterkultur-Wurst hatte einen Stich ins Griinliche. Etwa gleiche Ergebnisse wurden auch beim Arbeiten mit Nitrat (Ver- suchsreihe X) erzielt; lediglich die Nitrit- und Nitratgehaltswerte weichen von den entsprechenden Resultaten der Versuchsreihe IX ab. Der Nitritgehalt bewegte sich einen Tag lang sehr nahe bei null, jedoch kam es dann zwischen dem ersten und zweiten Tag zu einer ziigigen Nitrat- Bild 21. Einfluss des Erythorbats auf den Restnitritgehalt bei Zusatz von 25 bzw. 200 ppm NaN0 2 . Ver- suchsreihe IX. Bild 22. Einfluss des Erythorbats auf den Restnitratgehalt bei Zusatz von 25 bzw. 200 ppm NaN0 2. Versuchsreihe IX. 55 56 reduktion. Nach zwei bis drei Tagen batten die Wiirste 5 und 6 einen Nitrit- gehalt von 50—60 ppm, der jedoch dann zuriickging. Bei den mit dem gerin- geren Nitratzusatz hergestellten Wiirsten blieb der Nitritgehalt die ganze Zeit iiber sehr niedrig. Erythorbat senkte den Nitritgehalt. Beim Nitrat- gehalt setzte nach dem ersten Tag eine sehr steile Abnahme ein, und die Reduktion erfolgte zum iiberwiegenden Teil zwischen dem ersten und vierten Tag. Bei den Wiirsten mit dem niedrigeren Nitratzusatz traten nur geringe Nitratgehaltsänderungen auf. Das Erythorbat hatte keinen Einfluss auf den Nitratgehalt. Die Wiirste 4 und 6 batten bereits nach einem Tag eine rote Oberfläche und auch eine durchweg rote Schnittflächenfarbe. Nach zwei Tagen waren alle nitrathaltigen Wiirste rot, jedoch zeigten die Wiirste 3 und 5 eine rot- braure Oberflächenfärbung. Nach vier Tagen batten die Farben eine gewisse Ausgleichung und Dunklung erfahren. Die Hcllfarbigkeit begann allmählich zu verschwinden, und nach elf Tagen waren die Farbunterschiede ausgeglichen, und die Wiirste batten nun die Farbe ausgereifter Ware. Nach 22 Tagen war die Situation die gleiche. Die Wurstfarbe zeichnete sich durch ausserordentlich gute Licht- und Sauerstoffbeständigkeit aus. Das beste Resultat reprasentierte in dieser Beziehung die Wurst 6, gefolgt von der Wurst 5; die Wiirste 3 und 4 waren untereirander gleichwertig. Die Konti oilwiirste zeigten in frisch geschnittenem Zustand eine rote, wenn auch im Kern etwas griinliche Farbung, die jedoch dann unter der Luft- und Lichteinwirkung in Graugriin umschlug. 3. 4. 4 Zucker In der Versuchsreihe XVI wurde der Einfluss der Glukosekon z e n t r a t i o n auf die Restnitr i t m e n g e und auf die Eigenschaften in erster Linie auf den pH der Roh wurst untersucht. Beziiglich des pH-Wertes unterschieden sich die Wiirste deutlich voreinander (Bild 23). Die Wurst 1 hatte einen um etwa 0,2 Einheden höheren pH als die Wurst 2, und diese wiederum einen um 0,2 Einheiten höheren pH als die Wurst 3. 0,1 Prozentpunkte Glukose bewirkten somit eire pH-Senkung um 0,1 Ein- heiten. Eine Ausnahme von dieser Regel machten die Wiirste 4 und 5. Die Nitrit- und Nitratergebnisse waren unerwartet: Obgleich die pH- Werte stark variierten, wiesen die Wiirste mit niedrigerem pH durchaus nicht weniger Nitrit bzw. Nitrat auf als die Wiirste, deren pH langsamer sank und auf einem höheren Wert stehenblieb. Die Farbe koirelierte mit dem pH-Wert in der Form, dass die Wurst 3, die den niedrigsten pH aufwies. die farbmassig beste war. 3. 4. 5 Temperatur Die Versuchsreihe XIII diente dem Zweck, den Einfluss der Temperatur im Anfangsstadium der Herstellung auf die Eigenschaften von Rohwiirsten 57 zu untersuchen, die entweder einen Nitrit- oder ei- nen Nitratzusatz erhalten hatten. Drei Tage vor Versuchsbeginn wurde das Flcisch in gefrorenem Zustand in einem grossen Rutter in Wiirfel von etwa 0,5—1 cm3 zerkleinert und soig- fältig gemischt. Von der so erhaltenen Masse wurde jeweils 16 Stunden vor der Herstellung einer Charge die dafiir erforderliche Menge zum Auftauen ins Riihlhaus gebracht. Der Speck wurde stets dem gleichen Posten und direkt dem Gefrierhaus entnommen. In Abständen von jeweils zwei Tagen wurden insgesamt fiinfmal je zwei Wurstposten (in heiden 6 Wiirste) auf genau gleiche Weise hergestellt. Jedes- mal wurde dem Wurstposten mit ungerader Ordnungszahl Nitrat, dem Wurst- posten mit gerader Ordnungszahl Nitrit zugesetzt. Die Wiirste wurden zur gleichen Zeit in der gleichen Reifekammer gehalten; jedesmal wenn eine neue Wurstpartie in die Rammer gebracht wurde, wurde die Temperatur um 2° C gesenkt. Die Feuchte betrug ständig 95 % rF. Am Morgen des zweiten Tages wurden die Wiirste leicht geräuchert, und zwar in der Form, dass alle Wiirste gleichoft Rauch erhielten. Die Temperaturprogramme sind in Tabelle 13 zusammengestellt. Aus den Gesamtbakterienzahlen geht ziemlich deutlich hervor, dass am Ende des Versuchs die bei niedrigeren Temperaturen hergestellten Wiirste einen höheren Bakterienbesatz als die unter höheren Temperaturen hergestellten Wiirste aufwiesen (Bild 24). Allerdings gab es gewisse geringfiigige Ausnahmen von diesem Trend, der sowohl bei den Nitrit- als auch bei den Nitrat-Wiirsten zu beobachten war. Eine ähnliche Tendenz wurde beziiglich der Laktobazillenzahl festgestellt, und die Lag-Phase war bei den n; edrigeren Temperaturen länger (Bild 25). Bild 23. Einfluss der zugesetzten Glukose- menge auf denpH-Wert. Versuchsrcihe XVI. Tabelle 13. Die im Temperaturversuch (Versuchsreihe XIII) gefahrenen Temperatur- und Feuchtigkeitsprogramme (Nitrat-Wiirste mit ungerader, Nitrit-Wiirste mit gerader Ordnungs- zahl). Temperatur: °C, Feuchtigkeit: % rF. Wurst- Zeit (Tage) poster. 1) 0-2 2-4 4-6 6-7 7-14 1,2 26°/95 % rF 24°/95 % rF 22°/95 % rF 20°/95 % rF 15°/80 % rF 3.5 24°/ » 22°/ > 20°/ » 18°/ » » 5.6 22°/ » 207 » 187 » 187 » » 7,8 207 • 187 » 18°/ » 187 » » 9,10 187 • 187 » 187 » 187 » » Bei den Mikrokokkenzahlen traten auch hier keine wesentlichen Unterschiede auf, und auch die Nitrit- und Nitrat-Wiirste unterschieden sich nicht vonein- ander. Da die Nitrit- und Nitrat-Resultate des Versuchs A in ihrer Entwicklung ziemliche Folgerichtigkeitsmangel erkennen lassen, stutzen sich die folgenden Betrachtungen im wesentlichen auf den Versuch B. Bei den Nitritgehalten der Nitrat-Wtirste ist der Einfluss der Temperatur sehr deutlich zu erkennen (Bild 26). Die höchste Konzentration wurde bei der Wurst 1, die zweithochste bei der Wurst 3 beobachtet. Die Wurst 5 erreichte ihr Maximum wahrschein- lich am zweiten Tag und lag zu diesem Zeitpunkt moglicherweise zwischen den Wiirsten 3 und 7; diese Annahme wird auch durch die am dritten Tag festgestellte Ergebnisreihenfolge