Microsoft Word - 28-Bio_18244 577 Original Article Biosci. J., Uberlândia, v. 31, n. 2, p. 577-583, Mar./Apr. 2015 IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS ISOLADAS EM CULTIVARES DE PALMA (Opuntia e Nopalea) USANDO O GENE recA IDENTIFICATION OF DIAZOTROPHS ISOLATED FROM PALM CULTIVARS (Opuntia and Nopalea) USING THE recA GENE Maria Luiza Ribeiro Bastos da SILVA1; Carolina dos Santos FIGUEIRÔA2; Adália Cavalcanti do Espírito Santo MERGULHÃO3; Maria do Carmo Catanho Pereira de LYRA4 1. Bióloga, Pós-doutoranda do PNPD/CAPES/FINEP do Instituto Agronômico de Pernambuco - Recife, PE. maria.luiza@ipa.br; 2. Bióloga, Bolsista de apoio técnico CNPq; 3. Bióloga, Pesquisadora – IPA, Recife, PE; 4. Engenheira Agrônoma, Pesquisadora– IPA, Recife, PE. RESUMO: Este trabalho teve como objetivo caracterizar filogeneticamente os isolados bacterianos da cultura da palma forrageira usando o gene recA. Para o isolamento caldódios de palma foram maceradas e inoculadas em meios semissólido semi-seletivo NFb, JNFb, LGI e LG sem adição de nitrogênio. Foram obtidos doze micro-organismos cuja a analise parcial do gene recA possibilitou a identificação dos gêneros Azospirillum, Bacillus e Methylobacterium.. Bactérias diazotróficas encontrados na cultura da palma podem ter uma grande função como bactéria promotora de crescimento. O gene recA mostrou-se bastante consistente para uso em filogenia molecular de bactérias. Observou-se ainda a presença de bactérias destes gêneros podem ter de grande interesse para futuros estudos considerando seu alto poder biotecnológico. PALAVRAS-CHAVE: Diversidade. Endofíticos. Filogenia. Reação em cadeia da polimerase (PCR). INTRODUÇÃO A cultura da palma forrageira no Nordeste do Brasil tem uma grande importância econômica por ser o alimento principal dos animais na região semiárida. Há alguns anos esta cultura vem sofrendo com o ataque de um inseto chamado cochonilha do carmim (Dactylopius Opuntiae) que está devastando toda área plantada e causando prejuízos para os pequenos agricultores que vivem da cultura da palma para alimentação de seu rebanho. Os micro-organismos endofíticos que estão presentes na cultura da palma forrageira, geralmente são fungos e bactérias, que interagem e vivem sistematicamente no interior dessas plantas, sem causar aparentemente danos aos seus hospedeiros. Existe uma série de razões para que se aprofundem os estudos com endofíticos, pois, vários deles são capazes de produzirem antibióticos e outros metabólicos secundários de interesse farmacológico, muitos têm sido usados como agentes de controle biológico de pragas e doenças e também como bioherbicidas (DÖBEREINER, 1997; CHEANG et al., 2005). Genes usados para o estudo de filogenia de espécies têm um papel importante na identificação taxonômica principalmente quando se trata de espécies e gêneros relacionados (FELSENSTEIN, 2004; VINUESA et al., 2005). É interessante estabelecer que a filogenia de um único gene não deve ser confundida com a filogenia das espécies já que cada árvore formada com um único gene é o resultado aleatório de um processo genealógico único. Escobar-Páramo et al, (2004), observaram que nas comparações multilocus a identificação e remoção de seqüências submetidas a transferência lateral dentro e entre espécies pode interferir de forma crítica na filogenia de espécies principalmente quando múltiplos isolados são analisados. Alguns autores como Eisen (1995) e Young (1998), avaliaram o impacto da transferência de genes na interpretação da filogenia de um único gene, como aqueles com base na SSU (pequena subunidade ribossomal) em que se faz necessário estudar mais loci. Estes autores observaram dois loci atpD e recA em espécies representativas de rizóbio de crescimento rápido, e verificaram que as bactérias são consistentes com a SSU correspondente em sua filogenia. O gene recA codifica parte do gene da recombinação gênica e no sistema de reparo do DNA, além de possuírem seqüencias curtas que podem limitar a detecção de mosaicismos intragênicos, que são, fenômenos que ocorrem quando um indivíduo apresenta dois materiais genéticos distintos, causando uma falha genética através de mutação resultando em linhagens de células distintas geneticamente. A falta de conhecimento sobre a ocorrência de bactérias endofíticas em plantas quanto a sua identidade, diversidade e os níveis populacionais nos diferentes tecidos das plantas é ainda um enigma para entender a intima relação que Received: 25/09/13 Accepted: 05/09/14 578 Identificação de bactérias diazotróficas... SILVA, M. L. R. B. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 31, n. 2, p. 577-583, Mar./Apr. 2015 desenvolveram estes micro-organismos com a sua planta hospedeira (BAZZICALUPO; OKON, 2000; MELLONI et al., 2004). Além de possuírem uma habilidade para sobreviver dentro da planta com pouca ou nenhuma competição microbiana os tornam potenciais candidatos para o controle biológico. Atualmente, não há estudos sobre os endofíticos presentes na cultura da palma forrageira. Diante disto, este trabalho teve como objetivo caracterizar filogeneticamente os isolados bacterianos da cultura da palma forrageira usando o gene parcial recA. MATERIAL E MÉTODOS Foi coletado como amostra um cladódio de cada variedade de palma (Tabela 1); as amostras de cladódio foram cultivadas em meios de cultivo semissólidos, semisseletivos (NFb, JNFb, LGI e LG) e sem adição de nitrogênio, como descrito por Döbereiner et al. (1995). Para o isolamento, foram utilizados 10 g de cada amostra do cladódio (massa fresca), os quais foram lavados com água corrente, triturados e misturados em 90 mL de solução salina (NaCl, 0,5%) e diluídos serialmente (101-107). De cada diluição, foram retiradas alíquotas de 0,1 mL e inoculadas em frascos de vidro contendo os meios de cultura (NFb, JNFb, LGI e LG); estes foram incubados a 30°C e o crescimento bacteriano foi avaliado aos três, cinco e sete dias, verificando-se o aparecimento ou não da película característica para as bactérias diazotróficas endofíticas. Após o completo isolamento de uma cultura pura, estes isolados foram crescidos em meio DYGS (RODRIGUES NETO et al., 1986) e foi realizada a extração de DNA genômico. Para identificar o provável gênero bacteriano foram realizadas extração de DNA usando o Kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega) de acordo com as recomendações do fabricante. A amplificação do gene recA foi realizado usando os primers recA-6F (5´-CGK CTS GTA GAG GAY AAA TCG GTG GA-3´) e recA-555R (5´-CGR ATC TGG TTG ATG AAG ATC ACC AT-3´) (GAUNT et al., 2001) e as condições de amplificação foi realizada em um volume final de 25 µ l contendo: 40 ng de DNA molde, 1µ M de cada primer, 12,5 µ L de la GoTaq Colorless (Promega). Os ciclos de temperaturas foram realizados em um termociclador PCT-100TM (MJ Research, Inc, USA) com uma desnaturação inicial de 94ºC por 4 min., 30 s a 94ºC, 30 s de anelamento a 50ºC e 1 min. de extensão a 72ºC, seguidos de uma extensão final de 8 min. a 72ºC por 30 ciclos. Os produtos amplificados foram visualizados em eletroforese a 1 % em gel de agarose usando tampão TBE 0,5X, a 100 Volts. Os produtos foram visualizados usando SybrGold (Invitrogen) e fotodocumentados no LPIX-HE da Loccus do Brasil. Após a purificação (LYRA, 2001), os produtos amplificados foram seqüenciados na Macrogen Inc. Korea. As sequências obtidas foram alinhadas e comparadas pelo programa ‘ClustalX V.4.0.’ (LARKIN et al., 2007), com base no gene recA. Além disso, para esta comparação, foi realizada a busca de sequências depositadas no GenBank, com o propósito de agrupar as bactérias nos respectivos gêneros. Para matriz de distância das árvores filogenéticas, foi utilizado o método fenético baseado em distância genética neighbor- joining (NJ) (SAITOU; NEI, 1987) e o algoritmo p- distance, respectivamente processado pelo programa Molecular Evolutionary Genetics Analysis-MEGA versão 4.0 (TAMURA et al., 2007). Todas as sequências do gene recA obtidas neste estudo foram enviadas ao banco de dados do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e receberam os números de acesso: KC312318 a KC312329. RESULTADOS E DISCUSSÃO Isolamento da bactéria diazotróficas Foram isolados doze microrganismos provenientes do interior dos cladódios de palma forrageira das regiões do agreste (Caruaru) e sertão de Pernambuco (Arcoverde) (Tabela 1). Rodríguez e Fraga (1999) relataram que os gêneros bacterianos que mais se destacam como promotores de crescimento são: Pseudomonas, Bacillus, Serratia, Azospirillum e Azotobacter. Estes dados corroboram com os resultados encontrados neste estudo onde foram isoladas bactérias diazotróficas endofíticas destes gêneros. 