CICLO DE VIDA DEL ENTOMONEMATODO NATIVO Steinernema feltiae Filipjev Life cycle of native entomonematode Steinernema feltiae Filipjev Adriana Sáenz' y Jesús Emilio Luque- RESUMEN En el laboratorio de Control Biológico de la Facultad de Agrono- mía de la Universidad Nacional, sede Bogotá, se estudio la biolo- gía básica del entomonemátodo nativo Steinernemafeltiae Filipjev, 1934 (Rhabditida: Steinemematidae). Utilizando larvas de último instar de la polilla mayor de las colmenas Galleria mellonella, expuestas a 8000 juveniles infectivos/caja de petri y realizando disecciones diariamente, se determinaron los estados de desarro- llo, duración del ciclo vida y relación de sexos del nemátodo nati- vo. El ciclo de vida consiste de un estado de huevo, cuatro esta- dos juveniles y un estado adulto (macho y hembra); éste se inicia con el estado de vida libre o juvenil infectivo (13) y puede tener dos vías. Si los nutrientes son suficientes y la densidad de 13 inicial es baja, estos desarrollan los machos y hembras de la prime- ra generación. Los huevos de estas hembras adultas eclosionan y los juveniles se desarrollan hasta formar hembras y machos adul- tos de la segunda generación. Los huevos producidos por estas hembras dan origen a los 13. Este ciclo corresponde al ciclo de vida largo, que toma 10 días a 20°C. Si los nutrientes son insufi- cientes' los 13 desarrollan hembras y machos adultos de la primera generación y los huevos producidos por las hembras desarrollan el estado juvenil infectivo. Este ciclo corresponde al ciclo de vida corto, que toma seis días a 20°C. Los nemátodos son tolerantes a temperaturas de lOa 24"C. La relación de sexos de la primera gene- ración está influida por la temperatura. Las hembras a 15°C consti- tuyen el 62% de la población, pero a 30°C corresponden al 43%. Palabras claves: Juveniles infectivos, primera generación, se- gunda generación, adultos, Galleria mellonella. SUMMARY The basic biology of the native entomonematode Steinernema feltiae Filipjev, 1934 (Rhabditida: Steinemematidae) was studied at the Laboratory ofBiological Control which belongs to Agronomy Faculty ofthe National University ofColombia. Larvae oflast urge ofthe greater moth of Galleria mellonella, were exposed to 8000 infective / box. Dissections were done daily and developmental stages, life cycle and ratio sexes were determinated for native nematode. The life cycle consisted of six stages: egg term, four juvenile periods and one adult stage. The last one period began at infective juvenile 3 (13). This one could be in two ways: Ifthere is enough food and the initial density is low, the mal e and female are developed. Eggs from female of first generation will develop males and females for second generation. The 13 generation will be produced from female of second cycle. The last one correspond to the long time cycle (lO days / 20°C). Ifnutrients are low, 13 cycle develop female and males of the first generation. Eggs for this cycle will be develop infective juvenile stage. This one will be the short life (6 days / 20°C). Nematodes are tolerant to temperatures between 10 to 24°C. Temperature about 15°C will show 62% of female, while 30°C will correspond to the 43% offemale. Key words: Infectives Juveniles, first generation, second generation, adults, Galleria mellonella. INTRODUCCION Las especies que pertenecen al género Steinernema Travassos, 1927 (= Neoaplectana Steiner, 1929) son patógenos obligados de insectos. Presentan características que les son únicas, ya que, a diferencia de otros Rhabditida, han desarrollado la habilidad de presentar una asociación mutualista con bacterias específicas del género Xenorhabdus (Akhurst, 1993), las cuales facilitan la muer- te del hospedero y éxito en la reproducción de los nemátodos, además de resistir las defensas del hospedero y evitan ser recono- cidos por el sistema de respuesta del insecto. Sin embargo, el destino de la bacteria en el hemocele varía con la especie de insec- to y el estado fisiológico del mismo (Dunphy y Thurston, 1990). También, tienen