Agronomía 24-2i.indd Efecto de la testa sobre la germinación de semillas de caucho (Hevea brasiliensis Muell.) Effect of the seed coats on germination of rubber (Hevea brasiliensis Muell.) seeds Fernando Moreno1, Guido A. Plaza2 y Stanislav V. Magnitskiy3 Resumen: La producción comercial de caucho (Hevea brasiliensis M.) presenta limitantes desde su fase de semilla, como son la consecución, la cali- dad y el bajo porcentaje de germinación, lo que trae como consecuencia la adquisición de grandes cantidades de semilla para el establecimiento de un huerto. El objetivo del presente trabajo fue identi- ficar el efecto de la testa en el proceso de germina- ción a nivel interno, con el fin de proyectar futuras investigaciones que solucionen la problemática de la semilla en el cultivo de caucho. El efecto de las testas se evaluó, mediante la remoción total y par- cial y sin remoción, a través de las variables índi- ce de velocidad de germinación (IVG) y porcentaje de germinación (PG), manejado bajo diseño expe- rimental completamente al azar (DCA); además, se obtuvo la curva de imbibición. Los mayores valores de germinación e índice de velocidad de germina- ción se presentaron en las semillas con tratamiento escarificado mecánico total. Los valores de imbibi- ción permiten apreciar el efecto negativo de la testa al intervenir como barrera en el proceso de toma de agua. Palabras claves adicionales: escarificación, im- bibición, permeabilidad de testa Abstract: Commercial rubber (Hevea brasiliensis Muell.) tree growth has limitations at the seed pro- duction level. Seed collection, maintenance of seed quality, and low germination of seeds make it neces- sary to use high amounts of seeds for plant estab- lishment. The objective of the present research was to identify the effect of the seed coats on germina- tion of rubber seeds with the purpose of increasing percentage seed germination in rubber tree culture. The mechanical effect of testa on seed imbibition and germination was evaluated by partial or total removal of the seed coats. The following variables were evaluated in a completely randomised design (CRD): index of germination rate (IVG), percentage germination (PG), and the imbibition curve of seeds. The highest germination percentages and index of germination rate were found in seeds with testa completely removed. The values of imbibition rate allowed to identify the negative effect of the seed coats functioning as a barrier in the process of water uptake. Additional key words: scarification, imbibition, testa permeability Fecha de recepción: 07 de julio de 2006 Aceptado para publicación: 30 de noviembre de 2006 1 Ingeniero agrónomo, Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá. e-mail: famorenoro@unal.edu.co 2 Profesor asociado, Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá. e-mail: gaplazat@unal.edu.co. 3 Profesor asistente, Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia. e-mail: svmagnitskiy@unal.edu.co Agronomía Colombiana 24(2): 290-295, 2006 Introducción LA PRODUCCIÓN DE CAUCHO (Hevea brasiliensis Muell.) en los países suramericanos y en el mundo es deficitaria (Gouyon et al., 1993; Williams et al., 2001; Schroth et al., 2004). El cultivo de caucho en estos países, en general, y en Colombia, en particular, presenta variados incon- venientes que limitan la producción y explican el déficit nacional (Zuleta, 2003). Actualmente, en el país no se cuenta con semilla de caucho debidamente manejada y de buena calidad, resultado de prácticas ineficientes en la recolección y de características intrínsecas de las semillas; en este último grupo se pueden mencionar las fisiológicas, que determinan su viabilidad durante unos 20 días, en condiciones ambientales propias del cultivo de caucho (Chin et al., 1981). Este parámetro, dificul- ta su almacenamiento y, por tanto, la disponibilidad de semilla en algunas épocas del año. Para obtener un número mínimo de individuos, se utilizan grandes can- tidades de semilla, aumentando con ello los costos de Moreno et al.: Efecto de la testa sobre la germinación... 