Agronomía 24-2i.indd Agronomía Colombiana 24(2): 207-213, 2006 FITOMEJORAMIENTO, RECURSOS GENÉTICOS Y BIOLOGÍA MOLECUL AR Protocolo para la micropropagación de Furcraea macrophylla Baker Micropropagation protocol for Furcraea macrophylla Baker María A. Martínez1 y José C. Pacheco2 Abstract: To the genus Furcraea belong textile spe- cies of great importance for the national and in- ternational markets, so much for the characteristics of their fiber as for the content of precursors of hormones, corticoides, sugars, fatty acids, biopes- ticides, and many other products in their juices. In this research, a protocol was developed for mi- cropropagation of Furcraea macrophylla B., starting from shoots apex from bulbils. The in vitro cultures were carried out in modified MS and supplemented with BA, TDZ, KIN and 2-IP alone or in combination with 2.69 µM NAA. After 12 weeks of initiation the cultures, in most of the achieved treatments, the explants developed axillary shoots. One hundred percent produced shoots rooted after 30 days in modified MS medium supplemented with 11.42 µM IAA, or with 2.46 µM IBA, or without growth regula- tors. After the hardening stage, 94% of the plantlets survived under ex vitro conditions. The established protocol for micropropagation of F. macrophylla is an effective procedure to supply the commercial demand of selected plant material, with good phy- tosanitary conditions, in relatively short periods and at low cost. Additional key words: Agavaceae, axillary shoots, growth regulators, furcraea Resumen: Del género Furcraea hacen parte especies textiles de gran importancia en los mercados nacio- nales e internacionales, tanto por las características de la fibra como por el contenido de precursores de hormonas, corticoides, azúcares, ácidos grasos y biopesticidas que se encuentran en sus jugos. En esta investigación se desarrolló un protocolo para la micropropagación de Furcraea macrophylla B. a partir de ápices caulinares procedentes de bulbillos. Los cultivos in vitro se realizaron en medio MS modifica- do y suplementado con BA, TDZ, KIN y 2-IP en forma individual o en combinación con 2,69 µM de ANA. Después de 12 semanas de iniciados los cultivos, en la mayoría de los tratamientos ensayados los explan- tes desarrollaron brotes axilares. 100% de los brotes producidos enraizaron después de 30 d en medio MS modificado suplementado con 11,42 µM de AIA, con 2,46 µM de AIB o en ausencia de reguladores de creci- miento. Después de la etapa de endurecimiento, 94% de las plántulas sobrevivieron en condiciones ex vitro. El protocolo establecido para la micropropagación de F. macrophylla es un procedimiento efectivo con el que se podría suplir la demanda comercial de material ve- getal seleccionado, en óptimo estado fitosanitario, en periodos relativamente cortos y a bajos costos. Palabras clave adicionales: Agavaceae, brotes axilares, reguladores de crecimiento, fique Fecha de recepción: 04 de mayo de 2006 Aceptado para publicación: 30 de noviembre de 2006 1 Bióloga, Escuela de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia (UPTC), Tunja. e-mail: maramca79@yahoo.com 2 Profesor titular, Escuela de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias, Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia (UPTC), Tunja. e-mail: jopach@hotmail.com Introducción LA FAMILIA AGAVACEA COMPRENDE 18 géneros y 600 es- pecies propias de zonas tropicales y subtropicales, per- fectamente adaptadas para sobrevivir en condiciones semidesérticas. Varias de estas especies son de interés económico por su valor ornamental o por ser fuente de productos de interés (Devesa, 1997). Los géneros Agave y Furcraea son los más representativos de la familia