Microsoft Word - 1-Agra_11301.doc 1 Original Article Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 1, p. 1-7, Jan./Feb. 2013 EXPRESSÃO TRANSIENTE DO GENE uidA EM EXPLANTES FOLIARES DE Eucalyptus saligna Sm. TRANSFORMADO VIA Agrobacterium tumefaciens TRANSIENT EXPRESSION OF uidA GENE IN LEAF EXPLANTS OF Eucalyptus saligna Sm. TRANSFORMED VIA Agrobacterium tumefaciens André Luís Lopes da SILVA1; Yohana de OLIVEIRA2; Marcia PROCOPIUK2; Clarissa de Souza MUDRY2; Gilvano Ebling BRONDANI2; Jefferson da Luz COSTA3; Gessiel Newton SCHEIDT3 1. Departamento de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia; Universidade Federal do Paraná; 81531-970; Curitiba, PR, Brasil. clonageinvitro@yahoo.com.br ; 2. Departamento de Fitotecnia e Fitosanitarismo; Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR, Brasil. 3. Departamento de Ciências Agrárias e Tecnológicas; Universidade Federal do Tocantins, Gurupi, TO, Brasil. RESUMO: O objetivo desse trabalho foi avaliar a influência do pré-cultivo de explantes foliares e do meio de cultura na ressuspensão de Agrobacterium tumefaciens para infecção dos explantes. Os meios MS/2 (50% da concentração de sais) e MS N/2 (50% da concentração de NH4NO3 e KNO3) + PGR (1,0µM de TDZ (thidiazuron) + 0,1 µM de ANA (ácido naftalenoacético)) foram testados na ressuspensão da bactéria para infecção dos explantes. O pré-cultivo consistiu da manutenção dos explantes em meio de cultura para formação de calos (MS N/2 + PGR) durante um dia, sendo o tratamento sem pré-cultivo consistituído dos explantes após a excissão dos mesmos. Os explantes foram mantidos no escuro a 25 ± 2ºC mediante a utilização de plástico preto. O delineamento usado foi o inteiramente casualisado com 20 explantes. Os experimentos foram repetidos duas vezes. O meio MS/2 promoveu resultados superiores (22,4%) comparado ao meio MS N/2 + PGR (14,5%) para a percentagem de área com expressão do gene uidA. Aos 7 dias de cultivo em meio seletivo, a percentagem de área expressando o gene uidA foi 1,6 no MS/2 e 0% para o MS N/2 + PGR. O pré-cultivo produziu resultados superiores aos encontrados sem pré-cultivo, atingindo 31,4% de expressão transiente e no tratamento sem pré-cultivo 2,1%. Após 7 dias de cultivo em meio seletivo, a percentagem de área de expressão dos explantes do tratamento com pré-cultivo permaneceu 4,8% e 0% para o tratamento sem pré-cultivo. Os resultados indicam que o pré- cultivo e ressuspensão da bactéria em meio MS/2 aumentaram a eficiência da expressão transiente do gene uidA em explantes foliares de E. saligna. PALAVRAS-CHAVE: Espécie lenhosa. Transformação genética. EHA105. Gene GUS. β-glucuronidase. INTRODUÇÃO As primeiras espécies de Eucalyptus geneticamente transformadas foram provenientes de E. globulus, através de biobalística (SERRANO et al., 1996) e E. camaldulensis via Agrobacterium tumefaciens (MULLINS et al., 1997). Posteriormente vários estudos foram realizados, entretanto poucos trabalhos relatam a obtenção de plantas transgênicas das principais espécies de interesse econômico. Além disso, existe uma grande dificuldade para regenerar plantas transgênicas de Eucalyptus, alcançando-se baixos índices de plantas transformadas. O protocolo estabelecido para E. saligna apresentou uma eficiência de 0,5% (1:200 explante transformado:explantes inoculados) (DIBAX et al., 2010), carecendo de mais pesquisas para otimizá-lo. Muitos fatores estão relacionados com o processo de transformação genética via Agrobacterium, tais como a adição de acetosiringona (SILVA et al., 2011), tipo de explante (TAZEEN; MIRZA, 2004), sonificação (HUSSAIN et al., 2007) genótipo, tempo de infecção e co-cultura (ZIA et al., 2010), dentre outros. A eficiência de transformação de uma determinada espécie está relacionada ao sistema de seleção dos transformantes (SILVA et al., 2010; SILVA et al., 2011), meio de cultura, temperatura e duração da co-cultura, genótipo, linhagem de Agrobacterium, além de muitos outros que normalmente não são considerados. Diante do exposto, os objetivos desse trabalho foram avaliar a influência de dois meios de cultura para a ressuspensão do Agrobacterium tumefaciens e tempo de pré-cultivo dos explantes na expressão transiente do gene uidA em explantes foliares de Eucalyptus saligna. MATERIAL E MÉTODOS Material vegetal Brotações múltiplas (várias brotações unidas em um único explante) de Eucalyptus saligna originados a partir de explantes cotiledonares e multiplicados conforme o protocolo estabelecido Received: 13/01/11 Accepted: 05/06/11 2 Expressão transiente... SILVA, A. L. L. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 1, p. 1-7, Jan./Feb. 2013 por DIBAX et al. (2010) foram utilizadas como fontes de explantes foliares (décimo segundo subcultivo). Esses explantes foram cultivados em sala de crescimento com a temperatura de 25o C ± 2 e fotoperíodo de 16 horas, sob uma intensidade luminosa de 30 µM m-2 s-1 obtida de lâmpadas fluorescentes brancas. Os frascos de cultivo tinham as seguintes dimensões, 6,5 cm de diâmetro de largura e 8,5 cm de altura e foram vedados com tampa de polipropileno rígido. Para a realização dos experimentos os explantes foliares foram retirados das brotações (terceira a sexta folha distal do broto) contido em brotações múltiplas e cortados longitudinalmente (porção distal e proximal). Os explantes utilizados no experimento avaliando o meio de ressuspensão da bactéria foram seccionados e mantidos em solução antioxidante (250 mg.L-1 de ácido ascórbico, 25 mg.L-1 de ácido cítrico e 1 g.L-1 de PVP40 (polivilpirrolidona), pH 5,0) durante a retirada dos explantes dos brotos doadores (TOURNIER et al., 2003). Essa solução antioxidante não foi usada para o preparo dos explantes utilizados no experimento com o pré- cultivo. O pré-cultivo consistiu da manutenção dos explantes em meio de cultura MS para formação de calos (MURASHIGE; SKOOG, 1962) e MS N/2 (10,3 mM de NH4NO3 e 9,4 mM KNO3) + 1,0 µM de TDZ (tidiazuron) e 0,1 µM de ANA (ácido naftalenoacético), sendo o tratamento sem pré- cultivo constituído de explantes após o preparo dos mesmos. Os meios foram suplementados com 30 g.L-1 de sacarose e solidificados com 7 g.L-1 de ágar. O pH foi ajustado para 5,8. Todos os meios de cultura foram autoclavados por 15 min a 121° C e 103 KPa. Linhagem, plasmídeo e condições de cultura e co- cultura de Agrobacterium tumefaciens A linhagem EHA105 (HOOD et al., 1993) de A. tumefaciens, e o plasmídeo pBI121 (ZHANG et al., 1995) foram utilizados. O plasmídeo pBI carrega o gene de interesse, P5CSF129A, que é uma forma mutante do gene P5CS de Vigna aconitifora (HONG et al., 2000). Este gene está sob o controle do promotor 35S-CaMV (do vírus do mosaico da couve-flor). Este gene está situado entre o promotor e a região NOS-3’, esta construção foi inserida no sítio EcoRI do vetor pBI121. Este vetor contém também os genes nptII e uidA (GUS), controlados pelos promotores, NOS-P (nopalina sintetase) e 35S, respectivamente, ambos contendo o terminador NOS-3’ (Figura 1). A linhagem EHA105 foi mantida em meio YEB sólido (7 g.L-1 de agar) (VERVLIET et al., 1975) e suplementado com 50 mg.L-1 de canamicina e 25 mg.L-1 de rifampicina a 28 oC durante 48h (no escuro) para a obtenção de colônias isoladas. Colônias isoladas (2 a 4 colônias) de EHA105 foram coletadas com o uso de palitos estéreis e cultivadas em 5 mL de meio YEB líquido adicionado de 50 mg.L-1 de canamicina e 25 mg.L-1 de rifampicina a 28 oC no escuro por 24h em agitador orbital (150 rpm). A absorbância (densidade ótica) da suspensão bacteriana foi determinada por leitura em espectrofotômetro, a cultura foi ajustada por diluição com meio YEB suplementado como descrito acima, diluições foram realizadas até a obtenção do valor da DO600nm = 0,85. A suspensão bacteriana (1 mL) foi transferida para um tubo de microcentrífuga estéril. Esta suspensão celular foi centrifugada a 5.000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e as células ressuspensas em 1 mL de meio de cultura líquido, sendo o MS/2 (50% da concentração de sais) ou MS N/2 (10,3 mM de NH4NO3 e 9,4 mM KNO3) + 1,0µM de TDZ (thidiazuron) e 0,1 µM de ANA (ácido naftalenoacético), conforme o experimento realizado, esses meios foram suplementados com 30 g.L-1 de sacarose e pH ajustado para 5,8. Todos os antibióticos usados nesse trabalho foram esterilizados por microfiltragem (0,22 µm). Condições gerais de inoculação Os explantes foliares cortados