gestiitzt. Die flache Nitritgehaltskurve der Wurst 9 erreicht ihr Maximum am siebten Tage. Was die Nitrit-Wiirste betrifft, standen die Ergebnisse am dritten Tag in der Form in einer der Temperatur entsprechenden Reihenfolge, dass die Bild 24. Einfluss der Reifetempcratur auf die Gesamtbakterienzahl. Nitrit-Wiirste,Versuchs- reihe XIII. 58 Wurst 2 den geringsten, die Wurst 10 den höchsten Nitritgehalt aufwies (Bild 27). Der höchste Restnitritgehalt wurde bei den Wiirsten 8 und 10 beobachtet, die Unterschiede zu und zwischen den iibrigen Wiirsten waren jedoch so klein, Bild 26. Einfluss der Reifetemperatur auf den Restnitritgehalt. Nitrat-Wiirste, Versuchsreihe XIII B. Bild 25. Einfluss der Keifctemperaturauf die Laktobazillenzahl. Ni- trit-Wiirste, Versuchs- reihe XIII. Bild 27. Einfluss der Reifetemperatur auf den Restnitritgehalt. Nitrit-Wurste, Versuchsreihe XIII B. 59 60 dass sie ohne Bedeutung blieben. Bei den Nitrat-Wiirsten folgte der Nitratge- halt konsequent den Nitritgehaltsänderungen (Bild 28). In den Nitrit-Wiirsten bildete sich bei den höheren Temperaturen weniger Nitrat; der maximale Nitratgehalt wurde bei 20° C erzielt. Die Nitxat-Nitrit- Gesamtmengen sowohl der Nitrit- als auch der Nitrat-Wiirste befanden sich nach drei bis sieben Tagen angenähert in einer dem Temperaturprogramm entsprechenden Reihenfolge; am Ende der Versuche wurden nur noch geringe und damit bedeutungslose Unterschiede festgestellt. Beziiglich des pH-Werts schien die Temperatur die Wiirste in zwei Gruppen zu unterteilen: in die bei 26° 22° C und die bei 20° —lB° C gereiften Wiirste (Bild 29 und 30). Am schnellsten und auf den tiefsten Wert sank der pH bei den Wiirsten 1 und 2. Die pH-Wert-Kurven der Wiirste 36 kreuzten sich; wesentliche Unterschiede wurden in keiner Phase festgestellt. Bei den Wiirsten 7—lo ergaben sich etwas grössere, jedoch inkonsequente Differenzen: Im Versuch A war die Reihenfolge umgekehrt wie im Versuch B. In gewissem Grade unerwaitet wenn auch iibereinstimmend mit den mikrobiologischen Eigebnissen war, dass sich zwischen den Nitrit- und Nitrat-Wiirsten, die jeweils die gleiche Temperaturbehandlung erfahren hatten, keine Unterschiede zeigten. Am ersten Tag waren bei der Versuchsreihe A zwischen den Wiirsten deutliche Farbunterschiede zu erkennen. Die Wiirste 1 und 2 waren sowohl an der Oberfläche als auch im Kern rot, die Wiirste 3 und 4 an der Oberfläche grau, im Kern rot, die Wiirste 5 und 6 an der Oberfläche grau, im Kern etwas weniger intensiv rot, die Wiirste 7 und 8 an der Oberfläche grau, im Kern graurot und die Wiirste 9 und 10 durchweg grau. Am dritten Tag hatten die Wiirste I—6 eine intensive rote Oberflächen- und Schnittflächenfarbe, die Wiirste 7 10 eine graue Oberfläche und einen roten Kern. Nach sieben und 14 Tagen waren die Unterschiede verschwunden; lediglich bei den Wiirsten 7 10 zeigte sich am 14. Tag ein ganz leichter Grauton in der Oberflächenfarbe. Der Versuch B verlief etwas »langsamer»; am ersten Tag zeigten die Wiirste 3 und 4 an der Oberfläche, die Wiirste s—lo an der Oberfläche und im Kern eine graurote oder graue Färbung. Am dritten Tag kam es zum Ausgleich der Farbdifferenzen. Auch am Ende des Versuchs wurden keine Unterschiede mehr festgestellt. Der Vergleich zwischen Nitrit und Nitrat ergab in gewissem Grade wider- spriichliche Resultate. Die bei den höheren Temperaturen unter Zusatz von Nitrit hergestellten Wiirste zeigten am ersten und dritten Tag vielleicht eine etwas bessere Schnittflächenfarbe, wahrend die Nitrat-Wiirste durchweg eine bessere und hellere Oberflächenfarbe hatten. Am Ende des Versuchs wurde bei den Nitrat-Wtirsten eine geringfiigig intensivere dunkelrote Färbung festgestellt. Die verschiedenen Temperaturen fiihrten in dieser Hinsicht zu keinen Unterschieden. Bei den höheren Temperaturen warden also eine raschere Umrötung und ein beschleunigter Riickgang der Nitrit- und Nitratkonzentrationen und ein rascher Abfall des pH-Werts erzielt. Zwischen Nitrit und Nitrat bestanden hingegen keine wesentlichen Un- terschiede, höchstens dass mit Nitrat eine um eine Idee bessere Farbe erzielt wurde. Bild 28. Einfluss der Reifetemperatur auf den Restnitratgehalt. Nitrat-Wiirste, Ver- suchsreihe XIII B. Bild 29. Einfluss der Reifetemperatur auf den pH-Wert. Nitrat-Wiirste, Ver- suchsreihe XIII. Bild 30. Einfluss der Reifetemperatur auf den pH-Wert. Nitrit-Wiirste, Ver- suchsreihe XIII. 61 62 Der Einfluss der Temperatur kam in dieser Versuchsreihe recht deutlich zum Ausdruck, wenn er auch, der Praxis folgend, durch stufenweises Senken der Temperatur bis auf 18° C geschwacht worden war. 3. 4. 6 Alter des Fleisches Mit der Versuchsreihe XV wurde bezweckt, den Einfluss des Fleisc halters auf die Nitratkonzentra- tion und auf die Eigenschaften der Ro h wurst kla r- zustellen. Fiir den Versuch lieferte der Schlachthof einen zwei Tage alten Schlacht- körper, von dem ein Vorderviertel abgetrennt und in einen Kiihlraum von 2° C und 95 100 % rF gebracht wurde. Dem Viertel wurde sofort nach Eintreffen ein Fleischposten entnommen, nach einer Woche ein zweiter und nach abermals einer Woche ein dritter. Diese Fleischposten wurden jeweils sofort eingefroren und am Wurstherstellungstag alle gleichzeitig auf normale Weise aufgetaut. Der Versuch wurde zweimal jeweils mit einem anderen Schlachtkörper durchgefiihrt. Die Gesamtbakterienzahlen lieferten kein verniinftiges Bild, denn obgleich die Wurst 3 in beiden Versuchen zu Beginn die höchste Bakterienzahl aufwies, verschwanden diese Unterschiede im Laufe des Versuchs. Zu Beginn wurden beim Versuch B zehnmal so viel Laktobazillen wie beim Versuch A festgestellt, und auch diese Unterschiede verschwanden im Laufe des Versuchs. Zwischen den einzelnen Wiirsten bestanden zum Schluss Unterschiede in der Form, dass die Wurst 3 die meisten und die Wurst 1 die wenigsten Lakto- bazillen enthielt. Bei der Mikrokokkenzahl wurden keine in irgendeiner Weise regelmässigen Unterschiede festgestellt. Auch auf die Zahl der fäkalen Streptokokken schien das Fleischalter keinen Einfluss zu haben, wohl aber auf die Anzahl der Hefezellen, von denen zu Versuchsbeginn die Wurst 2 mehr als zehnmal so viel wie die Wurst 1, und die Wurst 3 etwa drei- bis fiinfmal so viel wie die Wurst 2 enthielt. Mit Fortschreiten des Versuchs vermehrten sich die Hefen in den Wiirsten nicht, jedoch hatten die Wiirste 2 und 3 noch nach vier bis neun Tagen