Aga- vacea. Los ágaves comprenden plantas textiles, como el Agronomía Colombiana 208 Vol. 24 · No. 2 sisal (A. sisalana) y el henequén (A. fourcroydes); ornamen- tales (A. victoria-reginae) y para producción de bebidas (A. tequilana). Las furcraeas comprenden plantas textiles, como borde de oro (F. castilla), uña de águila (F. macro- phylla) y cenizo (F. cabuya), entre otras. En Colombia se conoce con el nombre de fique a las plantas que pertenecen al género Furcraea, que com- prende aproximadamente 20 especies, algunas de ellas utilizadas para extraer de sus hojas la fibra textil co- nocida como cabuya. De la planta sólo se aprovecha 4% de la hoja, que corresponde a la fibra; el 96% res- tante son jugos y fibras cortas. Este bajo porcentaje de aprovechamiento de las plantas hace que los cultivos no sean rentables, razón por la que las plantaciones fueron abandonadas y/o erradicadas en décadas ante- riores. Sin embargo, las investigaciones realizadas en los últimos años han creado nuevas expectativas para el aprovechamiento integral de la planta. En su jugo se han encontrado, entre otros compuestos, precursores de productos hormonales, corticoides, ácidos grasos, azúcares, sulfatos y sustancias con actividad biopesti- cida (MAVDT et al., 2002). Además, tanto la fibra larga como la fibra corta son materia prima para la indus- tria y la artesanía. Pero, a pesar de estas expectativas, el aprovechamiento integral del fique a gran escala enfrenta la falta de genotipos seleccionados y de mate- rial vegetativo suficiente para la renovación y estable- cimiento de nuevas plantaciones. El fique es una planta monocotiledónea, de creci- miento lento, con un ciclo de vida largo (aproximada- mente, 20 años), florece sólo una vez hacia el final de su ciclo de vida y raramente produce semillas fértiles. Por tanto, el mejoramiento y la propagación sexual presentan serias dificultades. La propagación ocurre principalmente a través de bulbillos, que son yemas epígeas o axilares de la inflorescencia que se producen en el maguey (flor), y a través de hijuelos que crecen en el tronco de la planta. Para la propagación in vitro de agaváceas, se han aplicado diferentes técnicas de cultivo, utilizando seg- mentos caulinares y foliares, bulbillos, semillas, callos, meristemos, yemas, embriones zigóticos (tabla 1). La mayoría de estas técnicas se ha enfocado a la multipli- cación masiva a través de brotes adventicios y/o axi- lares y la producción de embriones somáticos. Se ha reportado: organogénesis directa e indirecta para di- versas especies, como A. arizonica (Powers y Backhaus, 1989) y A. fourcroydes (Muñoz et al., 2004; Eastmond et al., 2000; Madrigal et al., 1989; Robert et al., 1987), A. sisalana (Binh et al., 1990), Agave sp. (Groenewald et al., 1977) y A. tequilana (Castro et al., 1990); proliferación de brotes directamente del explante original, para A. fourcroydes (Robert et al., 1987), A. sisalana (Das, 1992) y A. schidigera (Rodríguez et al., 1996a); proliferación de brotes adventicios a partir de callos, en A. sisalana (Ha- zra et al., 2002; Nikam, 1997) y A. cocui (Yépez et al., 2004); proliferación por brotes axilares en A. parrasana (Santacruz et al., 1999); embriogénesis somática en es- pecies ornamentales, como A. victoria-reginae (Martínez et al., 2003; Rodríguez et al., 1996b) y especies texti- les, como A. sisalana (Nikam et al., 2003) y A. fourcroydes (González et al., 2001). En especies del género Furcraea no se han encontra- do reportes sobre manipulación in vitro de tejidos. En esta investigación se desarrolló un protocolo para mi- cropropagación de F. macropylla B. a través de brotes axilares, utilizando como explantes primarios ápices caulinares extraídos de