transversalmente foram inoculados em solução bacteriana e incubados por um período de 30 minutos sob agitação de 150 rpm à 25 ºC (no escuro). Em seguida, foram secos em papel filtro estéril e co-cultivados em meio de cultura MS N/2 contendo 30 g.L-1 de sacarose, 0,1 µM de ANA e 1,0 µ M de TDZ. Ao final do período de co-cultura (5 dias), os explantes foram transferidos para o mesmo meio acrescido de 250 mg.L-1 de Cefotaxima® e 15 mg.L-1 de canamicina para a eliminação da Agrobacterium tumefaciens e seleção das células transformadas. As placas de Petri contendo os explantes foram mantidas no escuro em sala de crescimento a 25 ± 2ºC mediante a utilização de um plástico preto. As placas de Petri utilizadas tinham 10 cm de diâmetro e 25 mL de volume. Foram vedadas com filme de PVC (polivinilcloreto). Ensaio histoquímico da ββββ-glucuronidase (GUS) A expressão transiente do gene uidA nos explantes foliares foi avaliada após o final da co-cultura (quinto dia) e após sete dias em meio seletivo pela expressão do gene uidA, através de detecção histoquímica da atividade da β-glucuronidase, conforme JEFFERSON et al. (1987). Os explantes 3 Expressão transiente... SILVA, A. L. L. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 1, p. 1-7, Jan./Feb. 2013 foram colocados em tubos eppendorfs de 1 mL e cobertos por X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β- D-glucoronídeo). Após 16 h em temperatura de 37 oC, foi realizada a remoção do reagente e as amostras foram lavadas três vezes em álcool etílico 70% para a remoção da clorofila, para melhorar a visualização da coloração azul expressa pela reação histoquímica. Após a remoção da clorofila as amostras foram mantidas em álcool etílico 70%, para posteriormente serem analisadas em estereomicroscópio (40X). Figura 1. Região de transferência do plasmídeo pBI121 (T-DNA), onde: P5CS é o gene de Vigna aconitifolia (∆1- Pirrolina – 5 – Carboxilato Sintase); nptII, gene que codifica a neomicina fosfotransferase II; gus, gene que codifica ß-glucuronidase; NOS-P, promotor do gene da nopalina sintetase de A. tumefaciens; 35S-P, promotor constitutivo do CaMV; NOS-3’, NOS 3’, terminador do gene da nopalina sintetase de A. tumefaciens; RD, borda direita do T-DNA; LB, borda esquerda do T-DNA (HONG et al., 2000). Os explantes foram fotografados e as imagens analisadas pelo Software Scion Image (Scion Corp., Fredrick, Maryland, USA) para determinação da percentagem da área azul. Todos os experimentos foram repetidos duas vezes, com resultados consistentes. RESULTADOS E DISCUSSÃO Primeiro experimento Foi observado que no final da co-cultura, o meio MS/2 promoveu resultados superiores ao MS N/2+PGR, sendo que a percentagem de área que apresentou expressão do gene uidA foi de 22,4% e no segundo 14,5% (Tabela 1). Após 7 dias de cultivo em meio seletivo, a percentagem de área expressando o gene uidA foi 1,6% quando foi usado o MS/2 e 0% quando usado MS N/2 + PGR (Tabela 1). Esses resultados sugerem que um maior potencial osmótico é benéfico para o aumento da expressão transiente, considerando que o meio MS com 50% da concentração dos sais e isento de reguladores de crescimento apresenta menor concentração de sais do que o MS N/2 suplementado com reguladores de crescimento. Contudo, outros fatores como a composição do meio de cultura e a presença ou ausência de reguladores de crescimento também podem influenciar nas respostas dos cultivos in vitro, sendo que novos estudos poderão elucidar tais observações. Na transformação genética do híbrido de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla, os explantes foram inoculados numa suspensão de Agrobacterium tumefaciens (meio C, meio desenvolvimento para co-cultura de explantes foliares e A. tumefaciens) com suplementação de 1 mM de prolina (TOURNIER et al., 2003). A prolina é um osmoprotetor, que funciona como um osmólito, o qual age no ajuste osmótico da célula, auxiliando a manter o balanço hídrico da planta, sem que haja decréscimo do turgor ou volume celular (TAIZ; ZEIGER, 2004). Ambos os meios, MS/2 e MS N/2 + PGR (“Plant Growth Regulators”) apresentaram 100% dos explantes com alguma área expressando o gene GUS no final da co-cultura, entretanto, apenas os explantes cultivados no meio MS/2 continuaram apresentando expressão transiente do gene GUS ao sétimo dia de cultivo em meio com canamicina (10%) (Tabela 1). Esses resultados são discordantes com os observados durante a transformação genética de E. saligna, onde 100% e 50% dos explantes 4 Expressão transiente... SILVA, A. L. L. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 1, p. 1-7, Jan./Feb. 2013 foliares apresentaram expressão transiente do gene GUS ao final de cinco dias de co-cultura e após sete dias de cultivo em meio com 50 mg.L-1 de canamicina e 500 mg.L-1 de cefotaxima® (DO600=1,0) (DIBAX et al., 2010). Entretanto, essas diferenças podem ter ocorrido pela densidade ótica utilizada ter sido maior do que a usada nesse trabalho (DO600=0,85), além de que o meio de ressuspensão das bactérias também ter sido diferente. Table 1. Expressão do gene uidA em explantes foliares de Eucalyptus saligna cultivados em dois meios de cultura usados para ressuspensão da solução bacteriana. Explantes tratados com solução antioxidante (TOURNIER et al., 2003) e sem pré-cultivo. Curitiba, 2008. Meio de cultura DCC EET % DEET %3 MG % 1-25 26-50 51-75 76-100 MS/2* 0 100 60 30 0 10 22,4 ± 24,8 7 10 10 0 0 0 1,6 ± 0,0 MS N/2** + PGR2 0 100 40 30 0 0 14,5 ± 16,4 7 0 0 0 0 0 0,0 ± 0,0 * MS/2 = meio MS com 50% da concentração de sais; ** MS N/2 = Meio MS (10,3 mM de NH4NO3 e 9,4 mM KNO3); 2 1,0 µM de TDZ e 0,1 µM de ANA; 3 Explantes que apresentaram área azul abaixo de 1% não consta na distribuição de freqüência; DCC = Dias após co- cultura, EET % = Explantes apresentando expressão do gene uidA (%), DEET % = Distribuição dos explantes com expressão transiente com base na percentagem de área, MG % = Média geral da porcentagem de área com expressão transiente. A presença de reguladores de crescimento no meio MS N/2 não favoreceram a expressão transiente do gene uidA, porém a expressão foi maior no meio MS/2 que não apresentava reguladores de crescimento, esses resultados contradizem os resultados encontrados na transformação genética de Arabidopsis thaliana em que os reguladores de crescimento demonstraram efeitos positivos (AKAMA et al., 1992). Entretanto, é possível que esses explantes foliares de E. saligna cultivados na ausência de reguladores de crescimento apresentem uma elevada taxa de divisão celular, o que resultou numa maior suscetibilidade à infecção pela Agrobacterium tumefaciens (VILLEMONT et al., 1997). Segundo experimento: No experimento com o pré-cultivo dos explantes, foi observado que no final da co-cultura, o pré-cultivo produziu resultados superiores aos encontrados sem pré-cultivo, atingindo 31,4% de percentagem de área que apresentou expressão do gene uidA e no tratamento sem pré-cultivo 2,1% (Tabela 2, Figura 2). Após 7 dias de cultivo em meio seletivo, a percentagem de área de expressão dos explantes do tratamento com pré-cultivo permaneceu 4,8% e 0% do tratamento que não foi pré-cultivado (Tabela 2). Na transformação genética do híbrido de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla, o pré- cultivo de explantes foliares favoreceu o aumento da expressão transiente proporcionalmente ao aumento de dias, sendo observados 70, 80 e 90% para ausência de pré-cultura, um e dois dias de pré- cultivo, respectivamente (ALCANTARA et al., 2011). Foi sugerido que a causa do aumento da expressão transiente dos explantes pré-cultivados seja devido ao favorecimento da ligação do Agrobacterium ao explante, possivelmente pela síntese de novas células (divisão celular) no local do ferimento e a produção de compostos indutores de genes vir, pelo metabolismo ativo dessas células (SUNILKUMAR et al.,1999). O preparo dos explantes com o uso da solução antioxidante proporcionou maiores taxas de expressão transiente do gene GUS, como observado nos dois experimentos em que foi usado o meio MS/2 para ressuspenção da bactéria e sem a realização do pré-cultivo (Tabelas 1 e 2). Os explantes preparados na solução antioxidante apresentaram uma área com expressão transiente de 22,4% comparado com 2,1% dos explantes que foram cortados sem o uso da solução antioxidante no final da co-cultura. No final do sétimo dia de cultivo em meio com canamicina, os explantes cortados no antioxidante obtiveram 2,1% e 0% de expressão nos explantes sem o uso da solução. O aumento da expressão transiente nos explantes tratados com solução antioxidante pode ter sido causada devido a diminuição da oxidação dos explantes. 