einen ziemlich hohen Gehalt an Hefe- zellen. Bei Versuchsende wurden nur noch ganz unbedeutende Differenzen festgestellt. Weder die Nitritgehalts- noch die Nitratgehalts- noch die Nitrit-Nitrat- Gesamtmengenunterschiede zwischen den einzelnen Wiirsten zeigten irgend- welche Regelgebundenheit. Die Ergebnisse von Versuch A und Versuch B wichen in so hohem Grade voneinander ab, dass eine Beziehung zwischen Fleischalter und den Restmengen an Nitrit und Nitrat nicht festzustellen war. Auch bei den pH-Werten zeigten sich keine klaren Unterschiede. Lediglich im Versuch B hatte die Wurst 3 anfangs einen sehr hohen pH, der jedoch bis zum neunten Tag abgenommen hatte. Am ersten Tag hatte die Wurst 3 eine deutliche rötliche Färbung, die iibrigen Wlirste hingegen nicht. Am zweiten Tag hatte die Wurst 3 eine kräftigere rote Oberflächenfarbe als die anderen (ohne Ring), wohingegen die Wiirste 1 und 2 im Kern ein intensiveres Rot zeigten. Nach vier Tagen war die Wurst 63 1 sowohl innen als aussen kräftiger rot gefärbt als die Wiirste 2 und 3, von denen wiederum die erstere röter als die letztere war. 3. 4. 7 pH-Wert Die Bedeutung des pH-Wertes wurde in vorliegender Arbeit bisher bereits mehrmals gestreift. In diesem Abschnitt wird das betreffende Material noch einmal zusammenfassend dargestellt, denn nach Auffassung des Verfassers ist der pH-Wert die wichtigste Einflussgrösse im Hinblick auf die Eigenschaf- ten der Rohwurst; eine ganz andere Sache ist nattirlich, welche Faktoren wiederum auf den pH einwirken. Aus dem an Hand der Versuchsreihe VIII gezeichneten Diagramm (Bild 31) geht hervor, dass eine Erhöhung der Nitritkonzentration liber den Wert 100 ppm hinaus die pH-Entwicklung nicht mehr wesentlich beeinflusst. Bei Konzentrationen unter 100 ppm wiederum tendiert der pH zu zu starkem Abfall. Flir Nitrat beträgt die entsprechende kritische Konzentration 125 ppm (Bild 32). Der pH-Wert sinkt um so schneller und tiefer, je höhere Temperaturen gefahren werden (Bild 33 und 34). Hierbei ist zu beriicksichtigen, dass bei der Versuchsreihe XIII die im Diagramm angegebene Temperatur nur zwei Tage gehalten wurde (s. Tabelle 13), so dass der Einfluss der Temperatur nicht so deutlich zum Ausdruck kommen konnte wie im Talle gleichbleibender Tempera- tur. Bild 31. Einfluss der zugesetzten Nitritmenge auf den pH-Wert. Versuchsreihe VIII B Bild 32. Einfluss der zugesetzten Nitratmenge auf den pH-Wert. Versuchsreihe VII. Bild 33. Einfluss der Reifetemperatur auf den pH-Wert. Nitrit-Wurste, Ver- suchsreihe XIII. Bild 34. Einfluss der Reifetemperatur auf den pH-Wert. Nitrat-Wiirste, Versuchsreihe XIII. 64 65 Im Versuch B lag der pH-Wert bei 20° C deutlich höher als bei 18° C, was offensichtlich auf einen Materialfehler zuruckzufiihren war. Dadurch erhielt die Kurve der Mittelwerte eine unlogische Richtungsänderung nach oben. Eine Erhöhung der Glukosekonzentration um 0,1 % bewirkte eine Senkung des End-pH um 0,1 Einheiten dies jedoch nur bis zu einem Glukosegehalt von 0,4 %; danach war mit steigendem Glukosegehalt kein weiterer pH- Abfall zu verzeichnen (Bild 35). Betrachtet man die am vierten Tag ermittelten Werte, so scheinen die höheren Glukosegehalte (0,6 und 0,8 %) sogar eine Verzögerung des pH-Abfalls bewirkt zu haben. Bei den GdL-haltigen Wiirsten nahm der pH sehr schnell ab, blieb jedoch oberhalb des Wertes 5,0. Der End-pH wurde bereits nach vier Tagen erreicht; der Nitrit- bzw. Nitratgehalt war in dieser Beziehung ohne Bedeutung. Bei den entsprechenden Laktobazillen-Wiirsten setzte erst nach drei Tagen ein steiler pH-Wert-Abfall ein, und ihr End-pH lag um 0,6—0,3 Einheiten niedriger als bei den entsprechenden GdL-Wtirsten. Eine Erhöhung der Nitratkonzen- tration von 100 ppm auf 500 ppm hatte einen Anstieg des End-pH um 0,3 Einheiten zur Folge (Tabelle 11). 3. 5 Ergebnisse der vergleichenden Versuche Auf Grund der Versuchsreihen VIII und VII wurde festgestellt, dass mit einem Nitritzusatz von 100 ppm bzw. einem Nitratzusatz von 125 ppm ein technologisch akzeptables Produkt erzielt wird. Die Resultate der Versuchs- reihen V und VI zeigten, dass diese Feststellung auch beim Arbeiten mit GdL zutrifft. Nach den Ergebnissen der Versuchsreihe XIV ist es auch von Vorteil, eine Nitrit-Nitrat-Mischung zu verwenden. Bild 35. Einfluss der zugesetzten dukosemenge auf den pH-Wert. Versuchsreihe XVI. 66 In den vergleichenden Versuchen wurden ausschliesslich die nitrithaltigen Wiirste unter Zusatz von GdL hergestellt. Die Nitritzugabe betrug 100 bzw. 200 ppm NaN0 2 . Die Herstellung der nitrathaltigen Wiirste erfolgte unter Einsatz von Mikrokokken-Laktobazillen-Starterkulturen. Der Nitratzusatz betrug 150 bzw. 300 ppm KN0 3 , was, umgerechnet in Nitrit, etwa den Nitiit- konzentrationen der o.g. GdL-Wiirste entsprach. Weiter wurde Wurst mit 50 ppm NaN02 und 75 ppm KN0 3 entsprechend einer Nitritkonzentration von 100 ppm hergestellt. Die Wahl der Zusatzmittelmengen wurde zum einen durch die Ergebnisse der Präliminarversuche, zum anderen durch entsprechende Angaben in der Fachliteratur (Leistner u.a. 1973 a und b, Wirth 1973, Skjel- kväle u.a. 1974) mitbestimmt. Auf Grund der Literaturauswertung und der Versuchsreihe XI wurde festgestellt, dass Voraussetzung fur die Senkung des Nitrit- oder Nitratzusatzes die Verwendung von GdL oder Starterkulturen ist. Darum wurde in die vergleichenden Versuche keine Versuchsreihe ohne obengenannte Zusätze aufgenommen. In der vorliegenden Arbeit wurde kein eigentlicher Vergleich zwischen Starterkultur- und GdL-Einsatz angestrebt; das Hauptgewicht lag vielmehr auf der Untersuchung der Auswirkungen einer Verringerung des Nitrit- bzw. Nitratzusatzes. 3. 5. 1 Chemische Zusammensetzung Um eine gleichmässige Zusammensetzung der Versuchswiirste zu gewahr- leisten wurden sie auf Wasser-, Fett- und Salzgehalt analysiert. Die Mittel- werte samtlicher Proben sind in Tabelle 14 zusammengestellt; wie daraus ersichtlich ist, waren die Proben beziiglich ihrer chemischen Grundzusammen- setzung, was die Mittelwerte betrifft, weitgehend homogen, wohingegen zwischen den Einzelwiirsten mitunter ziemlich grosse Unterschiede auftraten,. die jedoch nach Auffassung des Verfassers keinen signifikanten Einfluss auf die iibrigen Ergebnisse batten. 3. 5. 