bulbillos procedentes de plan- tas seleccionadas. Materiales y métodos3 Material vegetal Se seleccionaron plantas madre de 15-20 años, con ho- jas productivas de 3 m, inflorescencia vigorosa con una producción de hasta 3.000 bulbillos. Los bulbillos utili- zados como fuente de explantes primarios se seleccio- naron teniendo en cuenta un tamaño uniforme, de 10 a 12 cm de longitud y 3 cm de diámetro basal. A los bulbillos seleccionados se les eliminaron las ho- jas de color verde, conservando la pequeña porción caulinar para facilitar la manipulación; la desinfección superficial se realizó en cámara de flujo laminar, así: inmersión en agua destilada estéril más Tween 20 (0,5 mL por 100 mL) durante 10 min, con agitación con- tinua; inmersión en alcohol al 70% durante 1 min y en hipoclorito de Ca (Ca(OCl) 2 , 5-10%) durante 25 min; finalmente se enjuagaron 4 veces consecutivas, 3 min cada una, con agua destilada estéril. La escisión de los ápices caulinares se realizó con ayuda de bisturí 3 Abreviaturas: BA, 6-bencilaminopurina; KIN, 6-furfuril-aminopurina; TDZ, N-fenil N’-1,2,3-tidiazol-5-il úrea; 2-IP, 2-isopentenil adenina; ANA, ácido naftalenacético; AIA, ácido 3-indol-acético; AIB, ácido 3-indol-butírico y MS, medio de Murashige y Skoog (1962). Martínez y Pacheco: Protocolo para la micropropagación... 2092006 Tabla 1. Algunos estudios in vitro realizados en agaváceas. Especie Tipo de explante Medio y/o reguladores de crecimiento Resultados Referencia Agave sp. Segmentos de tallo de bulbillos Inducción: LS + 14,76 µM IBA Proliferación: LS + 1,71 µM AIA + 4,65µM KIN Callo, brotes adventicios Madrigal et al., 1989 A. arizonica Segmentos basales de hojas in vitro Inducción: LS+ 0,3 mg · L-1 2,4-D Regeneración: MS + piridoxina-HCL 0,5 µM + tirosina 100 mg/L + BA 10 mg · L-1 + ANA 0,09-1,0 mg · L-1 + adenina 80 mg · L-1 Callos, regeneración de brotes Powers y Backhaus, 1989 A. sisalana Segmentos de tallo de brotes in vitro MS + 20 g · L-1 sacarosa, 10% agua de coco, 0,075 mg · L-1 ANA, 0,49 µM IBA y 2,32 µM KIN Múltiples brotes, callo, plántulas enraizadas Binh et al., 1990 A. sisalana Segmentos de tallo, bulbillos y rizomas MS; SH; Gamborg y White + AIA; ANA; 2,4-D, KIN y BA (0,44 a 28,54 µM) Callos, múltiples brotes y regeneración de plántulas Nikam, 1997 A. sisalana Segmentos de hojas in vitro MS + 1.000 mg · L-1 CH + BA (8,9-44,0 µM) Transferencia a MS ½ + BA 8,9 µM Callos, proliferación brotes adventicios Hazra, 2002 A. sisalana Brotes in vitro MS + 4,65-9,29 µM KIN ó 0,88-2,22 µM BA + 0,90-2,26 µM 2,4-D Embriogénesis somática Nikam et al., 2003 A. parrasana Semilla MS + vitaminas L2 + 30 g · L-1 sacarosa, 2,4-D (0,0 a 0,04 µM) + BA (26,6; 39,9 y 53,2µM) Proliferación brotes axilares Santacruz et al., 1999 A. victoria- reginae Segmentos de hojas in vitro MS + vitaminas L2 + 30 g · L-1 sacarosa + 2,4-D 1,4 µM Embriogénesis somática indirecta Rodríguez et al., 1996 A. victoria- reginae Segmentos de tallo de plántulas MS + 2,26 µM 2,4-D Callos embriogénicos, embriogénesis somática Martínez et al., 2003 A. cocui Segmentos de hojas in vitro Inducción callo organogénico: MS + 4,52 µM 2,4-D + 4,44 µM BA Organogénesis: BA 44,38 µM Callos, organogénesis indirecta Yépez et al., 2004 A. fourcroydes Yemas apicales de bulbillos Knudson y MS + 13,31 µM BA KM + 0,46 µM KIN + 32,22 µM ANA Proliferación brotes axilares, callos organogénicos Muñoz et al., 2004 A. fourcroydes Meristemos apicales de plantas seleccionadas Inducción de callo, MS modificado + 0,011 µM 2,4-D+ 4,44 µM de BA Embriogénesis:2,4-D (12,65; 25,5; 102,24 µM ) + 2,32 µM KIN Embriogénesis somática González et al., 2001 BA, 6-bencilaminopurina; KIN, 6-furfuril-aminopurina; TDZ, N-fenil N’-1,2,3-tidiazol-5-il úrea; 