Microsoft Word - 6-Agra_18172 512 Original Article Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 2, p. 512-524, Oct./14 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA, GENÉTICA E PATOGENICIDADE DE ISOLADOS DE Rhizoctonia solani PROVENIENTES DE ALGODOEIROS NO BRASIL MORPHOLOGICAL, GENETIC CHARACTERIZATION AND PATHOGENICITY OF Rhizoctonia solani ISOLATES FROM COTTON IN BRAZIL Amanda Cabral Corrêa OLIVEIRA1; Paulo Estevão de SOUZA2; Edson Ampélio POZZA2; Antônia dos Reis FIGUEIRA2; Gabriel Dornelas AVELAR3; Eliane Aparecida GOMES4; Fernando Pereira MONTEIRO3 1. Universidade Federal de Lavras - UFLA, Departamento de Fitopatologia, Lavras, MG, Brasil. amandacco@hotmail.com; 2. Professor(a), Doutor(a), Universidade Federal de Lavras, UFLA, Departamento de Fitopatologia, Lavras, MG, Brasil; 3. Doutorando, Departamento de Fitopatologia - UFLA, Lavras, MG, Brasil; 4. Pesquisadora da Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG, Brasil. RESUMO: A espécie Rhizoctonia solani é um patógeno importante na cultura do algodão associada a doenças conhecidas como tombamento e mela. A variabilidade entre os isolados são extremamente importantes, porque existem diferenças entre os grupos de anastomose, tomadas como aqueles isolados capazes de trocar informações genéticas entre si. A caracterização morfológica, quando confirmada pela a caracterização genética fornece informações concretas sobre a distribuição do isolados quando agem como um agente patogênico. O objetivo foi identificar e caracterizar os grupos de anastomose no Brasil e confirmá-los pela caracterização genética. Foram consideradas 51 isolados de Rhizoctonia solani com o objetivo de caracterizar os grupos de anastomose e determinar a patogenicidade. A caracterização morfológica foi realizada observando-se o número de núcleos, morfologia da colônia e identificação de grupos de anastomose (AG). Na caracterização genética foram sequenciados e analisados os fragmentos genômicos contendo as regiões 5.8 S, ITS1 e ITS2, comparando-se os isolados listados no GenBank. A patogenicidade foi avaliada utilizando a escala de infecção com graus que variam de 1 a 4. Considerando-se o AG foram identificados 36 de 51 isolados como AG-4 e dois isolados como AG-7, 13 isolados não tiveram classificação. Em análises moleculares foram confirmados os 36 isolados identificados pela caracterização morfológica e mais 10 isolados como AG-4. Todos os isolados AG-7 foram confirmados e encontrado mais um nas análises moleculares. Para a patogenicidade verificou-se que cinco isolados não diferem do controle. A virulência intermediária e alta virulência foram observadas em 16 e 24 isolados, respectivamente, com médias 2,52-3,3 e 3,4-3,9. PALAVRAS-CHAVE: Algodão (Gossypium hirsutum L.). Necrotrófico. Tombamento. Biologia molecular. Virulência INTRODUÇÃO Rhizoctonia solani Kühn é a fase assexuada de Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk, um basidiomiceto da família Ceratobasidiaceae (SNEH et al., 1991). O conhecimento de características morfológicas, culturais, grupos de anastomose (AG) e de patogenicidade das populações de R. solani pode elucidar importantes aspectos ligados à sua etiologia e epidemiologia, fornecendo subsídios para o estabelecimento de medidas de controle mais eficientes no campo (OGOSHI, 1987). Os AGs podem ser caracterizados pela manifestação de compatibilidade somática entre os indivíduos, através da anastomose de hifas (fusão). Há isolados representando diferentes AGs em função da incompatibilidade desta reação entre alguns grupos (ANDERSON, 1982). Existem reconhecidos quatorze grupos de anastomose de hifas em R. solani e numerosos subgrupos (SNEH et al., 1991; CARLING et al., 1999). Em algodoeiro, o grupo de anastomose AG- 4 é identificado frequentemente como o agente etiológico do tombamento em pré e pós-emergência (SINCLAIR, 1965; MOUSTAFA-MAHMOUD et al., 1993; GOULART, 2001; SANTOS et al., 2005), bem como na recente doença conhecida por “mela do algodoeiro”, em que os sintomas iniciais caracterizam-se por lesões nas bordas dos cotilédones, as quais evoluem para o encharcamento, seguida de destruição total dos cotilédones e morte da plântulas. Goulart et al. (2011) comprovaram a ocorrência de mela por R. solani AG4-HGI em plântulas de algodoeiro no Brasil, sendo que em casos mais severos tem levado a ressemeadura. Isolados de AG-7 foram registrados na Geórgia e no Mississippi, EUA, também causando tombamento em algodoeiro (BAIRD, 1997; BAIRD et al., 2000). Os isolados de R. solani AG-4 e AG-7 têm hospedeiros, morfologia e produzem sintomas similares; consequentemente, isolados AG-7 nos Estados Unidos podem ter sido equivocadamente identificados como AG-4 (BAIRD Received: 20/09/12 Accepted: 20/02/14 513 Caracterização morfológica... OLIVEIRA, A. C. C. et al Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 2, p. 512-524, Oct./14 et al., 2000). O último grupo de anastomose a ser identificado, foi o AG-13; os isolados foram obtidos de raízes doentes de algodoeiro em campos da Geórgia (CARLING et al., 2002). No Brasil, o principal agente causal do tombamento de plântulas é R. solani AG-4, devido à frequência com que ocorre (mais de 95% dos casos) e pelos danos causados nas plântulas durante a fase de estabelecimento da lavoura (GOULART, 2007). Rosa et al. (2005) relataram também a associação não patogênica do AG-7 à batata em áreas de cultivo de Ponta Grossa, PR. Entretanto, não foram encontrados relatos de R. solani AG-11 e AG-13 associado ao algodoeiro no país. Para inferir relações taxonômicas entre os diferentes AGs de R. solani por métodos moleculares, utiliza-se extensivamente o operon, que codifica o RNA ribossomal (rRNA) (WHITE et al., 1990; GONZALES et al., 2001), além da sequência de nucleotídeos das regiões espaçadoras internas do rDNA (ITS1 e ITS2), os quais podem embasar a proposição de uma nova classificação (OGOSHI, 1987; SNEH et al., 1991; LIU; SINCLAIR, 1993). Meinhardt et al. (2002), produziram um padrão de bandas específico para o grupo de anastomose AG-4 e seus subgrupos, que permitiu identificar onze genótipos entre os dezoito isolados de R. solani, obtidos de feijão. Oliveira (2008) avaliando isolados padrão e de campo, por árvore filogenética observou a aproximação entre os grupos de anastomose AG-4 e AG-7, com 93% de similaridade, enquanto entre isolados AG-4, a similaridade foi de 100%. Assim, objetivou-se neste estudo, identificar os isolados de Rhizoctonia solani obtidos em áreas produtoras de algodão, nos estados da Bahia, Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul e Minas Gerais, classificá-los quanto ao grupo de anastomose, por análises morfológicas e genéticas, bem como confirmar sua patogenicidade. MATERIAL E MÉTODOS Os experimentos foram conduzidos nos Laboratórios de Epidemiologia e Fitovirologia Molecular do Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal de Lavras. Caracterização morfológica dos isolados de Rhizoctonia solani Para a obtenção dos 51 isolados foram selecionadas regiões produtoras de algodão nos estados da Bahia (6 isolados), Goiás (2 isolados), Mato Grosso (7 isolados), Mato Grosso do Sul (2 isolados) e Minas Gerais (34 isolados), cujas lavouras tinham histórico de doenças causadas por R. solani. Em cada lavoura foram coletadas plantas em reboleiras com sintoma de tombamento e/ou mela. Realizou-se o isolamento direto, a partir de fragmentos das plantas coletadas, utilizando-se placas de Petri preenchidas com 12 mL de meio de cultura Ágar-Água (AA). Após 24 e 48 horas, as colônias com hifas características de Rhizoctonia sp. foram repicadas para placas de Petri com 12 mL de meio Batata-Dextrose-Ágar (BDA) e monitoradas por 15 dias, observando-se hifas septadas, não formação de esporos e características típicas de colônia de Rhizoctonia sp. Em ambas as etapas, as placas foram incubadas em câmara de germinação (BOD), à temperatura de 20ºC. Para contagem de núcleos, as hifas de culturas ativas foram transferidas para lâminas e coradas com Safranim-O (BANDONI, 1979). A identificação dos grupos de anastomose foi realizada pelo método de Parmeter modificado (CARLING et al., 1987). Em lâminas flambadas contendo meio ágar-água 2% foram pareados os discos de micélio do isolado-teste (AG-4 e AG-7) e do isolado de campo, em extremidades opostas. As lâminas foram acondicionadas em câmara úmida e incubadas em BOD, a 20ºC por 24-48 horas, monitoradas em microscópio de luz até a observação da sobreposição. Em seguida, as lâminas foram coradas com azul de tripan 0,05% em lactofenol e reexaminadas ao microscópio estereoscópico com câmara digital, quanto à anastomose da hifa. Para a certificação da anastomose, a fusão da parede celular e plasmalema acompanhada da morte de células adjacentes (reação K), foram visualizadas em, pelo menos, dez sítios de fusão para cada leitura de anastomose positiva. Obtendo-se 51 isolados de campo. Caracterização molecular dos isolados de Rhizoctonia solani Para a extração de DNA, os 51 isolados de R. solani foram cultivados em 50 mL de meio líquido de extrato de malte e incubados em agitador (80rpm) à temperatura ambiente por três dias. O micélio produzido foi filtrado em filtro de porcelana com o auxílio da bomba de vácuo e, em seguida, macerado em nitrogênio líquido na presença de polivinil pirrolidona (PVP). A extração do DNA genômico total foi obtido pelo o método descrito por Moller et al. (1992). O DNA obtido foi analisado por eletroforese em gel de agarose (0,7%). Procedeu-se a PCR (Polymerase Chain Reaction) nos isolados de R. solani, utilizando-se um par de primers para as regiões do rDNA, denominados ITS 4 (5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’) e ITS 514 Caracterização morfológica... OLIVEIRA, A. C. C. et al Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 2, p. 512-524, Oct./14 5 (5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’). A reação foi composta por 2µL do DNA, 5µL do tampão 10X (0,5M Tris-HCl, 0,7M KCl, 0,1M MgCl2 pH 8,0), 1,5µL de MgCl2 (50mM), 1µL de dNTP (2mM), 2µL de cada primer na concentração de 10ρmol/µL, 1µL de Taq DNA polimerase (5un/µL), 35,5µL de água ultrapura. A amplificação foi realizada no termociclador PCT-100 (MJ Research, Inc. USA), empregando-se 35 ciclos de 40 segundos, a 94ºC, 1 hora a 55ºC, 2 minutos a 72ºC, seguido de um ciclo final de 5 minutos a 72ºC. O produto da PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose (0,7%). A purificação do DNA foi feita direto do produto de PCR e os isolados que não apresentaram bom resultado ou que apresentaram mais de uma banda foram repetidos, utilizando-se a purificação a partir do gel de agarose, ambos, utilizando-se o kit Wizard(Promega), seguindo-se as recomendações do fabricante. O sequenciamento foi realizado no Laboratório NBA, do Núcleo de Biologia Aplicada, Embrapa, Sete Lagoas, MG. A reação foi composta por 2µL do Mix Big Dye® (Applied Bioystems), 1µL do primer ITS4 ou ITS5, 2µL do tampão 5X (buffer dilution), 3,5µL de água ultrapura e 1,5µL de DNA. A amplificação foi realizada no termociclador, utilizando-se o programa ABI. Em seguida, realizou-se a purificação da reação, de acordo com as instruções do fabricante. E o produto foi injetado no sequenciador ABI3100. Após a correção, com o auxílio dos cromatogramas, as sequências foram analisadas, fazendo-se a comparação das mesmas entre si e com outros 15 isolados de R. solani disponíveis no Gene Bank (NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION, 2009), (Tabela 1). Para o alinhamento múltiplo, foi utilizado o programa Clustalw (EUROPEAN MOLECULAR BIOLOGY LABORATORY, 2009) e, para a análise filogenética, foi utilizado o programa Mega 4.1 (MOLECULAR EVOLUTIONARY GENETICS ANALYSIS, 2009). Foram construídas árvores filogenéticas, com bootstrap de 2.000 repetições, considerando-se somente os valores superiores a 50%. TABELA 1. Origem dos isolados publicados no banco internacional de dado de Rhizoctonia solani e Rhizoctonia binucleada. Isolados AG* Procedência AB286941 AG-P Japão AY684924 AG-4 Taiwan DQ102449 AG-4 Israel EF429313 AG-A China AF354100 AG-7 México EF203246 AG-4 Vietnan EF203248 AG-4 Vietnan EF203251 AG-4 Vietnan EU244842 AG-4 Suíça FJ440198 AG-4 China FJ746914 AG-4 Estados Unidos FJ746938 AG-4 Estados Unidos FJ746974 AG-4 Estados Unidos AY270002 AG-4 GO, Brasil FJ746939 AG-4 Estados Unidos * AG = grupo de anastomose Determinação da patogenicidade dos isolados de Rhizoctonia solani A patogenicidade dos 51 isolados foi determinada utilizando-se o método in vitro desenvolvido por Eken e Demirci (2004) e modificado por Oliveira et al. (2008). De acordo com este método, sementes de algodão da cultivar Delta Opal foram desinfestadas superficialmente ao imergir as semente em NaOCl (1%), por cinco minutos, seguida da tríplice lavagem das mesmas em água corrente, sendo transferidas para a câmara de fluxo laminar para o processo de secagem. Quando secas, foram distribuídas 10 sementes de algodão de forma circular em placas de Petri (15 cm de diâmetro), preenchidas com 20 mL de meio AA. No centro de cada placa foi disposto um disco de 9 mm, provindo de colônias do patógeno com três dias de idades, desenvolvidas no escuro, a 20ºC. Na 515 Caracterização morfológica... OLIVEIRA, A. C. C. et al Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 2, p. 512-524, Oct./14 testemunha foi adicionado o disco de meio de meio de cultura contendo o inóculo. As placas foram incubadas em câmaras de crescimento, à temperatura de 20°C, mantidas por quatro dias no escuro e por mais seis dias, em fotoperíodo de 12 horas. O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado com 5 repetições, sendo a unidade experimental uma placa de Petri com 10 sementes. A severidade da doença foi medida adaptando-se escala com notas de 1 a 4, em que: 1 – sem sintomas, plântula sadia; 2 – radícula infectada e hipocótilo sadio; 3 – radícula e hipocótilo infectados e 4 – necrose completa da plântula ou completamente podre ou, ainda, semente não germinada. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa Sisvar® (FERREIRA, 2000). RESULTADOS E DISCUSSÃO Caracterização morfológica dos isolados de Rhizoctonia solani Os 51 isolados foram identificados como R. solani, pois apresentaram hifas septadas, bem definidas e foram observados mais de dois núcleos dentro de cada célula vegetativa da hifa, sendo então, classificada como multinucleada. As colônias apresentaram coloração de bege a marrom e todas produziram escleródios, obedecendo aos critérios de classificação baseados na citomorfologia da hifa e morfologia da colônia, sugeridos por Sneh et al. (1991). Quanto ao grupo de anastomose, dos 51 isolados testados, 36 (70,59%) se comportaram como AG-4, sendo 14 da região norte de Minas, 11 do Triângulo Mineiro, 4 da Bahia, 1 de Goiás, 5 do Mato Grosso e 1 do Mato Grosso do Sul. O grupo de anastomose AG-4 no algodoeiro, é frequentemente encontrado causando tombamento de pré e pós-emergência (SINCLAIR, 1965; MOUSTAFA-MAHMOUD et al., 1993; GOULART, 2007). Pertencentes a AG-7, apenas 2 isolados (3,92%), ambos do norte de Minas. Entretanto, o grupo de anastomose AG7 também é relatado causando tombamento em plântulas de algodão, por Baird (1997), Baird et al. (2000). Neste trabalho, faz-se o primeiro relato do AG-7 causando tombamento no Brasil. Entretanto, os grupos de anastomose AG-4 e AG-7 apresentam grande semelhança na gama de hospedeiros, na morfologia da colônia e nos sintomas, consequentemente, dificulta a classificação correta dos isolados (BAIRD et al., 2000), (Tabela 2). TABELA 2. Identificação, grupos de anastomose e procedência dos isolados de Rhizoctonia solani, obtidos de plântulas de algodão Código dos isolados Grupo de anastomose Procedência Testemunha MG 1 – I11 AG-7 Buriatizeiro – MG MG 1 – I20 AG-4 Buriatizeiro – MG MT 2 – I01 AG-4 Nova Mutum - MT MG 1 – I22 AG-7 Buriatizeiro – MG MT 2 – I03 AG-4 Nova Mutum – MT MG 1 – I02 AG-7* Buriatizeiro – MG MG 1 – I04 AG-4 Buriatizeiro – MG BA 2 – I02 AG–A* Luiz Eduardo – BA MG 1 – I21 AG-4 Buriatizeiro – MG BA 3 – I01 AG-4 Luiz Eduardo – BA MT 2 – I02 AG-4* Nova Mutum – MT MS 2 – I03 AG-4* Dourados – MS MG 1 – I17 AG-4 Buriatizeiro – MG MG 1 – I07 AG-P* Buriatizeiro – MG MG 1 – I09 AG-4 Buriatizeiro – MG MG 1 – I25 AG-4 Buriatizeiro – MG MG 2 – I01 AG-4 Presidente Olegário – MG MG 2 – I06 AG-4 Presidente Olegário – MG MG 1 – I01 AG-4 Buriatizeiro – MG MG 1 – I26 AG-4 Buriatizeiro – MG MT 2 – I05 AG-4* Nova Mutum – MT MG 3 – I05 AG-4 Varjão de Minas – MG MG 1 – I19 AG-4 Buriatizeiro – MG 516 Caracterização morfológica... OLIVEIRA, A. C. C. et al Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 2, p. 512-524, Oct./14 MT 3 – I02 AG-4 Rondonópolis MT 1 – I01 AG-4 Nova Mutum – MT MT 2 – I04 AG-4 Nova Mutum – MT BA 1 – I05 AG-4 Roda Velha – BA MG 3 – I01 AG-4* Varjão de Minas – MG MG 1 – I05 AG-4 Buriatizeiro – MG MG 1 – I15 AG-4 Buriatizeiro – MG MG 1 – I03 AG-4 Buriatizeiro – MG MG 1 – I14 AG-4* Buriatizeiro – MG MG 4 – I04 AG-4 Patos de Minas – MG BA 1 – I03 AG-4 Roda Velha – BA GO 1 – I02 AG-4* Posse – GO MG 4 – I02 AG-4* Patos de Minas – MG MG 1 – I28 AG-4 Buriatizeiro – MG MS 1 – I01 AG-4 Dourados – MS MG 7 – I01 AG-4 Uberlândia – MG MG 5 – I01 AG-4 Uberlândia – MG MG 4 – I03 AG-4 Patos de Minas – MG GO 1 – I01 AG-4 Posse – GO BA 1 – I06 AG-4* Roda Velha – BA MG 6 – I01 AG-4* Patos de Minas - MG MG 2 – I05 AG-4 Presidente Olegário – MG BA 2 – I01 AG-4 Luiz Eduardo – BA MG 4 – I01 AG-4 Patos de Minas – MG MG 1 – I08 AG-4 Buriatizeiro – MG MG 3 – I02 AG-4 Varjão de Minas – MG MG 1 – I24 AG-4* Buriatizeiro – MG MG 2 – I03 AG-4 Presidente Olegário – MG * Isolados não caracterizados nos estudos morfológico, mas por estudos moleculares; 1 Médias seguidas da mesma letra, minúscula, não diferem entre si, pelo teste de Scott-Knott (P≤0,05). Permaneceram sem agrupamento 13 isolados (25,49%), o que pode ter acontecido porque a técnica utilizada para agrupar isolados de R. solani baseia-se numa manifestação de compatibilidade somática entre os indivíduos, sendo positiva quando há fusão de hifas, mas nem sempre é possível visualizar o ponto de fusão (ANDERSON, 1982; SNEH et al., 1991; CARLING et al., 1999). Caracterização molecular dos isolados de Rhizoctonia solani obtidos de áreas produtoras de algodão no Brasil Os primers ITS 4 e ITS 5 permitiram a amplificação de fragmentos com aproximadamente 700 pares de bases (pb), obtendo-se as regiões ITS 1, 5,8S rDNA e ITS 2 completas, para 98% dos isolados de R. solani do algodoeiro estudados. As sequências apresentaram entre 203 a 240pb na região ITS1, 155 a 163pb no gene 5,8S e 261 a 282pb na região ITS2. Analisando-se as árvores filogenéticas baseadas na sequência de nucleotídeos das regiões ITS1 e ITS2 (Figuras 1 e 2), observa-se que os isolados AG-7 ficaram num mesmo grupo, juntamente com o isolado AF3354100, do México, também classificado dentro desse grupo. Quanto aos demais isolados, houve tendência de aparecer um grupo com um maior número de isolados dentre os classificados como AG-4, sendo 27 do Brasil e 5 do GenBank, na árvore referente ao ITS1 (Figura 1) e 23 do Brasil e 4 do GenBank na referente ao ITS2 (Figura 2) Na árvore construída com base nos nucleotídeos da região 5,8S os isolados do tipo AG- 7 se agruparam com os AG-4 sem um padrão distinto entre eles (Figura 3). Entretanto, os grupamentos observados não se deram por região geográfica nem apresentaram um padrão específico de comportamento, confirmando a proximidade entre isolados AG-4 e AG-7, observada por Oliveira (OLIVEIRA et al., 2008), quando estudou a árvore filogenética obtida com base na sequência de nucleotídeos para isolados de cenoura obtidos em campo de grupos de anastomose padrão. 