Agronomía Colombiana 25-1-2007.pdf Agron. Colomb. 25(1), 2007 26 La citogenética molecular y su aplicación en el estudio de los genomas vegetales Molecular cytogenetics in plant genome analysis Juan Carlos Herrera 1 1 Investigador científico II, Disciplina de Mejoramiento Genético y Biotecnología, Centro Nacional de Investigaciones del Café (CENICAFE), Chinchiná, Caldas. e-mail: juanc.herrera@cafedecolombia.com Resumen: La citogenética es la disciplina que es- tudia las implicaciones genéticas de la estructura y el comportamiento de los cromosomas. Durante las últimas dos décadas los estudios citogenéticos avan- zaron gracias a la información generada por métodos clásicos, los cuales permitieron establecer los prime- ros modelos citogenéticos en especies como tomate, trigo y arroz. Al final del siglo pasado los estudios ci- togenéticos mostraron un avance significativo gracias a la implementación de nuevas técnicas destinadas al análisis de cromosomas, tanto mitóticos como meióti- cos, entre las cuales se destacan el bandeo de cromo- somas y la hibridación in situ sobre cromosomas. Ac- tualmente, la mayoría de las técnicas de citogénetica molecular se basan en la tecnología de la hibridación in situ fluorescente o FISH (fluorescent in situ hybridization). Esta tecnología abrió la posibilidad de estudiar regio- nes específicas de la cromatina directamente sobre los cromosomas, gracias a la información derivada de la secuencia misma del ADN, y no solamente por sim- ples características morfológicas. Como consecuen- cia, la citogenética molecular ha adquirido una im- portancia cada vez mayor en los diferentes proyectos de mapeo genético que se adelantan actualmente. En la presente revisión se hace una descripción breve de la progresión que han tenido las técnicas de citoge- nética, desde la llamada ‘citogenética clásica’ hasta las técnicas actuales de alta resolución. Esta descrip- ción histórica es seguida de varios ejemplos concretos que ilustran la utilización de la FISH, no sólo en el mejoramiento genético de los cultivos, sino también en el estudio estructural y funcional de los genomas vegetales. Palabras clave: hibridación in situ, FISH, cromoso- mas, mejoramiento genético, mapa citogenético. Abstract: Cytogenetics would be defined as a disci- pline concerned with the genetic implications of chro- mosome structure and behavior. During past twenty years cytogenetics studies were carried out due to the information derived from classical methods based on chromosome deletions and translocations. As a result of such studies, the first cytogenetic models in such species as tomato, wheat, and rice were created. Sig- nificant advances in most plant cytogenetic systems have occurred in the last quarter of the 20 century with the introduction of chromosome banding, in situ hybridization, and other techniques for the analysis of somatic and meiotic chromosomes. Most of current cytogenetic protocols are based on the fluorescent in situ hybridization (FISH) technology. This DNA:DNA in situ method had opened a possibility to address chromatin regions of individual chromosomes on the basis of DNA sequence information in addition of mere morphological features. With genome ma- pping projects underway sequencing chromosomes and genomes, cytogenetic research had become more relevant. In this review, a historical perspective of chromosome research during the last 80 years is presented. It shows the progression of the ‘classical cytogenetics’ up to current ‘molecular cytogenetics’ founded on high resolution techniques such as FISH. The diversity of applications is illustrated through some practical examples of valuable current utiliza- tion of FISH-based methodologies in plant breeding programs, as well as in structural and functional ge- nomics. Key words: in situ hibridization, FISH, plant bree- ding, plant chromosomes, cytogenetic map. Fecha de recepción: 21 de noviembre de 2006 Aceptado para publicación: 06 de junio de 2007 Agronomía Colombiana 25(1), 26-35, 2007 Herrera: La citogenética molecular y su aplicación... 