Microsoft Word - 48-Bio_18193 440 Original Article Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 1, p. 440-447, June/14 ESTUDOS BIOLÓGICOS DE ESPÉCIES DE PUCCINIA UTILIZANDO “GERMINATÉLIOS” BIOLOGICAL STUDIES OF PUCCINA SPECIES USING “GERMINATELIA” Christiane Ceriani Aparecido1; Martha Maria Passador2 1. Pesquisadora Científica, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal, Instituto Biológico, São Paulo, SP, Brasil. christianeceriani@biologico.sp.gov.br; 2. Pós Doutoranda Faculdade de Ciências Agronômicas - FCA, Universidade Estadual Paulista - UNESP, Campus de Botucatu, SP, Brasil. RESUMO: Apesar da importância dos fitopatógenos pertencentes à Ordem Pucciniales (=Uredinales), popularmente denominados de ferrugens, certas particularidades de sua biologia são pouco conhecidas, principalmente devido à dificuldade de cultivá-los em meios de cultura e também pela falta de metodologias adequadas ao desenvolvimento das pesquisas. Portanto, o objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência de aparatos denominados “germinatélios” para a obtenção de dados sobre a produção de basidiósporos e biologia de diferentes espécies de Pucciniales. Foram utilizadas no estudo as espécies Puccinia psidii, P. pampeana, P. pelargonii-zonalis, P. arachidis, P. mogiphanis, P. emiliae, P. hetereospora, P. malvacearum e P. cnici oleracei. A utilização dos “germinatélios” permitiu constatar elevada produção de basidiósporos (estruturas infectivas) por um período de até 5 meses, à temperaturas entre 12 a 21oC. Além disso, em P. malvacearum foi possível registrar a germinação por repetição (estratégia de sobrevivência) em 4,5% dos basidiósporos produzidos. Todas as espécies foram favorecidas a temperaturas amenas. Estes resultados demonstram, portanto, que a utilização dos “germinatélios” é eficiente, auxiliando na obtenção de dados sobre a biologia e ciclos de diferentes espécies de Puccinia, possibilitando melhor conhecimento sobre estes fitopatógenos, resultando em medidas de manejo e controle mais adequadas/precisas. PALAVRAS-CHAVE: Produção de basidiósporos. Metodologia. Ciclo biológico. INTRODUÇÃO As doenças fúngicas causadas por basidiomicetos pertencentes à Ordem Pucciniales (=Uredinales) recebem o nome de ferrugens. Tais microrganismos são ditos, atualmente, parasitos ecologicamente obrigados uma vez que algumas poucas espécies puderam ser mantidas em laboratório graças ao desenvolvimento de culturas axênicas (KATSUHIRO; KATSUYA, 1985; CARVALHO JR. et al., 1998). Os agentes causais das ferrugens estão entre os microrganismos de ciclo biológico mais complexo. Atualmente, poucos ciclos de vida de ferrugens tropicais foram demonstrados, devido ao pleomorfismo que torna seus ciclos vitais, muitas vezes, complicados e de difícil interpretação. Porém, alguns ciclos puderam ser demonstrados por meio de estudos realizando-se inoculações experimentais com esporos dos diferentes estágios cíclicos como é o caso, por exemplo, de Puccinia graminis (heteroécia) e P. heliantii, espécie autoécia, pois todo o ciclo ocorre na mesma planta hospedeira, ambas de regiões temperadas do hemisfério Norte (CRAIGIE, 1931). Aqui no Brasil foram realizados alguns estudos para a compreensão do ciclo de P. pampeana, agente causal da ferrugem da pimenta e do pimentão, sendo que foi constatado ser este espécie biteleomórfica, com ciclo reduzido (HENNEN et al., 1984; FIGUEIREDO et al., 1987). Outras, a exemplo da ferrugem do café (Hemileia vastatrix), tiveram seus ciclos teoricamente interpretados por meio de análises morfológicas (HENNEN; FIGUEIREDO, 1984). Os fungos representantes da Ordem Pucciniales apresentam alta especificidade em relação a seus hospedeiros, sendo capazes de infectar um grande número de plantas vasculares, cultivadas ou silvestres. Várias espécies consideradas cosmopolitas, com distribuição mundial, infectam plantas cultivadas, causando perdas significativas