AGRONOMIA 26-2 -PROFE194).indd Reichel, Cuervo y Morales. Caracterización parcial de un potexvirus de Musa coccinea... 285 RESUMEN ABSTRACT Fecha de recepción: abril 10 de 2008. Aceptado para publicación: julio 10 de 2008 1 Investigadora, Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Corpoica), C.I. Tibaitatá, Mosquera (Colombia). hreichel@rocketmail.com 2 Laboratorio de Sanidad Vegetal, Unidad de Recursos Genéticos, Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Palmira (Colombia). mcuervo@ cgiar.org. 3 Jefe, Unidad de Virología Vegetal, Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Palmira (Colombia). fmorales@cgiar.org Caracterización parcial de un potexvirus aislado de Musa coccinea afectada por rayado necrótico en Colombia Partial characterization of a potexvirus isolated from a Musa coccinea plant affected by necrotic streak in Colombia Helena Reichel1, Maritza Cuervo2 y Francisco J. Morales3 Agronomía Colombiana 26(2), 285-291, 2008 Se observaron síntomas de rayado necrótico en las hojas de una planta de Musa coccinea (banano escarlata), procedente de Antioquia (Colombia). Mediante inmunocaptura, transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (IC-RT-PCR), se amplificó un fragmento de aproximadamente 377 pares de bases, con una identidad de secuencia de aminoácidos de 57% con el gen de la cubierta proteica del Alstroemeria virus X [AlsVX, AB206396] del género Potexvirus. Este es el primer reporte de un potexvirus en M. coccinea. El análisis comparativo de la 3’UTR del potexvirus aislado de M. coccinea con el correspondiente del AlsVX muestra que estos dos virus difieren significativamente en esta región, lo que sugiere que el potexvirus aislado de M. coccinea en Colombia es una nueva especie del género Potexvirus. Se propone el nombre de virus de la raya necrótica del banano escarlata (Scarlet banana necrotic streak virus [SBanNSV]) para este virus aislado de M. coccinea en Colombia. Palabras clave: banano escarlata, cubierta proteica, Flexiviri- dae, SBanNSV, 3’UTR. Necrotic streak symptoms were observed on the leaves of a Musa coccinea (scarlet banana) plant from Antioquia (C o l o m b i a). I m mu n e c a p t u r e r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n polymerase chain reaction (ICRT-PCR) amplified a DNA fragment of approximately 377 base pairs showing amino acid sequence identities of 57% with the coat protein of Alstroemeria virus X [AlsVX, AB206396] genus Potexvirus. This is the first report of a potexvirus infecting M. coccinea. Alignments of the 3’UTRs of the M. coccinea potexvirus and AlsVX showed that these two viruses differ in a significant way in t his region, which suggests t hat t he potex v irus isolated from M. coccinea in Colombia is a new specie in the genus Potexvirus. We propose the name of Scarlet banana necrotic streak virus (SBanNSV) for the potexvirus that was isolated from M. coccinea. Key words: scarlet banana, protein coat, Flexiviridae, SBanNSV, 3’UTR. Introducción Musa coccinea, conocida como ‘banano escarlata’, es una especie ornamental de la familia Musaceae (Jones, 2000), nativa de China (Liu et al., 2002). M. coccinea se encuentra ampliamente distribuida en el mundo, incluidos Colombia (Villegas et al., 2005) y Brasil (Lins y Coelho, 2004) en Amé- rica del Sur. El único patógeno viral anteriormente descrito para esta especie en Colombia es el virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus [CMV]) (Villegas et al., 2005). En septiembre 25 de 2001 se observó una planta de M. coccinea afectada por el síntoma del rayado necrótico en las hojas (figura 1), en el departamento del Antioquia (Colombia). El objetivo de este estudio fue determinar la etiología de la enfermedad de M. coccinea e investigar su posible relación con los virus