gran capacidad de adaptación a nuevos ambien- tes y a condiciones adversas (Molyneux, 1985), presentan un am- plio rango de hospedantes (Poinar, 1979); la capacidad de actuar en forma sinérgica con otros entomopatógenos incrementan su eficacia y resaltan su potencialidad como biorreguladores de po- blaciones de insectos perjudiciales (Koppenhofer y Kaya, 1997); pueden ser cultivados in vivo e in vitro (Bedding, 1981-1984) Ylos estados infectivos pueden ser almacenados por largos períodos, conservando su capacidad infectiva y, posteriormente, ser aplica- dos a través de los métodos convencionales empleados para in- secticidas químicos (Friedman, 1990). El ciclo de vida de las especies del género Steinernema, descri- to porGlaser (l932), Bovien (1937), Dutky(l974) y Poinar(l979), consiste de un estado de huevo, cuatro estados juveniles y un estado adulto (macho y hembra). El segundo estado juvenil (J2) puede ser el estado preinfectivo o el estado no preinfectivo y el tercer estado juvenil puede ser el estado infectivo (13) o el estado Bióloga. Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Colombia. Bogotá. E-mail: adrinemato@yupimail.com/adsaenz@poligran.edu.co Profesor Asistente. Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Colombia. Bogotá. E-mail: jluquez@usa.net Agronomía Colombiana, 2000. 17: 17-24 18 Agronomía Colombiana Vol. 17 no infectivo (IJ). Generalmente ocurren dos generaciones en un insecto hospedero. Kaya y Stock (1997) establecen que algunos de los huevos producidos por la primera generación de hembras desarrollan J3, pero la mayoría de los huevos dan origen a la se- gunda generación de adultos. Los huevos producidos por la se- gunda generación de hembras se desarrollan en 13, los cuales conservan la cutícula del segundo estado juvenil, que les confiere resistencia a condiciones ambientales adversas (Stock, 1998). Wouts (I980) establece que la presencia de los estados juveniles está condicionada por la densidad de 13 que ingresan inicialmente a un hospedero. En Colombia, aunque no se han realizado estudios relaciona- dos con la biología básica de entomonemátodos nativos, se pue- den destacar los trabajos de Caicedo y Bellotti (1996), Ortíz (1994) y Garzón et al. (1996), con especies que pertenecen al género Steinernema, para el control de algunas plagas de interés nacio- nal. Por ello, esta investigación reporta el ciclo de vida del entomonemátodo nativo Steinernema feltiae, además de la des- cripción de los estados juveniles, influencia de la temperatura en el ciclo de vida y la relación de sexos. MATERIALES Y METODOS El estudio se realizó en el laboratorio de Control Biológico de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, de Bogotá, bajo condiciones de temperatura y humedad relativa controladas. Material Entomológico Se utilizó como insecto hospedero larvas de último instar de Gallería mellonella (L) (Lepidoptera: Pyralidae), criadas en labo- ratorio con dieta artificial (Garzón y Aza, 1994). Esta dieta está compuesta por: harina de maíz (400 gr), germen de trigo (160 gr), levadura de cerveza (IOOgr), leche en polvo (50gr), miel de abejas (16OmI),glicerina (l25rnl), agua (100ml)y formaldehído (0,03%, mi). Los ingredientes sólidos y líquidos se prepararon por separado y luego se mezclaron hasta conseguir una pasta homogénea que se colocó dentro de una bolsa plástica y se aplanó con un rodillo hasta obtener un grosor de 0,5 cm. Se cortaron círculos de dieta del mismo diámetro de la base de los frascos de cría (bomboneras) y se colocaron dentro de éstos, junto con dos tiras que contenían huevos, los frascos se taparon herméticamente y se colocaron en cámaras de cría a una temperatura de 22°C. Obtención del entomonemátodo nativo Los 24.000 juveniles infectivos de S.feltiae, que se utilizaron para los diferentes ensayos, se obtuvieron de las existencias de almacenamiento del laboratorio de control biológico de la Facul- tad de Agronomía; los cuales se encontraban almacenados a 10°C, en recipientes de 20ml, que contenían 2ml de agua destilada y 30 (1 de Triton