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Original Article 

Biosci. J., Uberlândia, v. 28, Supplement 1, p. 122-129, Mar. 2012 

VARIABILIDADE GENÉTICA DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS 
ASSOCIADAS A PLANTAS DE CANA-DE-AÇÚCAR CAPAZES DE 

SOLUBILIZAR FOSFATO INORGÂNICO 
 

GENETIC VARIABILITY OF SUGARCANE-ASSOCIATED DIAZOTROPHIC 

BACTERIA CAPABLE OF INORGANIC PHOSPHATE SOLUBILIZING 
 

Luana LIRA-CADETE1, Andreza Raquel Barbosa de FARIAS1, Andresa Priscila de Souza 
RAMOS2, Diogo Paes da COSTA3, Fernando José FREIRE4, Júlia KUKLINSKY-SOBRAL5 

1. Acadêmicas do curso de Agronomia, Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco (UAG/UFRPE), 
Garanhuns, PE, Brasil. luanalirac@gmail.com; 2. Professora, Mestre, UAG/UFRPE, Garanhuns, PE, Brasil; 3. Mestrando do curso de 

Pós-Graduação em Solos e Nutrição de Plantas, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, 
Piracicaba, SP, Brasil; 4. Professor, Doutor, Departamento de Agronomia, UFRPE, Recife, PE, Brasil; 5. Professora, Doutora, 

UAG/UFRPE, Garanhuns, PE, Brasil. 
 
RESUMO: A cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância agrícola, nacional e mundial, requerendo 

grandes quantidades de fertilizantes nitrogenados e fosfatados. Além disso, apresenta associação com bactérias que podem 
promover o desenvolvimento vegetal. O objetivo deste trabalho foi selecionar bactérias diazotróficas, associadas a plantas 
de cana-de-açúcar, capazes de solubilizar fosfato inorgânico e avaliar a variabilidade genética bacteriana. Para tanto, foram 
avaliadas 68 linhagens bacterianas diazotróficas, endofíticas de folha e raiz e do rizoplano, de plantas de três variedades de 
cana-de-açúcar. A seleção de bactérias solubilizadoras de fosfato inorgânico foi realizada em meio sólido suplementado 
com fosfato insolúvel, sendo avaliado o índice de solubilização. A análise da variabilidade genética foi realizada pela 
técnica de BOX-PCR. Os resultados revelaram que 74% das linhagens diazotróficas foram capazes de solubilizar fosfato, 
apresentando índices de solubilização diferentes. Foi observado que o tecido vegetal e a variedade de cana influenciaram a 
interação entre bactérias diazotróficas solubilizadoras de fosfato e plantas de cana. O BOX-PCR revelou alta variabilidade 
genética entre as linhagens analisadas. Logo, conclui-se que as bactérias diazotróficas associadas a plantas de cana-de-
açúcar avaliadas expressam a capacidade de solubilizar fosfato inorgânico e que algumas bactérias avaliadas pela técnica 
de BOX-PCR apresentam alta variabilidade genética. 

 
PALAVRAS-CHAVE: Bactérias endofíticas. Fixação de nitrogênio. Saccharum spp.  

 
INTRODUÇÃO 

 
Alguns micro-organismos, principalmente 

as bactérias, apresentam a capacidade de se associar 
às plantas e estimular o desenvolvimento destas. 
Essas bactérias podem se desenvolver no interior do 
hospedeiro, passando a ser chamadas de endofíticas, 
ou na parte externa, as chamadas epifíticas. 
Bactérias benéficas, endofíticas e epifíticas, podem 
ser encontradas habitando diversos nichos 
associados aos vegetais, onde os mais comuns são a 
rizosfera, rizoplano, raízes, caules e folhas 
(HARDOIM et al., 2008; HALLMANN et al., 1997; 
COMPANT et al., 2010). O estímulo ao 
desenvolvimento da planta, por algumas espécies de 
bactérias, pode ser realizado através da 
disponibilização de nutrientes, como o fósforo, pela 
sua solubilização, e o nitrogênio, pela fixação 
biológica do nitrogênio atmosférico (HARDOIM et 
al., 2008; BERG et al., 2009; COMPANT et al., 
2010). 