2912006 producción en el rubro material vegetal. El estudio de la conservación y almacenamiento de semillas de caucho se hace necesario para un desarrollo adecuado y per- manente de proyectos productivos de caucho en los que este insumo no sea limitante. Las semillas de caucho provienen de un fruto corres- pondiente a una cápsula tricarpelar, con una semilla por carpelo, que presenta dehiscencia explosiva. Las semillas tienen testa dura con manchas color marrón y café claro. Han sido clasificadas como xerofóbicas, lo que es sinónimo de recalcitrantes, o sea, semillas que pierden su viabilidad por deshidratación produ- cida por el medio donde se encuentren, sea éste de almacenamiento o natural (Vieira et al., 1994). Lo anterior hace que las semillas pierdan fácilmente su poder germinativo y sea difícil el almacenamiento, en comparación con semillas ortodoxas. Para conservar su poder germinativo, las semillas de condición xero- fóbica requieren temperaturas medias y humedades relativas altas (Triviño, 1990). La diferencia principal entre semillas ortodoxas y recalcitrantes se refiere a la tolerancia de las primeras a la desecación, esto es, la habilidad para conservarse viables a pesar de un bajo contenido de humedad (Farrant et al., 1993; Bewley y Black, 1994). Los posibles mecanismos de manteni- miento de la viabilidad de las semillas recalcitrantes incluyen las relaciones de carbohidratos tipo sacarosa- rafinosa, que intervienen en el mantenimiento de la estabilidad de la membrana durante la desecación de la semilla y previenen su daño (Koster, 1991; Black y Pritchard, 2002). Otros mecanismos fisiológicos pue- den estar envueltos en el deterioro de las semillas re- calcitrantes durante los períodos de almacenamiento y ser activados por radicales libres de oxígeno (Bailly, 2002) y contenidos bajos de ácido abscísico (ABA) en el embrión (Barbedo y Bilia, 1998). Las semillas de caucho son utilizadas para obtener plantas que se emplean como patrones, sobre los que se injertan las yemas procedentes de clones selecciona- dos como óptimos para el establecimiento de la nueva plantación (Zuleta, 2003). La disponibilidad de semi- lla, así como su calidad, es ampliamente discutida por los agricultores de las distintas regiones del país, don- de actualmente se establecen nuevos cultivos; para la obtención de 50 mil patrones, es necesario germinar una tonelada de semilla, equivalente a unas 200 mil semillas, lo que representa una germinación de sólo el 25%. El bajo porcentaje de germinación se puede explicar por la alta sensibilidad de la semilla a la de- secación (Barbedo y Bilia, 1998), de manera que su almacenamiento se dificulta al perder en el tiempo la viabilidad (Torres, 1999). Los estudios de germinación de semillas de caucho son pocos, al igual que el conocimiento sobre las con- diciones óptimas de germinación, como niveles de tem- peratura, humedad. Se asume que el bajo porcentaje de germinación de las semillas se debe a la reducción de la viabilidad de la semilla –antes o después del inicio del proceso– o a mecanismos de latencia. Por su parte, los mecanismos de latencia de las semillas de caucho pue- den estar influenciados por la presencia de las testas. Durante el desarrollo de la semilla dentro del fruto, tiene lugar la transformación del tegumento o tegu- mentos del óvulo en lo que se conoce como testa o cu- bierta de la semilla, mientras que la oosfera fecundada o zigoto se transforma en el embrión de la planta hija y el núcleo triploide, o núcleo del endospermo, se divi- de para dar origen al endospermo o albumen (Vargas y Hernández, 1990). La geminación se inicia con la imbibición y termina con la emergencia. La imbibición es la toma de agua por parte de la semilla seca, sin importar si ésta se encuentra viable o no, y la emergencia es el proceso por el cual el eje embrionario en especies dicotiledóneas o radícula en monocotiledóneas crece, se extiende y atraviesa las es- tructuras que lo rodean (Azcón y Talon, 2003). La absor- ción de agua por parte de