2-iP, 2-isopentenil adenina; ANA, ácido naftalenacético; AIA, ácido 3-indol-acético; AIB, ácido 3-indol-butírico y MS, medio de Murashige y Skoog (1962). y estereoscopio, eliminando progresivamente las hojas en desarrollo. Los ápices caulinares escindidos, con un tamaño de 0,7 a 1,0 cm (figura 1a), comprenden el meristemo, los primordios foliares y las primeras hojas en desarrollo. Inducción y proliferación de brotes axilares Para inducir la formación de yemas y promover el de- sarrollo de brotes axilares, los ápices caulinares se cul- tivaron en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) con macroelementos y Fe-EDTA disminuidos a la mitad de la concentración original, suplementado con BA (13,31 ó 22,19 µM), 2-IP (24,61 ó 34,4 µM), KIN (32,52 ó 46,47 µM) ó TDZ (0,045, 0,225 ó 0,45 µM) en combinación con 2,69 µM de ANA. Los explantes se mantuvieron en los mismos medios durante 180 d, transfiriéndolos a medio fresco cada 45 d. Para el establecimiento de cadenas proliferativas, después de la tercera transfe- rencia, los brotes de longitud ≥ 1,5 cm se individuali- zaron y subcultivaron en los mismos medios utilizados durante la etapa de inducción. Esta última etapa se repitió cada 60 d. Enraizamiento de brotes axilares Para estimular la formación de raíces, se cultivaron bro- tes de longitud ≥ 3 cm durante 4 semanas en el mismo medio utilizado para inducción y proliferación de brotes, al que se le adicionó 20 g· L-1 de sacarosa y se suplementó o no con 11,42 µM de AIA ó 2,46 µM de AIB. Condiciones generales de cultivo A todos los medios utilizados se les ajustó el pH a 5,7 con HCl (0,1 N) ó KOH (0,1 N), se solidificaron con 7,5 g· L-1 de agar y se esterilizaron en autoclave a 121 ºC y 1 kg· cm-2 de presión durante 20 min. Los explantes se cultivaron en recipientes de vidrio de 5 y 50 mL con alícuotas de 3 y 25 mL de medio para las etapas de in- ducción y multiplicación, respectivamente. Los cultivos se incubaron a 25 ± 1 ºC y con fotoperíodo de 16 h suministrado por lámparas Silvana de 75 W. Aclimatización Los brotes enraizados se extrajeron de los recipientes de cultivo, se les eliminó el agar adherido a las raíces y se Agronomía Colombiana 210 Vol. 24 · No. 2 x BP = x brotes axilares por explante · % explantes que forman brotes 100 En cada tratamiento se cultivaron 20 unidades expe- rimentales y cada tratamiento se repitió 2 veces. Resultados y discusión Los procesos organogénicos relacionados con neoforma- ción de meristemos axilares, así como con su desarrollo, pueden ser suprimidos o retardados mientras los meris- temos apicales estén activos. La inducción, crecimiento, desarrollo y proliferación de brotes axilares son, por lo ge- neral procesos promovidos por la incorporación de regu- ladores de crecimiento al medio de cultivo; comúnmente, las citoquininas suprimen la dominancia del meristemo apical y promueven la formación de brotes axilares. Las citoquininas influyen sobre el desarrollo y fisio- logía de los vegetales, incluyendo germinación de se- sumergieron en una solución fungicida de Benlate® (1,0 g· L-1); luego se sembraron en vasos plásticos de 200 mL que contenían un sustrato estéril preparado con casca- rilla de arroz, tierra y arena en proporción 2:1:1. Las plántulas se mantuvieron en invernadero en módulos cubiertos con plástico durante 15 d y, posteriormente, en módulos descubiertos durante 20 d. Análisis estadístico Los datos obtenidos se analizaron aplicando análisis de varianza (Anova) y la prueba F, utilizando el programa SPSS Windows versión 11.5 (SPSS Inc.). Cuando el Anova indicó diferencias entre las medias de los tratamientos, se aplicó la prueba DHS (diferencia honestamente sig- nificativa) de Tukey para determinar los