na produção. Uma importante particularidade das ferrugens é o pleomorfismo, característica que permite que a uma mesma espécie apresentar até cinco tipos de esporos diferentes ou, mais raramente, até seis como é o caso de Puccinia vexans. Cada esporo é produzido por uma estrutura diferente, sendo que a manifestação de cada uma ocorre em diferentes épocas do ano. Várias destas estruturas podem ser infectivas, sendo que os basidiósporos são uma das mais importantes por serem produzidos por todas as espécies. Com relação aos urediniósporos, também são estruturas importantes, funcionando como conídios (FIGUEIREDO; PASSADOR, 2008). Algumas espécies, denominadas heteroécias, necessitam de dois hospedeiros não relacionados entre si para que Received: 21/09/12 Accepted: 05/02/14 441 Estudos biológicos... APARECIDO, C. C.; PASSADOR, M. M. Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 1, p. 440-447, June/14 seus ciclos vitais sejam completados, enquanto que outras, as autoécias, são capazes de completar seu ciclo vital em um único hospedeiro. Além disso, a morfologia das estruturas esporíferas, algumas vezes, não coincide com as funções normalmente desempenhadas no ciclo vital das espécies mais bem estudadas. Como resultado de todas estas particularidades, os agentes causais das ferrugens estão entre os microrganismos de ciclo biológico mais complexo (CUMMINS, 1978; CUMMINS; HIRATSUKA, 1983; FIGUEIREDO et al., 1987; HENNEN et al., 1984). Estudos realizados no Brasil permitiram estimar a existência de, pelo menos, 3000 espécies de ferrugens no País (HENNEN et al., 1982). Destas, cerca de apenas 800 são conhecidas, sendo que pouco se sabe sobre a biologia e ciclos vitais destes importantes patógenos, como resultado da dificuldade de cultivá-los em laboratório e, também à falta de metodologias adequadas ao desenvolvimento das pesquisas (CUTTER JR., 1959; CARVALHO JR. et al., 1998). Existem algumas informações, que se referem, principalmente, a trabalhos de campo (MAGALHÃES et al, 2008; LIMA, 2009). Como resultado destas dificuldades, dados básicos à cerca da biologia desses microrganismos são escassos na literatura nacional e internacional, dificultando o manejo das doenças por eles provocadas. Assim, Diante do exposto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a eficiência e viabilidade de um método que possibilite o estudo dos ciclos vitais de diferentes espécies de Pucciniales, incrementando o conhecimento sobre a biologia deste importante grupo de fitopatógenos. MATERIAL E MÉTODOS Para a realização deste estudo foram utilizados aparatos denominados “germinatélios”, que funcionam como uma microcâmara úmida (FIGUEIREDO; COUTINHO, 1984). Foram utilizados soros teliais de Puccinia psidii, P. pampeana, P. pelargonii-zonalis, P. arachidis, P. mogiphanis, P. emiliae, P. hetereospora, P. arechevaletae, P. cnici-oleracei e P. malvacearum, coletados, respectivamente, de folhas de jambo (Syzygium jambos), diferentes espécies de pimenteiras (pimenta dedo-de-moça - Capsicum bacattum; pimenta tomate - red ruffled - Capsicum annuum; pimenta bode - Capsicum chinense), gerânio (Pelargonium spp.), amendoim (Arachis hypogaea), Alternanthera sp., Paullinia sp., Emylia sonchifolia e Sida spp. as duas últimas espécies. No estudo, também, foram coletados teliossoros aecidióides de P. pampena. Na Figura 1 estão ilustrados alguns dos materiais utilizados no estudo e provenientes de diferentes plantas hospedeira. Figura 1. Estruturas de diferentes espécie de Pucciniales estudadas com o uso do “germinatélio”. A → Puccinia cnici-oleracei; B → P. heterospora; C → P. psidii; D → P. pampeana. D C B A C 442 Estudos biológicos... APARECIDO, C. C.; PASSADOR, M. M. Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 1, p. 440-447, June/14 Os teliossoros tiveram seu diâmetro medido e, para o cálculo da área foi utilizada a fórmula A=πR2, cujo valor médio correspondeu, em mm2, a 0,049 para P. psidii e 0,64 para P. pampeana (teliossoros telióide). Quanto aos teliossoros aecidióides de P. pampeana, por terem formato cilíndrico, foi calculado o volume, através da fórmula V=πR2xH, tendo sido obtido o valor de 0,0443 mm3. Para as demais ferrugens, os materiais foram coletados a partir das folhas infectadas, sendo retirados juntamente com parte do tecido vegetal, fragmentos de 1mm2. Os soros foram assentados sobre pequena porção de algodão umedecido existente nos germinatélios e, posteriormente, estes foram invertidos sobre lâminas de microscopia onde havia discos de ágar-água (AA). O conjunto foi colocado no interior de cristalizadores (placas de vidro com 20 cm de diâmetro e 4 cm de altura) forrados com espuma de náilon umedecida com água destilada, permanecendo a diferentes temperaturas. Diariamente os soros teliais foram lavados com água destilada estéril, para remoção dos autoinibidores presentes nas paredes dos teliósporos, e os discos de AA foram observados em microscópio de luz para verificar se houve liberação de basidiósporos, sendo realizada a troca dos discos após cada observação (FIGUEIREDO; COUTINHO, 1984). Na Figura 2 podem ser observados os procedimentos realizados durante a condução dos experimentos. Figura 2. Germinatélios com soros (A e B- Fonte: Mário Barreto Figueiredo), demonstrando o procedimento de lavagem efetuado diariamente (C e D - Fonte: Mário Barreto Figueiredo). Os teliossoros de P. psidii foram mantidos às seguintes temperaturas: 12, 15, 18, 21 e 240C. Quanto aos teliossoros telióides de P. pampeana foram submetidos a choques térmicos em câmaras com temperaturas controladas a 8ºC, 12ºC e 35ºC. Os materiais permaneceram sob estas temperaturas por um período de três horas, no escuro. Depois foram agrupados em única câmara a temperatura a 12ºC, e fotoperíodo de 14 horas de luz e 10 horas de escuro, onde permaneceram até o final do estudo. O tratamento controle correspondeu aos teliossoros que permaneceram a 12ºC desde o início do experimento. Com relação aos teliossoros aecidióides, permaneceram sob 15oC e 18oC. P. pelargonii-zonalis foi mantida a 19ºC e as demais espécies, a 17ºC. Para avaliação dos experimentos, foram registrados: (i) o tempo passado desde o preparo dos germinatélios até o início da liberação de liberação de basidiósporos; (ii) o número de quedas; (iii) quando possível, contagens, com o auxílio de um contapasso manual, do número de basidiosporos liberados, para que fosse determinada a capacidade média de produção. Com o objetivo de facilitar a contagem, os discos de ágar-água foram quadriculados, com o auxílio de um conjunto de lâminas, de forma que a superfície desses discos ficasse semelhante a uma câmara de Neubauer. O 443 Estudos biológicos... APARECIDO, C. C.; PASSADOR, M. M. Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 1, p. 440-447, June/14 delineamento experimental usado foi o de blocos ao acaso, sendo cada tratamento (ferrugem x temperatura) havia quinze repetições. Foi aplicado o teste de Tukey a 5% de probabilidade. Os dados foram analisados por meio do programa ASSISTAT, versão 7.5 beta. RESULTADOS E DISCUSSÃO A utilização dos germinatélios possibilitou a obtenção de importantes dados sobre a biologia das espécies de Puccinia estudas. Pôde-se, por exemplo, documentar a germinação por repetição, fenômeno que ocorre com alguns basiodiósporos de P. malvacearum que germinam novamente produzindo um novo basidiósporo, este de menor tamanho, mas que contém as mesmas informações genéticas, aumentando a probabilidade de sobrevivência da espécie na ausência do hospedeiro e/ou sob condições ambientais desfavoráveis (Figura 3). Figura 3. Basidiósporo produzido por teliósporo de P. mavacearum apresentando a geminação por repetição (seta). Quanto ao início da produção e contagem de basidiósporos por unidade de área dos soros teliais, verificou-se que, para P. psidii, a 