la semilla está directamente in- fluenciada por la presencia de la testa y la permeabilidad que ésta tenga. El tejido de reserva absorbe agua a una velocidad intermedia hasta completar su hidratación. El papel de la testa es fundamental en la toma de agua por la semilla; ésta y su permeabilidad están relacionadas con el intercambio gaseoso (Bewley y Black, 1994). El efecto de las testas puede ser químico –por ejem- plo, por la presencia de inhibidores fenólicos– (Selle et al., 1983) o mecánico –impidiendo el flujo necesario de agua y oxígeno para la germinación– (Kelly et al., 1992). Bajo condiciones naturales, las semillas con cu- biertas muy fuertes germinan sólo hasta que la testa es ablandada, lo que se consigue a través de degradación bioquímica en la digestión de los animales o microor- ganismos habitantes naturales del ambiente o por los efectos físicos del pisoteo (Sánchez et al., 1983). De acuerdo con la información obtenida de los pro- ductores y la revisión de la literatura relacionada, se 292 Vol. 24 · No. 2Agronomía Colombiana nadas a intervalos de 7 d y su valor numérico se cal- cula a través de: IVG = ∑ N I /D I = N 1 /D 1 …..N 10 /D 10 …N N /D N (Veira et al., 1994). Dentro del ensayo de germinación se elaboraron pruebas de viabilidad del embrión, utilizando la prueba bioquímica de tetrazolio 1% (Ditleusen, 1980), que per- mite conocer la actividad celular a través de una tinción de color rojo, por la reducción de esta sal incolora. Se tomaron dos variables para la evaluación: viables, co- rrespondientes a embriones teñidos con rojo vivo, y no viables, correspondientes a embriones teñidos rosados y no teñidos. Al momento del establecimiento del ensayo se determinó el contenido inicial de humedad en la se- milla, sometiéndola durante 24, 48 y 72 h a 105 ºC con el fin de obtener el porcentaje de humedad. Resultados y discusión Imbibición A los datos registrados se les realizaron análisis de re- gresión y se establecieron modelos gráficos, obtenién- dose las curvas de tendencia para cada tratamiento. El tratamiento con testa se adecuó al modelo lineal y el tratamiento sin testa, al modelo logarítmico (figura 1). La diferencia en las tendencias de respuesta, a través de los pesos registrados en las semillas, evidenció el efecto de la testa en el proceso de imbibición. Las semillas del tratamiento sin testa iniciaron con un peso de 56,4 g, logrando alcanzar un peso final de 91,5 g. El tratamien- Figura 1. Efecto de la presencia de la testa en la toma de agua en semillas de caucho. evidenció la poca información existente sobre las carac- terísticas de la semilla de caucho que se produce en el país; por esta razón, se planteó como objetivo de este trabajo evaluar el efecto de permeabilidad de la testa sobre la viabilidad y germinación de semillas de esta especie, bajo la premisa de que el incremento de la ger- minación por eliminación del efecto mecánico de las testas es inicialmente significativo. Materiales y métodos Los ensayos se llevaron a cabo en las instalaciones del la- boratorio de fisiología de cultivos de la Facultad de Agro- nomía en la Universidad Nacional de Colombia, Bogotá. Las evaluaciones se realizaron en semillas de caucho reco- lectadas en el segundo semestre de 2005 de la zona de La Victoria (Caldas, Colombia). Las semillas se dispusieron en cámara de germinación Seedburo Equipment a una temperatura de 25 ºC, humedad relativa de 90% y oscuri- dad total durante el tiempo del ensayo. Las condiciones de humedad, luminosidad y temperatura fueron constantes, de acuerdo a los reportes de Ditleusen (1980) y Besinier (1989). Las mediciones se tomaron cada 7 d sobre semillas germinadas, o sea, aquéllas que emiten radícula. Para la elaboración de las curvas de imbibición que mostraran la dinámica del agua en la semilla, se estable- cieron dos tratamientos –semillas con testa y semillas sin testa, retirada mecánicamente– con tres repeticiones y 20 semillas por repetición. La variable, medida con balanza analítica Mettler P1 200, fue peso en fresco a períodos de 24 h. El