x 100 (Sáenz, 1998). Ciclo de vida del entomonemátodo nativo Estudibs preliminares con Steinernemátidos (Wouts, 1980) indican que cuando el suministro de nutrientes es limitado y hay superpoblación; los entomonemátodos tienen un ciclo de vida corto (una generación) y, cuando hay gran cantidad de nutrientes, un ciclo normal o largo (2 generaciones). Para con- firmar la presencia de los ciclos, se realizaron los siguientes montajes: A. Ciclo de vida largo. Se expusieron 50 larvas de G. mel/onel/a por lO días a 8000 13, en cajas de petri (100xl5 mm) a 20°C con papel filtro humedecido y se disectaron diariamen- te hasta cuando el ciclo de los entomonemátodos se comple- tó. Las larvas se disectaron en cajas de petri de 60x 15 mm cada 6 y 12 horas. El proceso de infección y disección se replicó 10 veces para confirmar la presencia de cada estado de vida. Además, mediante las disecciones, se hicieron observacio- nes sobre sitios de invasión, características de cada estado de desarrollo y cambios morfológicos durante el ciclo. B. Ciclo de vida corto. Pedazos pequeños de tejido de la larva (Lmm ') se colocaron en un pedazo de papel filtro saturado de agua (l crn-) en una caja de petri de 60X15mm. Dos hembras preadultas y dos machos adultos del entomonemátodo, procedentes desde cualquiera de las lar- vas, se transfirieron al tejido, además, se adicionaron cua- tro gotas de agua cerca al papel para asegurar la hume- dad, se sellaron y mantuvieron a 20°C. Este procedimiento se replicó 20 veces, las cajas se examinaron diariamente hasta cumplidos siete días y se contaron los nemátodos obtenidos. Descripción de los estados del ciclo de vida del entomonemátodo nativoS·feltiae La descripción morfológica de cada estado se realizó con montaje en placa (Stock, 1998). Los datos morfométricos de longitud total y ancho del cuerpo de cada estado se tomaron con ayuda del ocular micrométrico del microscopio CARL-ZEISS y los oculares 20 y 40X, respectivamente. Influencia de la temperatura en el ciclo de vida Para establecer la influencia de la temperatura en el ciclo de vida, se expusieron 50 larvas de G. mel/onel/a por caja de petri (100x15 mm) a 800013, para un total de 16 cajas. Grupos de dos cajas se colocaron a temperaturas de 10; 15; 20; 24; 30; 33; 35 y 37°C. Después de dos días, se disectaron diariamente tres larvas y los estados de vida se determinaron hasta com- pletar el ciclo de vida. Influencia de la temperatura en la relación de sexos de la primera generación de adultos Para determinar la influencia de la temperatura en el rango de sexos hembras/machos, se expusieron 10 larvas de G. mellonella a 8000 13 en cajas de petri (tres en total). Cada caja de petri se colocó a 15, 24 y 30°C. Después de tres días, todas las larvas se disectaron y el número de hembras y machos se contabilizó. Las pruebas estadísticas consistieron de una prueba de Ji-Cuadrado y rango múltiple de Duncan, usando el programa SPSS. RESULTADOS Ciclo de vida largo de Steinernema feltiae Mediante las disecciones de las larvas inoculadas, se pudo com- probar que el juvenil infectivo o 13 de vida libre aplicado a larvas de último instar de G. mellonella invade a través de la boca, ano y espiráculos penetra la pared del sistema digestivo y entra a la cavidad corporal. Algunos 13 se acumulan en la cápsula cefálica y 2000 Saenz y Luque: Ciclo de vida del entonemátodo ... parte posterior del intestino. El 13, antes de mudar al próximo esta- do juvenil, inicia su desarrollo incrementando la longitud total del cuerpo y del estoma y después que alcanza la cavidad corporal del hospedero; esto toma en promedio ocho horas (Figura 1). El ciclo de vida de S.feltiae está compuesto de ciclo largo (dos generaciones) y ciclo corto (una generación), pero esto depende del número de J3 que, inicialmente invade el hospedero y la dispo- nibilidad de nutrientes para los estados de desarrollo, lo cual se observa en el montaje de larvas y trozos de tejido. Este entomonemátodo nativo presenta siete estados diferentes de de- sarrollo: huevo, cuatro estados juveniles (11, 12, J3 Y14), separa- dos por mudas y adultos de los dos sexos (machos y hembras). Los cuatro estados juveniles son morfológicamente distintos. Dieciséis horas después de haber ingresado al hospedero, el estoma del juvenil infectivo se abre gradualmente, el esófago inclu- yendo el bulbo basal, se expande y las glándulas excretoras incrementan su tamaño. La cámara bacterial, ubicada en la región anterior del intestino, contiene las células bacterianas de Xenorhabdus bovienii que son liberadas, a través del ano, en el hemocele de las larvas de G. mellonella. En la hemolinfa, las bacte- rias se propagan y causan septicemia, la cual, en 48 horas, mata las larvas de la polilla mayor de las colmenas, G. mellonella. Alcanzada la cavidad corporal del hospedero, este juvenil crece muy poco en longitud pero dobla su ancho. A las 24 horas, mudan a 14 o preadultos machos y hembras (esto se inicia con el rompimiento de la cutícula posteriormente y el nemátodo empieza a salir, abando- nando la cutícula vieja. (Figura 2). El ancho del cuerpo de los 14 se incrementa más rápido que en longitud, hasta alcanzar casi el ancho 19 y la longitud del adulto. Durante este tiempo, el dueto excretor llega a ser largo y se ha formado el sistema reproductor. El 14 muda formando la primera generación de hembras y ma- chos jóvenes entre las 48 y 60 horas después de la inoculación. Inicialmente, ambos sexos son de igual tamaño, pero las hembras incrementan varias veces su longitud, mientras que los machos lo hacen a lo ancho. El apareamiento se inicia en el momento que uno o dos machos están cerca de una hembra y uno de ellos se enrolla a ella e inserta la espícula por la vagina o, en algunas veces, en zonas diferentes del cuerpo de la hembra hasta encontrar la vulva y, finalmente, realizar la cópula. Al finalizar la copula, el macho se desenrolla de la hembra y ésta puede ser copulada por otro macho. La mayoría de las hembras expulsan los huevos; sin embargo al- gunas hembras desarrolladas tardíamente retienen en su cuerpo los huevos (ovovivíparas) y éstos embargo, algunas hembras de- sarrolladas tardíamente eclosionan internamente, iniciándose el proceso de nutrición de los 11 (Figura 3). De 12 a 20 horas des- pués, los 11 rompen el cuerpo de la hembra y se mueven entre el hemocele del insecto. Los 11 mudan a 12 y estos mudan a J3 (juve- nil infectivo), que retiene la cutícula del segundo estado juvenil, la cual le sirve como protección (Figura 4). Otros 11 sufren mudas sucesivas a 12, 13 y 14 y aparece la segunda generación de adultos hembras y machos. Sin embargo, ésto se ve condicionado por la disponibilidad de nutrientes y la densidad de la progenie de la primera generación, es decir, en un hospedero fresco y con una densidad poblacional baja, se desarrolla rápidamente el 14. Cuan- do la densidad de la población es alta y los nutrientes son insufi- cientes, se desarrollan los 12 dando origen a los 13 infectivos. Las AMBIENTE 1J I 1IllAS I J)ETERIORAIJO~D= ~~~ ,~~~ J3 ENTRAN AL HOSPEDERO =J3 LOCALIZANLARVAS DE Gallería mcllonclla CICLO DI CICLO LARGO I @0 SUFICIENTE ALIMENTO (ambiente fresco) .~ 'NS:FlClENH ~ U ALIMENTO f.:\ HOSPEDEROS ~ PEQUE~OS n 11.21JIAS I o Figura /. Ciclos de vida largo y corto del nemátodo nativo Steinernema feltiae. H: hembra, M: macho, IG: primera generación, 2G: segunda generación " \ 20 Agronomía Colombiana Vol. 17 hembras se alimentan y viven cerca de cuatro a cinco días y los machos viven de seis a siete días. Los adultos de la segunda generación aparecen entre las 120a 130 horas y son mucho más pequeños que los adultos de la primera generación. El ciclo de vida largo de Steinernema fe/tiae tiene una duración de 10 días, en el cual se completan las dos generaciones (Figura 1). Ciclo de vida corto de Steinemema feltiae En cuanto al ciclo corto, se pudo establecer que los 13 apare- cen al quinto día después de colocadas las hembras preadultas y los machos adultos en el tejido de la larva, muchos 13 están pre- sentes después de 6 días (Figura 1). Además, cerca del 99% son 13 infectivos (30 cajas de las 40 replicas y todos los 13 son juveniles infectivos) y el 1% son 13 no infectivos (las 10 cajas restantes, con un 99% de 13 infectivos). Los 13 producidos por el ciclo corto son igualmente infectivos a larvas de G. mellonella, como son los obtenidos por ciclo largo. La tasa reproductiva promedio de la primera generación de hembras de S.fe/tiae fue de 1537,7813 (n=40; rango: 312-368013). Descripción de los estados del ciclo de vida del entomonemátodo nativo S.feltiae Primer estado juvenil (JI): El JI emerge desde el huevo y son transparentes y activos y, después de alimentarse, acumulan reser- vas y toman una apariencia oscura (Figura 5). La cutícula es lisa, arnfidos y fasmidos no observados, región labial ligeramente cerra- da y con seis labios. Estoma triangular, ceilostoma cambia de trans- parente enjóvenes a parcialmente oscuro en JI próximos a mudar a J2. Prostoma-telestoma en forma de embudo; esófago, isthmus y bulbo basal distintivo. Poro excretor presente e incospicuo. Ano distintivo. Cola cónica y con terminación aguda, los JI mudan a J2 aproximadamente 13 horas después de salir del huevo. Los JI Figura 2. Tercer Estado juvenil no Infectivo de la Primera Generación en proceso de muda. Figura 3. Hembra de primera generación del entomonemátodo nativo Steinernema feltiae. a: primer estado juvenil (JI) en el útero; b: huevos. disectados desde larvas de G. mel/one//a y colocados en agua mueren sin completar su desarrollo. El rango de longitud va desde 225J.1ma 250J.1myel ancho desde 17,5J.1ma 27,5J.1m(n=10). Segundo estado juvenil (J2): Cutícula lisa, campos laterales ausentes, fasmidos no se distinguen fácilmente. Región labial con seis labios. Ceilostoma cerrado, protostoma-telostoma y esófago presentes, isthmus distintivo, rodeado por el anillo nervioso, poro excretor indistinto. Intestino oscuro y con reservas. Ano distinti- vo, con labio posterior extendido. Cola gradualmente aguda y del- gada al terminar (Figura 6). La oscilación de la longitud es desde 450J.1ma 580J.1my el ancho, desde 42,5J.1ma 57,5!lm (n= 1O).Si los J2 se desarrollan bajo condiciones desfavorables (Figura 1), éstos pueden ser considerablemente pequeños o, si el alimento es sufi- ciente, el J2 se desarrolla a 13. Sin embargo, si el alimento es insu- ficiente (hospederos pequeños, por ejemplo, Achroia grise//a y Tecia so/anivora, Sáenz (1998)) o si los J2 son removidos desde una fuente de alimento, después de 14 horas el estoma se estre- cha, el esófago se reduce en tamaño y los J2 llegan a ser J2 preinfectivos, justamente antes de mudar al tercer estado infectivo, los cuales retienen la cutícula del segundo estado, la cual le sirve Figura 4. Juvenil Infectivo del entomonemátodo nativo Steinernema feltiae. a. Cuticula del segundo estado juvenil. como protección. Los J2 disectados desde larvas infectadas en O,lml de agua y los fluidos del cuerpo, llegan a ser juveniles infectivos entre 24 y 36 horas. Tercer estado juvenil no infectivo (ij) de la segunda generación: El tamaño del cuerpo es variable, pero es más grande que el J2 de la segunda generación. Ellumen intestinal es prominente. Los IJ mu- dan a J4 aproximadamente a las 24 horas. El rango de longitud del cuerpo es de 740J.1ma 900J.1my el ancho, de 38J.1ma 57J.1m(n= 1O). Tercer estado juvenil infectivo (J3): Cuerpo delgado, agu- do desde la base del esófago al extremo posterior. Cutícula con anulación transversa distintiva, claramente visible en desarro- llos tempranos, cuando todavía está rodeado por la cutícula del J2 y hasta finales del desarrollo, cuando reanuda el crecimiento en un nuevo hospedero (Figura 4). Campos laterales con nueve líneas laterales. Región labial lisa, generalmente no cerrada. Protostoma-telostoma en forma triangular anteriormente. Esó- fago largo y estrecho, con lumen ocupando de tl3 a 1/4 del ancho del cuerpo, angosto a nivel del anillo nervioso, termi- nando en el bulbo. Poro excretor distintivo, localizado a nivel de la mitad del esófago. Dueto excretor largo, glándula excretora ventral y desplaza el bulbo basal y el extremo anterior del intes- tino. Una bolsa bacterial encerrada por la pared intestinal e inmediatamente debajo del Cardia. Lumen del intestino angos- to o cerrado. Pared intestinal oscura y con glóbulos. Recto 2000 Saenz y Luque: Ciclo dé vida del entonemátodo ... 