AgroCol_VOL27_3finalSINguias.pdf ABSTRACTRESUMEN Los abonos orgánicos se vienen utilizando como ente supre- sor de enfermedades de la raíz de la planta, debido a la gran cantidad de microorganismos que interactúan en ellos, lo que ha llevado a considerarlos como parte de las estrategias de control biológico. En este contexto, se evaluó la diversidad de la micoflora de dos sustratos orgánicos (suelo orgánico y lombri- compuesto) y su efecto sobre el control del hongo Rhizoctonia solani. La diversidad de la micoflora de los sustratos se deter- minó a través del método de dilución de placas de Warcup, que permitió contar el número de colonias e identificar los hongos. Los aislamientos más abundantes de cada sustrato fueron selec- cionados para realizar cultivos duales con Rhizoctonia solani. Se encontraron 16 aislamientos de hongos pertenecientes a tres ordenes y ocho géneros, incluyendo (Penicillium sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. y Trichoderma harzianum Rifai). En el lombri- compuesto se encontró una micoflora significativamente más abundante (P≤0,05) que en el suelo orgánico. En los cultivos duales, T. harzianum presentó un porcentaje de inhibición de R. solani significativamente superior (P≤0,05) al del resto de los hongos. Con la incorporación del lombricompuesto no se introdujeron nuevos hongos, pero sí se incrementaron las poblaciones existentes en la micoflora nativa. T. harzianum resultó ser el hongo de mayor crecimiento y mayor porcentaje de inhibición, lo que sugiere que es un controlador biológico de R. solani, y que es factible incorporarlo al suelo durante la preparación del mismo. The use of organic manures for root disease control, which results from the remarkable diversity of microorganisms that interact there, has led to consider them as part of biological control strategies. In this context, we evaluated the mycological diversity of two organic substrates, (organic soil and vermi- compost) and their effect on the control of the fungus Rhizoc- tonia solani. The mycoflora of the two organic substrates was assessed through Warcup’s soil plate method, which allowed identifying the fungi and counting the number of colonies. The most abundant isolates were grown against R. solani in dual cultures. The results allowed identifying 16 isolates belonging to three orders and eight genera of fungi, including Penicillium sp., Aspergillus sp., Fusarium sp. and Trichoderma harzianum Rifai. A significantly more abundant mycoflora (P≤0.05) was found in the vermicompost substrate. In the dual cultures, T. harzianum attained a higher pathogen inhibition percentage (P≤0.05) than the other fungi. The vermicompost substrate did not determine the growth of new fungi, but enhanced the development of the pre-existing native ones. Not only having shown the best results in controlling R. solani, but also the most vigorous growth among the identified fungi, T. harzianum comes up as a promissory biological controller of the pathogen, that can be incorporated to the soil during its preparation. Key words: biological control, antagonism, soil fungi, vermicompost. Palabras clave: control biológico, antagonismo, hongos del suelo, lombricompuesto. Fecha de recepción: 5 de febrero de 2009. Aceptado para publicación: 6 de noviembre de 2009 1 Laboratorio de Fitopatología y Control Biológico, Núcleo Universitario Rafael Rangel, Universidad de Los Andes, Trujillo (Venezuela). 2 Escuela Técnica Agropecuaria “Adolfo Navas Coronado”, Ministerio de Educación, Trujillo (Venezuela). 