aislados anteriormente de Musa spp. en Colombia, como el CMV (Castaño et al., 1994a y 1994b; Reichel et al., 1995a y 1995b; Reichel et al., 1996a; Belalcázar et al., 1996; Mariño, 1997; Escobar y Martínez, 1997; Martínez, 2002a), el virus del rayado del banano (Banana streak virus [BSV]) (Reichel et al., 1996b; Reichel et al., 1996c; Corpoica, 1996; Belalcázar et al., 1998), y el virus del mosaico atenuado del banano (Banana mild mosaic virus [BanMMV]) (Reichel, 2002; Martínez 2002a; Martínez et al., 2002b; Reichel et al., 2003 y 2004; Martínez, 2005). Esta investigación se realizó en el Laboratorio de Virología Vegetal del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), en Palmira (Colombia). AGRONOMIA 26-2 -PROFE194).indd 285 06/10/2008 19:40:59 286 Agron. Colomb. 26(2) 2008 Materiales y métodos Aislamiento del virus, IC-RT-PCR, clonación y secuenciación Se utilizó una hoja de M. coccinea como fuente del agente causal. Para amplifi car parte del gen de la cubierta proteica (CP) y la región 3’ no codifi cante, conocida en inglés como untranslated region (UTR), se utilizó el método de im- munocaptura, transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (IC-RT-PCR) (Sharman et al., 2000). La síntesis de ADNc se realizó según el método de Sharman et al. (2000), con leves modifi caciones. La mezcla del ADNc consistió de 30 pmol del iniciador degenerado Poty 1 (Gibbs y Mackenzie, 1997), 20 unidades (U) de RNaseOUT recombinant ribonuclease inhibitor (Gibco, BRL), 4 μL de MgCl2 25 mM, 2 μL de dNTPs 10 mM (Promega), 4 μL de DTT 100 mM (Gibco, BRL), 200 U de transcriptasa reversa Super Script II (Gibco, BRL) y ca. 3 U de E. coli RNase H, en un volumen fi nal de reacción de 40 μL. La mezcla de la PCR consistió de 2,5 μL de tampón 10X PCR, 2 mM MgCl2, 200 μM de cada dNTP (Invitrogen), 10 pmol del iniciador degenerado Poty1 (Gibbs y Mackenzie, 1997), 30 pmol del iniciador degenerado DCCP (5’-TAT- GCNGCNTTYGAYTTCTTRGAYG-3’), 1 U de polimerasa Taq (AmpliTaq DNA polymerase, Perkin Elmer), 2 μL del template de la síntesis del cDNA y agua destilada estéril, para un volumen fi nal de reacción de aproximadamente 25 μL. La PCR (Saiki et al., 1988) se realizó en un termoci- clador PTC-100 (MJ Research), con el siguiente programa: 94 °C/1 min; 94 °C/20 s; 56 °C/1 min; 72 °C/1 min; por 35 ciclos y un ciclo fi nal de 72 °C/3 min. El producto de la PCR se purifi có usando el kit Magic PCR DNA Purifi cation System (Promega), según las instruccio- nes del fabricante y luego se clonó en la cepa INVα F’ de E. coli, utilizando como vector el plásmido pCR 2.1 del kit TA Cloning (Invitrogen), según las instrucciones del fabri- cante. Las colonias de E. coli se establecieron en el medio selectivo Luria-Bertani-agar (Sambrook et al., 1989) con ampicilina, X-Gal y el inductor IPTG, para seleccionar los clones recombinantes. Se realizó una PCR con los iniciado- res M13 y T7, usando las colonias blancas, para identifi car las colonias que contenían el plásmido recombinante; los productos amplifi cados se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1%, usando bromuro de etidio. El ADN plasmídico se purifi có usando el kit Wizard Miniprep DNA Purifi cation Systems (Promega). Para determinar la presen- cia del inserto en el plásmido recombinante, se realizaron digestiones con la enzima de restricción EcoRI, usando 12 U de enzima (Promega) con 3 μL del ADN plasmídico purifi cado, en un volumen fi nal de reacción de 20 μL. Las digestiones se llevaron a cabo a 37 °C por cerca de 2 h en el tampón de restricción del fabricante. Los productos de FIGURA 1. Síntomas de rayado necrótico en hoja de Musa coccinea, proveniente de Antioquia (Colombia). TABLA 1. Porcentaje de identidad a nivel de aminoácidos entre la secuencia parcial de la cubierta