tratamientos que presentaron diferencias significativas. Para establecer la efectividad de los tratamientos en- sayados durante dos ciclos de proliferación, la media de brotes por explante se estimó mediante la relación: Figura 1. Micropropagación de F. macrophylla B.: a) ápice caulinar utilizado como explante primario; b) brotes axilares forma- dos después de 60 d de iniciados los cultivos; c) brotes axilares múltiples desarrollados después de 120 d de cultivo en medio MS modificado suplementado con 35,52 µM de KIN más 2,69 µM de ANA; d) brotes axilares elongados después de 180 d de cultivo; e) brote enraizado, después de 30 d de cultivo en MS modificado, suplementado con 11,42 µM de AIA y f) plántula aclimatizada, después de 30 d en condiciones ex vitro. Martínez y Pacheco: Protocolo para la micropropagación... 2112006 millas, control de la dominancia apical, interacción planta-patógeno, desarrollo de flores y frutos y senes- cencia de hojas, entre otros. Estos procesos también son influenciados por otros estímulos –como la luz y otros fitorreguladores–, y los resultados fisiológicos y de desa- rrollo reflejan respuestas altamente dependientes de ta- les estímulos (Shimizu y Mori, 2001; Haberer y Kieber, 2002). Se ha observado que cultivos de callos indiferen- ciados de zanahoria forman brotes o raíces, dependien- do de la cantidad relativa de citoquininas a auxinas en el medio de cultivo, y que la proporción –más que la cantidad absoluta– de esas dos hormonas determina la respuesta (Skoog y Miller, 1957). Según George (1996), una proporción auxina-citoquinina balanceada mantie- ne las células en un estado indiferenciado, mientras que una proporción alta de citoquinina a auxina promueve el desarrollo de brotes y una proporción baja promueve el desarrollo de raíces. En esta investigación, 72-98% de los ápices caulinares inducidos in vitro en presencia de las diferentes concen- traciones de BA, KIN y 2-IP, combinadas con ANA, fueron viables y la formación de brotes axilares fue evidente des- pués de 8 semanas de cultivo (figuras 1a-d). Esta respues- ta concuerda con las obtenidas en cultivos in vitro de otras agaváceas, como A. arizonica (Powers y Backhaus, 1989), A. cantala (Binh et al., 1987), A. fourcroydes (Robert et al., 1996) y A. victoria-reginae (Rodríguez et al., 1996b), en las que un requerimiento de concentraciones moderadas a bajas de 2,4-D, IBA ó ANA, en combinación con una cito- quinina, fue efectivo para inducir procesos organogéni- cos conducentes a la formación de brotes. Sin embargo, en otras agaváceas, como A. sisalana (Das, 1992) y A. pa- rrasana (Santacruz et al., 1999), la proliferación de brotes fue inducida en presencia de citoquininas sin requerirse la adición de auxinas al medio de cultivo. En los cultivos in vitro de ápices caulinares de F. macro- phylla B., la presencia de BA, KIN, 2-iP ó TDZ en combina- ción con 0,5 mg· L-1 de ANA en el medio de cultivo afectó el porcentaje de explantes que formaron brotes axilares y, por ende, la media de brotes por explante (x) (tabla 2). Los porcentajes de ápices caulinares que formaron brotes axilares fueron más elevados cuando se cultivaron en medio suplementado con KIN en concentraciones de 46,47 µM (98%) y de 32,52 µM (95%). En los cultivos de explantes realizados en medio con BA (13,31 y 22,19 µM) y con 2-iP (24,61 y 34,4 µM) en combinación con ANA se cuantificó 73-81% de explantes con brotes axilares. En los ápices caulinares cultivados en los medios con TDZ (0,225 y 0,45 µM) se cuantificaron los porcentajes más bajos Tabla 2. Efecto del BA, KIN, 2-iP y TDZ en presencia de 2,69 µM de ANA sobre la proliferación y desarrollo de brotes axila- res, a partir de ápices caulinares de