Microsoft Word - 19-Agra_11699.doc 152 Original Article Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 1, p. 152-158, Jan./Feb. 2013 INTERAÇÃO DE Bacillus sp. COM A RIZOSFERA DE TRÊS ESPÉCIES DE PLANTAS FORRAGEIRAS INTERACTION OF RHIZOBACTERIA Bacillus sp. WITH PASTURES RHIZOSPHERE Fabio Fernando de ARAUJO1; Ricardo Anderson Bizelli PEDROSO2 1. Professor, Doutor, Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE, Presidente Prudente, SP, Brasil. fabio@unoeste.br ; 2.Graduando em Agronomia – UNOESTE, Presidente Prudente, SP, Brasil RESUMO: Foi realizado um estudo para investigar a colonização da rizosfera de plantas forrageiras por rizobactérias do gênero Bacillus, como também avaliar se a fertilidade do solo interfere nesta colonização bacteriana. Para isto foram coletadas amostras da parte radicular de Brachiaria decumbens, B. brizantha e Panicum maximum em 18 propriedades rurais com atividade pecuária na região oeste paulista, SP. Durante a condução do trabalho foram efetivadas análises de fertilidade do solo nas áreas amostradas. A quantificação de Bacillus spp. na rizosfera das plantas foi efetivada com o emprego da técnica do choque térmico e diluição seriada, finalizando-se com plaqueamento em meio de cultura. A colonização de Bacillus na rizosfera de plantas forrageiras apresentou-se com baixos valores e não houve correlação da colonização da rizosfera com a maioria dos parâmetros de fertilidade do solo. Apenas a matéria orgânica no solo se correlacionou de forma negativa com a colonização bacteriana na rizosfera. Não houve diferença significativa na colonização de Bacillus encontrada na rizosfera das três espécies de plantas forrageiras avaliadas. PALAVRAS-CHAVE: Rizobacteria. Brachiaria. Panicum. INTRODUÇÃO As gramíneas do gênero Brachiaria foram introduzidas no Brasil na década de 1950, porém, a verdadeira expansão ocorreu nas décadas de 1970 e 1980, principalmente nas regiões de clima mais quente (ZIMMER et al., 1988). A utilização da Brachiaria em pastagens no Brasil proporcionou aumento na produção animal de 20 kg para 180 kg de peso vivo/ha/ano, tornando-se a maior e mais ampla fonte de alimentação animal na produção de carne e de leite. Mais da metade das pastagens presentes no país hoje são baseados em braquiárias, uma área de aproximadamente 100 milhões de hectares (ANUALPEC, 2008). O gênero Panicum foi difundido pela cultivar Colonião, depois pelas cultivares Tobiatã, Aruana, Tanzânia e Mombaça. Em pastagens com uso racional de adubos e corretivos, a resposta das forrageiras desse gênero é bastante acentuada; já em situações de baixa fertilidade a produção é reduzida, caracterizando-a como forrageiras exigentes em fertilidade do solo (SILVA, 1995). As rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (RPCPs) habitam o solo e com frequência são isoladas da rizosfera de diversas plantas cultivadas. Os efeitos desses microrganismos sobre o desenvolvimento das plantas são amplos, incluindo os efeitos benéficos na germinação de sementes, emergência de plântulas e crescimento de plantas (LAZARETTI; BETTIOL, 1997). Dentro do grupo das rizobactérias o gênero Bacillus tem se destacado com algumas espécies de importância agrícola que desenvolvem ações benéficas às plantas (KLOEPPER, 1999). Entre os diversos mecanismos de ação para promover o crescimento de plantas impulsionado pelas rizobactérias está a produção de hormônios vegetais como auxinas (ASGHAR, et al.,2002). Sabe-se que as auxinas e as giberelinas, bem como seus precursores, têm sido os metabólitos de origem bacterianos que mais afetam o crescimento das plantas (BROWN, 1972). Entretanto, já foi relatado que rizobactérias, como as do gênero Bacillus, podem produzir concentrações de hormônios que proporcionam efeitos deletérios em plantas (KARADENIZ, et al., 