Microsoft Word - 10-Agra_10048.doc 597 Original Article Biosci. J., Uberlândia, v. 27, n. 4, p. 597-602, July/Aug. 2011 PRODUÇÃO E REGENERAÇÃO DE PROTOPLASTOS DE Colletotrichum gloeosporioides EM DIFERENTES CONDIÇÕES DE CULTIVO PRODUCTION AND REGENERATION OF PROTOPLASTS FROM Colletotrichum gloeosporioides IN DIFFERENT CONDITIONS Cecilia ARMESTO1; Fernanda Gonçalves Martins MAIA1; Mário Sobral de ABREU2; Antônia Figueira dos REIS3; Nara Edreira ALENCAR4 1. Engenheira Agrônoma, Doutoranda em Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras - UFLA, Lavras, MG, Brasil. cecirpj@hotmail.com feagrosal@yahoo.com.br ; 2. Professor, Doutor, Laboratório de Diagnose e Controle de Doenças - Departamento de Fitopatologia - UFLA, Lavras, MG, Brasil; 3. Professora, Doutora, Laboratório de Fitovirologia e Biologia Molecular - Departamento de Fitopatologia - UFLA, Lavras, MG, Brasil. 4. Engenheira Agrônoma, Mestre em Fitopatologia, UFLA, Lavras, MG, Brasil RESUMO: A obtenção de protoplastos de fungos, utilizando-se enzimas degradadoras de parede celular, tem sido o método mais utilizado em processos de transformação genética. Foram testados dois tipos de estruturas fúngicas (micélio e conídios), diferentes concentrações enzimáticas (5, 10, 20 mg), estabilizadores osmóticos (NaCl 0,7 mol.L-1 pH 5,7; (NH4)2SO4 1,2 mol.L -1 pH 5,8; KCl 0,7 mol.L-1 pH 5,8; MgSO4 0,7 mol.L -1 pH 5,5; Sacarose 0,5 mol.L-1 pH 5,7; SorbitoL 0,6 mol.L-1 pH 5,7) e seis tempos de exposição dos protoplastos ao sistema lítico, para estabelecer condições otimizadas de obtenção e regeneração de protoplastos de Colletotrichum gloeosporioides, agente relacionado a mancha manteigosa em cafeeiros. Protoplastos de C. gloeosporiodes foram obtidos em maior quantidade quando o micélio foi exposto durante 4 horas, com 10 mg.mL-1 de Lysing Enzime em KCl 0,7 mol.L-1 que se apresentou como melhor estabilizador osmótico, com frequência de regeneração de 11,64%. PALAVRAS-CHAVE: Protoplastos. Digestão Enzimatica. Estabilizadores. INTRODUÇÃO A mancha manteigosa, relacionada ao fungo Colletotrichum gloeosporioides, é uma doença cujos principais sintomas são observados em folhas e frutos de café (Coffea arabica), pelo aparecimento de manchas de coloração verde-claro com aspecto oleoso, as quais, em estádios avançados, evoluem para lesões necróticas, causando queda prematura das folhas (MANSK; MATIELLO, 1977). Esta é uma doença de grande importância nas lavouras em que ocorre, devido à destruição completa da planta e ainda hoje não esclarecida quanto à sua infecção e colonização (PEREIRA et al., 2009). No Brasil, o gênero Colletotrichum, associado ao cafeeiro, além de relacionado com a mancha manteigosa, causa doenças como a antracnoses em folhas, ramos e frutos e a seca de ponteiros (OROZCO, 2003). Vários são os estudos sobre o patossistema Colletotrichum x cafeeiro. Recentemente, técnicas de transformação genética têm sido exploradas objetivando desvendar passos sobre a transmissibilidade e a variabilidade do fitopatógeno. Transformação genética refere-se ao processo de inserção de fragmentos de DNA exógeno em uma célula hospedeira, com a finalidade de promover a alteração genética do organismo receptor, ou a expressão de tal DNA, permitindo assim o estudo de aspectos da biologia molecular de organismos vivos (MULLINS; KANG, 2001). A preparação de protoplastos a partir de células fúngicas utilizando várias enzimas degradadoras da parede celular é um método comumente usado na preparação de células para a transformação (ZANETTE, 2007). Protoplastos são células desprovidas de parede celular, tornando-as receptoras e permeáveis à entrada do DNA exógeno. Especialmente em fungos filamentosos, que apresentam espessa parede celular, a protoplastização parece ser uma etapa essencial para uma transformação bem sucedida (POSSIEDE, 2004). Segundo Peberdy (1991) dentre os principais fatores envolvidos na protoplastização são: a) o estado fisiológico das células a serem convertidas em protoplastos; b) o estabilizador osmótico que deve proporcionar um alto rendimento de protoplastos; c) o composto lítico utilizado, que pode influenciar tanto na obtenção como na regeneração dos protoplastos. Diante das perspectivas apresentadas, objetivou-se estabelecer um protocolo para obtenção de protoplastos de C. gloeosporioides, analisando concentrações do sistema lítico, tipos de Received: 10/11/10 Accepted: 05/05/11 598 Produção e regeneração... ARMESTO, C. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 27, n. 4, p. 597-602, July/Aug. 2011 estabilizadores osmóticos, tempos de protoplastização e regeneração destes. MATERIAL E MÉTODOS Colletotrichum gloeosporioides Foi utilizado o isolado IS1, pertencente à coleção micológica do Laboratório de Diagnose e Controle de Doenças de Plantas, Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal de Lavras (Lavras, MG, Brasil). O isolado foi mantido em meio de cultura MEA (Extrato de malte 2% - Ágar), em câmara de crescimento a ±25°C e fotoperíodo de 12 horas. Obtenção de protoplastos Para a obtenção dos protoplastos, 1 mL de suspensão de 2x106 conídios.mL-1 foi transferida para meio malte líquido (Extrato de Malte - Água Destilada Autoclavada), sob agitação a 120 rpm. Após 24 horas de incubação, o micélio foi filtrado e lavado por duas vezes em estabilizador osmótico. Como procedimento padrão para protoplastização, a cada 100 g de micélio úmido, utilizou-se 3 mL de estabilizador osmótico. Posteriormente, a suspensão foi submetida à agitação a 70 rpm em temperatura ambiente. Para garantir maior confiabilidade foram realizados dois ensaios, no qual para cada tratamento foi aplicado quatro unidades experimentais (erlenmeyer 25 mL). Os protoplastos foram observados ao microscópio ótico e quantificados em câmara de Neubauer. Tipos de estabilizadores osmóticos Foi verificada a eficiência dos seguintes estabilizadores osmóticos comumente utilizados na protoplastização de fungos filamentosos: NaCl 0,7 mol.L-1 pH 5,7; (NH4)2SO4 1,2 mol.L -1 pH 5,8; KCl 0,7 mol.L-1 pH 5,8; MgSO4 0,7 mol.L -1 pH 5,5; Sacarose 0,5 mol.L-1 pH 5,7; Sorbitol 0,6 mol.L-1 pH 5,7 e o controle (água destilada esterilizada). Digestão do micélio - Concentração da enzima lítica Para estabelecer a melhor relação massa micelial x enzima, foram utilizadas três concentrações da enzima lítica (Lysing enzymes, Sigma # L 1393) para a digestão do micélio: 5, 10 e 20 mg. Tempo de exposição dos protoplastos ao sistema lítico Detectada a combinação sistema lítico/concentração enzimática/estabilizador osmótico mais eficiente, monitorou-se a protoplastização em função do tempo de incubação. O tempo de exposição do material ao sistema lítico foi monitorado a cada 60 minutos, em um período total de seis horas. Após o término do tempo de incubação foi determinado o número de protoplastos produzidos utilizando-se câmara de Neubauer. Tipo de material fúngico Foram analisados dois tipos de estruturas fúngicas para obtenção dos protoplastos: conídios e micélio de C. gloeosporioides obtidos de colônias com sete dias de crescimento a 25°C e fotoperíodo de 12 horas. Regeneração dos protoplastos A regeneração dos protoplastos foi realizada plaqueando-se 500 µL da suspensão de protoplastos em 15 mL de Meio Completo (0,1% Extrato de Levedura, 0,1% Caseína Hidrolisada, 34,2% Sacarose, 1% Ágar Granulado) e Meio MEA (25% Extrato de Malte, 5% Ágar,) acrescido de um dos estabilizadores KCl 0,7 mol.L-1, NaCl 0,7 mol.L-1, Sacarose 0,56 mol.L-1 ou Sorbitol 0,6 mol.L-1. Os protoplastos foram incubados por 48 horas, a ± 25 ºC e fotoperíodo de 12 horas. Como controle foi utilizado somente meio completo e meio MEA, sem a adição de um estabilizador osmótico. A regeneração dos protoplastos foi calculada de acordo com a fórmula: Regeneração (%) = (A-B) / C x 100, onde A é o número de colônias nos tratamentos testados, B é o número de colônias desenvolvidas no controle, e C o número de protoplastos plaqueados. Análise dos dados Utilizando o programa estatístico Sisvar (FERREIRA, 2000) os dados foram inicialmente avaliados pela análise de variância