21 Figura 5. Primer Estado Juvenil (J 1) del entomonemátodo nativo Steinernema feltiae. Figura 6. Segundo Estado Juvenil (J2) del entomonemátodo nativo Steinernema feltiae. largo y angosto, ano distintivo. Cola cónica con terminación aguda. El rango de longitud del cuerpo es de 680llm a 900llm y el ancho, de 241lm a 341lm. Cuarto estado juvenil 04) preadulto macho y hembra de la primera y segunda generación: Cutícula lisa, líneas laterales au- sentes. Anfidos indistintos, ceilostoma triangular. Prostoma- telostoma esclerotizado y en forma de embudo. Esófago ancho, ocupa cerca de la mitad del ancho del cuerpo, procorpus hincha- do, realzando el ithmus angosto, lurnen triradiado. Anillo nervioso inmediatamente anterior al bulbo basal. Bulbo Basal piriforme. Poro excretor a nivel de la mitad del esófago, abierto, glándulas excretoras grandes, desplazando el bulbo basal dorsalmente. Lumen del in- testino ancho. Desarrollo del tracto genital. En los J4 hembras, se observan los primordios conspicuos de la vulva y, en el J4 macho los primordios de las espículas. Recto ancho, ano distintivo con labios anales posteriores (Figura 7). Cola considerablemente corta más que en el 13. Excepto por los primordios de los órganos sexua- les y la forma de la cola, no hay caracteres que distingan J4 ma- chos y hembras. Además, las dos generaciones son similares y varían únicamente en el tamaño. Este estado dura aproximadamen- te de 12 a 24 horas. El estado adulto del macho, puede ser recono- cido por las espículas bien formadas, gubemaculum, gónadas y mucrón en la cola del adulto (Figura 8). La longitud del cuerpo de laprimera generación de J4 hembras va de 2282.4llm a 2853um y el ancho, desde 120llm a 200llm (n= IO);en el J4 machos desde 951um a 1014.4llm y ancho, desde 70llm a 80llm (n=10). La longitud de la segunda generación de J4 hembras, desde 951um a 10461lm y an- cho, desde 90llm a 1051lm (n=10); J4 machos, desde 900llm a 950 um y ancho, desde 27,51lm a 52,51lm (n=10). Macho de la primera generación: Cutícula lisa, sin líneas late- rales; región labial, estoma y esófago como en el preadulto, excep- to por las glándulas excretoras que están localizadas bajo el bulbo basal y no están desplazadas. Poro excretor distintivo, muy abier- to, localizado a nivel del procorpus. Testículos reflexos. Espículas duras, amarillas y con manubrio grande (Figura 9). Gubemaculum amarillo, distalmente angosto, extremo proximal, usualmente, incli- nado anteriormente y es, aproximadamente, la mitad máxima del Figura 7. Cuarto estado Juvenil (J4) preadulto macho y hembra de la primera generación del entomonemátodo nativo. ancho. Cola aguda, delgada y terminación corporal en un fino mucrón. Bursa ausente (Figura 8). La longitud va desde 1085urn a 1430llm y el ancho, desde 821lm a 98 (n=10). Macho de la segunda generación: estos machos son similares a los de la primera generación, excepto que ellos son cortos (780llm a 9951lm) y, aproximadamente, la mitad de ancho (451lm a 58Ilm). Hembra de la primera generación: Cutícula lisa, líneas laterales ausentes. Región labial, inicialmente, parecida a la del preadulto. En he~bras grandes, la papila labial s~ incrementa en tamaño, la región labial y el estoma se ensanchan. Anfidos oscuros. Ceilostoma con paredes esclerotizadas.Protostoma-telostoma a forma de embudo. Esó- fago corto con relación al tamaño del cuerpo, similar al J4. Bulbo basal piriforme y pequeño, en comparación a otros estadios y con relaciónal tamaño del cuerpo. Poro excretor a nivel del procorpus. Glándulas excretoras desplazadas a la parte anterior del intestino. Tracto genital pareados y reflexos. Utero y espermateca localizados ventralmente: ovarios localizadosdorsalmente y terminan ventralmente enfrentede I~ mitad del cuerpo. Labios vulvares sobresalientes. Recto y ano distinti- Figura 8. Macho de primera Generación del entomonemátodo nativo Steinernema feltiae. 