2 Nitrit- und Nitratgehalt Der Nitritgehalt ist der zentrale Faktor dieser Studie. In Tabelle 15 und Bild 36 ist die Entwicklung des Nitritgehalts bei den Wiirsten der vergleichen- den Versuchsreihen im Laufe des Herstellungsprozesses dargestellt. Bei den GdL-Wiirsten war schon am ersten Tag ein rascher Rtickgang des Nitritgehalts zu beobachten. Die Wurst 1 mit der niedrigeren Konzentration enthielt am dritten und siebten Tag knapp halb so viel Nitrit wie die Wurst 2 mit der höheren Konzentration, am 14. Tag aber schon 2/3 der in der Wurst 2 enthaltenen Menge. Bei den Starterkultur-Wiirsten lag der Nitritgehalt nach Ablaut des ersten Tages sehr niedrig; dies traf auch fur die mit einem Nitritzusatz von 50 ppm hergestellte Wurst 5 zu. Nach drei Tagen erreichte die Nitritkonzentration ihr Maximum und begann dann langsam zu sinken. Am dritten Tag hatte die Wurst 1 den signifikant kleinsten, die Wurst 4 den signifikant grössten Nitritgehalt. Ausserdem enthielt die Wurst 5 signi- fikant weniger Nitrit als die Wurst 2. Nach 14 Tagen hatte die Wurst 2 die 67 Tabelle 14. Wasser-, Fett- und Salzgehalt der Wiirste der vergleichenden Versuchsreihen Vl-V6, (%). Wurstposten l 1) 2 3 4 5 Wassergehalt 0 Tage 50,5 49,6 49,6 49,8 50,0 1 • 50,7 49,6 50,0 49,8 49,6 3 i 48,5 47,4 48,5 48,7 48,6 7 • 45,5 43,4 44,0 44,0 44,0 14 I 39,8 39,0 39,0 39,1 38,9 Kettgehalt 0 Tage 31,6 32,6 32,7 32,4 32,1 1 »> 30,2 31,4 38,9 31,4 31,8 3 » 32,0 33,2 32,0 31,9 31,9 7 » 33,3 36,0 33,5 35,4 35,4 14 » 38,4 39,1 39,1 39,3 39,2 Salzgehalt 0 Tage 3,0 2,9 3,0 3,0 3,0 1 • 3,2 3,2 3,2 3,2 3,1 3 .) 3,4 3,3 3,3 3,4 3,4 7 » 3,7 3,6 3,7 3,6 3,6 14 » 3,9 3,9 3,9 3,9 4,0 ') Siehe Tabelle 5 Tabelle 15. Nitritgehalte der Wiirste der vergleichenden Versuchsreihen VI V6, (ppm). Wurstposten1) k.s.U. Zeit 12 3 4 5 S.d.U. (S.d.U. = (Tage) 0.05) 0 x 78,8 127,5 1,5 1,2 37,8 s 5,6 13,0 0,6 0,4 6,5 1 14,1 35,8 5,0 7,5 8 7 2.4 2,5 5,9 12,1 5,1 3 10,0 21,1 17,1 28,7 17,6 0,001 5,42 1.5 1,9 5,0 6,3 4,5 7 9,0 14,4 10,1 13,9 10,3 1,7 1,0 1,5 9,0 1,1 14 10,2 15,2 9,8 12,9 10,7 0,001 1,74 1,5 0,6 1,1 1,8 1,5 3 j Siehe Tabelle 5 signifikant stärkste Nitritkonzentration und unterschied sich somit in signifi- kanter Weise von der mit entsprechend grossem Nitratzusatz hergestellten Wurst 4. Die mit dem geringeren Nitrit- bzw. Nitratzusatz hergestellten Wiirste unterschieden sich nicht signifikant voneinander, wohl aber von den 68 Wtirsten 2 und 4. Eine praktische Bedeutung kam diesen Differenzen jedoch nicht zu. Bei der Einschätzung des gesundheitlichen Risikos in seiner Gesamtheit ist auch die Nitratmenge in Rechnung zu stellen. Die Entwicklung des Nitratge- halts im Verlauf des Herstellungsprozesses ist aus Tabelle 16 und Bild 37 ersichtlich. Der Nitratgehalt der GdL-Wiirste 1 und 2 war anfangs gering, stieg aber in den ersten drei Tagen kräftig an und blieb bis zum Versuchsende auf einem hohen Wert. Die Verringerung der Nitritmenge hatte keinen signi- Tabelle 16. Nitratgehalte der Wurste der vergleichenden Versuchsreihen VI—V6, (ppm). Wurstposten 1) k.s.U. Zeit 12 3 4 5 S.d.U. (S.d.U. - (Tage) 0.05) 0 x 16,6 46,4 137,3 255,3 78,3 s 8,6 28,0 25,6 59,8 13,8 1 69,8 46,4 139,1 262,0 115,8 19,8 14,5 27,0 40,5 18,0 3 92,1 71,8 40,9 111,7 61,4 0.001 25,6 22,1 22,6 18,0 29,4 9,4 7 84,2 87,3 20,1 54,0 21,6 15,8 32,8 2,9 15,4 6,2 14 99,4 99,7 20,9 28,4 21,3 0,001 16,8 20,6 19,4 4,2 7,1 5,5 1) Siehe Tabelle 5 Bild 36. Nitritgehalts-Mittelwerte der Wiirste der vergleichenden Versuchsreihen VI V6. fikanten Einfluss auf den Restnitratgehalt. Die Starterkultur-Wiirste hatten anfangs einen hohen Nitratgehalt, der jedoch nach drei Tagen etwa auf das Niveau der GdL-Wiirste abgesunken war. Bei der mit Nitrit-Nitrat-Zusatz hergestellten Wurst 5 stieg der Nitratgehalt zunächst an, und nach drei Tagen wies diese Wurst mehr Nitrat als die Wurst 3 auf. Nach 14 Tagen hatten dei Starterkultur-Wiirste etwa ein Viertel des Nitratgehalts der GdL-Wiirste, Signifikante Unterschiede waren in keiner der beiden Gruppen festzustellen jedoch enthielt die mit dem höheren Nitratzusatz hergestellte Wurst 4 mehr Nitrat als die mit dem geringeren Zusatz hergestellten Wiirste 3 und 5. Da die Wiirste einen höheren Nitrat- als Nitritgehalt hatten, war ersterer bestimmend in bezug auf die Unterschiede des Gesamtnitritäquivalentgehalts (Tabelle 17), was auch in den zum Nitratgehalt analogen Ergebnissen zum Ausdruck kommt. In Tabelle 17 ist die in Nitritäquivalente umgerechnete Nitrit-Nitrat-Gesamtmenge in Prozent der zugesetzten Menge angegeben; ausserdem sind die Werte abweichend von den vorangehenden Tabellen dem Gewichtsverlust entsprechend korrigiert, so dass ersichtlich ist, wieviel Bild 37. Nitratgehalts- Mittelwerte der Wiirste der vergleichenden Ver- suchsreihen VI V6. 69 70 Tabelle 17. Nitrit-Nitrat-Gesamtmengen-Mittclwerte tier Wiirste der vergleichenden Ver- suchsreihen VI —V6, gerechnet als NaNOj-Äquivalente und ausgedriiekt in Prozent der zugesetzten Menge unter Beriicksichtigung des Gewichtsverlustes der Wiirste. Wurstposten 1) Zeit 12 3 4 5 (Tage) 0 90,2 79,7 93,1 85,7 93,9 1 58,6 33,2 95,8 88,7 85,3 3 68,4 32,8 40,9 47,8 53,1 7 59.9 32,5 20,4 21,7 21,6 14 63.3 33,3 18,7 12,4 19,9 *) Siehe Tabelle 5 des zugesetzten Nitrits bzw. Nitrats an den einzelnen Stichtagen noch vor- handen war. Wie aus Tabelle 17 hervorgeht, nahm bei den Starterkultur-Wiirsten die Nitrit-Nitrat-Gesamtraenge wahrend des Herstellungsprozesses ständig ab, wdhrend bei den GdL-Wursten der Riickgang bereits nach einem Tag zum Stillstand kam. Der relative Riickgang war um so starker, je mehr Nitrit bzw. Nitrat zu Beginn zugesetzt worden war. 3. 5. 3 Stickoxidmyoglobin-Gehalt In der vorliegenden Arbeit wurde die an Hämin gebundene Stickoxidmenge (NO) bestimmt und als Stickoxidmyoglobin (NOMb) angegeben, unabhängig davon ob das Stickoxid eventuell an undenaturiertes Globin (Stickoxidmyo- globin) oder an denaturiertes Globin (Stickoxidmyochromogen) gebunden war (Tabelle 18). Unter Beriicksichtigung des Gewichtsverlustes (Tabelle 26) kann konstatiert werden, dass die NOMb-Menge nach dem dritten Tag nicht mehr wesentlich zunahm. Bei den mit den niedrigeren Nitrit-und/oder Nitratzusätzen hergestell- ten Wursten stieg der NOMb-Gehalt, wobei in den Starterkultur-Wiirsten eine stärkere Zunahme als bei den GdL-Wursten zu beobachten war. Bei den Wursten mit dem höheren Nitrit- oder Nitratzusatz ging die NOMb-Menge sogar etwas zuriick. Nach drei Tagen wiesen die Wiirste keine NOMb-Gehaltsunterschiede auf, aber nach 14 Tagen wurde dann bei der Wurst 1 ein signifikant geringerer NOMb-Gehalt als bei den Wiirsten 3, 4 und 5 festgestellt. 