27 2007 Introducción EL TÉRMINO CITOGENÉTICA define en un sentido amplio aquella disciplina que trata sobre la estructura y el com- portamiento de los cromosomas, así como de las impli- caciones genéticas derivadas de su estudio (Gill y Frie- be, 1998). Los trabajos citogenéticos realizados en los últimos veinte años se han concentrado principalmente en el estudio de la estructura y evolución del genoma de diferentes especies vegetales, tanto silvestres como cultivadas. En estas últimas, la citogenética ha facilita- do grandemente el entendimiento de la organización y estructura de los genomas, de ahí la importancia que ha empezado a tener en los proyectos de mapeo genético que se adelantan actualmente en distintas especies. Los llamados mapas citogenéticos o cromosómicos constituyen una etapa intermedia entre los mapas físi- cos (basados en el ordenamiento secuencial de grandes fragmentos cromosómicos) y los mapas genéticos (de- rivados de los análisis genéticos o de ligamiento). La disponibilidad de un mapa citogénetico permite posi- cionar los genes, y los marcadores ligados a éstos, con respecto a los marcadores de tipo estructural propios de regiones cromosómicas específicas (por ejemplo, cen- trómeros, telómeros, constricciones secundarias). En consecuencia, una información citogenética detallada resulta indispensable para combinar de manera cohe- rente, la información genética disponible con la estruc- tura física de los cromosomas. Orígenes de la citogenética clásica La citogenética clásica propiamente dicha nació en los albores del siglo XX con los estudios sobre la estructura y comportamiento de los cromosomas del maíz, los cua- les dominaron una buena parte de las ciencias biológicas de la época (Longley, 1927; Randolph, 1941; Roman, 1947). Gracias a estos primeros resultados, hacia 1930 ya se contaba con mapas detallados de los cromosomas paquiténicos del maíz, donde cada cromosoma podía ser diferenciado con base en su tamaño, la posición del centrómero, el largo de sus cromátides y los patrones de coloración de la cromatina. Como resultado de ello, diferentes mapas citogéneticos estuvieron rápidamente a disposición de los genetistas, cada vez más interesa- dos en el estudio detallado del genoma. Dentro de los muchos estudios citogéneticos realizados cabe destacar las contribuciones pioneras de la Dra. Barbara McClin- tock al conocimiento de la dinámica de los ‘elementos móviles’ en los cromosomas del maíz (Jones, 2005). Años más tarde, Rick y colaboradores desarrollarían el primer sistema citogénetico para el tomate, basados en la información generada por los estudios sobre los cro- mosomas paquiténicos. Fue justamente este complejo sistema el que sirvió de base al grupo de Tanksley para la clonación del primer gen de resistencia sobre una es- pecie vegetal (Martin et al., 1993). Luego del descubrimiento en 1953 del código gené- tico por Watson y Crick, la mayor parte de los trabajos científicos en el área de la citogenética se orientaban a la descripción minuciosa de la forma y el número de cromosomas, así como a la caracterización detallada de las mutaciones. El rápido desarrollo de nuevas meto- dologías de tinción y manipulación de los cromosomas llevó sentar las bases para el gran desarrollo que habría de tener la citogenética en los años venideros. Fue por aquella época que se logró determinar el número exac- to de cromosomas del genoma humano (Tijo y Levan, 1956) e identificar las estructuras proteicas responsables del apareamiento cromosómico durante el proceso de división celular (Moses, 1968). La nueva era de la citogenética molecular Quince años debieron pasar antes que las llamadas ‘tecnologías del ADN’ hicieran irrupción en el área de la citogenética, dando comienzo a una revolución sin precedentes en el conocimiento de la ultraestructura y el funcionamiento de los cromosomas. Como producto de ello nació la citogenética molecular, una disciplina que podría definirse como la fusión entre la citogené- tica clásica y la biología molecular. En forma