Atualmente, a cana-de-açúcar é cultivada 
em quase todos os estados brasileiros, com 
rendimento médio de 80 ton/ha e uma produção 

total de 690 milhões de toneladas, na safra 
2009/2010 (IBGE, 2010). Essa cultura apresenta-se 
com alta capacidade extratora, retirando do solo 
quantidades de nitrogênio maiores do que as 
habitualmente são fornecidas nas adubações. Esse 
processo pode ser explicado pela fixação biológica 
de nitrogênio (FBN) (BODDEY et al., 2003). Neste 
contexto, estudos conduzidos com inoculantes 
bacterianos têm apontado contribuições em torno de 
60% para o nitrogênio fixado biologicamente no 
cultivo da cana (POLIDORO et al., 2001). 

Além do nitrogênio, a cultura da cana requer 
grande quantidade de fertilizante fosfatado, devido 
as características dos solos em que são cultivadas 
(SIMÕES NETO et al., 2009), sendo este elemento 
um dos mais limitantes para o desenvolvimento dos 
vegetais, mesmo se adicionado como fertilizante 
químico, pois pode se tornar rapidamente 
indisponível, principalmente em solos mais 
intemperizados (CANBOLAT et al.,2006 ; 
GYANESHWAR et al., 2002).  

Portanto, torna-se importante a 
bioprospecção de isolados bacterianos com 
potencial para promover o desenvolvimento vegetal, 

Received: 30/06/11 
Accepted: 05/11/11 



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Variabilidade genética...  LIRA-CADETE, L. et al. 

Biosci. J., Uberlândia, v. 28, Supplement 1, p. 122-129, Mar. 2012 

que atuem com eficiência na solubilização de 
fosfato, contribuindo para um manejo sustentável da 
cana-de-açúcar. Contudo, além do conhecimento 
dos mecanismos fenotípicos de interação bactéria-
planta, é crucial o conhecimento da diversidade 
genética das bactérias, contribuindo para a 
utilização das mesmas como insumos biológicos 
para promoção do desenvolvimento vegetal das 
culturas agrícolas. Neste aspecto, as técnicas de 
biologia molecular têm contribuído para o 
conhecimento da variabilidade genética desses 
micro-organismos e do potencial biotecnológico a 
ser explorado (LEE; WONG, 2009; MARQUES et 
al., 2008). 

O objetivo deste trabalho foi selecionar 
bactérias diazotróficas associadas a variedades de 
cana-de-açúcar, cultivadas em Pernambuco, capazes 
de solubilizar fosfato inorgânico, in vitro, e avaliar a 
sua variabilidade genética através da técnica de 
BOX-PCR. 
 
MATERIAL E MÉTODOS 
 
Linhagens bacterianas 

Foram avaliadas 68 linhagens bacterianas 
diazotróficas, sendo 26 do rizoplano, 28 endofíticas 
de folha e 14 endofíticas de raiz, oriundas de plantas 
de três variedades de cana-de-açúcar (RB92579, 
RB867515 e RB863129), cultivadas na Usina 
Petribú Ltda., situada no município de Lagoa de 
Itaenga, PE. As linhagens pertencem à coleção de 
culturas microbianas do Laboratório de Genética e 
Biotecnologia Microbiana (LGBM) da Unidade 
Acadêmica de Garanhuns (UAG/UFRPE). 
 