517 Caracterização morfológica... OLIVEIRA, A. C. C. et al Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 2, p. 512-524, Oct./14 BA1-I03 MG1-I01 MT1-I05 MG4-I04 MG1-I17 MG4-I03 EF203246 GO1-I02 MT1-I03 BA1-I05 MG3-I01 MG1-I24 MT1-I02 BA1-I06 MT1-I04 EF203248 MG6-I01 MS2-I03 MG1-I14 MG1-I21 MG4-I02 MG1-I25 MG1-I26 BA2-I01 EF203251 MG1-I19 AY270002 FJ440198 GO1-I01 MT2-I01 MG1-I04 MT1-I01 MG1-I07 AB286941 MS1-I01 EU244842 MG1-I011 MG1-I22 MG1-I02 AF354100 MG4-I01 MG1-I20 MG2-I06 MG1-I15 MG1-I08 AY684924 BA2-I02 EF429313 BA3-I01 DQ102449 MG1-I03 MG7-I01 MG1-I05 MG2-I01 MT3-I02 FJ746914 FJ746938 MG3-I05 MG2-I03 MG2-I05 FJ746974 MG3-I02 MG1-I09 FJ746939 MG5-I01 MG1-I28 89 100 100 100 100 96 100 96 67 50 64 100 100 61 59 100 100 100 100 100 88 100 100 100 62 50 67 Figura 1. Árvore filogenética obtida com base nas sequências de nucleotídeos da região ITS 1 do rDNA de isolados de Rhizoctonia solani, sendo 51 sequenciados e estudados neste trabalho e os demais obtidos no Gene Bank. Os valores de bootstrap (UPGMA) foram obtidos por meio do programa MEGA versão 4.1, com 1.000 repetições, sendo mostrados os valores acima de 50% 518 Caracterização morfológica... OLIVEIRA, A. C. C. et al Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 2, p. 512-524, Oct./14 MS2-I03 MT1-I04 MT1-I02 GO1-I02 MT1-I05 MG1-I26 MG1-I24 MT1-I03 MG4-I04 MG1-I25 MG1-I21 EF203246 MG4-I03 MG6-I01 MG3-I01 BA1-I05 MG4-I02 BA1-I06 BA1-I03 EF203248 BA2-I01 EF203251 MG1-I19 MG1-I01 MG1-I17 MG1-I14 AY270002 MS1-I01 EU244842 MG1-I02 MG1-I22 MG1-I11 AF354100 MG2-I01 DQ102449 MG4-I01 MG2-I06 MG1-I08 MG1-I20 MG1-I15 AY684924 FJ746938 MG1-I04 MT2-I01 MT1-I01 GO1-I01 FJ440198 MG1-I07 AB286941 BA2-I02 EF429313 BA3-I01 MG1-I03 MG1-I05 MG7-I01 MG3-I02 MT3-I02 FJ746974 MG2-I03 MG1-I09 MG1-I28 MG3-I05 FJ746939 FJ746914 MG2-I05 MG5-I01 100 65 65 100 100 100 68 63 100 70 59 100 100 100 100 100 100 100 100 100 75 Figura 2. Árvore filogenética obtida com base nas sequências de nucleotídeos da região ITS 2 do rDNA de isolados de Rhizoctonia solani, sendo 51 sequenciados e estudados neste trabalho e os demais obtidos no Gene Bank. Os valores de bootstrap (UPGMA) foram obtidos por meio do programa MEGA versão 4.1, com 1.000 repetições, sendo mostrados os valores acima de 50% 519 Caracterização morfológica... OLIVEIRA, A. C. C. et al Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 2, p. 512-524, Oct./14 Figura 3. Árvore filogenética obtida com base nas sequências de nucleotídeos do gene 5,8S do rDNA de isolados de Rhizoctonia solani, sendo 51 sequenciados e estudados neste trabalho e os demais, obtidos no Gene Bank. Os valores de bootstrap (UPGMA) foram obtidos por meio do programa MEGA versão 4.1, com 1.000 repetições, sendo mostrados os valores acima de 50% MG1-I02 AY270002 MG1-I22 MG4-I03 MG1-I19 MG4-I02 MT1-I02 MS2-I03 MG1-I11 MG1-I14 BA1-I06 MG1-I17 BA2-I01 MT1-I05 MG1-I24 BA1-I05 EF203248 MG6-I01 MG1-I26 MT1-I03 MG1-I01 MG1-I21 BA1-I03 EF203251 AF354100 EF203246 MG4-I04 MG1-I25 GO1-I02 MT1-I04 MG3-I01 MG2-I03 MG5-I01 MG2-I05 MG1-I09 MG3-I05 MG1-I28 FJ746939 FJ746914 MG3-I02 FJ746974 MT3-I02 MG1-I03 MG1-I05 MG7-I01 DQ102449 MG1-I07 AB286941 BA2-I02 EF429313 MG2-I01 BA3-I01 MG1-I20 AY684924 MG1-I15 MG2-I06 MG4-I01 MG1-I08 FJ746938 MS1-I01 EU244842 GO1-I01 MT2-I01 MT1-I01 MG1-I04 FJ440198 100 100 95 100 64 61 100 100 100 100 100 69 60 73 520 Caracterização morfológica... OLIVEIRA, A. C. C. et al Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 2, p. 512-524, Oct./14 O isolado BA2-I02 não se agrupou com nenhum outro isolado, nas três árvores filogenéticas, enquanto o BA2-I01 se agrupou com os isolados AG-4, os quais formaram o maior grupamento nas três árvores, confirmando a teoria citada por Carbone & Kohn (2004), de que a variação no rDNA é sempre menor dentro de uma única espécie fúngica se comparado entre espécies distintas. O isolado MG1-I07 também não se agrupou a nenhum outro nas árvores referentes à ITS1 e ITS2, mas ficou junto com o grande grupo dos AG-4 na árvore referente à região 5,8S. Isso pode ter se dado por ser um gene de uma região mais conservada (BOYSEN et al., 1996). Os resultados apresentados sugerem que a análise genética das regiões ITS 1 e ITS 2 pode constituir um dos critérios para a separação de diferentes AGs, concordando com Rosa et al. (2005), que utilizando a mesma região para o estudo de isolados de R. solani provenientes de batata, conseguiram separá-los tanto em grupos como subgrupos de anastomose. Meinhardt