2006). Outro mecanismo freqüentemente estudado nas rizobactérias é o da ação solubilizadora de fosfatos minerais (FREITAS et al., 1997). Ganhos na nutrição mineral em plantas inoculadas com Bacillus spp. têm sido destacado como benefício adicional derivado da presença deste grupo de microrganismos na rizosfera (ARAUJO, 2008). Rodrigues E Fraga (1999) citaram que estirpes do gênero Pseudomonas, Bacillus e Rhizobium estão entre as rizobactérias com maior poder de solubilização de fósforo. Richardson (2000) relatou que a maioria dos solos tropicais é pobre em fósforo disponível às plantas e que o fertilizante fosfatado representa um alto custo para o agricultor, desta forma é interessante desfrutar dos microrganismos do solo com potencial para solubilização de fósforo. Alem disso, outros mecanismos proporcionados pelas RPCPs estão relacionados com a ciclagem de nutrientes no solo, sob influencia de várias enzimas Received: 08/03/11 Accepted: 05/09/11 153 Interação de Bacillus... ARAÚJO, F. F.; PEDROSO, R. A. B. Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 1, p. 152-158, Jan./Feb. 2013 como: nitrogenases, quitinases e glucanases (CATTELAN, et al., 1999). Faz-se importante ressaltar que as RPCPs também são agentes potenciais para controle biológico de fitopatógenos (KLOEPPER, 1999). Algumas espécies podem suprimir doenças causadas por fungos, principalmente pela ação de antagonismo, relacionado à produção de antibióticos antifúngicos, como exemplo a iturina em Bacillus subtilis (ARAUJO et al., 2005). No entanto, embora haja inúmeros relatos positivos sobre as RPCPs quanto ao aumento na produção das culturas, crescimento de plantas e supressão de doenças, a utilização desses microrganismos como inoculante comercial nem sempre tem fornecido bons resultados o que tem dificultado a sua recomendação, pois comumente os isolados introduzidos apresentam dificuldades de se estabelecer e sobreviver nas diferentes condições edafoclimáticas (ATKINSON; WATSON, 2000). Salienta-se também que a interação de microrganismos com plantas podem ser úteis para o aumento da produtividade das pastagens evidenciando-se que as plantas forrageiras tiram pouco proveito dessas interações (MONTEIRO; COSTA, 1996). Portanto, justifica-se estudar a ecologia desses microrganismos na rizosfera de diferentes culturas e obter informação sobre a colonização de raízes, em condições de solos tropicais, com influência de fatores ambientais e interações com elementos químicos no solo. Neste sentido o objetivo deste trabalho foi de verificar a colonização da rizosfera de Brachiaria decumbens, Brachiaria brizantha e Panicum maximum, com bactérias do gênero Bacillus spp. como também a interação desta colonização com a fertilidade do solo. MATERIAL E METODOS O trabalho foi realizado durante o período de junho a outubro de 2009. Foram amostradas plantas adultas em 18 propriedades em cinco municípios da região Oeste de São Paulo. Em todas as propriedades visitadas buscou-se coletar plantas das espécies: Brachiaria brizantha, B. decumbens e Panicum maximum. Com base nas espécies vegetais encontradas nas propriedades o estudo foi realizado em oito locais de cultivo para cada espécie de gramínea com amostragem de cinco plantas em cada local, totalizando-se 24 locais onde foram coletadas 120 plantas. Em cada local de coleta de plantas procedeu-se também amostragem para coleta de solo (0-20 cm) visando efetivação da analise de fertilidade de acordo com metodologia de Raij et al. (2001). No procedimento da coleta as plantas foram retiradas com um pouco de solo aderido as raízes, colocadas em sacos plásticos, identificadas e levadas imediatamente ao laboratório para se proceder a avaliação de bactérias na rizosfera, utilizando a técnica de diluição seriada. De cada local de coleta foram