3 Autor de correspondencia. cguedez@ula.ve Agronomía Colombiana 27(3), 395-399, 2009 de las características del material utilizado (Cotxaterra et al., 2002). Incorporar abonos orgánicos al agroecosistema prove- nientes de diferentes materiales vegetales y animales ha demostrado tener ciertos efectos supresivos hacia algunas Micoflora asociada a dos sustratos orgánicos y su efecto en el control de Rhizoctonia solani Kühn Mycoflora of two organic substrates and its effect on the control of Rhizoctonia solani Kühn Clemencia Guédez1, 3, Luis Miguel Cañizalez1, Carmen Castillo1 y Rafael Olivar2 Introducción Las enmiendas orgánicas constituyen una fuente de carbono y otros nutrientes, lo cual favorece la actividad microbiana y mejora la estructura del suelo, creando así un medio adecuado para el crecimiento de las plantas. Sin embargo, la respuesta es variable y depende del cultivo, tipo de suelo, factores climáticos, prácticas de manejo y 396 Agron. Colomb. 27(3) 2009 enfermedades, debido a una situación especial de las poblaciones microbianas (Craft y Nelson, 1996; Hoitink et al., 1997; Hoitink y Bohem, 1999; Bulluck et al., 2002; Cotxaterra et al., 2002). Y muchos autores señalan que el fenómeno de supresión de patógenos de suelo por la adición de enmiendas orgánicas está asociado fundamentalmente al antagonismo ejercido por estimulación de la actividad microbiana y que, como tal, debiera ser considerado como un fenómeno de control biológico (Baker y Cook, 1974). El efecto de las enmiendas sobre la composición cualitativa y cuantitativa de la micoflora ha sido señalado como un indi- cador de la supresividad potencial de este método (Hoitink y Boehm, 1999; Dissanayake y Hoy, 1999). El hongo Rhizoctonia solani Kühn es un hongo del suelo que se encuentra repartido por todo el mundo atacando a muchos cultivos, y forma parte de un conjunto de hongos que provocan el Damping off o caída de plántulas produc- to del estrangulamiento y necrosis del tallo en cuello en plantas recién germinadas. Durante mucho tiempo, su gran variabilidad impedía que se le atribuyese inequívocamente a ciertos hospedadores. Hoy se sabe de innumerables es- tudios que existen distintas razas clasificadas en grupos de anastomosis, debido a lo cual puede atacar a distintos cultivos. Este hongo se conserva en el suelo en forma de esclerocio o de micelio viviendo de la materia orgánica, y por su alto potencial saprófito puede sobrevivir en forma de micelio durante tres años. La actividad del hongo comienza cuando suben las temperaturas del suelo (>15°C). Después de desarrollarse en la superficie de la raíz, las hifas penetran el tejido vegetal por medio de enzimas que disuelven las paredes celulares (Wiese, 1987). Las pruebas de antagonismo se realizan a través del enfren- tamiento del patógeno y el antagonista en una caja de Petri con medio de cultivo artificial, y tiene por finalidad deter- minar el crecimiento de ambos hongos, y al mismo tiempo se detectar alguna actividad antagónica, ya sea del tipo micoparasitismo, competencia por sustrato o antibiosis; es considerado un estudio preliminar que permite determinar si un aislamiento de un hongo tiene posibilidades como controlador biológico, realizando posteriormente pruebas in vivo para confirmar su potencial biológico. La diversidad microbiana como indicador de calidad del suelo ha sido muy discutido en la última década con el surgimiento de las técnicas de biología molecular (Johnson et al., 2003). Sin embargo, se le ha dado poca importancia a la cuantificación de la relación benéfica entre diversidad microbiana, funcionamiento del suelo y sustentabilidad del ecosistema (Kennedy y Smith, 1995). El fenómeno de supresividad de R. solani sobre poroto chaucha puede responder a la estimulación general de la micoflora más que al antagonismo de alguna cepa en particular (Nico et al., 2003). La utilización de índices de diversidad puede funcionar como bioindicador de microorganismos en comunidades microbianas del suelo, que pueden obtenerse en medios de cultivo definidos (Atlas, 1984). El índice de diversidad asume que los individuos fueron muestreados al azar de una población indefinidamente grande y que todas las especies están presentes en la muestra (ecuación 1). H’ = - pi ln pi (1) donde, pi es la proporción de individuos encontrados de la iésima especie. Este valor es estimado por ni/N, donde ni es el