et al. (2002) para isolados de feijão, obtiveram padrão de bandas capaz de separar o grupo AG-4 e seus subgrupos, entretanto, a técnica incluía não só PCR como também Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). Pela análise molecular, que comparou os 51 isolados de algodão a 15 isolados de Rhizoctonia do GenBank, confirmaram-se os 36 isolados e mais 10 como AG-4; os 2 isolados AG-7 também foram confirmados, além de mais 1, sendo os 3 isolados AG-7 da mesma região, no norte de Minas Gerais e 2 foram caracterizados como Rhizoctonia binucleada (espécie de Rhizoctonia com apenas dois núcleos), sendo um AG-P, oriundo do norte de Minas e um AG-A, da Bahia (BA). Nas árvores filogenéticas, os dois isolados binucleados permaneceram próximos a isolados multinucleados de R. solani. Estudos com Rhizoctonia spp. binucleada tem se tornado frequente pelo seu potencial para a indução de resistência (BASSETO et al., 2008). Nos estudos morfológicos não foi encontrado nenhum isolado binucleado, demonstrando que há divergências entre as técnicas morfológicas e moleculares, sendo necessários estudos mais aprofundados para a confirmação da classificação desses isolados. Determinação da patogenicidade dos isolados de Rhizoctonia solani obtidos das regiões produtoras de algodão no Brasil Verificou-se estatisticamente, que cinco isolados não diferiram da testemunha, sendo três do norte de Minas Gerais, dos quais pertenciam ao grupo de anastomose AG-7 e um AG-4, assim como mais dois isolados do Mato Grosso do grupo AG-4 (Tabela 3). Seis isolados demonstraram baixa virulência, enquadrando-se entre as médias 1,60 e 1,96. Destes, três são do norte de Minas, sendo um AG-7 e dois AG-4, mais dois isolados da Bahia, sendo um AG-A e outro AG-4 e, ainda, um isolado do Mato Grosso, também pertencente ao grupo AG- 4. Com virulência intermediária de 2,52 a 3,30, enquadraram-se 16 isolados, sendo sete do norte de Minas e três do Triângulo Mineiro, quatro do Mato Grosso e, ainda, um da Bahia e outro do Mato Grosso do Sul. Com alta agressividade, 24 isolados se enquadraram com médias entre 3,4 a 3,9, sendo 7 isolados do norte de Minas, 11 do Triângulo Mineiro, 3 da Bahia, 2 de Goiás e l do Mato Grosso do Sul, observando-se que todos pertenciam ao grupo AG-4. Logo, 92% dos isolados foram patogênicos e 51% deles apresentaram alta virulência. Observa-se que os isolados AG-7 apresentaram de nenhuma a baixa virulência, contradizendo os relatos de Baird et al. (2000), que relataram R. solani AG-7 causando lesões marrom- escuras em raízes de algodão e com patogenicidade confirmada a 18° e 24°C. Entretanto, os isolados classificados nesse esse estudo como AG-7 são oriundos do norte de Minas, uma região de temperaturas mais elevadas. Logo, como o teste de patogenicidade foi realizado a 20°C, pode não ter favorecido a virulência do patógeno. O isolado de algodão BA2-I02 pertence ao AG-A apresentou baixa virulência de 1,89, semelhante aos resultados encontrados por Eken & Demice (2004) para isolados de feijão do grupo AG- A. Neste estudo, com exceção do isolado MG1-I07 do grupo AG-P, todos os isolados de média e alta virulência foram classificados como AG-4, podendo-se afirmar, que no Brasil este é o principal agente causal do tombamento de plântulas de algodão, e é o mesmo grupo de anastomose utilizado em estudos no Brasil por Goulart (2007) e Santos et al. (2005). 521 Caracterização morfológica... OLIVEIRA, A. C. C. et al Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 2, p. 512-524, Oct./14 Tabela 3. Dados médios da severidade da doença na patogenicidade de isolados de Rhizoctonia solani, em plântulas de algodão Código dos isolados Grupo de anastomose Médias 1 Testemunha 1,00 a MG 1 – I11 AG-7 1,22 a MG 1 – I20 AG-4 1,26 a MT 2 – I01 AG-4 1,40 a MG 1 – I22 AG-7 1,42 a MT 2 – I03 AG-4 1,45 a MG 1 – I02 AG-7* 1,60 b MG 1 – I04 AG-4 1,65 b BA 2 – I02 AG–A* 1,89 b MG 1 – I21 AG-4 1,94 b BA 3 – I01 AG-4 1,94 b MT 2 – I02 AG-4* 1,96 b MS 2 – I03 AG-4* 2,52 c MG 1 – I17 AG-4 2,89 c MG 1 – I07 AG-P* 2,93 c MG 1 – I09 AG-4 2,96 c MG 1 – I25 AG-4 2,97 c MG 2 – I01 AG-4 3,03 c MG 2 – I06 AG-4 3,03 c MG 1 – I01 AG-4 3,03 c MG 1 – I26 AG-4 3,04 c MT 2 – I05 AG-4* 3,11 c MG 3 – I05 AG-4 3,14 c MG 1 – I19 AG-4 3,17 c MT 3 – I02 AG-4 3,17 c MT 1 – I01 AG-4 3,23 c MT 2 – I04 AG-4 3,28 c BA 1 – I05 AG-4 3,30 c MG 3 – I01 AG-4* 3,40 d MG 1 – I05 AG-4 3,42 d MG 1 – I15 AG-4 3,43 d MG 1 – I03 AG-4 3,45 d MG 1 – I14 AG-4* 3,49 d MG 4 – I04 AG-4 3,51 d BA 1 – I03 AG-4 3,56 d GO 1 – I02 AG-4* 3,56 d MG 4 – I02 AG-4* 3,59 d MG 1 – I28 AG-4 3,60 d MS 1 – I01 AG-4 3,60 d MG 7 – I01 AG-4 3,65 d MG 5 – I01 AG-4 3,65 d MG 4 – I03 AG-4 3,67 d GO 1 – I01 AG-4 3,73 d BA 1 – I06 AG-4* 3,73 d MG 6 – I01 AG-4* 3,74 d MG 2 – I05 AG-4 3,76 d BA 2 – I01 AG-4 3,76 d MG 4 – I01 AG-4 3,79 d MG 1 – I08 AG-4 3,80 d MG 