ensayo se realizó bajo un diseño completamente al azar (DCA), ya que las condiciones de homogeneidad del laboratorio lo permitían. Los tratamientos fueron: 1) escarificado mecánico total (EMT), 2) ruptura parcial de la testa (RT) y 3) testigo –semilla con testa completa (TC)–, con tres repeticiones y se estableció un tamaño de muestra de 50 semillas, para un total de 150 semillas por tratamiento y 450 semillas para todo el ensayo. El efecto de los tratamientos se evaluó cada 7 d, to- mando cada semilla como unidad de muestreo. Como referencia se tuvieron las siguientes variables: • Total de semillas germinadas (PG). Para efecto del análisis estadístico se utilizó la transformación (Iossi et al., 2003): ArcoSen√ PG /100 • Índice de velocidad de germinación (IVG). Esta varia- ble permite determinar el número de semillas germi- Moreno et al.: Efecto de la testa sobre la germinación... 2932006 to con testa registró 90 g en la medida inicial y 122,2 g en la medida final. La diferencia en los pesos iniciales entre los dos tratamientos se debe a la presencia o no de la testa, cuya participación porcentual en el peso total de la semilla es 62%. La testa protege al embrión de las condiciones ambientales adversas, pero también puede afectar negativamente la captación de agua impidien- do el inicio de las reacciones bioquímicas que finalizan en el proceso de germinación (Bewley y Black, 1994; Omokhafe y Alika, 2004). En la curva de imbibición para el tratamiento sin testa se observa una diferencia en la tendencia antes y después de la tercera evaluación –a las 72 h–, diferen- cia que se aprecia por el cambio en la pendiente de la curva; en la parte inicial –entre 24 y 72 h– la pendiente es mayor que en el resto de la curva, representando una mayor velocidad en la toma de agua (figura 1). De lo esto se puede deducir que el potencial hídrico de la semilla en la parte inicial es lo suficientemente ne- gativo para lograr la entrada del agua necesaria para iniciar los procesos de germinación (Vásquez-Yanes y Orozco-Segovia, 1993; Zuleta, 2003). La segunda parte de la gráfica del tratamiento sin testa es estable, mos- trando una reducción en el potencial hídrico de la semi- lla, relacionada con el inicio de la actividad enzimática propia del proceso de germinación a causa de la toma acelerada de agua (figura 1). La gráfica comparativa muestra diferencias entre el tratamiento con testa y el tratamiento sin testa: las curvas de semillas con testa no muestran un incremento acelera- do inicial del peso, como sí lo hacen las semillas sin testa, diferencia que se interpreta como la intervención de la testa en el proceso de toma de agua (figura 1). Teniendo en cuenta que la imbibición es la primera etapa del pro- ceso germinativo (Bewley y Black, 1994), la permeabili- dad que muestra la tendencia de la gráfica de las semillas con testa permite ver que la toma de agua es estable du- rante el proceso y disminuida por la influencia de la testa, por lo que se puede deducir que la presencia de la testa retrasa el proceso natural de germinación. Las curvas de los dos tratamientos en sus fases lineales permiten apreciar incrementos estables en la toma de agua de 14% en el tratamiento con testa en las siete evaluaciones últimas y de 0,8% en el tratamiento sin testa entre las evaluaciones 3 a 7, a las 72 y 168 h (figura 1). El mayor incremento en el porcentaje de peso que se presenta en semillas con testa se relaciona con la pre- sencia de este tejido y su potencial hídrico. La capaci- dad de retención de agua por la testa afecta de manera directa el transporte de agua, en términos de tiempo, a los tejidos de reserva (figura 1). Germinación El tratamiento escarificado total mecánico (ETM) dio mayor porcentaje de germinación (PG) y el mayor índice de velocidad de germinación (IVG), con una clara dife- rencia sobre los tratamientos ruptura de testa (RT) y el testigo con testa completa (TC). Los tratamientos RT y TC no presentaron diferencia significativa entre ellos, con una respuesta semejante en cuanto a IVG y PG (tabla 