CAPITULO IV USO DE LA COMPATIBILIDAD VEGETATIVA EN LA IDENTIFICACION DE LAS RAZAS FISIOLOGICAS DE Fusarium oxysporum f.sp. dianthi Xiomara Sinisterra 1, Gregorio Medina2 y Germán Arbeláez3 INTRODUCCION La propagación eminentemente asexual de los hon- gos Imperfectos, entre los cuales se encuentra Fusarlum oxysporum f.sp. dianthi, les permite una rápida adaptación a un ambiente cambiante; por esta razón, se puede esperar una población del patógeno en la cual puede existir una gran variación y, sólo, se necesita una presión de selección deter- minada para aumentar o disminuir sus frecuencias génicas (Van der Plank, 1982). Una de las mayores fuentes de variación la consti- tuye el ciclo parasexual, en el cual ocurre la fusión de micelio y de núcleos provenientes de aislamien- tos diferentes, originándose un micelio hetero- carionte; dicha compatibilidad o complementación vegetativa puede ocurrir dentro o entre razas o formas especiales preexistentes, con la conse- cuente aparición de variantes patogénicas. La compatibilidad vegetativa ha sido usada para establecer la variabilidad genética existente en los hongos imperfectos, encontrándose que los aisla- mientos compatibles, con capacidad de anastomo- sarse y formar heterocariontes estables, son simi- lares en caracterlsticas, como el tamaño de la colonia, la producción de antibióticos, los patrones de isoenzimas y la virulencia (Anagnostakis, 1982; Leach y Yoder, 1983; Bosland y Williams, 1987; Katan et al, 1989). Mediante el uso de mutantes del hongo que no utilizan nitratos como fuente de nitrógeno (mutantes nit), Puhana (1985) estableció una técnica para determinar la relación existente entre distintos ais- lamientos de Fusarium, permitiendo que ocurra la complementación sobre un medio de cultivo rníní- , Microbiologa, Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Colombia, AA14490, Santafé de Bogotá, D.C. , Laboratorista, Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Colombia, AA 14490, Santafé de Bogotá, D.C. , Profesor Titular, Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Colombia, AA 14490, Santafé de Bogotá, D.C. 28 mo, el cual contiene nitrato de sodio como única fuente de nitrógeno; la aparición de micelio tipo "salvaje" en el punto de contacto entre los aislamien- tos se considera como reacción positiva. Con esta metodologla, Puhana (1985) demostró que aislamientos que pertenecen a diferentes for- mas especiales de Fusarlum oxysporum pueden clasificarse en grupos de compatibilidad diferentes que contienen los genes que determinan la compa- tibilidad vegetativa y los genes que condicionan la patogenicidad. Probablemente dichos genes que- daron fijados en el mismo grupo de ligamento a través de la evolución, originando grupos de compatibilidad vegetativa caracterizados por una virulencia especifica. El análisis de los grupos decompatibilidad vegetativa se ha usado para la caracterización de aislamientos no patogénicos de Fusarlum oxysporum, pudiendo comprobarse que estos aislamientos pertenecen a grupos de compatibilidad diferentes de los aisla- mientos patogénicos de Fusarium oxysporum (Corren y Puhana, 1986a; Katan et al, 1989; Wright et al, 1992). Además, la compatibilidad vegetativa se ha utifizado para caracterizar razas de algunas formas especia- les de Fusarium oxysporum, tales como F. oxysporum f.sp. dianthi (Katan et al, 1989), F. oxysporum f.sp. apii (Corren et al, 1986b), F. oxysporum f.sp. conglutinans (Bosland y Williams, 1987), F. oxysporum f.sp. vasinfectum (Katan y Katan, 1988), F. oxysporum f.sp. Iycopersici (Ellas y Schneider, 1988), F. oxysporum f.sp. cubense (PloetzyCorren, 1988), F. oxysporumf.sp. me/onis (Jacobson y Gordon, 1988), F. oxysporum f.sp. asparag (Elmer y Stefens, 1989) y Fusarium sec- ción "Elegans" (Baayen y Kleijn, 1989). En estudios sobre la ecofisiologla y la dinámica de las poblaciones de los aislamientos patogénicos y no patogénicos de Fusarium oxysporum, se han usado la compatibilidad vegetativa y los grupos de compatibilidad como marcadores genéticos natura- les (Corren y Puhalla, 1986a; Katan et al, 1989). Para la caracterización y la identificación de las razas fisiológicas de Fusarium oxysporum f.sp. dianthi, se han utilizado métodos tales como las pruebas de patogenicidad sobre variedades dife- renciales (Garibaldi, 1983), la determinación de patrones de isoenzimas (Belalcazar, 1984), el estu- dio de las caracterlsticas morfológicas y de la tasa de crecimiento micelial (Correll st al, 1986b) y el polimorfismo de la longitud de fragmentos de DNA (Manicon et al, 1987; Kristler et al, 1991). Sin embargo, los estudios de compatibilidad vegetativa son de fácil ejecución, ya que no necesi- tan equipos especializados para su realización, ni reactivos demasiado costosos y no requieren mu- cho espacio, ni se ven afectados por condiciones ambientales y se pueden obtener resultados en corto tiempo. El objetivo de este estudio fue la determinación de los grupos de compatibilidad vegetativade Fusarium oxysporum f.sp. dianthi como criterio para su utili- zación en la identificación de las diferentes razas de dicho patógeno. MATERIALES Y METODOS Para el ensayo se utilizaron 60 aislamientos de F. oxysporum f. sp. dianthi, colectados en diferentes cultivos de clavel ubicados en la Sabana de Bogotá . por Cevallos et al (1990) y 14 aislamientos prove- nientes de Estados Unidos, Holanda e Italia; igualmente, se utilizaron tres aislamientos no patógenos de F. oxysporum. Cada uno de estos aislamientos se cultivó en el medio Papa-dextrosa- agar(PDA)yse incubó a 24°C durante5dlas, antes de iniciar las pruebas de compatibilidad vegetativa. Obtención de mutantes que no utilizan nitratos (nit). De cada uno de los aislamientos se tomaron discos de 0,5 cm de diámetro, los cuales fueron transferi- dos a cajas de Petri con PDA suplementado con clorato de potasio, en concentraciones de 1,5; 3,0; 5,0; 7,Oy9,0% yseincubaron a24°C por siete dlas. Posteriormente, se escogieron, como mutantes, las colonias de rápido desarrollo, cuyo micelio era poco denso y presentaba un crecimiento totalmente pe- gado a la superficie del agar. De cada aislamiento, se obtuvieron por lo menos dos mutantes. Pruebas de compatibilidad vegetativa. Inicialmente, se determinó la autocompatibilidad permitiendo el contacto entre el micelio en creci- miento y, de cada pareja de mutantes sobre un medio mlnimo para Fusarium (MMF); este medio es rico en sales (Na2N03 - 2 gil; KH2PO, - 1 gil; MgSO,.7H20 - 0,5 gil), Ytiene nitrato de sodio como única fuente de nitrógeno. La aparición de micelio tipo "salvaje" en el punto de unión del micelio se consideró como reacción positiva; lareacción nega- tiva consistió en el cese de crecimiento del micelio en el punto de contacto de los aislamientos. Para determinar la complementaridad entre los diferentes aislamientos del hongo, una pareja de mutantes autocompatibles y un mutante provenien- te de otro aislamiento se cultivaron en una caja de Petri sobre el medio mlnimo para Fussrium y se incubaron a 24 ·C; las lecturas se hicieron a los 7 y a los 14 dlas. RESULTADOS La menor concentración de clorato de potasio de la cual se pudieron obtener mutantes de todos los aislamientos de F. oxysporum fue del 5 % y, a partir de los mutantes que se desarrollaron en dicha concentración, se obtuvieron aquéllos que se usa- ron en las pruebas de auto y heterocompatibilidad vegetativa. En la investigación se establecieron siete grupos de compatibilidad vegetativa (Cuadro 4.1). En tres de esos grupos se colocaron los aislamientos extran- jeros de la raza 2 y la mayorla de los aislamientos colombianos clasificados como raza 2 por Cevallos et al (1990). Los otros cuatro grupos de compa- tibilidad correspondieron a los aislamientos de las razas 1, 4 Y 8 del patógeno. La mayorla de los aislamientos colombianos de la raza2 pertenecen a un solo grupo de compatibilidad (Grupo 2001), mientras que el aislamiento 200-02, proveniente de Holanda, y el aislamiento CSU 2, proveniente de los Estados Unidos, ambos pertene- cientes a la raza 2, correspondieron cada uno a un grupo de compatibilidad diferente. El aislamiento CSU 2 fue el único que presentó el fenómeno de autoincompatibilidad, elcual consiste en laimposibi- lidad de obtener mutantes que puedan complemen- tarse vegetativamente. Los aislamientos no patogénicos C5CSU, C14CSU y 618-9 de Fusarium oxysporum pertenecen al mismo grupo de compatibilidad que la mayorla de los aislamientos colombianos de la raza 2. Los aislamientos 310 de Italia, F-4 de Holanda y los aislamientos colombianos 3, 4 Y 93, identificados como de la raza 4 del patógeno, se clasificaron en un solo grupo de compatibilidad; además, a este grupo pertenecen los aislamientos 72,73,75 y79 de la raza 2. 