proteica del potexvirus aislado de M. coccinea en Colombia, del Alstroemeria virus X [AlsVX, AB206396], Narcissus mosaic virus [NMV, AY225449], Lettuce virus X [AM745758] y Asparagus virus 3 [AV-3, AB304848], usando el programa DNAMAN. Virus M. coccinea potexvirus AlsVX NMV Lettuce virus X AV-3 M. coccinea potexvirus – AlsVX 50,00% (36/72) – NMV 48,61% (35/72) 88,00% (66/75) – Lettuce virus X 47,22% (34/72) 76,00% (57/75) 74,67% (56/75) – AV-3 44,44% (32/72) 81,33% (61/75) 86,67% (65/75) 72,00% (54/75) – AGRONOMIA 26-2 -PROFE194).indd 286 06/10/2008 19:41:01 Reichel, Cuervo y Morales. Caracterización parcial de un potexvirus de Musa coccinea... 287 las digestiones se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro de etidio. Se utilizó un secuenciador automático ABI Prism 377 DNA (Perkin-Elmer). Las secuencias obtenidas se analizaron con los programas Sequencher 4.0 (Gene Codes Corporation), BLAST (NCBI, NIH) y DNAMAN versión 5.2.10 (Lynnon BioSoft ). Se realizaron análisis comparativos de los alineamientos múltiples de las secuencias parciales de aminoácidos en- contradas en la región C-terminal de la CP del virus aislado de M. coccinea en Colombia con las correspondientes se- cuencias parciales de la CP de Alstroemeria virus X [AlsVX, AB206396] y del Narcissus mosaic virus [NMV, AY225449], Lettuce virus X [AM745758], Banana mild mosaic virus [BanMMV, AF314662], Cherry necrotic rusty mottle virus [CNRMV, NC_002468] y Citrus leaf blotch virus [CLBV, AJ318061], de la familia Flexiviridae (Adams et al., 2004; Fauquet et al., 2005; Martelli et al., 2007). Resultados y discusión Análisis moleculares Se amplifi có un fragmento de aproximadamente 377 pb (fi gura 2a, carril 1) y se obtuvo un plásmido recombinante en una colonia de E. coli mediante la PCR con el par de iniciadores (primers) M13 y T7 (fi gura 2b, carril 1). La digestión de ADN plasmídico recombinante con la en- zima de restricción Eco RI reveló la presencia del inserto (fi gura 2c). El análisis con el programa TBLASTX del fragmento ampli- fi cado mostró una identidad de secuencia de aminoácidos de 50%-57% con las CP de los potexvirus Alstroemeria virus X [AlsVX, AB206396], Narcissus mosaic virus [NMV, AY225449], Lettuce virus X [AM745758] y Asparagus virus 3 [AV-3, AB304848]. La región amplifi cada de la CP del potexvirus aislado de M. coccinea (localizada en la región 3’ terminal del ORF5), está formada por 220 nucleótidos, incluido el codón de termina- ción TGA. La composición parcial de la CP del potexvirus aislado de M. coccinea tiene la composición: 25,9% A; 33,6% C; 22,7% G; 17,3% de T y 0,5% de otros (fi gura 3). La secuencia parcial de 220 nucleótidos de la CP del potex- virus aislado de M. coccinea codifi ca para 72 aminoácidos (fi gura 4). En el análisis comparativo del alineamiento múltiple de las secuencias parciales de aminoácidos de la CP del potexvirus aislado de M. coccinea, con las correspondientes secuencias parciales del CP de AlsVX [AB206396], AV-3 [AB304848], NMV [AY225449], Lettuce virus X [AM745758], CNRMV [NC_002468] y BanMMV [AF31462], se observaron 11 aminoácidos conservados (fi gura 5). El motivo conservado TGG para una proteasa de treonina se encuentra en la CP de BanMMV (Gambley y Th omas, 2001) y de CNRMV, pero no, en el CP del potexvirus aislado de M. coccinea, AlsXV [AB206396], NMV ó AV-3. Del árbol de homología se concluye que las secuencias parciales de aminoácidos de la CP del potexvirus aislado de M. coccinea comparte más similitudes con la región correspondiente a la CP de AlsVX, NMV y Lettuce virus X ó AV-3 (fi gura 6). FIGURA 2. a) Carril 1: fragmento amplificado (ca. 377 bp) por IC-RT-PCR con el par de iniciadores DCC/Poty1 de un potexvirus aislado de Musa coccinea, procedente de Antioquia (Colombia); carril 2: marcador