Seleção de bactérias solubilizadoras de fosfato 
inorgânico in vitro 

A seleção de bactérias solubilizadoras de 
fosfato inorgânico foi realizada segundo 
metodologia descrita por Verma et al. (2001), com 
algumas modificações. As bactérias foram 
inoculadas em placas contendo meio de cultura 
sólido acrescido de fosfato insolúvel, tendo como 
fonte fosfato de cálcio bibásico. A seguinte 
formulação compõe o meio de cultura: 10g/L de 
glicose; 5g/L de NH4Cl; 1g/L de NaCl;1g/L de 
MgSO4.7H2O; 4g/L de CaHPO4; 15g/L de agar; 
pH7,2, e em seguida incubadas a 28°C por 72h. Os 
experimentos foram realizados em triplicatas e a 
presença de halo translúcido em torno da colônia 
indicou a solubilização do fosfato, indicando a 
atuação de enzimas fosfatases, excretadas pelo 
metabolismo bacteriano, que acidificam o meio de 
cultura convertendo o fosfato de cálcio em íons 
solúveis (H2PO4

− e  HPO4
−2) (TAURÍAN et al., 

2010). Os índices de solubilização (IS), método 
semi-quantitativo, foram obtidos a partir da razão do 
diâmetro do halo de solubilização (ØHS) pelo 
diâmetro da colônia (ØC) por meio da formula: 
IS=ØH / ØC. As linhagens foram classificadas em 
três grupos em relação ao índice de solubilização: 
BAIXO (IS < 2); MÉDIO (2≤IS<4); e ALTO (IS>4) 
(BERRAQUERO et al., 1976).  

Os dados dos índices de solubilidade foram 
transformados em raiz de x+1 para atender aos 
requisitos estatísticos e submetidos a análise de 
variância (ANOVA), e as médias foram comparadas 
através do teste de Scott-Knott (P<0,05), pelo o 
software estatístico SISVAR® versão 5.3.  

 
Análise da diversidade genética bacteriana por 
meio de BOX-PCR 

As linhagens foram cultivadas em meio 
líquido TSA (Tripcase Soy Agar), a partir de 
colônias isoladas, mantidas sob agitação constante 
de 120 rpm por 24 horas, a temperatura de 28°C. 
Quatro mililitros da cultura bacteriana foram 
centrifugados, a 12000 g por 5 min, para 
precipitação das células bacterianas, sendo 
descartado o sobrenadante. O precipitado celular foi 
ressuspendido em 200µ L de TE (10 mM de Tris-
HCl; pH 8,0) e submetido à extração de DNA. 

O DNA genômico bacteriano foi extraído 
com a utilização do Genomic DNA Purification Kit 
(Fermentas), de acordo com a metodologia do 
protocolo recomendado pelo fabricante. A reação de 
PCR foi realizada com o primer BOX-A1R 
(5´CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3´), em 
um volume final de 25 µL contendo 0,5 a 10 ng de 
DNA molde; 1 µM do primer; 0,6 mM de cada 
dNTPs; 7,5 mM de MgCl2 e 0,08 U da enzima Taq 
DNA polimerase em 20 mM de Tris-HCl pH 8,4 e 
50 mM KCl. A reação foi realizada em 
termociclador programado para realizar uma 
desnaturação inicial a 95°C por 5 min, 35 ciclos de 
desnaturação a 94°C por 2 min, anelamento a 50°C 
por 1 min e extensão de primer a 65°C por 2 min, 
seguida de extensão final a 65°C por 10 min. Após a 
amplificação, a reação foi avaliada por eletroforese 
em gel de agarose (1,5% p/v) em tampão 1x TAE 
(40 mM de Tris-acetato; 1 mM de EDTA) e corado 
com Blue green loading dye, segundo as 
especificações do fabricante. A observação foi 
realizada sobre luz ultravioleta no transluminador 
horizontal e fotodocumentado.  

Os perfis de bandas observados foram 
transformados em uma planilha binária e em 
seguida utilizados para obter um dendrograma de 
similaridade calculado através do Coeficente de 
Jaccard e agrupado utilizando o algoritmo UPGMA 



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(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical 
Average), utilizando o software PAST versão 1.90. 

 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 

Diversos estudos foram realizados com 
bactérias solubilizadoras de fosfato 
(GYANESHWAR et al., 2002; KUKLINSKY-
SOBRAL et al., 2004; DIAS et al. 2009), para 
avaliar a capacidade destes isolados de interagir 
com as plantas e promover seu desenvolvimento, no 
entanto, diversos fatores interferem na interação, 
como por exemplo, o genótipo do hospedeiro, nicho, 
idade do mesmo, entre outros (COMPANT et al., 
2010). 