F. macrophylla. Tratamientos (µM) Explantes con brotes axilares (%) Brotes por explante (x ) Longitud x brotes (cm) BA 13,31 72 ± 0,71c 4,18 ± 0,31b 3,6 ± 0,3bc BA 22,19 74± 2,12c 4,27 ± 0,33b 3,5 ± 0,1b KIN 32,52 98 ±3,54d 6,63 ± 0,24c 4,5 ± 0,4d KIN 46,47 95 ± 1,41d 7,08 ± 0,50c 4,3 ± 0,1cd 2-iP 24,61 81 ± 1,41cd 3,64 ± 0,28b 4,4 ± 0,1cd 2-iP 34,4 73 ± 3,54c 3,8 ± 0,07b 4,9 ± 0,07d TDZ 0,045 0a 0a 0a TDZ 0,225 24± 5ab 0,60± 0,14a 3,1 ± 0,14b TDZ 0,45 9 ± 12b 0,17 ± 0,24a 3,6 ± 0,14b Promedios con una misma letra no difieren estadísticamente, según prueba de Tukey (P = 0,05). BA, 6-bencilaminopurina; KIN, 6-furfuril-aminopurina; TDZ, N-fenil N’-1,2,3-tidiazol-5-il úrea; 2-iP, 2-isopentenil adenina. (24% y 9%) de explantes que formaron brotes axilares. Sin embargo, el TDZ promovió en cada ápice caulinar el desarrollo de un brote con 3 a 4 hojas de longitud mayor a 10 cm. En cambio, en cultivos de ápices tomados de brotes de Yucca aloifolia L, otra agávacea, se ha registrado un alto número de brotes (brotes por explante, 6,6), en cultivos realizados en medio suplementado con 4,5 µM de TDZ combinado con 1,1 µM de ANA (Atta-Alla y Van Staden, 1997). Mediante análisis de varianza aplicado a los datos de brotes producidos (x BP) en los cultivos de ápices cauli- nares en presencia de las citoquininas combinadas con ANA, se establecieron diferencias significativas entre los tratamientos (Fc: 193,415; Ft: 3,23; α = 0,05), presen- tándose el valor más alto en los cultivos suplementados con KIN 46,47 µM (x BP = 7,08) y 32,52 µM (6,63); valo- res medios se registraron en presencia de BA 13,31 µM (4,18) y 22,19 µM (4,27), 2-IP 24,61 µM (3,64) y 34,4 µM (3,8). En contraste, en los tratamientos en que se adicionó al medio de cultivo TDZ combinado con ANA, la producción de brotes por explante fue inferior a 1. En otras especies de agaváceas se han reportado medias de brotes por explante significativamente más elevadas; en cultivo de brotes axilares de A. parrasana (Santacruz et al., 1999), la media de brotes por explante fue de 25,5 a 23,8 en MS suplementado con 2,4-D (0 a 0,04 µM) en combinación con BA (13.3; 26,6; 39,9 y 53,2 µM); mien- tras que en cultivos de callos organogénicos de A. sisala- na (Nikam, 1997) en MS suplementado con 0,5 mg· L-1 de KIN se reportó una media de 27,7 brotes por explan- Agronomía Colombiana 212 Vol. 24 · No. 2 te. En cuanto al tamaño de los brotes producidos en la diferentes tratamientos realizados en esta investigación, la mayor longitud promedio (4,3-4,9 cm) la presentaron los brotes cultivados en presencia de KIN y 2IP, mientras que en presencia de BA y TDZ los brotes alcanzaron 3,1 a 3,6 cm de longitud. Enraizamiento Entre 90% y 100% de los brotes desarrollados (longi- tud ≥ 3 cm) enraizaron después de 15 a 30 d de cul- tivo en medio suplementado con AIA (figura 1e) o AIB, o en medio sin auxinas. El AIA en el medio de cultivo fue más efectivo (100%) para inducción y desarrollo radicular que el AIB (92%) y que el medio sin auxinas (90%). Aunque en todos los tratamientos ensayados se cuantificaron altos porcentajes de brotes enraiza- dos, la diferencia más notoria entre ellos fue el me- nor tiempo que requirieron para enraizar los brotes cultivados en presencia de auxinas, comparado con el tiempo requerido por aquellos cultivados en ausen- cia de ellas (tabla 3). En este sentido, Villalobos et al. (1991) y Yépez et al. (2004) han reportado que bro- tes de A. atroviensis y A. cocui, respectivamente, pueden enraizar cultivándolos en medio sin auxinas, aunque la formación y desarrollo radicular puede estimularse más rápidamente si los brotes se cultivan en medio con sales diluidas al 50% y suplementado con 2,46 µM de AIB. Resultados semejantes reportaron