3. 5. 4 Mikrobiologiselle Ergebnisse Die Gesamtbakterienzahlen sind in Tabelle 19 zusammengestellt. Bei den GdL-Wursten stieg die Gesamtbakterienzahl nach dem dritten Tag urn etvva 1,5 logarithmische Einheiten an. Nach 14 Tagen wies die Wurst 2 einen etwas geringeren Bakterienbesatz als die Wurst 1 auf. Bei der Gesamt- bakterienzahl der Starterkultur-Wiirste zeigten sich keine wesentlichen Yeränderungen; allerdings hatte die Wurst 4 am Ende des Versuchs den nied- 71 Tabelle 18. Stickoxidmyoglobin-Menge (NOMb, mg/g). Wiirste der vergleichenden Ver- suchsreihen VI—V6. Zeit Wurstposten2) S.d.U. k.s.U. (Tage) 12 3 4 5 (S.d.U. = 0.05) 3 x 4.65 5.25 4.70 5.42 5.01 >0,05 s 0,76 0,94 0,99 1,67 1,18 14 5,63 6,05 6,32 6,25 6,47 0,05 0,62 0,48 0,45 0,50 0,63 0,71 Zusatz zum 5,1% -0,7% 15,8% -1,6% 11,4% 3-Tage-Wert1) x) Gewichtsverlust beriicksichtigt 2) Siehe Tabelle 5 Tabelle 19. Gesamtbakterienzahl (log N, Keime/g) in den vergleichendenVersuchsreihen VI —V6 Zeit Wurstposten 1) (Tage) 12 3 4 5 0 5,68 5,69 7,31 7,35 7,34 1 5,91 5,12 7,37 7,31 7,29 3 5,75 5,59 7,54 7,52 7,52 7 7,19 6,97 7,49 7,36 7,67 14 7,26 7,02 7,28 7,03 7,45 ») Siehe Tabelle 5 rigsten Bakteriengehalt. Die grösste Nitrit- bzw. Nitratzugabe senkte somit die Gesamtbakterienzahl um durchschnittlich 0,3 logarithmische Einheiten. Allerdings ist hierzu festzustellen, dass nach Tabelle 20 die Wurst 4 nach 14 Tagen einen Laktobazillengehalt von logN = 7,35 aufwies, wohingegen nach Tabelle 19 die Gesamtbakterienzahl log N = 7,03 betrug, so dass nicht alle der in SL-Nährboden gediehenen Bakterien auch in PC-Nährboden gediehen waren. Tabelle 20. Laktobazillenzahl (log N, Keime/g) in den vergleichenden Versuchsreihen VlV6. Zeit Wurstposten 1) (Tage) 12 3 4 5 0 2,46 2,06 7,31 7,28 7,25 1 2,90 2,62 7,25 7,22 7,20 3 5,72 5,36 7,58 7,61 7,43 7 6,80 6,54 7,49 7,20 7,39 14 7,01 6,85 7,27 7,35 7,61 *) Siehe Tabcllc 5 72 Bei den GdL-Wiirsten fand zwischen dem zweiten und siebten Tag ein steiler Anstieg der Laktobazillenzahl statt. Der Unterschied zwischen den Wiirsten 1 und 2 war jedoch gering. Bei den Starterkultur-Wiirsten blieb die Lakto- bazillenmenge während der gesamten Versuchsdauer etwa auf gleichem Niveau, und auch der Quantität des Nitratzusatzes schien in diesem Falle keine Bedeu- tung zuzukommen. Tabelle 21. Mikrokokkenzahl (log N, Keime/g) in den vergleichenden Versuchsreihen VI —V6. Zeit Wurstposten 1) (Tage) 12 3 4 5 0 4,27 3,83 7,26 7,14 7,07 1 4,12 3,90 7,23 7,21 7,12 3 4,22 3,99 6,94 7,00 7,03 7 4,13 3,91 6,67 6,79 6,69 14 4,12 3,62 6,74 6,73 6,81 ') Siehe Tabelle 5 Die Mikrokokkenzahl (Tabelle 21) der GdL-Wurste nahm wahrend der gesamten Versuchsdauer etwas ab. Die stärker nitrithaltige Wurst 2 enthielt von Anfang an weniger Mikrokokken, aber zwischen den Wiirsten 1 und 2 bestand kein wesentlicher Unterschied, es sei denn, dass eine unmittelbare Wirkung des Nitrits auf einen Teil der Mikrokokken gleich am Herstellungstag vorlag. Bei den Starterkultur-Wiirsten wurde auch ein leichter Riickgang der Mikrokokkenzahl beobachtet, Unterschiede zwischen den Wiirsten waren jedoch nicht festzustellen. Die Anzahl der fäkalen Streptokokken, Kolibakterien und Hefezellen lag bei den Wiirsten der vergleichenden Versuchsreihen so nahe bei der Feststell- barkeitsgrenze (100 Keime/g), dass eine Auswertung des Ergebnismaterials nicht möglich war. Infolge der zahlreichen leeren Flatten konnten keine Mittelwerte berechnet werden. Ganz allgemein sei festgestellt, dass die o.g. Mikroben in den Versuchsreihen keinerlei Problem darstellten, denn sie ver- mehrten sich während der Dauer der Versuche kaum. In einigen wenigen Fallen enthielten die Starterkultur-Wiirste die oben angeftihrten Mikroben anfangs in etwas grösseren Hengen als die GdL-Wurste, jedoch waren diese nach sieben und 14 Tagen nahezu ausnahmslos auf einen Wert unter 100 Keime/g gesunken. 3. 5. 5 pH-Wert, Konsistenz und Gewichlsverlust In Tabelle 22 und Bild 38 ist die pH-Entwicklung bei den Wiirsten der vergleichenden Versuchsreihen dargestellt. Bei den GdL-Wiirsten nahm der pH bereits wahrend des Kutterns ab und lag somit schon am Herstellungstag niedriger als bei den Starterkultur-Wiirsten. Nach einem Tag batten die GdL-Wurste schon nahezu ihren End-pH erreicht, wahrend der pH-Wert der Starterkultur-Wiirste gegenuber dem Anfangswert kaum Anderungen erfahren 73 Tabelle 22. pH-Entwicklung bei den Wursten der vergleichenden Versuchsreihen VI V6. Zeit Wurstposten1 ) S.d.U. k.s.U. (Tage) 12 3 4 5 (S.d.U. = 0.05) 0 x 5,36 5,40 5,61 5,61 5,61 s 0,17 0,15 0,08 0,07 0,09 1 5,07 5,06 5,47 5,50 5,49 0,04 0,04 0,06 0,07 0,05 3 5,07 5,10 5,12 5,10 5,20 >0,05 - 0,05 0,04 0,12 0,08 0,13 7 5,00 5,04 4,83 4,83 4,87 0,09 0,09 0,10 0,08 0,06 14 4,94 5,01 4,72 4,76 4,78 0,01 0,20 0,14 0,10 0,12 0,07 0,09 ') Siehe Tabelle 5 hatte. Nach drei Tagen bewegte sich der pH der Starterkultur-Wiirste bereits so nahe beim pH-Wert der GdL-Wiirste, dass zwischen ersteren und letzteren keine statistisch signifikanten Unterschiede mehr bestanden. Nach 14 Tagen betrug der pH der Starterkultur-Wiirste 4,7—4,8, der der GdL-Wiirste etwa 5,0. Die mit dem höheren Nitrit- bzw. Nitratzusatz her- Bild 38. Mittehverte der pH-\Verte der Wiirste aus den vergleichenden Versuchsreihen VI V6. 74 gestellten Wurste zeigten einen etwas höheren pH als die entsprechenden Wurste mit dem niedrigeren Nitrit- bzw. Nitratzusatz. Bei den Starterkultur- Wiirsten wies allerdings die Wurst 5 den höchsten pH-Wert auf. Die Wurst 2 hatte einen signifikant höheren pH als die Starterkultur-Wurste, die Wurst 1 einen signifikant höheren pH als die Wurst 3. Hierbei ist jedoch zu be- riicksichtigen, dass die Anderungen des pH-Werts wegen dessen logarithmischen Charakters in keinem direkten Verhältnis zur Säurekonzentration stehen. Auch das Pufferungsvermögen des Fleisches stellt in diesem Bereich eine beachtens- werte Variable dar. Dazu kommt, dass der Einfluss der Wasserstoffionenkon- zentration auf die technologischen, mikrobiologischen und organoleptischen Eigenschaften der Rohwurst in diesem pH-Bereich wohl kaum ein linearer ist. Rein statistische Betrachtungen des pH-Werts bieten deshalb nur sehr ungenii- gende Anhaltspunkte bei der Beurteilung dessen Auswirkungen. Hinsichtlich der a w-Werte wurden zwischen den Wtirsten keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt (Tabelle 23). Tabelle 23. a w-Werte der Wurste der vergleichenden Versuchsreihen VI V6. Zeit Wuistposten1) k.s.U. (Tage) 12 3 4 5 S.d.U. (S.d.U. = 0.05) 0 x 0,952 0,951 0,954 0,955 0,953 s 2 12 2 2 1 0,949 0,949 0,950 0,951 0,951 4 3 3 3 3 3 0,944 0,943 0,944 0,945 0,944 >0,05 2 3 2 2 3 7 0,931 0,932 0,933 0,933 0,934 3 2 2 11 14 0,916 0,914 0,913 0,917 0,914 >0,05 4 4 5 3 4 *) Siehe Tabelle 5 Die Konsistenzwerte (Tabelle 24) folgten konsequent der pH-Wert-Entwick- lung. Die zwischen pH und Konsistenzwert festgestellten Korrelationskoeffi- zienten gehen aus Tabelle 25 hervor. Am dritten Tag batten die GdL-Wiirste eine festere Konsistenz als die Starterkultur-Wurste (Tabelle 24). Die Wurste 1 und 2 waren signifikant fester als die Wurst 5. Am 14. Tag batten sämtliche Starterkultur-Wurste eine signifikant bessere Konsistenz als die GdL-Wihste. In heiden Gruppen war die Festigkeitsrangfolge umgekehrt proportional zur pH-Reihenfolge. Beztiglich der Festigkeit warden am dritten Tag, organoleptisch beurteilt, keine signifikanten Unterschiede festgestellt (Tabelle 24). Nach sieben Tagen unterschieden sich die Starterkultur-Wurste signifikant von den GdL-Wxhsten, jedoch kam dem Nitrit- bzw. Nitratzusatz in dieser Hinsicht keine Bedeutung zu. Nach vierzehn Tagen wurde die Konsistenz der Starteikultur-Wiirste Tabelle 24. Konsistenzwerte (kg) und organoleptisch beurteilte Konsistenzpunktzahlen (maxim. 2) der Wurste der vergleichenden Versuchsreihen VlV6. Zeit Wurstposten1 ) S.d.U. k.s.U. (Tage) 12 3 4 5 (S.d.U. = 0.05) Gemessen 1 x 2,3 2,3 1,4 1,3 1,4 s 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 3 2,6 2,4 2,2 2,2 2,0 0,01 0,4 0,3 0,3 0,2 0,3 0,2 7 3,1 2,9 4,0 4,0 3,8 0,4 0,5 0,9 0,6 0,5 14 4,6 4,8 6,8 6,5 6,3 0,001 1,2 0,6 0,6 1,1 0,9 0,9 Organoleptisch beurteilt 3 0,9 0,8 0,9 1,0 0,9 >0,05 - 0,2 0,2 0,3 0,5 0,4 7 0,8 0,8 1,4 1,6 1,3 0,001 0,45 0,2 0,2 0,5 0,2 0,6 14 1,1 1,4 1,9 1,8 1,8 0,001 0,43 0,3 0,3 0,1 0,3 0,2 1 ) Siehe Tabelle 5 punktmässig höher bewertet als die der GdL-Wiirste. Die Konsistenz-Punkt- zahl der Wurst 1 lag signifikant niedriger als die entsprechenden Werte der Starterkultur-Wurste. Der Nitrit- bzw. Nitratzusatz war ohne Belang. Aller- dings erreichte die Wurst 2 eine etwas höhere Punktzahl als die Wurst 1, ob- wohl auf Grund der pH-Werte eigentlich das umgekehrte Ergebnis zu erwarten gewesen wäre (Tabelle 21). Nach Tabelle 25 bestand am dritten Tag zwischen dem Konsistenzwert und der organoleptischen Beurteilung keine Korrelation, wohingegen am siebten Tag bereits ein sehr hoher Korrelationskoeffizient, r = +0,963, vorlag. Tabelle 25. Korrelationskoeffizienten (r) zwischen pH-Wert und Konsistenzwert sowie zwischen gemessener und organoleptisch bestimmter Konsistenzpunktzahl. Zeit r (Tage) pH-Wert Konsistenzwert (gemessen) 1 -0,999 3 -0,906 7 -1,000 14 -0,964 Konsistenzwert (gemessen) 3 -0,312 7 +0,963 14 +0,969 Konsistenz (organoleptisch beurteilt) 75 76 Beim Gewichtsverlust (Tabelle 26) wurden zwischen den einzelnen Wiirsten keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt; allerdings wiesen die Starterkultur-Wtirste einen geringfiigig höheren Gewichtsverlust als die GdL- Wiirste auf. Moglicherweise war die Versuchsdauer (14 Tage) fiir das Ent- stehen wesentlicher Differenzen zu kurz. Tabelle 26. Gewichtsverlust bei den Wiirsten der Versuchsreihen VI—V6 (%)• Zeit Wurstposten 1) S.d.U. k.s.U. (Tage) 12 3 4 5 (S.d.U. - 0.05) 1 1,7 1,9 2,2 2,5 1,7 3 6,3 6,4 6,8 6,7 6,7 <0,05 - 7 12,2 12,4 12,3 12,8 12,9 14 19,5 20,2 20,7 21,3 20,4 <0,05 - b Siehe Tabelle 5 3. 5. 6 Farbe Sämtliche Wurste wiesen bereits im Alter von einem Tag rote Schnitt- flächenfarbe auf. Die GdL-Wiirste batten einen dlinnen grauen Ring; die Wurst 1 einen etwas dickeren als die Wurst 2 (Foto 1). Am dritten Tag war bei den Starterkultur-Wtirsten eine Intensivierung vor allem der Oberflächen- färbung eingetreten, wohingegen die GdL-Wiirste an der Oberfläche noch leicht grau waren (Foto 2). Am siebten Tag batten sämtliche Wurste eine rote Schnittflächenfarbe, an der Oberfläche waren die GdL-Wiirste jedoch nach wie vor grau; das gleiche Bild bot sich auch am 14. Tag (Foto 3 und 4). Am 22. Tag zeigte das Schnittbild der GdL-Wiirste, verglichen an dem der Starter- kultur-Wiirste, einen Stich ins Bläuliche. Die GdL-Wiirste batten eine etwas schlechtere Farbbeständigkeit als die Starterkultur-Wtirste; ihre Farbe schlug ziemlich schnell in Graubraun um (Foto 5). Organoieptisch beurteilt war die Schnittflächenfarbe der Wurst 1 am dritten Tag signifikant schwächer als die der Wurste 2 und 4; die Wurst 5 wiederum hatte eine schlechtere Schnittflächenfarbe als die Wurst 4 (Tabelle 27). Die Oberflächenfarbe der Wurste 1 und 2 war signifikant schlechter als die der Wurste 35, ausserdem hatte die Wurst 1 gegeniiber der Wurst 2 eine signifikant schwächere Oberflächenfarbe. Am siebten Tag war die Situation beziiglich der Oberfläche die gleiche mit dem Unterschied, dass die Wurst 1 und die Wurst 2 nicht mehr signifikant verschieden waren. Am siebten Tag zeigten sämtliche Starterkultur-Wtirste eine signifikant bessere Schnittflächen- farbe als die GdL-Wiirste. Am 14. Tag hatte die Wurst 1 eine signifikant schlechtere Oberflächenfarbe als die iibrigen Wurste; die Wurst 2 hatte eine schwächere Farbe als die Wurst 4. Bei der Schnittflächenfarbe wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt. Bei der Beurteilung der Schnittflächenfarbe der 22 Tage alten Wurste durch Rangordnungspriifung wurde die frische Schnittfläche der Wurst 1 farb- 77 Tabelle 27. Oberflächenfarbe (maxim. 6), Schnittflächenfarbe (maxim. 