Das linhagens avaliadas, 75% apresentaram 
capacidade de solubilizar fosfato inorgânico in vitro. 
Foi observado que a raiz foi o nicho que apresentou 

maior frequência de linhagens solubilizadoras de 
fosfato, acima de 84%, seguido da folha e rizoplano 
(Figura 1). Avaliando-se o IS apenas das bactérias 
solubilizadoras, foi observado que 36% foram 
classificadas com médio IS e linhagens de baixo e 
alto IS com 24% e 15% , respectivamente. Esses 
resultados estão de acordo com os verificados por 
Alam et al. (2002), que isolaram bactérias 
solubilizadoras de fosfato isoladas da rizosfera de 
variedades de milho e encontraram maior frequência 
de linhagens com médio índice de solubilização. A 
cana-de-açúcar, pertence a família Poaceae, assim 
como o milho, e possui forte interação com 
bactérias capazes de solubilizar fosfato, uma vez 
que todos os nichos estudados apresentaram uma 
frequência de linhagens solubilizadoras, como no 
presente trabalho. 

 
Figura 1. Frequência relativa de bactérias diazotróficas solubilizadoras de fosfato inorgânico isoladas do 

rizoplano e endofíticas de folha e raiz de variedades de cana-de-açúcar cultivadas em Pernambuco. 
 

 
Taurian et al. (2010) estudaram 433 isolados 

bacterianos endofíticos e epifíticos isolados de 
amendoim e observaram que 35% foram capazes de 
solubilizar fosfato in vitro. Naik et al. (2008) 
testaram 443 linhagens do gênero Pseudomonas 
isoladas de banana e arroz, destas apenas 18% se 
mostraram capazes de solubilizar fosfato in vitro. 
Comparando com os resultados do presente 
trabalho, a proporção de bactérias capazes de 
solubilizar fosfato, encontradas na cana, foi bem 
maior do que a dos referidos trabalhos, confirmando 
mais uma vez a forte interação que a cana-de-açúcar 
apresenta para as condições estudadas e para estas 
variedades, com bactérias solubilizadoras de fosfato. 

Quanto às variedades de cana-de-açúcar, foi 
observado maior frequência de bactérias 
solubilizadoras associadas à variedade RB92579, 
com 92% das suas linhagens apresentando 
capacidade de solubilizar fosfato inorgânico, 
seguido da variedade RB 867515 e RB863129, com 

71% e 58% das suas linhagens positivas para a 
solubilização de fosfato, respectivamente (Figura 2). 

Verificando os índices de solubilização (IS) 
em relação do nicho, as linhagens foram 
classificadas em grupos, sendo IS<2 classificado 
como potencial baixo, 2≤IS<4, classificado como 
potencial médio e IS>4 como alto potencial de 
solubilização em meio sólido. O nicho rizoplano foi 
o que proporcionou maior frequência de bactérias 
que apresentaram alto índice de solubilização, 
enquanto que os nichos folha e raiz apresentaram 
maior frequência de bactérias que apresentaram IS 
médio (Figura 3). 

Silva Filho et al. (2002) recomendam que a 
linhagem ideal para ser usada em programas de 
manejo com inoculação microbiana, deve apresentar 
diversas características benéficas, como a fixação 
biológica de nitrogênio e altas taxas de solubilização 
de fosfato, pois quanto maior a capacidade de 
solubilização da linhagem utilizada como 



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inoculante, maior será a quantidade de nutrientes 
disponibilizado para a cultura. 

 

 

 
 

Figura 2. Frequência relativa de bactérias diazotróficas solubilizadoras de fosfato inorgânico isoladas de três 
variedades cana-de-açúcar (RB92579, RB867515 e RB863129) cultivadas em Pernambuco. 