general, agrupa un conjunto de técnicas que aplican diferentes métodos de la biología molecular directamente sobre preparaciones citológicas tales como tejidos, células, cromosomas y fibras de ADN. El punto de partida de la citogenética molecular re- monta a los primeros experimentos de hibridación con sondas de ADN y de ARN marcadas radioactivamente (Jhon et al., 1969; Pardue y Gall, 1969). A pesar de la importancia de estos resultados, por aquella época la técnica per se no tendría el auge esperado por dos ra- zones fundamentales: a) la existencia de limitaciones técnicas relacionadas con la detección autoradiográfica de las sondas radioactivas, y b) la ausencia de protoco- los eficientes para la clonación de secuencias de interés. No obstante, una observación derivada de estos traba- Agron. Colomb. 25(1), 2007 28 jos daría comienzo a una importante innovación en el campo de la citogenética. En efecto, durante sus expe- rimentos, Pardue y Gall (1969) notaron una alteración en las propiedades de coloración de los cromosomas cuando éstos eran sometidos a condiciones de denatu- ración específica (por ejemplo, lisis alcalina y alta tem- peratura). Este hecho sugería que era posible obtener bandas específicas que a priori permitirían diferenciar individualmente los cromosomas. Un año después los trabajos de Caspersson et al. (1970) mostraron que al- gunos agentes fluorescentes como la quinacrina, permi- ten obtener patrones de bandas específicos cuando se fijaban sobre regiones cromosómicas ricas en guanina. Este tipo de bandeo diferencial, conocido como ‘bandas Q’, sirvió de base para la identificación completa de los cromosomas en humanos y más tarde en otras especies (Comings, 1978; Schweizer, 1980; Vosa, 1985). La verdadera revolución en el campo de la citogené- tica se dio en los últimos 15 años, particularmente en el área humana y animal. Las innovaciones técnicas en la microscopía confocal y epifluorescente, así como el desarrollo de componentes ópticos de excelentes carac- terísticas (lentes, filtros, captores), mejoraron de mane- ra decisiva el desempeño de los clásicos microscopios de luz transmitida. A estos cambios se sumó la imple- mentación progresiva de una amplia gama de métodos de hibridación con sondas fluorescentes, basadas en la utilización de una gran variedad de fluorocromos que abarcaban prácticamente toda la gama del espectro lu- minoso, desde el infrarrojo hasta el ultravioleta. En fin, el desarrollo de métodos rápidos y precisos para la mar- cación y detección de sondas, así como la utilización de software especializado para el tratamiento de imágenes, darían un gran empuje a las técnicas modernas basadas en la llamada hibridación in situ fluorescente o FISH (por fluorescent in situ hybridization) utilizadas en la investiga- ción médica y biológica actual. La hibridación in situ de alta resolución A diferencia de las técnicas citogenéticas convenciona- les, las técnicas FISH se basan en reacciones moleculares específicas entre el ADN cromosómico y otra secuen- cia cualquiera denominada ‘sonda’. El principio de la técnica FISH sobre cromosomas consiste en la hibrida- ción de sondas de ADN previamente marcadas con un fluorocromo específico directamente sobre el ADN cromosómico, aprovechando la homología existente en- tre éstas. Las sondas utilizadas pueden ser de dos tipos: secuencias repetitivas o secuencias únicas o de ‘copia simple’. Para la detección de tales sondas los prepara- dos cromosómicos se exponen a la luz ultravioleta, lo cual provoca la excitación de los electrones de la molé- cula fluorescente. Esta excitación se caracteriza por una emisión de rayos cuya longitud de onda varía según el tipo de fluorocromo empleado. Las principales venta- jas de esta técnica radica en su seguridad, su rapidez y, sobre todo, en su potencial para la identificación simul- tánea de diferentes sondas (Jiang y Gill, 1994; Heslop- Harrison y Schwarzacher, 1996; Lichter, 1997). Los primeros estudios de FISH en diferentes especies vegetales se orientaron principalmente al mapeo de