Santacruz et al. (1999), quienes indujeron enraizamiento de brotes de A. parrasana en medio sin auxinas o suplementado con 9,8-39,2 µM de AIB, sin observar diferencias sig- nificativas entre los tratamientos. Además, Hazra et al. (2002) reportaron enraizamiento de brotes de A. sisalana 20-25 d después de iniciado el cultivo en MS suplementado con 11,42 µM de AIA. En otras especies de agávaceas, como A. arizonica (Powers y Backhaus, 1989), A. cantala, A. furcroydes (Binh et al., 1990), A. si- salana (Binh et al., 1990; Das, 1992), el cultivo de los brotes en medio basal fue suficiente para estimular la formación y el desarrollo de raíces. Aclimatización En condiciones de invernadero, la disminución pro- gresiva de la humedad relativa y el incremento de la intensidad de luz, así como la siembra en un sustrato compuesto por cascarilla de arroz molida, arena de río y tierra en proporción 1:1:1, fueron condiciones físicas favorables para el proceso de aclimatización de plántu- las, obteniéndose después de 30 d de iniciado 94% de plántulas viables con apariencia normal y crecimiento activo (figura 1f). Conclusión El proceso de micropropagación de F. macrophylla, a par- tir de ápices caulinares procedentes de bulbillos hasta regenerar y endurecer plántulas, implica un periodo de 8 meses; posteriormente, cada ciclo proliferativo se de- sarrolla en 60 d. Este protocolo puede aplicarse para selección in vitro de materiales élites y para su propaga- ción en gran escala. Agradecimientos Los autores expresan sus agradecimientos al Convenio del Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Cien- cia y la Tecnología ‘Francisco José de Caldas’ (Colcien- cias) y el Banco Interamericano de Desarrollo (Bid) y a la Dirección de Investigaciones de la Universidad Peda- gógica y Tecnológica de Colombia (UPTC) por el aporte económico asignado para el desarrollo de este trabajo. A los integrantes del grupo de investigación Bioplas- ma-UPTC, a la Cadena Productiva del Fique Regional Boyacá y a la Cadena Productiva Nacional del Fique (Cadefique), por su interés en la realización de esta in- vestigación, así como a todos los cultivadores de fique que suministraron el material vegetal utilizado en ella. Literatura citada Atta-Alla, H. y Van Staden. 1997. Micropropagation and establish- ment of Yucca aloifolia. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 48, 209-212. Binh, L.T., L.T. Muoi, H.T.K. Oanh, T.D. Thang y D.T. Pong. 1990. Rapid propagation of agave by in vitro tissue culture. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 23, 67-70. Castro, C.L., V.M. Loyola, J.L. Chan y M.L. Robert. 1990. Gluta- mate dehydrogenase activity in normal and vitrified plants of Agave tequilana Weber propagated in vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 22, 147-151. Das, T. 1992. Micropropagation of Agave sisalana. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 31, 253-255. Devesa, J. 1997. Plantas con semillas, familia Agavaceae. En: Izco, J., E. Barreno, M. Costa y J. Devesa (eds.). Botánica. Interameri- cana McGraw-Hill, España. 781 p. Tabla 3. Enraizamiento de brotes de F. macrophylla cultivados en MS suplementado o no con AIA y AIB. Tratamiento (µM) Brotes enraizados (%) 15 d 30 d AIA 11,42 95 100 AIB 2,46 83 92 Sin RC 50 90 Martínez y Pacheco: Protocolo para la micropropagación... 2132006 Eastmond, A., J.L. Herrera y M.L. Robert. 2000. Contribución a la biotecnología del henequén. pp. 59-71. En: Eastmond, A., J.L. Herrera y M.L. Robert. (eds.). La biotecnología aplicada al henequén: alternativas para el futuro. Centro de Investigación Científica de Yucatán (CICY), México. George, E. 1993/1996. Plant propagation by tissue culture. In prac- tice. Part 2. Exegetics, Easter Press, England. 