 
 

 
Figura 3. Frequência relativa de bactérias diazotróficas solubilizadoras de fosfato inorgânico isoladas do 

rizoplano e endofíticas de folha e raiz de variedades de cana-de-açúcar cultivadas em Pernambuco, 
agrupadas quanto ao índice de solubilização como: Baixo (IS < 2), Médio (2≤IS<4) e Alto (IS>4). 

 
As bactérias, incluindo as endofíticas, para 

entrarem em associação com a planta hospedeira e a 
colonizarem, provavelmente, foram inicialmente 
colonizadoras da rizosfera, uma vez que as fissuras 
formadas durante o crescimento radicular são a 
principal fonte de entrada desses micro-organismos 
(COMPANT, et al. 2010). Como o sistema radicular 
é a porta de entrada e nicho preferencial de bactérias 
associadas às plantas, então é de se esperar que 
fosse, também na raiz, encontrado a maior 
frequência de linhagens solubilizadoras de fosfato, 
no entanto foi o nicho folha que se sobressaiu após o 
nicho rizoplano, como Kuklinsky-Sobral et al. 
(2004) que também observaram maior freqüência de 
bactérias solubilizadoras de fosfato inorgânico em 

folhas de soja, em relação a raiz e caule. 
A análise de variância mostrou que houve 

interação significativa entre as variáveis: nicho 
(tecido vegetal) e variedades de cana (Tabelas 1 e 
2), e que a variedade não influenciou 
significativamente (p<0,05) na população de 
bactérias diazotróficas solubilizadoras de fosfato. A 
interação significativa entre nicho e variedade de 
cana confirmou que fatores como o genótipo do 
hospedeiro, também como o local do qual as 
linhagens foram isoladas podem influenciar o 
comportamento da mesma, como relatado em alguns 
trabalhos (GYANESHWAR et al., 2002; 
KUKLINSKY-SOBRAL et al., 2004; COMPANT 
et al., 2010). 



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Tabela 1. Análise de variância do índice de solubilização considerando-se o nicho (tecido vegetal) e as 
variedades de cana. 

FV QM Fc Pr>Fc 
Variedade  0.304 1.387 0.253 
Nicho 2.478 11.291 0.000 
Nicho*Variedade 0.830 3.782 0.012 
CV (%) 25.35   

 
Tabela 2. Média do índice de solubilização de fosfato inorgânico de bactérias diazotróficas isoladas do 

rizoplano e endofiticamente de folha e raiz de variedades de cana-de-açúcar cultivadas em 
Pernambuco. Valores na mesma linha, seguidos por letras minúsculas iguais, e valores na mesma 
coluna, seguidos por letras maiúsculas iguais, não diferem entre si ao nível de 5% pelo teste de 
Scott-Knott. 

NICHO VARIEDADES 
 RB92579 RB867515 RB863129 

Endofíticas de Folha 3,18 aA 1,52 bB 2,32 aA 
Endofíticas de Raiz 0,96 bB 2,11 aA -- 
Rizoplano 3,24 aA 3,57 aA 3,51 aA 

 
Das linhagens de bactérias diazotróficas 

capazes de solubilizar fosfato inorgânico, 23 
linhagens foram selecionadas para análise da 

variabilidade genética pela técnica de BOX-PCR. A 
análise do agrupamento (Figura 4). 

 

 
Figura 4. Dendrograma obtido pelo agrupamento realizado pelo algoritmo UPGMA (Unweighted Pair-Group 

Method with Arithmetical Average) a partir da matriz de similaridade genética entre bactérias 
fixadoras de nitrogênio e solubilizadoras de fosfato inorgânico associadas a plantas de cana-de-
açúcar. O coeficiente de Jaccard foi utilizado para a construção da matriz de similaridade. Os números 
nos nós do dendrograma indicam o valor da porcentagem de vezes que o grupo ocorreu no mesmo nó 
durante o Bootstrap de 1000 repetições. 