3 – I02 AG-4 3,85 d MG 1 – I24 AG-4* 3,86 d MG 2 – I03 AG-4 3,91 d 522 Caracterização morfológica... OLIVEIRA, A. C. C. et al Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 2, p. 512-524, Oct./14 Dos 51 isolados estudados, apenas três foram obtidos de plântulas com sintoma de mela MT3-I02, MS1-I01 e MG7-I01. Todos foram patogênicos apresentando média ou alta virulência e classificados como AG-4, não tendo sido possível, neste trabalho, identificar o subgrupo com os testes aplicados. Seria necessária uma nova busca, no banco de dados, apenas de isolados AG-4 com subgrupos definidos e, então, a construção de novas árvores, buscando a similaridades entre os isolados MT3-I02, MS1-I01 e MG7-I01 e os do banco de dados. CONCLUSÕES Os grupos de anastomose identificados na caracterização morfológica foram confirmados na caracterização molecular; Houve divergência entre a caracterização morfológica e molecular para os isolados binucleados; Os isolados AG-4 foram encontrados em maior número e, na grande maioria, mais virulento. O grupo de anastomose AG-7 foi identificado como o agente etiológico do tombamento no Brasil. AGRADECIMENTOS À Universidade Federal de Lavras (UFLA), pela oportunidade de realização do doutorado, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão da bolsa de estudos e a FAPEMIG pelo apoio financeiro do projeto de tese. ABSTRACT: The Rhizoctonia solani is an important pathogen in cotton crop associated with damping-off disease. The variability among isolates are extremely important, because differences exist between anastomosis groups, taken as those isolates capable of exchanging genetic information with each other. Morphological characterization, when confirmed by genetic characterization provides concrete information about the isolates distribution when it acts like a pathogen. Our study was to identify and characterize the anastomosis groups in Brazil and confirm them by genetic characterization. We considered 51 Rhizoctonia solani isolates aiming to characterize the anastomose group and determine their pathogenicity. The morphological characterization was done observing the number of cores, colony morphology and identification of anastomosis groups (AG). In genetic characterization were sequenced and analyzed the genomic fragments containing the 5.8 S, ITS1 and ITS2 regions and compared them to Rhizoctonia isolates listed in the GenBank. The pathogenicity was evaluated for the disease severity, using the scale of infection with grades ranging from 1 to 4. Considering the AG we identified 36 of 51 isolates as AG-4 and two isolates as AG-7 and 13 isolates were listed as unrated. In molecular analyses were confirmed those 36 isolates and were identified more 10 isolates as AG-4. All the AG- 7 isolates were confirmed and we found one more considering the molecular analyses. For the pathogenicity was found that five strains did not differ from the control. Intermediate virulence and high virulence were observed in 16 and 24 isolates, respectively with averages from 2.52 to 3.3 and from 3.4 to 3.9. KEYWORDS: Cotton (Gossypium hirsutum L.). Necrotrophic. Dumping-off. Molecular biology. Virulence. REFERÊNCIAS ANDERSON, N. A. The genetics and pathology of Rhizoctonia solani. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v. 20, n. 1, p. 329-347, Jan./Dec. 1982. BAIRD, R. E. First report of Rhizoctonia solani AG-7 in Georgia. Plant Disease, Saint Paul, v. 81, n. 7, p. 832, July 1997. BAIRD, R. E.; BATSON, W.; CARLING, D.; SCRUGGS, M. First report of Rhizoctonia solani AG-7 on cotton in Mississippi. Plant Disease, Saint Paul, v. 84, n. 10, p. 1156, Oct. 2000. BANDONI, R. J. Safranin O as a rapid nuclear stain for fungi. Mycologia, v. 71, p. 873-874, 1979. BASSETO, M. A.; VALÉRIO FILHO, W. V. ; SOUZA, E. C.; CERESINI, P. C. O papel de Rhizoctonia spp. binucleadas na inducão de resistência da mela da soja. Acta Scientiraum Agronomy, Maringá, v. 30, n.2, p. 183-189, 2008. 523 Caracterização morfológica... OLIVEIRA, A. C. C. et al Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 2, p. 512-524, Oct./14 BOYSEN, M.; BOJA, M.; DEMORAL, C.; RUBIO, V.; SALAZAR, O. Identification at strain level of. Rhizoctonia solani AG-4 isolates by direct-sequence of asymmetric PCR products of the ITS regions. Current Genetics, Berlin, v. 29, n. 2, p. 174-181, Feb. 1996. CARBONE, I.; KOHN, L. M. Inferring process from pattern in fungal population genetics. In: ARORA, D. K.; KHACHATOURIANS, G. G. (Ed.). Fungal genomics, applied mycology and biotechnology series. Toronto: Elsevier Science, 2004. p. 29-58. CARLING, D. E.; LEINER, R. H; KEBLER, K. M. Characterization of a new anastomosis group (AG-9) of Rhizoctonia solani. Phytopathology, Saint Paul, v. 77, n. 11, p. 1609-1612, Nov. 1987. CARLING, D. E.; POPE, E. J.; BRAINARD, K. A.; CARTER, D. A. Characterization of mycorrhizal isolates of Rhizoctonia solani from an orchid, including AG-12, a new anastomosis group. Phytopathology, Saint Paul, v. 89, n. 12, p. 942-946, Dec. 1999. CARLING, D. E.; BAIRD, R. E., GITAITIS, R. D.; BRAINARD, K. A.; KUNINAGA, S. Characterization of AG-13, a newly reported anastomosis group of Rhizoctonia solani. Phytopathology, Saint Paul, v. 92, n. 8, p. 893-899, Aug. 2002a. EKEN, C.; DEMIRCI, E. Anastomosis groups and pathogenicity of Rhizoctonia solani and binucleate Rhizoctonia isolates from bean in Erzurum, Turkey. Journal of Plant Pathology, Pisa, v. 86, n. 1, p. 49-52, Jan. 2004. EUROPEAN MOLECULAR BIOLOGY LABORATORY. Clustalw2. 