número de individuos de la especie i y N es el nú- mero total de individuos muestreados (promedios totales por hábitat). En esta investigación se evalúa la diversidad de la micoflora de dos sustratos, y se determina el comportamiento anta- gónico in vitro de los hongos aislados con más frecuencia frente a R. solani. Materiales y métodos Micoflora del sustrato El estudio de micoflora se realizó sobre dos sustratos (suelo orgánico y lombricompuesto) y dos muestras por sustrato (M1 y M3 para suelo orgánico y M2 y M4 para lombricom- puesto), en la localidad de San Pablo, Valera, estado Trujillo (9º13”48’ N; 70º40”15’ W). El sustrato de suelo orgánico de la zona (materia orgánica [MO] 22,41%; pH 5,9; C/N 8,96; nitrógeno total [NT] 0,45%) y sustrato de lombricompues- to: producto del cultivo de lombriz californiana de suelo franco-arenoso, excremento de caballeriza y materia vege- tal (pH 4,20; MO 30,45%; C/N 11,90 y NT 0,60%). Los sustratos de los germinadores utilizados se dejaron secar al aire durante 8 d; la unidad experimental la cons- tituyeron cuatro muestras de 10 submuestras cada una. El estudio de la micoflora se realizó de acuerdo con el méto- do de dilución en placas (Warcup, 1950). De cada una de las mezclas se pesó un gramo, se colocó en una fiola y se agregaron 99 mL de agua destilada estéril. Esta mezcla se colocó a agitación continua por 15 min, y con la suspensión aún en movimiento se pipeteó una porción para diluirla en volumen suficiente de agua destilada estéril según la concentración final deseada (10-2, 10-3 y 10-4). Se procedió 3972009 Guédez, Cañizalez, Castillo y Olivar: Micoflora asociada a dos sustratos orgánicos y su efecto en el control de Rhizoctonia solani Kühn a la siembra en cajas de Petri con PDA + antibiótico (clo- ranfenicol) colocando 1 mL de la suspensión de suelo, se sembraron 10 cajas de Petri por muestra que representó un tratamiento y se incubaron a temperatura ambiente (27°C±1) y cada día durante 5 d se determinó el número de colonias presentes y la identificación de las mismas. Los datos correspondientes a las 10 cajas de Petri se promedia- ron y expresaron como unidades formadoras de colonia (ufc) por gramo de suelo (previamente secado al aire y tamizado). En cada tratamiento se calculó la diversidad de la micoflora fúngica recurriendo al índice d de diversidad de Shannon y Weaver (1963). Los promedios obtenidos en los registros de número total de ufc e índice de diversidad fueron sometidos a Anova y separación de medias por Test de Tukey al 5% de signifi- cancia. Posteriormente se efectuó análisis de correlación entre abundancia total e índice de diversidad, por un lado, y los valores de índice de supresividad. Cultivos duales de hongos presentes En estos sustratos, se realizaron previamente ensayos donde se evaluó el efecto de T. harzianum sobre R. solani, observándose en este estudio que donde se aplicó T. har- zianum como controlador no se presentó la enfermedad por R. solani en germinadores de tomate, y donde no se aplicó T. harzianum sin esterilizar el sustrato se presentó, lo que sugiere que existe la posibilidad de supresión de la micoflora presente en los sustratos. De los hongos identificados del estudio de la micoflora se seleccionaron los aislamientos más abundantes en cada tratamiento y se realizaron estudios de antagonismo in vitro frente a Rhizoctonia solani. La técnica utilizada fue la de cultivos duales (Mariano, 1993): en cajas de Petri con PDA se “sembraron” dos discos de agar, uno con el patógeno y el otro con el antagonista, separados 5 cm entre sí. Las cajas se mantuvieron a temperatura ambiente a 27°C±1 durante 48 h y al cabo de las mismas se midió el desarrollo de am- bas colonias para calcular el porcentaje de inhibición del crecimiento del patógeno según la ecuación 2 desarrollada por Camporota (1985). I=de/dt x 100 (2) donde: I = porcentaje de inhibición del crecimiento del patógeno. de = radio de la colonia del patógeno en el sentido