se- cuencias repetitivas y de familias de multigenes (Jiang et al., 1996). Sin embargo, el rápido progreso de la téc- nica ha permitido optimizar cada una de las diferen- tes etapas, trayendo como consecuencia una mejora sustancial tanto en la sensibilidad como en el poder de resolución espacial, hasta el punto de permitir la detec- ción de secuencia únicas (Herrick y Bensimon, 1999). El término ‘sensibilidad’ designa el tamaño mínimo de una secuencia de ADN que puede ser detectada de ma- nera no ambigua bajo el microscopio. Por su parte, ‘la resolución espacial’ puede definirse como la distancia física mínima a la que dos secuencias adyacentes (en el ADN cromosómico) pueden ser identificadas bajo un microscopio de fluorescencia (De Jong et al., 1999). Los trabajos recientes que han usado la microscopía electrónica de barrido han permitido tener una visión más realista de la estructura de los cromosomas mitóti- cos de las plantas. De acuerdo con el modelo propuesto por Wanner et al. (2005), los cromosomas se estructuran en diferentes niveles de condensación, que van desde la fibra desnuda de ADN de apenas dos nanómetros (nm) hasta los llamados cromómeros, que corresponden a es- tructuras en bucle de 200 a 300 nanómetros (figura 1). Es el ‘super-enrollamiento’ de estos cromómeros lo que va a formar los brazos (o cromátidas) de los cromosomas. En la práctica, bajo condiciones óptimas de hibridación y de detección, la sensibilidad de la técnica FISH depende en buena parte de la accesibilidad de la sonda a la región ho- móloga sobre el ADN, la cual está determinada a su vez, por el grado de condensación del ADN cromosómico. En otras palabras, entre menos condensados se encuen- tren los cromosomas, la molécula de ADN estará menos enrollada y, en consecuencia, la accesibilidad de las son- das al ADN cromosómico será mejor (Van de Rijke et al., 2000). El grado de condensación de la cromatina varía Herrera: La citogenética molecular y su aplicación... 29 2007 de forma importante, no solamente entre las diferentes fases de la división celular (figura 2), sino también en- tre los diferentes tipos de configuración adoptada por el ADN cromosómico (tabla 1). El primer material utilizado para realizar análisis FISH fueron los cromosomas mitóticos en metafase. Este tipo de cromosomas se caracterizan por mantener su morfología básica, lo cual permite inferir de ma- nera general la ubicación de las sondas en el genoma. Sin embargo, la elevada condensación de la cromati- na que caracteriza la metafase reduce grandemente tanto la resolución como la sensibilidad obtenidas al utilizar este tipo de cromosomas. Ante tal limitante, la fijación de cromosomas mitóticos en estadios más tempranos (como la interfase) es una alternativa in- teresante dado el menor grado de condensación que presentan. Si bien la resolución mejora sensiblemen- te, la pérdida de la estructura cromosómica, a causa de la descondensación de la cromatina, impide la lo- calización precisa de la sonda respecto al cromosoma (De Jong et al., 1999). La utilización de cromosomas meióticos, y más exactamente en fase de paquiteno, ofrece dos ventajas importantes con respecto a los cromosomas mitóticos: a) son naturalmente menos condensados y, por tanto, de mayor longitud (hasta 40 veces más largos que los cromosomas mitóticos), lo cual mejora sensiblemente la resolución obtenida; y además b) muestran una diferenciación clara en- tre las regiones de eucromatina y heterocromatina que facilita la identificación de regiones específicas dentro de cromosomas individuales (Lavania, 2001; Cheng et al., 2002). A pesar de esto, la obtención de cromosomas paquiténicos sigue siendo difícil y tedio- sa, particularmente en lo que respecta a la obtención de los tejidos florales (por ejemplo, las anteras) y a la interpretación correcta de las diferentes fases del ciclo meiótico entre especies. Aunque el poder de resolución obtenido con los cro- mosomas paquiténicos es elevado (entre 10 5 y 10 6 ba- ses, según el tipo de cromatina), el mayor progreso en la detección