 

 

 

1
0
0

3
6

1
3

2
0

0

1
7

6
7

6
8

5

2
9

2
7

4
0

4
6

7
7

9

5
1

3
7

1
0

3
6

4
5

0

0
.1

0
.2

0
.3

0
.4

0
.5

0
.6

0
.7

0
.8

0
.9 1

Similarity

UAGC783

UAGC806

UAGC852

UAGC827

UAGC775

UAGC771

UAGC767

UAGC854

UAGC849

UAGC835

UAGC838

UAGC824

UAGC845

UAGC772

UAGC773

UAGC769

UAGC796

UAGC784

UAGC839

UAGC843

UAGC814

UAGC828

UAGC825

Cluster 

Cluster 

Cluster III 



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O coeficiente de similaridade de Jaccard 
evidenciou três grupos distintos (clusters) com alta 
variabilidade entre as linhagens, apresentando, no 
máximo, 83% de similaridade entre poucas 
linhagens. Contudo, destacam-se os agrupamentos 
entre as linhagens UAGC775 e UAGC771, que 
apresentaram o maior grau de similaridade, e entre 
as linhagens UAGC772 e UAGC773, que 
apresentaram o segundo maior grau de similaridade, 
sendo todas isoladas de folhas de plantas da 
variedade RB92579 de cana-de-açúcar. Esse 
resultado foi semelhante ao encontrado por Naik et 
al. (2008), que encontraram cerca de três clusters, 
com perfis que apresentaram até 80% de 
similaridade, contudo, apesar dos autores terem 
avaliado bactérias solubilizadoras de fosfato, essas 
bactérias foram isoladas em meio especifico para 
Pseudomoniaceae, enquanto que no presente 
trabalho, a seletividade utilizada foi a capacidade de 
fixar biologicamente o nitrogênio atmosférico e 
solubilizar fosfato inorgânico. 
 

CONCLUSÕES 
 
Os nichos (rizoplano e endofíticas de folha e 

raiz) influenciaram a frequência de bactérias 
diazotróficas solubilizadoras de fosfato associadas a 
cana-de-açúcar em relação a expressão do índice de 
solubilização. 

A variedade RB92579 de cana-de-açúcar 
apresentou maior interação com linhagens de 
bactérias diazotróficas que apresentaram alto índice 
de solubilização de fosfato. 

Bactérias diazotróficas capazes de 
solubilizar fosfato inorgânico, associadas a plantas 
de cana-de-açúcar, apresentaram alta variabilidade 
genética. 

 
AGRADECIMENTOS 

 
As instituições de fomento FACEPE e 

CNPq, pelas bolsas e apoio financeiro; e, ao grupo 
do Laboratório de Genética e Biotecnologia 
Microbiana da UAG/UFRPE.  

 
 

ABSTRACT: The sugarcane is a culture of great importance for the Brazilian agriculture. Every year this 
culture consumes great amounts of nitrogen and phosphate fertilizers. However, the use of plant growth-promoting 
bacteria can reduce the use of the chemical fertilizers, contributing to the economy and the environment conservation. So, 
the goal of this study was to select sugarcane-associated diazotrophic bacteria able to solubilize inorganic phosphate and to 
evaluate the genetic diversity of these bacteria. A total of 68 diazotrophic bacteria, leaf and root endophytic and rizoplane, 
of three sugarcane varieties. The selection of inorganic phosphate solubilizing diazotrophic bacteria was assayed by the 
solubilization index (SI) in solid medium containing insoluble phosphate. The genetic variability was analyzed by the 
BOX-PCR technique. The results showed that 74% of the diazotrophic strains were able to solubilize inorganic phosphate, 
presenting classes of different SI. The results showed that the vegetal tissue and the genotype plant influenced in the 
interaction between phosphate solubilizing diazotrophic bacteria and sugarcane plants. BOX-PCR revealed high genetic 
variability among the strains analyzed. So, sugarcane-associated diazotrophic bacteria express the capacity to solubilize 
inorganic phosphate and they present high genetic diversity. 
 

KEYWORDS: Endophytic bacteria. Nitrogen Fixation. Saccharum spp.  
 
 
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