29 Cuadro 4.1. Grupos de compatibilidad vegetativade Fusal1um oxyspotllm f.sp. dlanthl. GRUPOS DE COMPATIBILIDAD VEGETATIVA RAZA FISIOLOGICA' AISLAMIENTO No. 1001 20012 Aislamientos no patogénicos 2002 2003 4001 8001 9001 2 2 2 2 4 8 1 2 200-01 (Holanda) 5,8,9,10,11,13,15,17,18,20,21,22,23, 24,25,26,28,32,33,34,37,38,41,43,44, 46,52,54,58,59,62,66,69,83,85,87,89, 90,95,97, 100 (Colombia) 200-04 (Holanda) CSCSU (Estados Unidos) C14CSU (Estados Unidos) 618-9 (Holanda) 200-02 (Holanda) CSU-2 (Estados Unidos) 3, 4, 75, 79, 93 (Colombia) 310 (Italia) F4 (Holanda) F8 (Holanda) 8F1 (Italia) F2 (Italia) F8 (Italia) . Según pruebas de patogenicidad Los aislamientos italianos que pertenecen a las razas 1, 2 Y 8 se colocaron en otro grupo de compatibilidad. En pruebas realizadas con la variedad Nora Bario, bajo condiciones controladas en elinvernadero, dos mutantes y el heterocarionte formado en la prueba de autocompatibilidad del aislamiento colombiano 18, que pertenece a la raza 2, conservaron su patogenicidad. DISCUSION La compatibilidad vegetativa ha probado ser una herramienta útil para la caracterización de la diver- sidad entre Iosaislamientos deFusariumoxysporum, como lo han demostrado Correll y Puhalla (1986a), Correll et al (1987), Katan et al (1989) y Wrigth et al (1992). De esta manera, fue posible colocar en distintos grupos de compatibilidad vegetativa a los aislamien- tos colombianos y extranjeros de las razas 1, 2, 4 Y 8, con excepción de los aislamientos italianos de las razas 1, 2 Y 8 que pertenecen al mismo grupo de compatibilidad; ésto parece significar que existe un origen vegetativo común entre ellos, diferente del de los aislamientos holandeses, norteamericanos y colombianos que pertenecen a esas mismas razas. La presencia de los aislamientos no patogénicos 30 C5CSU, C14CSU y 618-9 de F. oxysporum en el grupo de compatibilidad 2001, junto con aislamien- tos patogénicos de F. oxysporum f.sp. dianthi, indica que estos aislamientos se originaron, posible- mente, por mutaciones de aislamientos de la raza 2, afectando los genes que gobiernan la patogenicidad y no a los genes que gobiernan la compatibilidad vegetativa. Además, el aislamiento 618-9 mostró mayor patogenicidad y los aislamientos C5CSU y C14CSU fueron ligeramente patogénicos en los trabajos de Rodrlguez et al (1992) y Sánchez y Rojas (1992). La existencia de varios grupos de compatibilidad vegetativa para-la raza 2, indica que existe una variabilidad adicional en esta raza, que, en este caso, es mayor que en las razas 1, 4 Y 8, lo cual coincide con lo observado por Arbeláez y Calderón (1992); sin embargo, lacaracterización de una raza por esta metodologla tiene que englobar toda la variabilidad posible, representada en todos los gru- pos de compatibilidad que puedan establecerse entre aislamientos de diverso origen. La autoincompatibilidad presentada por el aisla- miento CSU-2 es un fenómeno que ya ha sido descrito por otros autores, como Puhalla (1985), Correll et al (1986a), Bosland y Williams (1987) y Jacobson y Gordon (1988), pero no se ha determi- nado su importancia ni su frecuencia a nivel de la población; se cree que este fenómeno resulta de la inhabilidad de un aislamiento para iniciar o comple- tar la formación de l:Ieterocariontes, debido a una doble mutación en algunos de los mutantes nit (Papas, 1986). Las pruebas de compatibilidad vegetativa junto con las pruebas de patogenicidad pueden proveer una valiosa información sobre la diversidad genética de las poblaciones naturales de F. oxysporum; ade- más, la técnica de la compatibilidad vegetativa es potencialmente útil para el diagnóstico de razas a nivel de laboratorio, para la caracterización de aisla- mientos no patogénicos del hongo y como criterio para determinar el riesgo de su uso como agente de control biológico en términos de su capacidad de combinación. BIBLlOGRAFIA 1. Anagnostakis, S .L. Genetic analyses of Endothla parasillca: Linkage data for four single genes and three vegetative compatibilily Iypes. Genetics 102: 25-28. 1982. 2. Arbeláez, G. and O.L. Calderón. Determination ofthe physiological races of Fusarlum oxysporum f.sp. dianthi on camation in Colombia. Acta Horticulturae 307: 43-49. 1992. 3. Baayen R.P. and J. Kleijn. The Elegansfusaria causing wilt diseases of camalion. 11. 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