de secuencias mediante la FISH se obtiene cuando se usan fibras desnudas de ADN, método cono- cido como ‘fiber-FISH’ (De Jong et al., 1999). Este método supone el aislamiento de los núcleos y la posterior libe- ración de las fibras de ADN, previa degradación de la matriz nuclear. Recientemente, Valàrik et al. (2004) pro- pusieron un método alternativo que se fundamenta en la preparación de cromosomas ‘super-extendidos’. Sin embargo, aunque ésta técnica ofrece elevados niveles de resolución, la necesidad de tener que aislar cromoso- mas individuales constituye una limitación mayor para una aplicación generalizada. Figura 1. Esquema de los diferentes niveles de condensación de la cromatina según el modelo de matriz dinámica (modifi- cado de Wanner et al., 2005). Figura 2. Microfotografías de cromosomas de café (Coffea arabica): a, b y c) diferentes fases de condensación de la cro- matina durante el ciclo mitótico; d) preparación de fibras de cromatina extendidas a partir de núcleos aislados de células somáticas de café. Línea blanca = 5 µm. Agron. Colomb. 25(1), 2007 30 Algunas aplicaciones de la FISH en el estudio de los genomas vegetales La adaptación de protocolos de FISH en un número cada vez más creciente de especies vegetales ha abier- to nuevas posibilidades para el estudio de los genomas vegetales permitiendo, entre otras cosas, los desarrollos siguientes: a) identificar cromosomas específicos, b) es- tudiar el origen y la estructura de los genomas híbridos, c) comparar regiones genómicas homologas, d) estudiar el comportamiento cromosómico, y e) localizar secuen- cias específicas de ADN (como por ejemplo, transposo- nes y otros fragmentos cromosómicos). A continuación se presentan ejemplos de algunas de estas aplicaciones. Identificación de cromosomas. La FISH, combina- da con otras técnicas como el bandeo de cromosomas, permite en algunos casos generar nuevos patrones de polimorfismo útiles en la identificación y caracteriza- ción de cromosomas (cariotipaje). Un ejemplo de esto es el trabajo de Schrader et al. (1997) en el girasol (He- lianthus annuus); estos autores combinaron la técnica de bandeo con Giemsa con la detección de genes específi- cos mediante la FISH con el fin de diferenciar cada uno de los cromosomas de ésta especie. En forma similar, Koo et al. (2004) utilizaron la hibridación in situ para caracterizar los cromosomas de una especie cultivada de colza (Brassica rapa). Combinando los patrones hete- rocromáticos producidos por la coloración fluorescente con DAPI (4’-6-diamino-2-fenilindol) y la presencia de secuencias repetitivas específicas, lograron construir un mapa citogenético completo. De otro lado, Andras et al. (2000) fueron capaces de obtener patrones diferen- ciales en cromosomas de diferentes especies vegetales, mediante la combinación de dos fluorocromos: el io- duro de propidio y el DAPI. En la figura 3 (a, b y c) se ilustran algunos ejemplos de la utilización de la FISH para la localización de secuencias repetitivas con el fin de diferenciar cromosomas de arroz, pino y maíz. Análisis del origen y estructura de genomas. La hibrida- ción genómica in situ (GISH, por genomic in situ hybridiza- tion) es una modificación de la FISH que permite colorear diferencialmente los cromosomas de distintos ancestros (en el caso de una especie) o de genomas parentales (en el caso de un híbrido). Esta técnica utiliza el ADN genó- mico total de uno de los ancestros (o especies parentales) como sonda, la cual se híbrida sobre los cromosomas me- tafásicos del individuo estudiado (ya sea una especie o un híbrido). Gracias a esta técnica ha sido posible clarificar el origen del genoma de algunas especies de interés, la mayoría de tipo alopoliploide como el tabaco (Kenton et al., 1993 ), el trigo (Mukai et al., 1993 ; Jiang y Gill, 1994), la avena (Jellen et al., 1994), el banano (D’Hont et al., 2000), el café (Lashermes et al., 1999), el maíz (Gon- zales et al., 2004), o la planta modelo, Arabidopsis (Ali et al., 2004). La figura 3 (d y e) muestran la utilización de la