1). El porcentaje de humedad inicial de las semillas se re- gistró en 22%, valor obtenido luego del proceso de de- secación. Se presentó una correlación positiva altamen- te significativa entre el IVG y PG (tabla 2), entendiéndose con ello que los porcentajes de germinación disminuyen a través del transcurso del tiempo (Kelly et al., 1992), lo que evidencia que las semillas de caucho pierden su viabilidad con el tiempo, condición característica de se- millas recalcitrantes (Chin et al., 1981). Con base en los resultados de la prueba de imbi- bición, en los que la velocidad de germinación pre- sentada por las semillas sin testa fue superior a las Tabla 1. Promedios para las variables índice de velocidad de germinación y germinación para los tratamientos: escarifica- do total mecánico (ETM), ruptura de testa (RT) y testa completa (TC), en semillas de caucho. Tratamientos Índice de velocidad de germinación Germinación (%) ETM 3,70a 0,81a RT 1,40b 0,32b TC 0,23b 0,25b * Tratamientos con letras diferentes presentan diferencia significativa para la prueba de Tukey (α < 0,05). Tabla 2. Contraste para los tres tratamientos e índices de co- rrelación para las variables índice de velocidad de germinación (IVG) y porcentaje de germinación (PG) en semillas de caucho. Variable Respuesta Índice de correlación R 2 Coeficiente de variación (%) Contraste IVG PG IVG ** 0,95 29,47 ETM vs. RT ** ** PG ** 0,98 12,66 ETM vs. TC ** ** ETM vs. RT+TC ns ns ** diferencia altamente significativa; ETM, escarificado total mecánico; RT, ruptura de testa; TC, testa completa; ns, diferencia no significativa. 294 Vol. 24 · No. 2Agronomía Colombiana semillas con testa, y esto relacionado con los altos PG presentados por el tratamiento ETM, se puede deducir una intervención negativa de la testa en el proceso germinación (Cuquel et al., 1994). La baja permeabi- lidad que ejerce la testa retrasa la entrada de agua a los tejidos de reserva que intervienen con la ini- ciación de la actividad metabólica (Ditleusen 1980; Azcón-Bieto y Talón, 2003). Las semillas del tratamiento ETM presentaron más semillas germinadas (44), valor que corresponde a 85% del total de semillas germinadas durante los 7 primeros días. Los tratamientos TC y RT presentaron sus mayores porcentajes de germinación en el segundo y tercer intervalo (14 y 21 d), respectivamente, con valores de germinación de 5% para RT y 3% para TC. Una posible explicación de la diferencia en los resulta- dos finales y en la dinámica de germinación es el efec- to de la presencia de la testa (Fonseca y Freire, 2003). Viabilidad Al final del ensayo (20 d después de siembra), las se- millas que no germinaron se sometieron a la prueba de viabilidad de embrión con tetrazolio (cloruro de 2, 3, 5 trifeniltetrazolio), mostrando un 45% de em- briones vivos en el tratamiento TC, un 30% en el tra- tamiento RT y ningún embrión vivo en el tratamiento ETM. Cuando una semilla, aun teniendo las condicio- nes favorables para germinar, no lo hace, inicia un estado de reposo (Ditleusen, 1980). En las semillas del tratamiento TC, sometidas a condiciones favora- bles de humedad y temperatura para germinación, 45% presentó embriones vivos al final de la prueba con bajos porcentajes de germinación, comparadas con el tratamiento ETM (cero embriones vivos). De lo anterior se puede deducir que las semillas de cau- cho pueden entrar en un período de reposo por la baja permeabilidad presentada por su testa o por la presencia de inhibidores de germinación en la testa (Vásquez-Yanes y Orozco-Segovia, 1993). Las semillas de los tratamientos con testa y sin testa para los diferentes ensayos mostraron diferencias al- tamente significativas, con lo que se puede probar la influencia negativa de la testa en los procesos iniciales de germinación, que finaliza con la emergencia del epicotilo. Su estudio y relación con otras variables es un paso fundamental en la investigación sobre el ma- nejo agronómico del caucho, que permitirá obtener semillas de buena calidad. 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