786 p. González, G., S. Alemán, F. Barredo y M.L. Robert. 2001. Embrio- génesis somática en Agave fourcroydes Lem. Biotecnología Vegetal 2(1), 3-8. Groenewald, E.G., D.C.J. Wessels y A. Koeleman. 1977. Callus for- mation and subsequent plant regeneration from seed tissue of an Agave species (Agavaceae). Z. Planzenphysiol. 81, 369-373. Haberer, G. y J.J. Kieber. 2002. Cytokinins. New insights into a clas- sic phytohormone. Plant Physiol. 128, 354-362. Harza, S.K., S. Das y A.K. Das. 2002. Sisal plant regeneration via organogenesis. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 70, 235-240. Martínez, P.A., L.P. Ortega, V. Chávez y R. Bye. 2003. Somatic embryogenesis and organogenesis of Agave victoria-reginae: con- siderations for its conservation. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 74, 135-142. Madrigal, L.R., E.F. Pineda y J.l. Rodríguez. 1990. Agave. pp. 206- 227. En: Ammirato, P.V., D.A. Evans, W.R. Sharp y Y.P.S. Ba- jaj. (eds.). Handbook of plant cell culture. Vol. 5. Ornamental species. Mc Graw-Hill Publishing Co., New York. Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial [MAVDT], Sociedad de Agricultores de Colombia [SAC] y Federación Na- cional de Cultivadores de Fique [Fedefique]. 2002. Guía am- biental para el subsector fiquero. Bogotá. 63 p. Muñoz, P.Y., L.A. Pérez, T.S. Pérez, P. Alcántara, M. Sagrera y C. Pimentel. 2004. Metodología para el mejoramiento genético del henequén (Agave fourcroydes Lem.) con el empleo de técnicas biotecnológicas. En: http://www.bioplantas.cu/bioinformáti- ca/taller 04 BV.pdf; consulta: febrero 2004. Murashige, T. y F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plantarum 15, 473-493. Nikam, T.D. 1997. High frequency shoot regeneration in Agave sisa- lana. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 51, 225-228. Nikam, T.D., G.M. Bansude y A. Kumar. 2003. Somatic embryo- genesis in sisal (Agave sisalana Perr. Ex. Engelm). Plant Cell Rpt. 22, 188-194. Powers, D.E. y R.A. Backhaus. 1989. In vitro propagation of Aga- ve arizonica Gentry & Weber. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 16, 57-60. Robert, M.L., J.L. Herrera, F. Contreras y K.N. Scorer. 1987. In vitro propagation of Agave fourcroydes Lem. (Henequen). Plant Cell Tiss. Org. Cult. 8, 37-48. Rodríguez, G.B., M.A. Gutiérrez y R.F. Santacruz. 1996a. Mé- todos de propagación biotecnológicos y convencionales en agaváceas para zonas áridas. pp. 57-86. En: Izquierdo, J. y G. Palomino (eds.). Técnicas convencionales y biotecnológicas para la propagación de plantas de zonas áridas. Fao Regional Office for the Latin American and Caribean Region, Santia- go de Chile. Rodríguez, G.B., M.A. Gutiérrez y D.B. Acosta. 1996b. Somatic embryogenesis of Agave victoria-reginae Moore. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 46, 85-87. Santacruz, R.F., P.H. Gutiérrez, y G.B. Rodríguez. 1999. Efficient in vitro propagation of Agave parrasana Berger. Plant Cell Tiss.Org. Cult. 56, 163-167. Shimizu, S.S. y H. Mori. 2001. Control of outgrowth and dorman- cy in axillary buds. Plant Physiol. 127, 1403-1413. Skoog, F. y C.O. Miller. 1957. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp. Soc. Exp. Biol. 11, 118-131. Villalobos, V.V., M.J. Mejía y A.H. Escobar. 1991. Micropropaga- ción de opuntias y ágaves. pp. 643-650. En: Roca, W.M. y L.A. Mroginski. (eds.). Cultivo de tejidos en agricultura. Fundamen- tos y aplicaciones. Centro Internacional de Agricultura Tropi- cal (CIAT), Cali (Colombia). Yépez, G., E. García y E. Vargas. 2004. Notas preliminares sobre la propagación clonal in vitro de Agave cocui Trel. En: http://www. investigación.unefm.edu.ve.pdf; consulta: junio 2004.