12oC a liberação das cargas de basidiósporos teve início 48 horas após o preparo dos germinatélios, enquanto que às demais temperaturas, o início da produção e liberação dos basidiósporos ocorreu após 24 horas . Foram registradas de 2 a 5 quedas, variando a produção média de 13.000 a 44.000 basidiósporos/mm2, conforme registrado na Tabela 1. Tabela 1. Produção média de basidiosporos pelos teliossoros de Puccinia psidii submetidos a diferentes temperaturas. Temperatura Produção média (basidiosporos/mm2)* 120C 18.633a 150C 13.571a 180C 23.143a 210C 44.673b 240C 26.490a *Média de quinze repetições; **Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo Teste de TUKEY / Coeficiente de variação = 7,65129%. Observando-se a Tabela 1, pode-se perceber que a maior produção de basidiosporos por mm2 ocorreu a 210C, sendo esta temperatura considerada a mais propícia para a produção de basidiosporos dentre as testadas, embora, a produção tenha sido elevada a todas as temperaturas avaliadas. Isto, provavelmente, tenha ocorrido devido às temperaturas utilizadas no experimento não serem adversas à produção/germinação de teliósporos, resultando em grande produção de basidiósporos. Ensaios realizados em casa de vegetação, permitiram constatar que temperatura média de 444 Estudos biológicos... APARECIDO, C. C.; PASSADOR, M. M. Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 1, p. 440-447, June/14 28oC tem influência negativa na formação de teliósporos de P. psidii, enquanto que, até 25oC, estas estruturas são produzidas em abundância (APARECIDO et al., 2003). Para P. pampeana a temperatura elevada também se mostrou fator limitante no que se refere à produção dos basidiósporos (APARECIDO et al., 1997). Com relação a P. pampeana, os teliossoros telióides provenientes tanto da pimenta dedo-de- moça como da variedade pimenta tomate (red ruflled), cepas coletadas em Botucatu-SP, submetidos a choque de temperatura a 35ºC, iniciaram a produção de basidisporos após 72 horas, ou seja, após 3 lavagens dos soros. Já aqueles submetidos a choque de temperatura a 8ºC iniciaram a produção de basidiósporos após 48 horas, ou seja, após 2 lavagens. Corroborando com resultados obtidos por FIGUEIREDO et al. (1987). Os teliossoros provenientes da pimenta dedo-de-moça, isolado coletado em Piedade-SP apresentaram diferença no início da produção: os que foram submetidos ao choque de temperatura a 35ºC e 8ºC iniciaram a sua produção após 48 horas, após 2 lavagens dos soros. Os teliossoros mantidos a 12ºC iniciaram a produção de basidiósporos após 72 horas, ou seja, após 3 lavagens. Até a sexagésima lavagem, todos os teliossoros amostrados produziram basidiósporos continuamente. Observou-se a paralisação na produção de basidiósporos, após 101 quedas nas amostras mantidas somente a 12ºC. Os primeiros que deixaram de produzir basidiósporos foram os coletados de pimenta tomate, mantidos a 12ºC, cuja produção cessou após 67 quedas. Com relação aos teliossoros coletados de pimenta dedo-de-moça, cepa de Botucatu-SP, os soros que foram tratados com choque de temperatura a 8ºC, foram os que encerraram a produção de basidiósporos primeiro, ou seja, após 89 quedas. Com relação à quantidade produzida, houve liberação de cerca de 2.500 basidiósporos/mm2 de área soral (Figura 4). Figura 4. Produção de basidiósporos pelos teliossoros telióides de P. pampeana coletados pimentas dedo-de- moça e redruffle provenientes de duas diferentes localidades e submetidos a choques de temperatura. De acordo com a Figura 4, em todas as amostras, o tratamento que induziu a maior queda de basidiósporos foi à temperatura de 12ºC, enquanto que a 35ºC foram registradas as menores quantidades. Além disso, os choques de temperatura provocaram uma alteração na produção de basidiósporos, antecipando (8ºC) ou postergando (35ºC) a liberação destas estruturas, mas sem inviabilizar os teliossoros telióides. Estes resultados