e teste F. A comparação entre as médias, quando o valor de F foi significativo, foi feita pelo teste de Scott & Knott (1974), a 5% de probabilidade. Os gráficos foram elaborados por meio da versão demonstrativa do aplicativo Sigma Plot 11.0 (Systat Software Inc). RESULTADOS E DISCUSSÃO Foi possível observar com clareza a diferença entre os estabilizadores osmóticos na protoplastização de C. gloeosporoides. Os melhores resultados para a liberação de protoplastos de C. gloeosporioides, foram obtidos utilizando KCl 0,7 mol.L-1 e NaCl 0,7 mol.L-1, com 2,7x106 e 1,5x106 protoplastos.mL-1, respectivamente (Figura 1). O estabilizador osmótico é um componente importante no processo de protoplastização, pois 599 Produção e regeneração... ARMESTO, C. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 27, n. 4, p. 597-602, July/Aug. 2011 deve promover condições favoráveis para a atividade enzimática e, principalmente, após a remoção da parede celular, o soluto deve garantir a integridade da célula até a síntese da nova parede (MARCHI et al., 2006). Estabilizador Osmótico (mol.L -1 ) Na Cl 0 ,7 (N H4 )2 SO 4 1, 2 KC l 0 ,7 M gS O4 0 ,7 Sa ca ro se 0 ,5 6 So rb ito l 0 ,6 AD E x 10 6 P ro to pl as to s m l-1 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 a b a b b b b Figura 1. Média da produção de protoplastos de Colletotrichum gloeosporioides em diferentes estabilizadores osmóticos. Colunas seguidas das mesmas letras não diferem pelo Teste de Scott-Knott, P<0,05. Barra representa o erro padrão da média. Resultados semelhantes, utilizando sais como estabilizadores osmóticos na protoplastização de C. lindemuthianum foram relatados por Ishikawa et al. (2010), que obtiveram 9,6 x 105 e 8 x 105 protoplastos.mL-1 utilizando NH4Cl 0,6 mol.L -1 e NaCl 0,37 mol.L-1, respectivamente. Constatou-se maior eficiência entre os estabilizadores salinos aos compostos por açúcares. Segundo Lalithakumari (1996), sais inorgânicos são preconizados como mais eficientes para a protoplastização de fungos filamentosos, enquanto açúcares ou açúcares-álcoois como mais apropriados para a liberação de protoplastos de leveduras. Não foi verificada diferenças na utilização das três concentrações testadas das enzimas líticas na obtenção dos protoplastos de C. gloeosporioides. Mesmo não demonstrando um incremento na protoplastização de C. gloeosporioides, Ishikawa (2010), Lalithakumari (1996) e Marchi (2006), relatam o aumento na produção de protoplastos quando usado níveis elevados de enzimas líticas, porém podendo ocorrer também a lise das células, tornando-se tóxico a estas. Em relação ao tipo de estruturas fúngicas, não houve produção de protoplastos quando utilizados conídios do fungo, mesmo estes tendo sido submetidos a diferentes tempos de exposição e condições favoráveis de protoplastização. Quando foram utilizadas hifas de C. gloeosporioides, houve produção de protoplastos, a partir de duas horas de exposição. Zanette (2007), trabalhando com protoplastos de Colletotrichum sublineolum também demonstrou a ineficiência da enzima lítica na digestão de paredes das células conidiais do patógeno, independente do tempo de exposição, porém, quando o tratamento ocorreu em hifas, foram obtidos até 5,5x105 protoplastos. mL-1. Este evento pode ser compreendido pelo fato da parede celular dos conídios ser mais espessa em relação à das hifas, e de composição distinta, o que exige combinações de enzimas mais complexas. Testes com a enzima Glucanex sobre conídios de C. sublineolum foram bem sucedidos alcançando a produção de 2,7x106 protoplastos.mL-1. A protoplastização de C. gloeosporioides foi monitorada a cada 60 minutos por um período de 6 horas. Quando atingido o intervalo entre quatro e cinco horas de exposição, ocorreu o máximo de produção de protoplastos havendo a liberação média de 5,1x106 protoplastos. mL-1(Figura 2); após esse intervalo o número de protoplastos decresce, e os 600 Produção e regeneração... ARMESTO, C. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 27, n. 4, p. 597-602, July/Aug. 2011 que permanecem no meio, tornam-se deformados devido a exposição excessiva à enzima. Em diversos microrganismos tem-se reportado a importância do tempo de exposição destes as enzimas líticas sobre a liberação de protoplastos, e de sua correlação com a concentração da enzima (LONGO et al., 1995.; TEBEEST; WEIDEMANN, 1990). Tempo (h) 0 1 2 3 4 5 6 7 x 1 0 6 P ro to p la st o s m l-1 0 1 2 3 4 5 N° Protoplast = - 0,5025 h2 + 4,2831 h - 4,5174 R2 = 0,48** (n=24) Figura 2. Número médio de protoplastos de Colletotrichum gloeosporioides em função do tempo de hidrólise enzimática, utlizado o estabilizador KCl 0,7 mol.L-1 pH 5,8 e 10 mg de Lysing enzime. Os protoplastos de C. gloeosporioides obtidos foram aptos a regenerar formando micélio quando semeados em meio de cultivo. A maior porcentagem de regeneração foi obtida com protoplastos gerados após 3 horas de hidrólise enzimática, utilizando como meio de regeneração: meio completo acrescido do estabilizador osmótico KCl 0,7 mol.L-1 pH 5,8. (Tabela 1). Tabela 1. Porcentagem de regeneração de protoplastos de C. gloeosporioides em meio completo (MC) e meio malte (MEA) acrescidos de diferentes estabilizadores osmóticos. Meios de regeneração % de regeneração MC+KCl 11,64 a MC+NaCl 5,85 b MC+Sacarose 5,77 b MC+Sorbitol 6,69 b MEA+KCl 8,32 b MEA+NaCl 6,28 b MEA+Sacarose 6,89 b MEA+Sorbitol 5,85 b Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente, pelo teste Scott-Knott, P<0,05. A frequência de regeneração obtida em cada experimento está relacionada à enzima lítica e ao tampão osmótico utilizados no experimento. Para que sejam funcionais nos estudos de fungos filamentosos, os protoplastos são requeridos em grande número, e principalmente apresentem boa capacidade regenerativa. Contudo, as taxas de regeneração e reversão são dependentes da espécie 601 Produção e regeneração... ARMESTO, C. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 27, n. 4, p. 597-602, July/Aug. 2011 fúngica, em geral não atingem 100%. Portanto, o aprimoramento de protocolos deve enfatizar a necessidade de determinar os fatores-chave da protoplastização, para alcançar resultados bem sucedidos (FARIÑA et al., 2004). Apesar de diversos trabalhos demonstrarem a maior eficiência de estabilizadores osmóticos oriundos de açúcares na regeneração de fungos filamentosos como, por exemplo, 5% de regeneração para protoplastos de C. lindemuthianum utilizando sacarose 0,56 mol.L-1 (ISHIKAWA et al., 2010) e 0,084% para Phaeoisariopsis griseola também com sacarose 0,6 mol.L-1 (GONZAGA et al., 2008), para C. gloeosporioides a adição de KCl 0,7 mol.L-1 ao meio completo resultou em incremento na regeneração. Como a liberação de protoplastos é extremamente sensível às condições fisiológicas do micélio, é comum observar certa variação no número obtido entre diferentes ensaios, em função de fatores não controlados, como condição fisiológica do esporo, oscilação da temperatura do ambiente de cultivo, etc. O importante é gerar um número elevado de protoplastos, uma vez que uma maior quantidade destes é fundamental para a eficiência do processo de transformação (ALMEIDA et al., 2008). Portanto, um protocolo bem sucedido para obtenção e regeneração de protoplastos de C. gloeosporioides, isolado de cafeeiro, inclui as seguintes condições ideais: utilização de micélio de C. gloeosporioides em estabilizador osmótico KCl 0,7 mol.L-1, concentração de 10mg.mL-1 de Lysing enzime, tempo médio de hidrólise enzimática de 4 horas e meio de crescimento completo com adição de KCl 0,7 mol.L-1 para regeneração. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico – CNPq pelo apoio financeiro. ABSTRACT: The isolation and regeneration of protoplasts from fungal cells, using several cell wall degrading enzymes, has been the most common method to prepare competent cells for genetic studies of filamentous fungi. In this work two types of fungal structures, different enzyme concentrations (5, 10, 20 mg), osmotic stabilizers (NaCl 0,7 mol.L-1 pH 5,7; (NH4)2SO4 1,2 mol.L -1 pH 5,8; KCl 0,7 mol.L-1 pH 5,8; MgSO4 0,7 mol.L -1 pH 5,5; Sacarose 0,5 mol.L-1 pH 5,7; Sorbitol 0,6 mol.L-1 pH 5,7), and six exposure times to establish optimum conditions of isolation and regeneration of protoplasts of Colletotrichum gloeosporioides, agent of blister spot on coffee, were tested. Protoplast of C. gloeosporioides were obtained in greater quantities when the mycelium was exposed for 5 hours with 15mg.mL-1 of Lysing Enzyme in 0.7 mol.L -1 of KCl as osmotic stabilizer, presenting a regeneration rate of 11.64%. KEYWORDS: Protoplasts. Enzymatic digestion. Stabilizers. REFERÊNCIAS ALMEIDA, A. P. M. M.; DIAS, E.S.; PEREIRA, R. T. G.; TOLEDO, R. C. C.; PFENNING, L. H. Production of protoplasts from the filamentous fungus Aspergillus ochraceus. Ciência Rural, Santa Maria, v. 38, n. 5, p. 1460-1462, 2008. FARIÑA, J. I.; MOLINA, O. E.; FIGUEROA, L. I. C. Formation and regeneration of protoplasts in Sclerotium rolfsii ATCC 201126. Journal of Applied Microbiology, Oxford, v. 96, n. 2, p. 254-262, 2004. GONZAGA, L. L; LIMA, S. S; ARAÚJO, E. F; QUEIROZ, M. V. Obtenção e regeneração de protoplastos em Phaeoisariopsis griseola, agente causal da mancha-angular do feijoeiro comum. In: 54º CONGRESSO BRASILEIRO DE GENÉTICA., 2008, Salvador. Anais... Salvador: Sociedade Brasileira de Genética, 2008. p. 54. ISHIKAWA, F. H.; BARCELOS, Q. L.; DE SOUZA, E. A.; DIAS, E. S. Factors affecting the production and regeneration of protoplasts from Colletotrichum lindemuthianum. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 34, n. 1, p. 74-79, 2010. LALITHAKUMARI, D. Protoplasts - a biotechnological tool for plant pathological studies. Indian Phytopathology, New Delhi, v. 49, p. 199-212, 1996. 602 Produção e regeneração... ARMESTO, C. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 27, n. 4, p. 597-602, July/Aug. 2011 LONGO, A. C. ; SCHRANK, A. ; AZEVEDO, J. L. Transformação genética para Colletotrichum musae, com o gene heterólogo de resistência a benomil. Genetics and Molecular Biology, Ribeirão Preto, v. 18, n. Supl., p. p. 176, 1995. MANSK, Z.; MATIELLO, J. B. Ocorrência de mancha manteigosa em café “Conilon” (Coffea canephora, Pierre) no Estado do Espírito Santo. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE PESQUISAS CAFEEIRAS, 5., 1977, Guarapari. Anais... Guarapari: IBC/GERCA, 1977. p. 172-173. MARCHI, C. E.; BROMMONSCHENKEL, S. H.; QUEIROZ, M. V. DE; MIZUBUTI, E. S. G. Obtenção e regeneração de protoplastos de Magnaporthe grisea. Summa Phytopathologica, Botucatu, v. 32, n. 3, p. 232- 238, 2006. MULLINS, E. D.; KANGS, S. Transformation: a tool for studying fungal pathogens of plant. Cellular and Molecular Life Sciences, Birkhäuser Basel, v. 58, n. 14, p. 2043-2052, 2001. OROZCO, E. F. M. Caracterização morfológica, molecular, bioquímica e patogênica de isolados de Colletotrichum spp. associados ao cafeeiro em Minas Gerais e comparação com Colletotrichum kahawae. 2003. 147 f. Tese (Doutorado em Fitopatologia) – Curso de Pós-Graduação em Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2003. PEBERDY, J. F. Fungal protoplast. In: Bennett, J.W.; Lasure, L. L. (Ed.). More Gene Manipulations in Fungi. California: Academic Press, 1991. p. 307-318. PEREIRA, I. S.; ABREU, M. S.; ALVES, E.; FERREIRA, J. B. Estudos histoplásticos da interação Colletotrichum gloeosporioides: cafeeiro. Bragantia, Campinas, v. 68, n. 1, p. 117-123, 2009. POSSIEDE, Y. M. Estudos morfológicos e genéticos em Guignardia spp e Phyllosticta spp. 2004. 129 f. Tese (Doutorado em Genética) – Curso de Pós-Graduação em Genética, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2004. TEBEEST, D. O, WEIDEMANN, G. J. Preparation and regeneration of protoplasts of Colletotrichum gloeosporioides f. sp. Aeschynomene. Mycology, Lawrence, v. 82, n. 2, p. 249-255, 1990. ZANETTE, G. F. Caracterização fenotípica e tentativa de obtenção de fase sexuada em Colletotrichum sublineolum. 2007. 102f. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular). Programa de Pós- Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2007.