técnica GISH para diferenciar el origen de los cromo- somas en un híbrido hexaploide de trigo y en un híbrido intergenérico entre Lolium Festuca. Tabla 1. Resolución y sensibilidad estimadas para la técnica FISH según las diferentes configuraciones del ADN cromosómi- co (modificado de Valàrik et al., 2004). Configuración del ADN cromosómico Resolución espacial Sensibilidad Características Cromosomas mitóticos en metafase 5-10 Mb 10 Kb Baja sensibilidad y resolución espaciales. La cromatina se encuentra altamente condensada. Los cromosomas conservan sus características morfológicas. Cromosomas en interfase y/o profase temprana 100 Kb 10 Kb Buena sensibilidad y resolución espaciales debido a una baja condensación de la cromatina nuclear. Cromosomas aprisionados en el núcleo sin una separación clara. Identificación morfológica casi imposible. Cromosomas meióticos en paquiteno 60 a 120 Kb (en eucromatina) 0,14 a 1,2 Mb (en heterocromatina) 10 Kb Alta sensibilidad y resolución espacial. Cromosomas fuertemente decondensados. Características morfológicas reconocibles. Preparación laboriosa. Cromosomas mitóticos super-extendidos 69 Kb 1-2 Kb Alta sensibilidad y resolución espaciales. Cromosomas metafásicos estirados linealmente. Pérdida completa de la morfología cromosómica. Fibras de ADN 1-5 Kb 1 Kb Optima sensibilidad y resolución espaciales. Las fibras desnudas de ADN posibilitan la estimación de las distancias físicas mediante co-localización de marcadores adyacentes. 1 Kb = 10 3 ; 1 Mb = 10 6 . Herrera: La citogenética molecular y su aplicación... 31 2007 Figura 3. Algunos ejemplos de las aplicaciones de la técnica FISH en el estudio de los genomas vegetales: a) localización de sondas de ADN repetitivo (pSc119.2; pSc200 y pSc250) sobre cromosomas metafásicos de arroz; b) localización de secuencias de ADN ribosomal sobre cromosomas metáfasicos de pino, Pinus elliottii; c) ubicación de secuencias teloméricas y centroméricas sobre cromosomas paquiténicos de maíz; d y e) Discriminación del origen parental de los cromosomas en dos híbridos inter- específicos diferentes mediante GISH; f) fibras extendidas de ADN del arroz (tomado de: Schwarzacher y Heslop-Harrison, 2000; Puertas y Naranjo, 2005). Agron. Colomb. 25(1), 2007 32 La GISH también ha sido utilizada con éxito para el análi- sis de la introgresión en híbridos interespecíficos e intergené- ricos, aprovechando la diferencia estructural entre genomas y, particularmente, la presencia de secuencias genoma-espe- cíficas (para revisión ver Anamthawat-Jonsson, 2001). La or- ganización nuclear y el comportamiento de los cromosomas han sido también objeto de intensos estudios, no sólo sobre híbridos F1 (Anamthawat-Jonsson et al., 1993; Poggio et al., 1999) sino también, sobre genotipos avanzados (Schwarza- cher et al., 1992; Hou y Peffley, 2000; Ji et al., 2004). La GISH se ha revelado igualmente eficiente para localizar regiones cromosómicas portadoras de genes de resistencia (Tang et al., 1997). Estudios comparativos entre genomas. La FISH ha sido empleada para el análisis comparativo entre ge- nomas gracias a la técnica conocida como hibridización genómica comparativa o CGH (por comparative genome hybridization). Esta técnica, propuesta por Zoller y co- laboradores (2001), se basa en la utilización del ADN genómico de una especie patrón (por ejemplo, Arabidop- sis) que se usa como sonda para hibridizarlo sobre los cromosomas de otra especie. Esta hibridación cruzada genera una serie de bandas sobre los cromosomas de la especie estudiada, las cuales corresponden a regiones genómicas conservadas (por lo general, secuencias re- petitivas) entre las dos especies. La ventaja principal de la CGH es que permite ana- lizar el cariotipo de una especie dada con un enfoque molecular, sin necesidad de utilizar secuencias específicas que son difíciles de obtener. La utilización de Arabidopsis como especie patrón tiene la ventaja del acceso a la infor- mación genética completa, gracias a que todo su genoma ya ha sido enteramente secuenciado. Una modificación de