apresentam-se próximos daqueles obtidos por Figueiredo et al. (1987), que obtiveram uma maior porcentagem de germinação dos teliósporos telióides quando estes foram submetidos a temperaturas entre 12ºC e 18ºC. Em ensaios comparando temperaturas entre 15ºC e 18ºC, Aparecido; Figueiredo (1997, 1998, 1999), obtiveram maior índice de germinação dos teliósporos e, como consequência, maior produção de basidiósporos, quando os teliossoros telióides foram submetidos a 15ºC. É importante ressaltar que a liberação de basidiósporos por um longo período de tempo é um resultado significativo e que reflete no aspecto epidemiológico do patógeno e da doença por ele 1463,7 1561,64 701,483 2038,48 2511,49 1827,48 742,4 1529,91 688,97 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 M é d ia d e b a s id o s p o ro s p ro d u z id o s 1Tratamentos Red Ruffled (cepa Botucatu) 8ºC/3h Red Ruffled (cepa Botucatu) 12ºC Red Ruffled (cepa Botucatu) 35ºC/3h Dedo de Moça(cepa Botucatu) 8ºC/3h Dedo de Moça(cepa Botucatu) 12ºC Dedo de Moça(cepa Botucatu) 35ºC/3h Dedo de Moça (cepa Piedade) 8ºC/3h Dedo de Moça (cepa Piedade) 12ºC Dedo de Moça (cepa Piedade) 35ºC/3h 445 Estudos biológicos... APARECIDO, C. C.; PASSADOR, M. M. Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 1, p. 440-447, June/14 causada. Em se tratando de um organismo biotrófico períodos longos de produção de estruturas infectivas contribuem para o encontro de hospedeiros com certa constância, favorecendo a sobrevivência do patógeno e dificulta o controle da doença. Com relação aos teliósporos aecidióides a produção de basidiósporos teve início 4 horas após o preparo dos germinatélios, sendo registradas até 3 quedas ou liberações, com produção média de 18.400 basidiósporos/mm3 e 16.400 basidiósporos/mm3 para amostras mantidas, respectivamente, a 15o e 18oC. Para Puccinia mogiphanes, foram registraram até 16 liberações, com produção média de 7.500 basidiósporos/mm2. P. cnici-oleracei, P. heterospora, P. arechevaletae e P. pelargonii- zonalis iniciaram as liberações, após 24h (a primeira) e 48 horas (as demais), sendo registradas de 17 a 35 liberações de basidiósporos, mas devido ao elevado número de basidiósporos produzidos a contagem por mm2 tornou-se difícil. Com relação a P. arachidis, foram registradas 4 quedas, com produção média de 1.500 basidiósporos/ mm2. Os resultados obtidos possibilitaram constatar a existência de espécies cujos soros telióides foram denominados de soros de “curta duração”, liberando de 2 a 4 descargas consecutivas de basidiósporos, e “longa duração”, em que se registrou de 16 até 101 liberações consecutivas de basidiósporos. É importante ressaltar que as ferrugens com teliossoros de “longa duração” apresentam soros pulvinados, enquanto que aquelas com teliossoros de “curta duração”, soros pulverulentos. Esta particularidade, talvez possa ser utilizada como mais uma característica para identificar as espécies, ou mesmo separar gêneros, pertencentes ao complexo grupo das Pucciniales. Pôde-se verificar que temperaturas amenas, entre 12o e 21oC foram as mais favoráveis. Para outras ferrugens que também ocorrem em regiões tropicais, elevadas produções de basidiósporos foram registradas a temperaturas amenas. Como exemplo, podem ser citadas: Puccinia arachidis, P. pampeana, P. mogiphanes, P. cnici-oleracei, P. hetereospora, P. arechevaletae, Uromyces appendiculatus var. appendiculatus (GOLD; MENDGEN, 1984; APARECIDO; FIGUEIREDO, 1997, 1998, 1999; FIGUEIREDO; APARECIDO, 1998). Devido ao Brasil ser um país de dimensões continentais, apresentando diferentes condições climáticas em diferentes regiões e épocas do ano, temperaturas amenas podem ocorrer durante a maior parte do ano em diferentes regiões do País, favorecendo a ocorrência das epifitias e resultando nas grandes perdas continuamente observadas. Principalmente durante a noite, as temperaturas podem ser mais baixas, além da umidade mais