22 Agronomía Colombiana Vol. 17 vos. Labio analposterior, cola ligeramente delgada, cuerpo redondeado al final, con terminación mucronada. La longitud corporal va desde 2658Jlma5175Jlmyelancho,desde 140Jlma220¡.un(n=10). Hembra de la segunda generación: Estas hembras son similares a lasde laprimera generación, excepto que son más pequeñas: 1.800Jlma 2.500¡.unde largoy 80Jlma 119¡.unde ancho. Influenciade latemperatura en el ciclo devida: La temperatura influyó enelciclodevidadeS.feltiae. A 1000C,laprimerageneracióndehembrasy machos aparece a losdoce días de expuesto el hospedero (Cuadro 1).Los JI de esta generación se encuentran a los 15días, embebidos en el tejido graso y su movimiento esmuy lento.A los 18días, el tamaño de algunos JI Figura 9. Espículas de macho de primera generación del entomonemátodo nativo Steinernema feltiae. (55%)noseincrementóyestáninmóvilesymueren.EI45%restantemudan a J2 y, a los25 días, aparece el 13. A esta temperatura,sólo,se presentó el ciclocorto (una generación) con una duración de 25 días. A 15° C, los juveniles infectivos desarrollan a los seis días, la primera generación de machos y hembras, no son muy activos y, a los cinco días después de expuesto el hospedero, aparece la se- Cuadro l. Influencia de la temperatura en el ciclo de vida del nemátodo nativo Steinernema feltiae. DURACION EN DlAS TEMP MUERTE lGA 2GA CICLO CICLO oC LARVA+ . .. CORTO LARGO 10 120 12 NP 25 NP 15 93 6 5 10 17 20 48 3 8 6 10 24 :26 I 5 5 8 30 24 NC NP NP NP 33 ----- NP NP NP NP 35 ----- NP NP NP NP 37 ----- NP NP NP NP + Tiempo en horas. IGA·: primera generación de adultos. 2GA •• : segunda generación adul- tos. NP: no se presentó. Ne: no se completó. gunda generación de adultos y el J3, a los 14 días; sin embargo, una alta producción de éstos aparece a los 17 días, tiempo en el cual finaliza el ciclo de vida (Cuadro 1). A 20° C, los 13, a los tres días de expuestos al hospedero desa- rrollan la primera generación de adultos. La mayoria de estos adul- tos están en la parte anterior y media de las larvas. Después de cuatro días, las hembras de la primera generación han producido huevos y mueren, pero unas pocas contienen JI, los cuales emergen desde el cuerpo de las hembras y migran a todas partes de la larva. Después de seis días, aparecen los 13 (ciclo corto) y a los ocho días los adultos de la segunda generación (Cuadro 1). Al noveno día, los huevos producidos por la segunda generación de hem- bras se desarrollan a JI, éste muda a J2 y, al décimo día, son abun- dantes los J3. A esta temperatura, el ciclo corto dura seis días y el largo, diez días (Figura 1). A 24° C, el J3 desarrolla la primera generación de machos adul- tos en un día y hembras, en día y medio. Los J3 (ciclo corto) y la segunda generación de adultos aparecen a los cinco días, sin em- bargo, algunas de estas hembras contienen J l. Los huevos produ- cidos por la segunda generación de hembras llegan a ser J3 en ocho días. Cerca del 7% de larvas de G. mel/onel/a contiene un número grande de adultos muertos. El ciclo de vida corto dura cinco días y el largo, ocho días (Cuadro 1). A 30° C, los 13 ingresan en el hospedero y llegan a ser machos adultos, pero, sólo, viven tres días. En cuanto a las hembras preadultas, no se desarrollaron a adultas y mueren en un día. A las temperaturas de 33, 35 y 37° C, los nemátodos no alcan- zan el estado J4 y mueren y sólo, en un 45% de las larvas se encontraron juveniles infectivos internos. Influencia de la temperatura en la relación de sexos de la primera generación de adultos. De acuerdo con la prueba de Ji-Cuadrado, la oscilación de hem- bras y machos obtenidos en la primera generación son dependien- tes de la temperatura (X2=12,03; gl=2; P=9,21; (= O,OU. A 15oC, la relación hembras/machos fue de 1,6:l (22/13); a 24°C, de 1.8:1(8/4) y, a 30°C, de 0,9: I (5/6) (Cuadro 2). Cuando las temperaturas se incrementan desde 15a 24°C, el porcentaje de hembras permanece constante (P