579 Identificação de bactérias diazotróficas... SILVA, M. L. R. B. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 31, n. 2, p. 577-583, Mar./Apr. 2015 Tabela 1: Resultados da busca por similaridade no NCBI GenBank dos isolados pelo seqüenciamento parcial do gene recA Legenda Genbank Meio de isolamento Variedade de Palma/Local de Coleta Micro-organismo Homologia no NCBI Identidade E-value isolAM01 KC312318 NFb (1327) Marmillon Fodder/Caruaru Azospirillum lipoferum 4B (NC_016622.1) 97% 100% 5e-125 isolAM02 KC312319 LG (1327) Marmillon Fodder/Caruaru Azospirillum lipoferum 4B, (NC_016622.1 97% 100% 7e-125 isolAM04 KC312320 NFb 27(1294) Mexico Vegetable/Arcoverde Azospirillum lipoferum 4B (NC_016622.1 100% 100% 2e-120 isolAM05 KC312321 NFb 27(1294) Mexico Vegetable/Arcoverde Azospirillum brasilense Sp245 (NC_016617.1) 99% 100% 7e-120 isolAM06 KC312322 JNFb AM6 16-F21 (403) Forrageira México/Arcoverde Methylobacterium radiotolerans (NC_010505.1) 91% 100% 1e-126 isolAM20 KC312323 LGI IPA 90-92/Caruaru Gluconacetobacter diazotrophicus PAl5 (NC_011365.1) 49% 100% 4e-06 isolAM24 KC312324 NFb 422 CPTSA 1281 (2001800)/Caruaru Bacillus pumilus SAFR- 032 (NC_009848.1) 80% 89% 6e-72 isolAM26 KC312325 NFb F3 Rojo Vigor – Frutífera/Arcoverde Bacillus pumilus SAFR- 032 (NC_009848.1) 94% 93% 0.0 isolAM28 KC312326 NFb Palma de Espinho Frutífera Methylobacterium radiotolerans JCM 2831 (NC_010505.1) 90% 95% 6e-115 isolAM29 KC312327 NFb /Arcoverde51-1317 Chile Fruit/Arcoverde Bacillus pumilus SAFR- 032 (NC_009848.1) 92% 94% 0.0 isolAM30 KC312328 NFb 43 – Miúda Tradicional/Arcoverde Bacillus pumilus SAFR- 032 (NC_009848.1) 91% 92% 0.0 isolAM36 KC312329 JNFb (438) F8 Forrageira/Caruaru Bacillus pumilus SAFR- 032 89% 91% 0.0 580 Identificação de bactérias diazotróficas... SILVA, M. L. R. B. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 31, n. 2, p. 577-583, Mar./Apr. 2015 Oito do total de bactérias diazotróficas endofíticas foram provenientes do meio NFb (Azospirillum brasilense; A. lipoferum; Bacillus pumilus, Methylobacterium radiotolerans). Segundo Magalhães e Döbereiner (1984) mostraram mesmo sendo as espécies de Azospirillum - favorecidas nos meios NFb, outros microrganismos diazotróficos podem crescer nestes meios, como ocorreu no presente estudo. O meio LG cresceu apenas um isolado que obteve homologia comAzospirillum brasilense) e no meio LGI, o isolado teve uma homologia muito baixa com Gluconacetobacter diazotrophicus PAl5 de 49%.. Foram encontrados dois isolados no meio JNFb (Bacillus e Methylobacterium) do total das bactérias diazotróficas isoladas. Apesar de descrito na literatura segundo Dobereiner (1997) que o meio JNFb (Tabela 1) seja um meio para isolar Herbaspirullum, no nosso estudo, os isolados que cresceram neste meio foram: Methylobacterium radiotolerans e Bacillus pumilus (Figura 1). A falta de especificidade do meio JNFb, já considerada por Baldani et al. (1999), indica que o meio JNFb permite o crescimento de outras bactérias endofíticas, principalmente aquelas capazes de tolerar a maior acidez inicial deste meio. A diversidade da comunidade endofítica ainda tem muito a ser elucidada. Algumas bactérias diazotróficas como Acetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae, Azoarcus spp. e Azospirillum spp (CHAINTREUIL et al., 2000), antes descritas somente com localização na região de rizosfera, agora também são descritas em regiões endofíticas. Figura 1. Dendrograma baseado na sequência do gene recA, mostrando as posições filogenéticas dos isolados em relação às sequências já depositadas em banco de dados. Os números internos representam a porcentagem de vezes em que foi possível reconstruir o agrupamento em questão. A régua é a distância de similaridade do agrupamento em questão. Análise e sequenciamento baseada no gene recA A qualidade do DNA genômico isolado foi avaliada por meio de eletroforese em gel de agarose. Foi utilizado o padrão 100 pb DNA ladder (Invitrogen) como padrão de tamanho molecular e o tamanho gerado pela amplifucação do gene recA foi de 700 pb. As seqüências do gene recA foram submetidas ao programa BLASTn do GenBank 581 Identificação de bactérias diazotróficas... SILVA, M. L. R. B. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 31, n. 2, p. 577-583, Mar./Apr. 2015 onde se realizou uma pesquisa cuja comparação ocorreu entre os dados obtidos neste trabalho com os que já se encontram no banco de dados. A análise por clusterização baseada nas sequências do gene recA permitiu um agrupamento mais congruente entre todos os gêneros distribuídos no dendrograma, porque os isolados estudados neste trabalho ficaram agrupados de acordo com suas espécies, mostrando que este gene tem uma capacidade de determinar a posição taxonômica de novos isolados segundo mostrado por Scholz et al. (2008) (Figura 1). De acordo com análise comparativa foram formados cinco grupos. O grupo I formado apenas por sequencias de bactérias retiradas do GenBank, dos gêneros Gluconacetobacter e Azospirilum. O grupo II formado pelas sequências dos isolados (isolAM01, isolAM02, isolAM04 e isolAM05) que apresentaram elevada homologia ao gênero Azospirilum, mas separadas em ramos diferentes. O grupo III e IV foi formado pelos isolados (isolAM20 e isolAM24) respectivamente. Já o grupo V foi representado pela seqüência dos isolados (isolAM26, isolAM29, isolAM30 e isolAM36) apresentaram elevada homologia com o gênero Bacillus. O predomínio dos gêneros Bacillus e Azospirillum corrobora com os resultados obtidos por (LALANDE et al., 1989). Os resultados entre as sequencias obtidas em relação às do banco de dados apresentaram entre 80-100% de similaridade, o que indica confiabilidade para os resultados encontrados. Apenas o isolado isolAM20 (Gluconacetobacter diazotrophicus) apresentou uma baixa homologia com 49% com as sequencias de bactérias diazotrófica endofítica. Segundo Payne et al. (2006) e Scholz et al. (2008), o gene recA, permite melhor discriminação do que o gene 16S rDNA e genes rrs (Ribossomais). Entretanto, as análises obtidas do gene recA não são exatamente semelhantes às obtidas pela filogenia da sequência do gene 16S rDNA, indicando maior grau de resolução entre espécies relacionadas. CONCLUSÕES O sequenciamento parcial do gene recA mostrou-se eficiente para o estudo filogenético de bactérias em palma forrageira. A presença dos gêneros Azospirillum, Bacillus e Methylobacterium pode ser de grande interesse para futuros estudos, uma vez, que estes gêneros apresentam grande potencial biotecnológico. AGRADECIMENTOS Ao Instituto Agronômico de Pernambuco - IPA, pela estrutura física e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES (PNPD - no. 02714/09-4 Linha MCT/ FINEP), e á Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco (FACEPE) pelo suporte financeiro concedido. ABSTRACT: This study aimed to characterize phylogenetically isolated bacterial culture of Cactus Pear using the parcial gene recA. For isolation cladodes were macerated and inoculated in semi-selective semisolid media NFB, JNFb, LGI and LG without added nitrogen. Twelve micro-organisms were obtained whose analysis of partial gene recA enabled the identification of the genera Azospirillum, Bacillus and Methylobacterium. Diazotrophic bacteria found in the culture of Cactus Pear may have a great function as growth-promoting bacteria. The partial gene recA was shown to be quite consistent for use in molecular phylogeny of bacteria. We also observed the presence of bacteria of these genera may be of great interest for future studies considering its high power biotechnology. KEYWORDS: Diversity. Endophytic. Phylogeny. PCR. DNA. REFERÊNCIAS BALDANI, J. I.; AZEVEDO, M. S.; REIS, V. M.; TEIXEIRA, K. R. S.; OLIVARES, F. L.; GOI, S. R.; BALDANI, V. L. D.; DOBEREINER, J. Fixação biológica de nitrogênio em gramíneas: avanços e aplicações. In: SIQUEIRA, J. O.; MOREIRA, F. M. S.; LOPES, A. S.; GUILHERME, L. R. G.; FAQUIN, V.; FURTINI NETO, A. E.; CARVALHO, J. G., eds. Inter-relação fertilidade, biologia do solo e nutrição de plantas. 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