6) und Punkte der organoleptischen Beurteilung der Wurste der vergleichenden Versuchsreihen VI V6. Zeit Wurstposten1 ) S.d.U. k.s.U. (Tage) 12 3 4 5 (S.d.U. = 0.05) Oberfläche 3 x 1,4 2,5 4,2 4,3 4,2 0,001 1,1 s 1,2 1,3 0,6 0,4 0,6 7 2,3 3,1 4,2 4,6 4,6 0,001 1,1 0,9 0,8 0,5 0,4 0,3 14 3,3 4,2 4,7 4,8 4,7 0,001 0,6 0,5 0.5 0,3 0,3 0,2 Schnittfläche 3 3,0 3,8 3,4 4,0 3,2 0,01 0,7 0,6 0,4 0,6 0,6 0,5 7 3,4 3,7 4,2 4,5 4,4 0,001 0,7 0,3 0,3 0,5 0,5 0,7 14 4,2 4,4 4,7 4,7 4,6 >0,05 0,3 0,3 0,4 0,6 0,7 h Siehe Tabelle 5 mässig fiir signifikant schwächer, die der Wurst 5 fiir signifikant besser als die Schnittflächen der anderen Wurste befunden. Die Farbe der drei Stunden alten Schnittfläche war bei den Starterkultur-Wiirsten stark signifikant besser als bei den GdL-Wiirsten. Hingegen hatten die Nitrit- und Nitratkonzen- trationen in dieser Beziehung keinen statistisch signifikanten Einfluss, wenn auch die Rangordnungssummen der mit dem höheren Zusatz hergestellten Wurste höher lagen als die der mit dem entsprechenden niedrigeren Zusatz hergestellten Wurste (Tabelle 28). Vergleiche zwischen den frischen und den drei Stunden alten Schnittflächen ergaben, dass die Starterkultur-Wurste gegeniiber den GdL-Wiirsten eine stark signifikant bessere Farbbeständigkeit aufwiesen. Tabelle 28. Schnittflächen-Farbbeständigkeit der Wiirste der vergleichenden Versuchsreihe V 6 (Rangordnungssumme 1)). y j. Wurstposten2) 12 3 4 5 Frische Schnittfläche 69* 55 58 50 37* 1 Std. alte Schnittfläche 73** 66 47 41 46 3 Stdn. alte Schnittfläche 71** 80** 39* 35** 39* Farbbeständigkeit frisch - 3 Stdn 82** 75** 38** 35** 37** x ) Beurteiler N= 18 Personen * Unterschied signifikant, S.d.U. = 0.05; ** S.d.U. = 0.01; signifikant schlechter 2 ) Siehe Tabelle 5 78 3. 5. 7 Geruchs-, Geschmacks- und Gesamtpunkte Beziiglich des Geruchs der Wiirste wurden an keinem der Stichtage signi- fikante Unterschiede festgestellt. Nach 14 Tagen hatte die Wurst 5 den besten Geschmack, gefolgt von den Wiirsten 3 und 4 (Tabelle 29). Geschmacklich am schwachsten war die Wurst 1, die sich in dieser Beziehung signifikant von den Wiirsten 4 und 5 unterschied. Die mit dem höheren Nitrit- bzw. Nitrat- zusatz hergestellten Wiirste erhielten bei der Beurteilung höhere Geschmacks- punkte; der Unterschied war jedoch gering und statistisch nicht signifikant. Allerdings erzielte die unter Zusatz einer Nitrit-Nitrat-Mischung hergestellte Wurst 5 die höchste Bewertung, obwohl ihr Nitrit-Nitrat-Zusatz dem niedrigeren Zusatzmittelniveau entsprach (Wiirste 1 und 3). Sämtliche Starterkultur-Wiirste erzielten signifikant höhere Gesamtpunkte als die Wurst 1, die Wiirste 3 und 4 wiederum signifikant bessere Gesamtpunkte als die Wurst 2. Bei den GdL-Wiirsten bewirkte eine Verdopplung des Nitrit- zusatzes eine Erhöhung der Gesamtpunkte, bei den Starterkultur-Wiirsten hingegen nur unbedeutende Veränderungen. Tabelle 29. Bei der organoleptischen Beurteilung fiir die Wiirste der vergleichenden Versuchs- rcihen VI —V6 erteilte Geruchs- (maxim. 2), Geschmacks- (maxim. 4) und Gesamtpunkte (maxim, 20). Wurstposten1 ) Zeit k.s.U. (Tage) 12 3 4 5 S.d.U. (S.d.U. = 0.05) Geruch 3 x 1,0 1,0 0,9 1,1 1,0 s 0,3 0,2 0,5 0,4 0,4 >°. o;> 7 1,0 1,1 1,4 1,4 1,4 0,3 0,3 0,4 0,4 0,3 >o ' os 14 1,5 1,5 1,6 1,6 1,7 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 >o'o3 Geschmack 14 2,2 2,4 2,7 2,9 3,0 >0,05 - 0,5 0,2 0,4 0,6 0,3 Gesamtpunkte 14 10,8 12,3 13,9 14,1 14,1 0,001 1,75 1,1 0,6 0,9 0,3 1,4 ') Siehe Tabelle 5 3.5. 8 Die zwischen Nitrit- und Nitratmenge sowie verschiedenen Eigenschaften der Rohwurst feslgestellten Korrelationskoeffizienten Der Einfluss der zugesetzten Nitrit- und Nitratmenge bzw. deren Rest- menge auf die Eigenschaften der Rohwurst wurde durch Berechuung der betref- fenden Korrelationskoeffizienten zu klären versucht (Tabelle 30). Der Nitrat- gehalt wurde hierzu zunächst in Nitritgehalt umgerechnet. 79 Nach Tabelle 30 bestand am dritten und am 14. Tag zwischen der zugesetzten Nitrit-/Nitratmenge und der Restnitritmenge eine starke Korrelation. Zwischen der zugesetzten Nitrit- bzw. Nitratmenge und der NOMb-Menge wurde am dritten Tag eine starke, am 14. Tag jedoch nur eine schwache Korrelation festgestellt. Das gleiche gait auch fur die Ergebnisse der organoleptischen Beurteilung sowohl beziiglich des zugesetzten Nitrits als auch des Restnitrits. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Nitritkonzentration am ersten Tag nach der Herstellung von Wichtigkeit im Hinblick auf Geschwindigkeit und Quan- tität der Umrötung ist, dass ihr abei später, nachdem offensichtlich eine Um- wandlung des Farbstoffs in die Chromogenform erfolgt ist, keine so grosse Bedeutung mehr zukommt. Zwischen der zugesetzten Nitritmenge sowie dem Geschmack und der Gesamtpunktzahl bestand keine Korrelation. Die Folgerung daraus ist, dass ein erhöhtei Nitrit- bzw. Nitratzusatz zwar zu Beginn des Herstellungspro- zesses eine Vexbesserung der Rohwursteigenschaften bewirkt, beim fertigen Produkt jedoch keine diesbeziiglichen Vorteile mehr festzustellen sind. Tabelle 30. In den vergleichenden Versuchsreihen VI —V6 zwischen der zugesetzten Nitrit- und Nitratmenge, der Restmenge und verschiedenen Rohwursteigenschaften festgestellte Korrelationskoeffizienten. Faktoren Zeit n Zugesetzte Nitritmenge1) Restnitritmenge 3 Tage +0,859 14 » +0,908 » » - NOMb-Menge 3 » +0,900 14 » +0,038 » » Farbe (organoleptisch beurteilt) 3 » +0,936 14 • +0,158 » » Geschmack 14 » +0,035 » » Gesamtpunkte 14 » +0,139 Restnitritmenge - NOMb-Menge 3 » +O,BBB 14 » -0,031 » Farbe (organoleptisch beurteilt) 3 » +0,953 14 » -0,074 b einschl. in NaNOa umgerechneten Nitrats 3. 6 Einfluss von Nitrit und Nitrat auf das Wachstum von Salmonellan Die Salmonellen-Versuchsreihe wurde zweifach ausgefiihrt. Beim ersten Mai betrug der Salmonellenzusatz 0,3 5,0 • 103 Keime/g, beim zweiten Mai 5,4 7,5 • 104 Keime/g. Allerdings ist die Möglichkeit nicht auszuschliessen, dass beim ersten Mai das GdL bereits vor der ersten Bestimmung eine Senkung der Salmonellenzahl bewirkte, denn die GdL-Wiirste batten unmittelbar nach der Herstellung nur etwa 1/10 des Salmonellengehalts der Starterkultur-Wurste. Beim zweiten Mai wurde allerdings keine solche Differenz mehr festgestellt (Tabelle 31). In Bild 39 sind die Ergebnisse, die auf der Platte unter dex Fest- Tabelle 31. Salmonella senftenberg-Anza.h\ (Keime/g) und pH-Wert der Rohwurst bei Zugabe verschieden grosser Nitrit- und Nitratmengen. Versuchsreihen Sl-S2. Zeit Wurstposten 1) (Tage) 12 3 4 5 Salmonellenzahl 0 SI 1) 0,5 • 103 0,3 • 103 4,0 • 103 5,0 • 103 1,2 • 103 S 2 6,0 • 104 6,3 • 10» 5,4 • 104 7,5 • 10 4 7,0 • 104 3 & Niinivaara, F. P. 1957. t'ber die Reifung der Rohwurst. 111. Mitteilung. t)ber die antagonistische Wirkung eines Mikrokokkenstammes gegen die in Rohwurst vorkom- menden Bakterienstämme. Z. Lebensm.- Unters. u. -Forsch 106: 298 301. Proc. ISNMP 1. 1974. Proceedings of International Symposium on Nitrite in Meat Products. 268 p. Pudoc, Wageningen. Proc. ISNMP 2. 1977. Proc. of the Second International Symposium on Nitrite in Meat Products, Zeist, Holland. (Im print). Puolanne, E., Törmä, P. & Djedjeva, G, 1977. t)ber das Nitratreduktionsvermögen der Stämme Micrococcus M 111 und Vibrio 21. Lebensm.