la CGH es el mapeo comparativo in situ o ISCM (por in situ comparative mapping) el cual permite la co-localiza- ción de secuencias particularmente conservadas entre dos genomas. Este tipo de análisis ha sido utilizado para el estudio de la colinearidad entre genomas de diferentes especies, y en particular, de la estructura de los cromoso- mas homeólogos (Cabrera et al., 2002). Mapeamiento físico de secuencias de ADN. Dado que los extendidos de fibras de ADN dejan al des- cubierto la posición linear de las secuencias a lo largo de un fragmento cromosómico, la hibridación in situ sobre fibras de ADN o fiber-FISH permite localizar y ordenar secuencias específicas de interés (figura 3, f). De esta forma es posible obtener una imagen detallada e integral de la secuencia y de su colinearidad con los marcadores asociados a dicha región. Además, permite calcular la distancia física que las separa. El desarro- llo de la técnica de fiber-FISH ha sido una herramienta decisiva para el mapeo de regiones asociadas con dife- rentes enfermedades en el genoma humano (Herrick y Bensimon, 1999). Si bien la adaptación de esta técnica para el estudio del genoma de las plantas se encuentra actualmente restringido a unas pocas especies, los resul- tados obtenidos son prometedores. La localización de genes presentes en regiones telo- méricas o centroméricas es de particular interés para los estudios de mapeo genético en plantas. Sin embargo, el estudio genético de estas secuencias es generalmente una tarea difícil por la presencia de regiones ricas en hetero- cromatina, las cuales perturban la recombinación meió- tica. Ante las limitaciones del análisis genético, la técnica FISH ofrece una alternativa rápida y precisa para el estu- dio de este tipo de secuencias. La utilidad de la FISH sobre fibras de ADN para la localización de sondas de pequeña longitud (hasta 40 kilobases, kb) fue demostrada por pri- mera vez en el arroz (Jiang et al., 1995). El trabajo realizado por Zhong et al. (1999) es un ejemplo práctico de la utilización de la FISH en fibras de ADN para el estudio de genes de interés. Con base en la información genética disponible, los autores lograron ubicar físicamente los genes Mi y ApsI presentes en la región centromérica del cromosoma 6 del tomate, par- ticularmente rica en secuencias repetitivas. Gracias a la hibridación con sondas portadoras de secuencias liga- das a tales genes se logró establecer de manera precisa la distancia física entre estos dos genes. Otros estudios permitieron confirmar la importancia de esta técnica como una herramienta complementaria para la generación, y posterior verificación, de mapas físicos en especies como arroz y Arabidopsis (Zhang y Wing, 1997; Jackson et al.,1998). La fiber-FISH ha sido utilizada igualmente para el mapeo de fragmentos de ADN-T transferidos por transgénesis en plantas de papa (Wolters et al.,1998) y en la localización física de diferentes fragmentos cromosómicos estrechamente asociados con genes de resistencia (Xu et al., 2001). Limitaciones de la técnica FISH Como toda nueva tecnología, las técnicas basadas en la hibridación in situ traen consigo algunas limitacio- Herrera: La citogenética molecular y su aplicación... 33 2007 nes, las cuales deben tenerse en cuenta al momento de considerar su utilización. Algunos de los problemas más recurrentes en los experimentos de FISH en plantas tienen que ver con la sensibilidad de detección (deter- minada principalmente por el tamaño de las secuen- cias usadas como sonda), y con la especificidad de las sondas (dependiente de la homología genética entre genomas). Estos problemas parecen explicarse por las diferencias existentes respecto del tipo de secuencias (únicas o repetitivas) y de su distribución (localizada o generalizada) a lo largo de los genomas, tanto anima- les como vegetales. Contrariamente a lo que se observa en los cromoso- mas animales, los cromosomas de las plantas poseen un ADN con una proporción muy importante de se- cuencias repetitivas que se caracterizan por un equi- librio entre los