2009. Disponível em: . Acesso em: 16 abr. 2009. FERREIRA, D. F. Análises estatísticas por meio do SISVAR para Windows versão 4. 0. In: REUNIÃO ANUAL DA REGIÃO BRASILEIRA DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE BIOMETRIA, 45., 2000, São Carlos. Resumos... São Carlos: UFSCar, 2000. p. 235. GONZALES, D. CARLING, D. E.; KUNINAGA, S.; VILGALYS, R.; CUBETA, M. A. Ribosomal DNA systematics of Ceratobasidium and Thanatephorus with Rhizoctonia anamorphs. Mycologia, New York, v. 93, p. 1138-1150, 2001 GOULART, A. C. P. Suscetibilidade de cultivares de algodoeiro a Rhizoctonia solani e benefícios do tratamento de sementes com fungicidas. Summa Phytopathologica, Jaguariúna, v. 33, n. 3, p. 222-228, jul./set. 2007. GOULART, A. C. P. Tratamento de sementes do algodoeiro com fungicidas. In: EMBRAPA. Algodão: tecnologia de produção. Dourados: Embrapa Agropecuária Oeste, 2001. p. 140-158. GOULART, A. C. P.; ASSIS, J. B.; CIAMPI, M. B.; CERESINI, P. C. Ocorrência de mela causada por Rhizoctonia solani AG4-HGI em plântulas de algodoeiro no Brasil. Summa Phytopathologica, Botucatu, v. 37, n. 1, p. 68-69, 2011. LIU, Z. L.; SINCLAIR, J. B. Differentiation of intraspecific groups within anastomosis group 1 of Rhizoctonia solani using ribosomal DNA internal transcribed spacer and isozyme comparisons. Canadian Journal of Plant Pathology, Ontario, v. 15, n. 4, p. 272-280, Dec. 1993. MEINHARDT, L. W.; WULFF, N. A.; BELLATO, C. M.; TSAI, S. M. Genetic analyses of Rhizoctonia solani isolates from Phaseolus vulgaris grown in the Atlantic Rainforest region of São Paulo, Brazil. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 27, n. 3, p. 259-267, set./dez. 2002. MOLECULAR EVOLUTIONARY GENETICS ANALYSIS. Mega 4.1. 2009. Disponível em:< http://www.megasoftware.net/>. Acesso em: 16 abr. 2009. 524 Caracterização morfológica... OLIVEIRA, A. C. C. et al Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 2, p. 512-524, Oct./14 MOLLER, E. M.; BAHNWEG, G.; SANDERMANN, H.; GEIGER, H. H. A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi, fruit bodies, and infected plant tissues. Nucleic Acids Research, Oxford, v. 20, n. 22, p. 6115-6116, Nov. 1992. MOUSTAFA-MAHMOUD, S. M.; SUMNER, D. R.; RAGAB, M. M.; RAGAB, M. M. Interaction of fungicides, herbicides, and planting date with seedling disease of cotton caused by Rhizoctonia solani AG-4. Plant Disease, Saint Paul, v. 7 7, n. 1, p. 79-86, Jan. 1993. NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION. Gene Bank. 2009. Disponível em: . Acesso em: 15 abr. 2009. OGOSHI, A. Ecology and pathogenicity of anastomosis and intraspecific groups of Rhizoctonia solani Kühn. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v. 25, n. 1, p. 125-143, Jan./Dec. 1987. OLIVEIRA, A. C. C.; SOUZA, P. E.; POZZA, E. A.; MANERBA, F. C.; LOPES, M. F. Metodologia de inoculação de Rhizoctonia solani na cultura da cenoura. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 32, p. 992-995, 2008. OLIVEIRA, A. C. C.; SOUZA, P. E.; POZA, E. A.; MANERBA, F. C.; LOPES, M. F. Determinação de patogenicidade e severidade de isolados de rhizoctonia solani em algodão. Tropical Plant Pathology, Brasília, v. 33, p. 185, 2008. Suplemento. ROSA, D. D.; FENILLE, R. C.; SOUZA, N. L.; KURAMAE, E. Caracterização citomorfologica, molecular e patogênica de isolados de Rhizoctonia solani de batata. Summa Phytopathologica, Jaguariúna, v. 31, n. 2, p. 133-141, abr./jun. 2005. SANTOS, F. S.; SOUZA, P. E.; OLIVEIRA, C. A.; MAGALHÃES, F. H. L.; LAURENTI, M. A. Ajuste do inóculo de R. solani AG-4 em substrato para estudo de Rhizoctoniose em algodoeiro e feijoeiro. Summa Phytopathologica, Jaguariúna, v. 31, n. 2, p. 374-376, abr./jun. 2005. SINCLAIR, J. B. Cotton seedling diseases and their control. Baton Rouge: Louisiana State University, 1965. 35 p. SNEH, B.; BURPEE, L.; OGOSHI, A. Identification of Rhizoctonia solani species. Saint Paul: APS, 1991. 134 p. WHITE, T. J.; BRUNS, T.; LEE, S.; TAYLOR, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: INNIS, M. A.; GELFAND, D. H.; SNINSKY, J. J.; WHITE, T. J. (Ed.). PCR Protocols: a guide to methods and applications. New York: Academic, 1990. p. 315-322.