retiradas três amostra de plantas. Inicialmente, cada amostra de planta, constituída de uma raiz inteira separada previamente da parte aérea, foi agitada vigorosamente para o desprendimento do solo que estava mais frouxamente aderido a ela. Após isto o conjunto da raiz mais o solo que permaneceu aderido foi considerado ambiente rizosférico (COELHO et al. 2007). Posteriormente, foi pesado 10 gramas de fragmentos (5 cm) das raízes e adicionados em erlenmeyer (250 mL) com 90 mL de solução salina (MgSO4.7H2O 0,01 M) esterilizada, visando-se facilitar o desprendimento das bactérias. Os erlenmeyers foram submetidos a três minutos de agitação, em agitador orbital mecânico (120 rpm). Para quantificação de bactérias do gênero Bacillus spp. foi retirado 1,0 ml da solução do erlenmeyer que foi colocado em tubo de ensaio com 9,0 mL de solução salina estéril e levado a banho Maria a 80ºC por 20 minutos, objetivando-se selecionar as bactérias deste gênero (BETTIOL, 1995). Em seguida a partir deste tubo de ensaio foi preparada uma diluição seriada, na base 10, empregando-se cinco tubos com 9,0 mL de solução salina estéril. Para a contagem das bactérias, alíquotas de 0,1 ml dos três últimos tubos da série de diluição foram transferidas para placa de petri com meio de cultura BDA (Batata 200g; dextrose: 20g: Agar) em duplicata e espalhadas com auxilio da alça de Drigalski. As placas foram incubadas em estufa a 28oC durante 72 horas. Após este período foram contadas as unidades formadoras de colônias em placas. Para análise estatística, os dados foram transformados em log de x e utilizou-se o teste de Scott-Knott a 5% para comparação das medias obtidas em cada local e espécie de planta. Empregou-se também a correlação de Pearson para avaliação dos resultados obtidos nas contagens bacterianas e nos parâmetros de fertilidade do solo RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados da fertilidade do solo nas áreas amostradas revelaram a predominância de solos ácidos com baixos valores de saturação por bases (Tabela 1). Apesar dos menores valores de 154 Interação de Bacillus... ARAÚJO, F. F.; PEDROSO, R. A. B. Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 1, p. 152-158, Jan./Feb. 2013 saturação por bases no solo ter sido encontrado nas áreas com cultivo de Brachiaria brizantha, Premazzi (1991) tinha observado baixa resposta desta gramínea à calagem encontrando-se maiores produções dessa forrageira quando a saturação por bases no solo atingiu 43%. Pode ser destacado também que as áreas com o cultivo de B. brizantha caracterizaram-se como de baixos teores de fósforo solúvel no solo. Com base nos resultados encontrados e de acordo com a recomendação de fertilidade de solo para cultivo de pastagens, apresentada em Spironello et al. (1997), pode-se inferir que a maioria das áreas de cultivo com P. maximum e B. decumbens atendem os padrões mínimos de recomendação da fertilidade do solo para o cultivo destas gramíneas no estado de São Paulo. Com relação a colonização de Bacillus na rizosfera, em média, foram encontrados valores da ordem de 104 a 105 bactérias por grama de raiz (Figura 1). Para fins de comparação não foram encontradas avaliações semelhantes em plantas forrageiras, disponíveis na literatura, contudo, estes valores são bem inferiores ao encontrado em estudo semelhante com avaliação da colonização de Bacillus em olerícolas (COELHO et al., 2007) o qual detectou valores da ordem de 107 bactérias por grama de raiz. Como também em estudo efetivado na rizosfera da gramínea Aristida adscensionis L., em condições de clima semi-árido, foram encontradas populações de bactérias gram positivas esporulantes da ordem de 106 a 107 células por g (GORLACH-LIRA; COUTINHO, 2007). Em estudo de quantificação de bactérias solubilizadoras de fosfatos em raízes de