de peso molecular 1 Kb DNA Ladder (Gibco, BRL). b) Análisis electroforético, en un gel de agarosa al 1%, del producto de la PCR con los iniciadores M13 y T7. Carril 1: producto amplificado por la PCR, de una colonia de E. coli transformada con el inserto del potexvirus, aislado de M. coccinea; carril 2: marcador de peso molecular 1 Kb DNA Ladder (Gibco,BRL). c) Electroforesis de la digestión con EcoRI del plásmido recombinante ADN purificado, conteniendo el inserto de un potexvirus aislado de M. cocci- nea, proveniente de Antioquia (Colombia). Carril 1: clon recombinante que contiene un sitio de restricción para EcoRI; carril 2: marcador de peso molecular 1Kb DNA Ladder (Gibco, BRL). AGRONOMIA 26-2 -PROFE194).indd 287 06/10/2008 19:41:02 288 Agron. Colomb. 26(2) 2008 FIGURA 3. Composición de la secuencia parcial de la CP del potexvirus aislado de M. coccinea, procedente de Antioquia (Colombia). FIGURA 4. Traducción de la secuencia parcial de la CP del potexvirus aislado de M. coccinea, localizada en la parte terminal de la CP. FIGURA 5. Alineamiento múltiple de las secuencias parciales de aminoácidos del CP del potexvirus aislado de M. coccinea y las correspondientes regiones de la CP de NMV, AlsVX, AV-3, BanMMV, CNRMV y Lettuce virus X. Nivel de homología de 100% indicado por cajas negras y de >75% indicado por cajas grises. Un análisis comparativo, mediante alineamiento múlti- ple de las secuencias parciales de aminoácidos, de la CP del potexvirus aislado de M. coccinea con la correspon- diente región del AlsVX [AB206396], NMV [AY225449], Lettuce virus X [AM745758] y AV-3 [AB304848], reveló la presencia de 32 secuencias de aminoácidos totalmente conservadas y altos niveles de homología (>75%), indi- cando que las secuencias de aminoácidos de la CP del potexvirus aislado de M. coccinea en Colombia tiene muchas características en común con la CP de los potex- virus AlsVX, NMV y Lettuce virus X (figura 7). El motivo DF(F/L)(D/E)(G/A)VL(S/N) encontrado en la CP del potexvirus aislado de M. coccinea en Colombia, del AlsVX, NMV, AV-3 y Lettuce virus X es similar al encon- trado en la CP de otros virus fl exuosos de plantas (Gambley y Th omas, 2001, Henderson et al., 1992; Dolja et al., 1991, Rustici et al., 2000) y probablemente tiene una función en AGRONOMIA 26-2 -PROFE194).indd 288 06/10/2008 19:41:03 Reichel, Cuervo y Morales. Caracterización parcial de un potexvirus de Musa coccinea... 289 las interacciones del RNA con la CP (Rustici et al., 2000; Gentit et al., 2002). El análisis comparativo entre los aminoácidos de la secuen- cia parcial de la CP del potexvirus aislado de M. coccinea, AlsVX, NMV y AV-3 (tabla 1) mostró el valor más alto de porcentaje de identidad de aminoácido (88%) entre AlsVX y NMV. Un valor alto (50%) de porcentaje de identidad de aminoácidos se encontró entre la CP del potexvirus aislado de M. coccinea y la CP de AlsVX. Se realizó el alineamiento múltiple de secuencias de nucleó- tidos de la 3’UTR del potexvirus aislado de M. coccinea, con la 3’UTR del BanMMV [AF314662], usando el programa DNAMAN (fi gura 8). La región 3’UTR del potexvirus aislado de M. coccinea y la del BanMMV AF314662 difi eren en tamaño (140 nts y 77 nts, respectivamente) y en varias regiones que no son conservadas entre ellos. Sin embargo, se observan motivos conservados que pueden estar involucrados en funciones fundamentales de estos virus, como en la replicación. Un análisis comparativo del alineamiento múltiple de las secuencias de nucleótidos de la 3’UTR del potexvirus aislado de M. coccinea de Colombia con las de la 3’UTR de AlsVX [AB206396], reveló la presencia de 28 nucleótidos totalmente conservados (fi gura 9), que están involucrados probablemente en funciones de replicación. Las regiones 3’UTR del potexvirus aislado