del eje que enfrenta al antagonista. dt = diámetro mayor de la colonia del patógeno. Resultados y discusión Estudio cualitativo y cuantitativo de la micoflora Un total de 16 cepas diferentes fueron aisladas de los tra- tamientos pertenecientes a tres órdenes y ocho géneros de hongos, siendo Penicillium spp., Aspergillus spp., Fusarium sp. y Trichoderma harzianum las cepas más abundantes (Tab. 1). Las muestras de los sustratos presentaron dife- rencias significativas (P≤0,05) en cuanto a la abundancia total y la diversidad. Las muestras M2 y M4 del sustrato de lombricompuesto mostraron una micoflora significativa- mente más alta (P≤0,05) que la registrada en las muestras M1 y M3 del sustrato de suelo orgánico, que presentaron poblaciones significativamente menos abundantes que el resto de las muestras de los sustratos. Los resultados de los índices de diversidad correspondientes a las poblaciones de hongos no exhibieron variabilidad con los valores de abundancia. Las unidades formadoras de co- lonias (ufc) de población microbiana aislada de las muestras del lombricompuesto (M2 y M4) resultó significativamente más alta en un 30% que las muestras (M1 y M3) del suelo orgánico (P≤0,05). Las ufc identificadas resultaron diferentes para cada una de las muestras. Aspergillus spp., Penicillium spp. y Tri- choderma sp. fueron los géneros que se presentaron con mayor abundancia en las muestras M1 y M3 en el suelo orgánico. En las muestras M2 y M4 del lombricompuesto se encontró a Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp. como los géneros más abundantes. Ávila y Gutiérrez (2000), Budge y Whipps (2001) y Whipps (2001) sostienen que el conocimiento de relaciones ecológicas, como el parasitismo, la competencia y predación ha implicado la búsqueda y evaluación de diversos microorganismos del suelo cuyas estrategias de sobrevivencia les permiten con- trolar ciertas enfermedades radicales en cultivos hortícolas de importancia económica. La abundancia de los hongos saprofitos Penicillium spp. y Aspergillus spp. se debe a que son hongos que están asociados a las raíces de las plantas, alimentándose de exudaciones radicales, capaces de mo- vilizar el fósforo y el nitrógeno del suelo (Atlas y Bartha, 1998). Según Booth (1971), Fusarium es un hongo amplia- mente distribuido en el suelo y sobrevive en asociación con las plantas, posee especies patógenas como saprófitas y es específica para cada cultivo. Cultivo duales de hongos presentes Los hongos escogidos para este estudio fueron Aspergillus sp. (A1), Penicillium sp. (P2), Trichoderma sp., hongos más frecuente en las muestras del suelo orgánico M1 y M3; los 398 Agron. Colomb. 27(3) 2009 más frecuentes en las muestras M2 y M4 del lombricom- puesto fueron Penicillium sp. (P11), Aspergillus sp. (A22) y Fusarium sp. (F1). Sólo en la muestra M4 del lombricom- puesto se encontró el hongo Rhizoctonia solani, debido al control previo con Trichoderma harzianum. T. harzianum presentó un porcentaje de inhibición significativamente superior (P≤0,05) al resto de las especies (Tab. 2). La cepa P1 de Penicillium y la cepa A22 de Aspergillus presentaron porcentajes medios de inhibición que no difirieron signifi- cativamente entre sí (P≤0,05), pero sólo Aspergillus sp. cepa A1 provoca inhibición a distancia. El resto de las especies muestra una capacidad antagónica significativamente inferior (P≤0,05). Fusarium sp. (F1) y Penicillium sp. (P11) presentaron un antagonismo débil, por lo cual cabe concluir que no son los responsables de la supresividad mostrada por el sustrato. En cambio Aspergillus sp. cepa A1, el hongo saprófito más abundante, exhibió in vitro una moderada capacidad antagónica. La adición de un sustrato en particular determina el de- sarrollo preferencial de aquellas especies más adaptadas al consumo de la fuente de nutrición (Kwasna et al., 2000; Harman et al., 2004) y, a su vez, en el corto plazo, la con- formación de poblaciones menos diversificadas. Lewis