elevada, momento durante o qual grandes cargas de basidiosporos podem ser liberadas. Observa-se, portanto, que a utilização do “germinatélio” pode fornecer dados importantes e significativos para o conhecimento das ferrugens que possuem teliossoros. Poucos são os dados existentes sobre este grupo de patógenos, principalmente no que se refere a estudos biológicos. Como exemplo podem ser citados os estudos epidemiológicos realizados por Naruzawa et al. (2006) com Phakopsora euvitis e que possibilitaram verificar que a temperatura de 25ºC, ausência de luz e a superfície inferior da folha de videira foram as melhores condições para a germinação de urediniósporos do patógeno. Também, Leu (1988) verificou que para a geminação de urediniósporos de Physopella ampelopsidis a temperatura de 24ºC é a ótima, enquanto que 8ºC é a mínima. Em um outro estudo de campo, Blum; Dianese (2001), avaliando os padrões de liberação de urediniósporos de P. psidii (ferrugem das mirtáceas), verificaram que a principal carga de esporos ocorreu de maio a julho, entre as 10h e as 13 horas. Martins (2010), também observou a ocorrência de germinação de urediniósporos a 10, 15, 20 e 25°C. No entanto, o crescimento do tubo germinativo foi mais rápido conforme a temperatura aumentava, apresentando redução do crescimento a partir de 25°C. Também, para Hemileia vastatrix, Capucho et al. (2011), registraram elevada taxa de germinação e infectividade de urediniósporos a temperaturas entre 21 e 24ºC. Todos estes dados corroboram com os resultados descritos neste estudo e que demostram a influência das temperaturas amenas favorecendo o ciclo biológico das Pucciniales no Brasil, além de comprovar que o “germinatélio” pode ser uma nova ferramenta para a realização de estudos biológicos em laboratório. Todas essas informações são importantes, uma vez que poderão facilitar a tomada de decisões para medidas de manejo e controle mais eficientes e acertadas, o que certamente poderá reduzir os custos de controle. ABSTRACT: Despite the importance of plant pathogens belonging to the Order Pucciniales (=Uredinales), popularly called rusts, certain peculiarities of its biology is poorly known, mainly due to the difficulty of growing them in 446 Estudos biológicos... APARECIDO, C. C.; PASSADOR, M. M. Biosci. J., Uberlandia, v. 30, supplement 1, p. 440-447, June/14 culture media and also by the lack of appropriate methodologies for the development of research. Therefore, this study was to verify the efficiency of apparatus called "germinatelia" to obtain data about the basidiospores production biology of different Pucciniales species. Were used in the study Puccinia pampeana, P. psidii, P. pelargonii-zonalis, P. arachidis, P. mogiphanis, P. emiliae, P. hetereospora, P. malvacearum and P. cnici-oleracei. The use of "germinatelia" have revealed high basidiospores production for a period up to 5 months at temperatures between 12o and 21oC. Furthermore, in P. malvacearum was possible to record the germination by repetition (survival strategy) in 4.5% of basidiospores produced. All species were favored to mild temperatures. These results therefore demonstrate that the use of "germinatélios" is efficient, assisting in obtaining data about the biology and cycles of different Puccinia species, enabling better understanding of these pathogens, resulting in management and control measures most appropriate/accurate. KEYWORDS: Basidiospores production. Methodology. Biological cycle. REFERÊNCIAS APARECIDO, C. C.; FIGUEIREDO, M. B. Influência e temperatura na produção de basidiosporos pelos soros teliais de Puccinia pampeana. Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v. 64, Suplemento, p. 61, 1997. APARECIDO, C. C.; FIGUEIREDO, M. B. Produção de basidiosporos pelos télios aecidióides (Endophyllum) de Puccinia pampeana submetidos a diferentes temperaturas. 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