de M. coccinea y del AlsVX difi eren en tamaño (140 nts y 77 nts, respec- tivamente), y el análisis comparativo mostró variabilidad molecular en varias regiones de ellos. Este análisis compa- rativo de la 3’UTR del potexvirus aislado de M. coccinea con la 3’UTR del AlsVX muestra que estos dos virus difi eren signifi cativamente en esta región, lo que sugiere que el po- texvirus aislado de M. coccinea en Colombia es una nueva especie del género Potexvirus. Conclusiones Este estudio mostró que M. coccinea en Colombia es afectada por un potexvirus aparentemente nuevo, similar pero diferente al AlsVX y al NMV. Se propone el nombre de virus de la raya necrótica del banano escarlata (Scarlet banana necrotic streak virus [SBanNSV]) para este virus aislado de M. coccinea en Colombia. El impacto económico de este virus en especies de Musa cultivadas se desconoce. Se recomienda proseguir la caracterización molecular y biológica de este virus, para poder determinar su modo de transmisión, rango de hospederos, distribución geográfi ca, etc., con el fi n de tomar medidas de control adecuadas. FIGURA 6. Árbol de homología obtenido del alineamiento múltiple de secuencias de aminoácidos de secuencias parciales del potexvirus ais- lado de M. coccinea (M. coccinea potex en esta figura), NMV, AlsVX, AV-3, Lettuce virus X, CNRMV y BanMMV en esta figura. FIGURA 7. Alineamiento múltiple de las secuencias parciales de aminoácidos del CP del potexvirus aislado de M. coccinea (M. Coccinea Potex en esta figura), con la correspondiente región del AlsVX [AB206396], NMV [AY225449], Lettuce virus X [AM745758] y AV-3 [AB304848]. Nivel de homología de 100% indicado por cajas negras y de >75% indicado por cajas grises. AGRONOMIA 26-2 -PROFE194).indd 289 06/10/2008 19:41:04 290 Agron. Colomb. 26(2) 2008 Agradecimientos Este estudio fue fi nanciado por la Unidad de Virología Vegetal del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), de Palmira (Colombia), y por el Fondo Nacional de Fomento Hortofrutícola-Asohofrucol (Colombia). Literatura citada Adams, M.J., J.F. Antoniw, M. Bar-Joseph, A.A. Brunt, T. Can- dresse, G.D. Foster, G.P. Martelli, R.G. Milne y C.M. Fauquet. 2004. Th e new virus family Flexiviridae and assessment of molecular criteria for species demarcation. Arch. Virol. 149, 1045-1060. Belalcázar, S., M.I. Arcila, J.A. Valencia, H. Reichel y J. Narváez. 1996. Efecto del virus del mosaico del pepino (CMV) sobre los parámetros de crecimiento, desarrollo y producción del clon de banano Gros Michel. Revista Agrocambio 2(3) 34-39. Belalcázar, S., H. Reichel, R. Pérez, T. Gutiérrez, G. Múnera y E. Arévalo. 1998. Banana streak badnavirus infection in Musa plantations in Colombia. pp. 55-57. En: Frison, E. y S.L. Sha- rrock (eds). 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Alineamiento múltiple de la 3’ UTR del potexvirus aislado de M. coccinea y la 3’ UTR del AlsVX. Las cajas negras representan aminoá- cidos con 100% de homología. AGRONOMIA 26-2 -PROFE194).indd 290 06/10/2008 19:41:06 Reichel, Cuervo y Morales. Caracterización parcial de un potexvirus de Musa coccinea... 291 Cherr y green ring mottle virus. Arch. Virol. 147, 1033- 1042. Gibbs, A. y A. Mackenzie. 1997. A primer pair for amplifying part of the genome of all potyvirids by RT-PCR. J. Virol. Methods 63, 9-16. Henderson, J., M.J. Gibbs, M.L. Edwards, V.A. Clarke, K.A. Gard- ner y J.I. Cooper. 1992. Partial nucleotide sequence of poplar mosaic virus RNA confirms its classification as a carlavirus. J. Gen. Virol. 73, 1887-1890. Jones, D.R. 2000. Introduction to banana, abacá and ensete. En: Jones, D.R. (ed.). Diseases of banana, abacá and ensete. CABI, Londres, Wallingford (Reino Unido). Lins, S.R.O. y R.S.B. Coelho. 2004. 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