y Lumsden (2001), Cotxaterra et al. (2002) y Donoso et al. (2008) encontraron que el agregar enmiendas orgánicas al suelo controlaba hongos como Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Pythium ultimun y Sclerotinia sclerotiurum. T. harzianum presentó un comportamiento apropiado en el estudio de antagonismo in vitro, si se considera el porcentaje medio de inhibición del patógeno. Por otra parte existen antecedentes exitosos referidos al control biológico de R. so- lani con T. harzianum (Elad et al., 1980; Chet y Baker, 1980; Lewis y Lumsden, 2001; Alonso et al., 2002; Ezziyyani et al., 2004; Osorio-Nila et al. 2005; Hoyos-Carvajal et al., 2008). Mónaco et al. (1994) y Alonso et al. (2002) interpretan que un buen comportamiento antagónico in vitro no alcanza predecir un control biológico en condiciones naturales, pero permite descartar ciertos factores como causa proba- ble del fenómeno de supresividad. T. harzianum, además de capacidad biocontroladora, tiene una acción positiva como promotor de crecimiento vegetal, lo que lo convierte en bioproducto potencialmente efectivo. Broadbent et al. (1971) y Harman (2000) sostienen que puede ocurrir que un antagonista de buen comportamiento in vitro funcione posteriormente mal en campo, pero nunca puede suceder que un agente que haya mostrado ser inefi- ciente en laboratorio se comporte bien en el terreno; allí radica la importancia de estos estudios in vitro. TABLA 1. Abundancia e índice de diversidad de hongos presentes en sustratos de suelo orgánico y lombricompuesto en dos muestreos en Valera (Venezuela). Hongo Sustrato suelo orgánico Sustrato lombricompuesto M1 M3 M2 M4 Aspergillus sp. (A11) 2,00 4,00 5,00 6,00 Aspergillus sp. (A1) 16,25 12,00 0,00 4,00 Aspergillus sp. (A22) 0,00 0,00 16,75 12,25 Aspergillus sp. (A2) 4,00 4,00 9,50 3,00 Trichoderma sp. (ThA) 4,50 9,50 0,00 2,00 Trichoderma sp. (T1) 0,00 0,00 2,75 0,00 Penicillium sp. (P2) 9,50 9,50 0,00 5,75 Penicillium sp. (P1) 0,00 0,00 5,75 0,00 Penicillium sp. (P11) 0,00 2,00 9,25 7,50 Gliocladium sp. (G1) 0,00 0,00 1,00 1,00 Fusarium sp. (F1) 5,75 4,00 8,25 6,50 Fusarium sp. (F2) 0,00 0,00 2,75 3,25 Cladosporium sp. (C1) 0,00 0,00 0,75 0,75 Rhizopus sp. (R1) 0,25 0,00 0,75 0,00 Rhizoctonia sp. (Rs1) 0,00 0,00 0,00 3,75 Rhizoctonia sp. (Rs2) 0,00 2,00 0,00 9,50 Abundancia total/muestra 42,25 b 47,00 a 62,50 b 65,25 a Índice de diversidad 1,60 1,34 2,01 2,38 M1, M2, M3 y M4, muestra integral compuesta con 10 sub-muestras. Promedios con letras distintas indican diferencia significativa según la prueba de Tukey (P TABLA 2. Porcentaje de inhibición de Rhizoctonia solani frente a hongos encontrados en sustratos de suelo orgánico y lombricompuesto en dos muestreos en Valera (Venezuela). Hongos Inhibición Aspergillus sp. (A1) 11,06 a Aspergillus sp. (A22) 30,95 b Trichoderma sp. (ThA) 64,31 c Penicillium sp. (P2) 34,88 b Penicillium sp. (P11) 10,61 a Fusarium sp. (F1) 8,10 a Promedios con letras distintas indican diferencia significativa según la prueba de Tukey (P Conclusiones Agregar al suelo sustratos orgánicos no determinó la intro- ducción significativa de nuevos hongos, sino más bien una modificación de la cantidad preexistente de la micoflora nativa y el establecimiento de Trichoderma harzianum. 3992009 Guédez, Cañizalez, Castillo y Olivar: Micoflora asociada a dos sustratos orgánicos y su efecto en el control de Rhizoctonia solani Kühn Trichoderma harzianum resultó tener mayor velocidad de crecimiento en cultivos duales y un alto porcentaje de inhibición del hongo Rhizoctonia solani, lo cual confirma que este hongo controla efectivamente a Rhizoctonia solani, independientemente de la micoflora presente. Literatura citada Alonso R., R., B. Barranco M., G. Gracia R. y G. Jiménez M. 2002. Actividad in vivo de Trichoderma harzianum sobre Sclerotium rolfsii en plántulas de tomate. Manejo Integr. Plagas Agroecol. 66, 45-48. Atlas, R.M. 1984. 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