nucleótidos adenina (A) y timina (T) respecto de la guanina (G) y la citocina (C), es decir, en la relación AT:GC. Tal equilibrio posiblemente ex- plica la extensa homogenización que han sufrido los cromosomas en los genomas vegetales como resulta- do de una frecuencia elevada de eventos de transpo- sición y/o conversión (Schwarzacher et al., 1997). En el caso de algunas especies alopoliploides (derivadas de un cruzamiento entre dos especies ancestrales) así como de ciertos híbridos interespecíficos, el uso de la FISH para discriminar genomas parentales no siempre resulta eficaz; ello por cuanto, si las secuencias repeti- tivas presentes en el ADN de cada uno de los padres son muy parecidas, o si tales secuencias parentales han sufrido una extensa homogeneización en el genoma del híbrido, la discriminación del origen de los cromo- somas se hace muy difícil, y en algunos casos, imposi- ble (Schubert et al., 2001). Finalmente, otro aspecto a tener en cuenta cuando se utiliza la FISH es la eventual variación en la respuesta con el tipo de tejido analiza- do (Murata et al., 1997). Por tanto, antes de proceder a una utilización extensiva de la FISH en un programa de mapeo físico, podría ser recomendable analizar la respuesta de diferentes tejidos a la hibridación con una prueba específica. Conclusiones y perspectivas Gracias al avance vertiginoso de la citogenética mo- lecular de alta resolución, hoy se dispone de un gran arsenal de herramientas destinadas al estudio estruc- tural y funcional de los genomas. El constante ade- lanto en la tecnología de los equipos de microscopía, así como el desarrollo de métodos de marcación y detección cada vez más sensibles, hacen presagiar un futuro promisorio para las técnicas de hibridación in situ sobre ADN en los campos de la genómica y la post-genómica. Dentro de las nuevas técnicas que se están aplican- do para la detección de secuencias en plantas, aquella conocida como PRINS (por primed in situ labeling) ofrece una elevada sensibilidad de detección respecto de la FISH convencional (Kubaláková et al., 2001). Esta téc- nica se basa en la hibridación de sondas no marcadas sobre el ADN cromosómico, seguida de una amplifica- ción enzimática vía PCR, en presencia de nucleótidos marcados con fluorescencia. De otro lado, la disponi- bilidad actual de una amplia gama de fluorocromos, permite la coloración simultánea de diferentes cromo- somas en un solo experimento de hibridación. Si bien esta técnica, llamada mcGISH (por multicolor GISH), ha sido ampliamente utilizada en el análisis del genoma humano y otras especies de mamíferos (Langer et al., 2004), su aplicación en plantas es aún limitada (Lysak et al., 2003). A estas nuevas metodologías se suma la posibilidad técnica de poder aislar cromosomas ente- ros o partes de un cromosoma con el fin de obtener librerías específicas de utilidad para el aislamiento de secuencias y genes de interés presentes sobre un cro- mosoma particular. La caracterización futura de los genomas animales y vegetales mediante las técnicas de citogenética mo- lecular va, sin duda, más allá de la simple genómica descriptiva. Un ejemplo de ello son algunos trabajos recientes que combinan el uso de técnicas de inmuno- citogenética y de citogenética molecular para el estudio de la arquitectura nuclear y de los procesos bioquími- cos implicados en la transcripción y la replicación del ADN (Tessadori et al., 2004). La utilización progresiva de todas estas tecnologías en los proyectos de genómica que se desarrollan actualmente en diferentes cultivos, servirá sin duda para mejorar nuestra comprensión so- bre la organización y la expresión de los genes, uno de los objetivos fundamentales de cualquier programa de mejoramiento genético. Agradecimientos El autor desea expresar sus agradecimientos a M. Ro- dier y F. Anthony por la lectura y sugerencias aportadas durante la escritura de este documento. Agron. Colomb. 25(1), 2007 34 Literatura citada Ali, H.B.M., M.A. Lysak e I. Schubert. 2004. 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