- Wiss.-Techn. (Im Druck). Raevuori, H. 1975. Effect of nitrite and erythorbate on growth of Bacillus cereus in cooced sausage and in laboratory media. Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. B 161: 280 287 » 1976. Studies of Bacillus cereus as a food-poisoning organismn with special reference to the effects of certain preservatives on growth of the bacterium. Doctoral thesis, The College of Veterinary Medicine, Helsinki, Finland. 79 p. » & Genigeorgis, C. 1975. 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Tämän työn tarkoituksena oli laatia sellaiset käyttö- määräsuositukset näille lisäaineille, ettei niin menetellen patogeenisten bakteerien aiheuttama terveydellinen riski kasva ja ettei esiinny teknologisia vaikeuksia. Tutkimus jakautui kolmeen osaan. Alustavissa kokeissa tutkittiin nitriitti- ja/tai nitraatti- lisäyksien vaikutusta kestomakkaran ominaisuuksiin. Näiden tulosten perusteella valittiin val- mistusohjeet tutkimuksen muihin osiin. Alennettujen nitriitti- ja/tai nitraattilisäyksien avulla valmistettuja makkaroita verrattiin yleisesti käytössä olevien lisäysten mukaisesti valmistettui- hin makkaroihin teknologisesti (vertailukokeet) ja salmonellan kasvun suhteen(salmonellakokeet). Tutkimusta varten valmistettiin yhteensä 208 makkarakoe-erää. Alustavissa kokerssa oli 16 koesarjaa, ja kukin koesarja tehtiin kaksi kertaa. Alustavien ko- keiden tarkoituksena oli tutkia eri nitriitti- ja nitraattilisäyksien vaikutuksia kestomakkaran ominaisuuksiin eri olosuhteissa. Makkaroissa käytettiin starterkulttuureina joko Micrococcus sp.\ ta (Baktoferment 61) tai Lactobacillus plantarum -j- Micrococcus sp:ta (Duploferment 66). 1. Lisätty tai nitraatista pelkistynyt nitriitti esti selvästi laktobasillien mutta ei mikrokokkien kasvua. Nitriittilisäyksen alentaminen 100 pprmstä 50 pprmään ja nitraattilisäyksen 125 pprmstä 62,5 pprmään tai alemmaksi aiheutti liian voimakkaan bakteerikasvun ja pH- arvon laskun (kuvat 68, 10 12, 16, 31 ja 32). Alhaisimmat kokeissa käytetyt lisäykset, 25 ppm NaNO s ja 50 ppm KN0 3 , antoivat kuitenkin vielä makkaraan kestävän tasaisen vä- rin. Askorbiiniyhdisteitä käyttämällä voitiin värinmuodostusta nopeuttaa. 2. Lämpötilan laskeminen 26° C:sta 18° C;een hidasti nitraatin pelkistymistä (kuva 26). Sa- malla jäi nitraatista pelkistynyt nitriitin maksimipitoisuus alhaisemmaksi. Loppu-pH-arvo jäi lämpötilan laskiessa korkeammaksi (kuvat 29, 30, 33 ja 34). Samassa lämpötilassa valmis- tettujen nitriitti- ja nitraattilisäysten avulla valmistettujen makkaroiden välillä ei ollut eroja missään tutkitussa lämpötilassa. Vertailukokeet tehtiin kuusi kertaa ja salmonellakokeet kaksi kertaa. 3. Käytettäessä glukono-delta-laktonia (GdL) nitriittilisäyksen alentamisella 200 pprmstä 100 pprmään tai starterkulttuureita käytettäessä nitraattilisäyksen alentamisella 300 pprmstä 150 ppm:ään tai nitraatin korvaamisella 50 ppmdlä NaNG2 ja 75 ppmdlä KN0 3 ei ollut ti- lastollisesti merkitsevää vaikutusta hajuun, makuun tai leikkauspinnan väriin (taulukot 27 ja 29). Kuitenkin alhaisemman nitrittiilisäyksen avulla valmistetussa makkarassa oli hei- kompi makkaran kuoren väri kuin korkeamman nitriittilisäyksen avulla valmistetussa makkarassa. 4. Nitriitti- tai nitraattilisäyksen pienentämisellä tai seoksen käytöllä ei ollut vaikutusta mak- karoiden fysikaalisiin ja mikrobiologisiin ominaisuuksiin (kuva 38, taulukot 11 24) eikä Salmonella senjtenhergin kasvuun, jonka lukumäärä laski GdL-makkaroissa nollaan tai lä- helle nollaa ja starterkulttuurimakkaroissa kymmenenteen osaan alkuperäisestä määrästä (kuva 39, taulukko 31). 103 5. GdL-makkaroiden ja starterkulttuurimakkaroiden jäännösnitriittipitoisuus oli samaa suu- ruusluokkaa (10 —l5 ppm NaNG 2 ) (kuva 36, taul. 15), mutta sen sijaan jäännösnitraatin määrä oli GdL-makkaroissa kolmesta viiteen kertaa suurempi (noin 100 ppm KN03 ) kuin starterkulttuurimakkaroissa (20 —2B ppm KNG 3 , kuva 37, taul. 16). 6. Vertailtaessa GdL-makkaroita ja starterkulttuurimakkaroita todettiin, että GdL-makka- roiden pH-arvo laski nopeammin kuin starterkulttuurimakkaroiden, mutta loppu-pH-arvo oli kuitenkin korkeampi (taul. 22). Tämän vuoksi starterkulttuurimakkaroissa oli parempi rakenne (taul. 24) ja värin säilyvyys (taul. 28) ja lisäksi niissä oli parempi maku kuin GdL- makkaroissa (taul. 29). 7. Kaikissa kokeissa nitriitin määrän väheneminen lakkasi pH-arvon saavutettua arvon 5,0 (kuva 40). Nitraatin pelkistymisessä tämä käännekohta oli pH-arvossa 5,2—5,3 (kuva 41), mutta se ei esiintynyt yhtä selvänä kuin nitriitin häviämisessä. Loppupäätelmät: Tämän tutkimuksen ja siihen liittyvän kirjallisuustutkimuksen perusteella todettiin, että teknologisesti ja terveydellisesti turvallisen kestomakkaran valmistus on mahdollista käyttä- mällä 100 ppm NaN02 tai 150 ppm KNO s tai seoksena 50 ppm NaNOa ja 75 ppm KN0 3. Edelly- tyksenä nitriitti- tai nitraattilisäyksenalentamiselle kuitenkin on, että samanaikaisesti käytetään GdL:ia ja/tai starterkulttuureita. Niitä käyttämällä varmistetaan tarpeeksi nopea pH-arvon lasku toivotulle pH-arvoalueelle (pH 5,3—4,8). Abkiirzungen AS = Askorbinsäure (Askorbinverbindung) aw =Wasseraktivität GdL = Glukono-delta-Lakton Hb = Hämoglobin (die iibrigen Formen und Verbindungen siehe Mb) K m = Mkhaelis-Menten Koeffizient Keime/g = mikrobiologiset! genauer: die Anzahl der eine Kolonie bildenden Individuen pro Gramm k.s.U. = kleinster signifikanter Unterschied Lb = Laktobazillen M = Mol Mb = Myoglobin Mb0 2 = Oxymyoglobin MMb = Metmyoglobin Mk = Mikrokokken NOMb = Stickoxidmyoglobin (oft auch Stickoxidmyochromogen) S.d.U. = Zuverlässigkeitsgrad des Hypothesen-Testens (Signifikanz des Unterschieds) ppb = ein Milliardstel ppm = ein Millionstel r =Korrelationskoeffizient s = Standardabweichung = Mittelwertx Foto 1 Die I'arbe von eiuen Tag alten Wiirsten. GdL-Wiirste: 1. 100 ppm NaNO z 2. 200 ppm NaN0 2 Starterkultur-Wiirste: 3. 150 ppm KNO. 4. 300 ppm KN0 3 5. 50 ppm NaN0 2 und 75 ppm KN0 3 Foto 2, Die Farbe von drei Tage alten Wiirsten. Nummer: siehe Foto 1. Foto 3, Die Farbe von sieben Tage alten Wiirsten. Nummer: siehe Foto 1. Foto 4. Die Farbe von 14 Tage alten Wiirsten Nummen siehe Foto 1. Foto 5. Die Farbe von frischen, 1 Std. und 3 Stdn. alten Schnittflächen der 22 Tage alten Wurste. Nummer: Siehe Foto 1. Toto 1. Foto 2. Foto 3. Foto 4. Foto 5.