5 Expressão transiente... SILVA, A. L. L. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 1, p. 1-7, Jan./Feb. 2013 Tabela 2. Expressão do gene gus em explantes foliares de Eucalyptus saligna inoculados com A. tumefaciens após um dia de pré-cultivo* e sem pré-cultivo. Explantes não tratados com antioxidante. Curitiba, 2008. Tempo de pré- cultivo (dias) DCC EET % DEET %1 MG % 1-25 26-50 51-75 76-100 0 0 100 60 0 0 0 2,1 ± 2,3 7 0 0 0 0 0 0,0 ± 0,0 1 0 100 40 30 30 0 31,4 ± 21,5 7 60 50 0 0 0 4,8 ± 4,2 1 Explantes que apresentaram área azul abaixo de 1% não constam na distribuição de freqüência;* Meio de indução de calos (Meio MS com 10,3 mM de NH4NO3 e 9,4 mM KNO3 + 1,0 µM de TDZ e 0,1 µM de ANA). DCC = Dias após co-cultura, EET% = Explantes apresentando expressão do gene uidA (%), DEET% = Distribuição dos explantes com expressão transiente com base na percentagem da área azul (%), MG%= Média geral da percentagem de área com expressão transiente. Figura 2. Expressão transiente do gene uidA em explantes foliares de Eucalyptus saligna. (a) Após 5 dias de co-cultura. (b) Após 7 dias de cultivo em meio com canamicina. Os resultados obtidos nesse estudo podem ser utilizados para otimização do protocolo de transformação genética de E. saligna, porém diversos outros fatores ainda não elucidados também podem ter uma influencia positiva para o processo de transformação genética. CONCLUSÃO O uso da solução antioxidante, pré-cultivo e ressuspensão da bactéria em meio MS/2 aumentam eficiência da expressão transiente do gene uidA em explantes foliares de E. saligna. AGRADECIMENTOS À Professora Marguerite Quoirin por ter permitido a realização dessa pesquisa. 6 Expressão transiente... SILVA, A. L. L. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 1, p. 1-7, Jan./Feb. 2013 ABSTRACT: The aim of this research was to evaluate the effect of the pre-culture of leaf explants and the effect of the culture medium for the Agrobacterium tumefaciens resuspension to the explant infection. The media, MS/2 (half strength) and MS N/2 (10.3 mM NH4NO3 and 9.4 mM KNO3) + PGR (1.0 µM TDZ (thidiazuron) and 0.1 µM NAA (1-Naphthaleneacetic acid)) were tested for the bacteria resuspension. The pre-culture consisted of the maintenance of the explants on culture medium for callus formation (MS N/2+PGR) during one day and the treatment without pre-culture consisted of the use of the explants after the excision of the same ones. At the end of the co-culture, the MS/2 promoted results superiors to the MS N/2+PGR, and the area percentage that presented expression of the gene uidA was of 22.4% compared at 14.5%. To the 7 days of culture on a medium with kanamycin, the area percentage expressing the gene uidA was 1.6 in MS/2 and 0% for the MS N/2+PGR. At the end of the co-culture, the pre-culture produced results superiors to the found in the treatment without pre-culture, reaching 31.4% of expression and in the treatment without pre-culture 2.1%. After 7 days of culture on a medium with kanamycin, the area percentage of explant expression of the treatment with pre-culture stayed 4.8% and 0% for the treatment without pre-culture. The results indicate that the pre-culture and the bacteria resuspension in MS/2 increase the efficiency of the transient expression of the gene uidA in leaf explants of E. saligna. KEYWORDS: Woody Plant. Genetic transformation. EHA105. GUS gene. β-glucuronidase. REFERENCES AKAMA, K.; SHIRAISHI, H.; OHTA, S.; NAKAMURA, K.; OKADA, K.; SHIMURA, Y. Efficient transformation of Arabidopsis thaliana: comparison of the efficiencies with various organs, plant ecotypes and Agrobacterium strains. Plant Cell Reports, Berlin, v. 12, p. 7–11, 1992. ALCANTARA, G. B.; BESPALHOK FILHO, J. C.; QUOIRIN, M. Organogenesis and transient genetic transformation of the hybrid Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla. Scientia Agricola, Piracicaba, v. 68, p. 246-251, 2011. 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