gramíneas na Amazônia também foram encontrados valores próximos a 107 bactérias por g de raiz (SYLVESTER-BRADLEY et al., 1982). Tabela 1. Características químicas dos solos amostrados Propriedade Cultura1 pH Mat. organica P K Ca Mg CTC Saturação por bases CaCl2 g dm -3 mg dm-3 ---------mmol dm-3-------- % Estancia São Geraldo B 4.4 8 9 2.5 10 8 52 39 Sitio Caiabu B 5.2 13 4 2.6 13 3 39 47 Sitio São Francisco B 4.9 16 5 2.4 12 4 44 42 Sitio Santo Antonio B 5.4 28 17 5.4 13 10 48 59 Sítio Indiana B 5.0 19 52 2.9 12 6 46 45 Sitio Mazetti B 4.9 27 5 2.7 15 11 67 43 Faz. Vale das Aguas B 4.9 16 2 2.2 12 7 49 43 Sitio Santa Aurora B 4.8 11 2 0.8 7 4 31 38 Sitio S. Antonio D 5.2 12 22 3.4 7 5 34 45 Estancia São Geraldo D 5.5 15 19 4.5 15 10 52 56 Sitio Santa Lourdes D 4.9 20 12 4.5 8 5 43 41 Chacara Santa Tereza D 5.6 12 50 2.6 17 4 41 57 Sitio Santa Clara D 4.8 14 3 1.3 7 3 35 32 Recanto Primavera II D 5.1 18 61 5.2 13 7 49 51 Recanto Primavera D 4.9 18 13 2.8 14 4 45 46 Sítio Mazetti D 4.9 22 5 2.9 10 10 56 41 Sitio S. Antonio P 6.0 12 50 2.3 13 5 33 62 Faz. Santa Rita Mom. P 5.9 24 65 1.0 21 9 48 65 Laticinio Pruden Leite P 5.4 16 6 2.8 17 5 43 57 Sitio Mazetti P 5.1 15 10 8.6 6 3 38 46 Estancia dos Pimenta P 4.2 13 1 0.9 3 1 35 14 Chacara JS P 5.4 16 27 4.2 10 5 39 49 Faz. Unoeste CII P 5.4 17 18 2.4 11 7 41 50 Fazenda Santa Rita II P 5.6 23 39 2.8 18 7 48 57 1- B=Brachiaria brizanta; D=Brachiaria decumbens; P= Panicum maximum 155 Interação de Bacillus... ARAÚJO, F. F.; PEDROSO, R. A. B. Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 1, p. 152-158, Jan./Feb. 2013 O efeito local proporcionou mais diferenças significativas na colonização de Bacillus sp nas braquiárias enquanto que Panicum maximum apresentou-se como de menor variação estatística no padrão de colonização da rizosfera dentro das diferentes localidades amostradas (Figura 1). B. decumbens 4,50 4,7 0 5,13 5, 19 5 ,36 5,47 5 ,66 5, 69 B. b ri za nth a 4,5 6 4,9 6 5 ,12 5, 22 5, 33 5,34 5,39 5 ,83 P. ma xi m un 4 ,56 4,8 5 4,9 0 5 ,04 5,14 5,1 8 5,3 4 5, 79 Figura 1. Colonização de Bacillus na rizosfera de Brachiaria decumbens, B. brizantha e Panicum maximum) em oito locais de cultivo. Valores expressos em log de células por grama de raiz. Valores com o mesmo padrão de cor não difere estatisticamente pelo teste Scott-Knott a 5% de probabilidade. No quesito de comparação da colonização por Bacillus entre as espécies analisadas, observou- se que não houve distinção estatística entre elas, as quais apresentaram, na média dos oito locais avaliados, colonização rizosférica em valores próximos de 2,0.105 (Tabela 2). A analise de correlação revelou que apenas o teor de matéria orgânica proporcionou correlação negativa com a concentração de Bacillus na rizosfera, de forma significativa (Tabela 3).Sobre isto pode-se inferir que no solo o carbono orgânico é a principal fonte de C para diversos grupos de microrganismos 156 Interação de Bacillus... ARAÚJO, F. F.; PEDROSO, R. A. B. Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 1, p. 152-158, Jan./Feb. 2013 e de que além da matéria orgânica presente no solo os exsudatos radiculares, dependendo da sua composição, pode favorecer microrganismos patogênicos ou benéficos a colonizarem a rizosfera (BADRI; VIVANCO, 2009). Tabela 2. Comparativo da colonização da rizosfera por Bacillus sp. entre as três espécies de plantas forrageiras analisadas. Espécies Log de células g raiz-1 Panicum maximum 5.10ª Brachiaria decumbens 5.21ª Brachiaria brizantha 5.21a Tabela 3. Correlação de Pearson (r) entre a concentração de Bacillus na rizosfera das gramíneas e variáveis de fertilidade de solo nas amostras coletadas. Variáveis Mat. Orgânica pH P K Ca MG Sat. de bases (V%) CTC Bacillus sp. na rizosfera -0,401* 0,014 NS -0,142 NS 0,080 NS -0,316 NS 0,083 NS -0,002 NS -0,224 NS *Significativo (P<0,05); Não significativo (NS) A escolha do nicho ecológico para as rizobactérias no solo tem influencia direta dos exsudatos radiculares pois a liberação dessas substâncias orgânicas pelas plantas hospedeiras tem importância fundamental para efetivação da maior ou menor colonização bacteriana na rizosfera (BAIS et al., 2004). No caso dos gêneros Brachiaria e Panicum foram descritos, em estudos recentes, que estas gramíneas produzem substâncias no sistema radicular que inibem o desenvolvimento de diversos grupos de bactérias, processo este conhecido como inibição da nitrificação biológica (SUBBARAO et al., 2009). A ausência de correlação encontrada na maioria das variáveis químicas analisadas permitem inferir que a fertilidade do solo não interferiu na colonização de Bacillus sp. na rizosfera das gramíneas avaliadas. Em análise semelhante efetivada na rizosfera de alface, Coelho et al. (2007) relataram que são necessários mais estudos para determinar como as características do solo interferem na seleção de bactérias pela planta hospedeira. A constatação de baixa colonização por Bacillus spp. na rizosfera das plantas forrageiras analisadas neste estudo, pode apontar para algum efeito inibitório relacionado a substâncias liberadas pelas raízes das plantas (SUBBARAO et al., 2009). O fato da correlação negativa entre a colonização bacteriana e o teor de matéria orgânica no solo indica que a maior disponibilidade deste substrato orgânico no solo seja mais atrativo para as bactérias, em situações desfavoráveis na rizosfera. Sobre este fato é importante ressaltar que o favorecimento de um gênero bacteriano em uma determinada rizosfera é uma importante característica que pode confirmar o sucesso de um inoculante bacteriano (ATKINSON; WATSON, 2000). Os resultados apresentados aqui permitem sugerir que as rizosferas das plantas forrageiras avaliadas não favoreceram a colonização de bactérias do gênero Bacillus, sendo esta constatação importante para ser considerada em programas de seleção de rizobactérias promotoras de crescimento para estas culturas. CONCLUSÕES A colonização de Bacillus na rizosfera de Brachiaria decumbens, B. brizantha e Panicum maximum apresentou-se com baixos valores e semelhantes entre as espécies. Dentre as características químicas do solo pela análise de rotina, apenas o teor de matéria orgânica apresentou correlação negativa com a concentração de Bacillus na rizosfera das três espécies de plantas forrageiras avaliadas. ABSTRACT: A study was conducted to investigate whether the rhizosphere of pastures promotes root colonization by rhizobacteria of the Bacillus genus, as also the fertility of this soil interferes with bacterial colonization. For this we collected samples of the root system of B. decumbens, B. brizantha and Panicum maximum in 18 farms with 157 Interação de Bacillus... ARAÚJO, F. F.; PEDROSO, R. A. B. Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 1, p. 152-158, Jan./Feb. 2013 cattle ranching in western Sao Paulo, Brazil. While driving to work were effective analysis of soil fertility in the sampled areas. Quantification of Bacillus spp. In the rhizosphere of plants was performed by employing the technique of thermal shock and dilution ending with plating on culture media. Colonization of Bacillus in the rhizosphere of pasture were considered low and there was no correlation between rhizosphere colonization with most of the parameters of soil fertility. Just organic matter in the soil correlated negatively with bacterial colonization in the rhizosphere. No significant difference was found in the colonization of Bacillus in the rhizosphere of three grassland species assessed. KEYWORDS: Rhizobacteria. Brachiaria. Panicum. 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