Microsoft Word - 25-Agra_22504_vet- 549 Original Article Biosci. J., Uberlândia, v. 31, n. 2, p. 549-554, Mar./Apr. 2015 ISOLAMENTO DE Streptococcus agalactiae EM DIFERENTES ÓRGÃOS DE TILÁPIAS DO NILO (Oreochromis niloticus) CRIADAS EM TANQUES-REDE ISOLATION OF Streptococcus agalactiae IN DIFFERENT ORGANS OF NILE TILAPIA (Oreochromis niloticus) REARED IN NET CAGES Paulo Fernandes MARCUSSO1; Silas Fernandes ETO1; Gustavo da Silva CLAUDIANO1; Flávia Campos Freitas VIEIRA2; Rogério SALVADOR3; Julieta Rodini Engrácia de MORAES1; Flávio Ruas de MORAES1 1. Departamento de Patologia Veterinária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista – UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil. paulomarcusso@gmail.com; 2. Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil; 3. Departamento de Patologia Geral, Campus Luiz Meneghel, Universidade Estadual do Norte do Paraná – UENP, Bandeirantes, PR, Brasil. RESUMO: A estreptococose é uma das principais causas de mortalidade na criação de tilápias no Brasil, causando grandes perdas econômicas. Assim, o estudo objetivou determinar a frequência de isolamento e identificação por PCR de Streptococcus agalactiae em diferentes órgãos de tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) naturalmente infectadas, oriundas de oito pisciculturas da região norte do estado do Paraná que apresentavam sinais clínicos característicos de infecção estreptocócica. Para tanto, coletaram-se amostras de sangue e fragmentos de rim, fígado, baço, coração e encéfalo. Essas foram semeadas em meio ágar infusão de cérebro e coração (BHI) adicionado 5% de sangue de ovino e incubados à 29ºC, durante 7 dias em aerofília. Após o crescimento bacteriano e a partir das características macro e microscópicas, foram selecionadas colônias compatíveis com as do gênero Streptococcus sp.. As espécies foram identificadas através de PCR e confirmadas por meio do sequenciamento do gene 16S rDNA. Os resultados demonstraram que em tilápias do Nilo infectadas com S. agalactiae, o isolamento é mais frequente em encéfalo, rim e fígado em ordem decrescente. PALAVRAS-CHAVE: Estreptococose. Oreochromis niloticus. Bacteriose. Teleósteos. INTRODUÇÃO As bacterioses são uma das principais causas de perdas econômicas na criação de tilápias, com destaque para os gêneros Aeromonas, Pseudomonas, Vibrio, Flavobacterium, Edwardsiella, Streptococcus e Enterococcus (MORAES; MARTINS, 2004). Estas bactérias podem ser encontradas em diferentes órgãos de peixes sadios (CAI et al., 2004; LIM; WEBSTER, 2006). Entre as espécies de Streptococcus que acometem os teleósteos, destaca-se Streptococcus agalactiae. No Brasil é responsável por altas taxas de morbidade e mortalidade em diferentes sistemas de criação, principalmente em tilápia do Nilo (SALVADOR et al., 2003; 2005; 2012). Os sinais clínicos incluem anorexia, escurecimento da pele, natação errática, letargia, curvatura do corpo, exoftalmia e opacidade de córnea uni ou bilateral, sufusões no opérculo e base das nadadeiras, ulceração da epiderme e morte (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). As lesões internas são caracterizadas por congestão brânquial, hepatomegalia acompanhada de congestão, ascite, esplenomegalia e encefalomalácia (SALVADOR et al., 2003; 2005; FIGUEIREDO et al., 2006; PRETTO-GIORDANO et al., 2010). A severidade da doença em tilápias está relacionada a fatores como a estirpe do S. agalactiae, dose infectante, temperatura da água, biomassa e manejo zootécnico (CHANG; PLUMB, 1996). A principal via de transmissão é a horizontal pelo contato com peixes e/ou alimentos contaminados, como também pelo contato indireto mediado pela água dos sistemas de criação (LIM; WEBSTER, 2006). A fim de se obter maior precisão na identificação de S. agalactiae, podem-se utilizar técnicas de biologia molecular que permitam relacionar os resultados dos testes fenotípicos e genotípicos (LANGE et al., 2011). Umas dessas técnicas é o sequenciamento do gene do RNA ribossomal 16S, amplamente utilizado com finalidade taxonômica e filogenética e que consiste na análise comparativa da sequência de determinados genes de macromoléculas conservadas como o RNA ribossomal (BECKER et al., 2004). As sequências encontradas são comparadas com aquelas depositadas em bancos de dados, como o National Center for Biotechnology Information (NCBI) (LANGE et al., 2011). Received: 17/04/13 Accepted: 05/09/14 550 Isolamento de streptococcus... MARCUSSO, P. F. et al Biosci. J., Uberlândia, v. 31, n. 2, p. 549-554, Mar./Apr. 2015 O objetivo foi avaliar a frequência de isolamento de S. agalactiae identificados por PCR em diferentes órgãos de tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) com sinais clínicos de infecção estreptocócica. MATERIAL E MÉTODOS Espécimes de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) (n=39) criadas em tanques-rede, (250±10 g), com sinais clínicos de infecção estreptocócica, foram adquiridos de oito pisciculturas comerciais da região norte do estado do Paraná. Após anestesia em banho de solução de benzocaina (1:20.000), diluída em álcool etílico 98° (0,1 g/mL) (WEDEMEYER et al., 1969), foram coletadas amostras de sangue da veia caudal e os peixes submetidos à eutanásia por aprofundamento do plano anestésico, necropsiados e coletados fragmentos de rim, fígado, baço, coração e cérebro. Em seguida, estes foram semeados em meio sólido de infusão de cérebro e coração (BHI) adicionado 5% de sangue de ovino e incubados em estufa à 29ºC, durante 7 dias, em aerofilia (SALVADOR et al., 2005). Após o crescimento foram selecionadas colônias compatíveis com as do gênero Streptococcus a partir de suas características macroscópicas e microscópicas (cocos gram positivos) (KONEMAN et al., 2008) e essas foram confirmadas pela reação em cadeia de polimerase (PCR) convencional. Para a identificação das espécies do gênero Streptococcus, realizou-se a extração de DNA das colônias isoladas de acordo com Jafar et al. (2009). Quantificou-se o DNA em espectrofotômetro (Nanodrop ND-1000), as quantidades foram ajustadas para a reação de PCR (50-100 µ g/µ L) e o DNA armazenado à -20 ºC até as reações de PCR. O DNA genômico bacteriano foi submetido à amplificação por PCR com dois primers específicos para S. agalactiae, amplificando uma sequência específica do gene 16S rDNA (MARTINEZ et al., 2001). Foram utilizados os primers: F1 5’GAGTTTGATCATGGCTCAG 3’ e IMOD 5’ACCAACATGTGTTAATTACTC 3’, que amplificam um fragmento de 220 pb (pares de bases). As reações de PCR continham 1x Taq DNA polimerase buffer, DNA genômico, primers específicos (0.2 pM de cada primer), 100 pM de dNTP e 1,25 U de Taq DNA polimerase. As condições para a ciclagem foram: desnaturação inicial a 94 ºC por 4 min, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 1 min, anelamento dos primers a 55 ºC por 1 min e extensão a 72 ºC por 1 min. Após a reação, os fragmentos de DNA amplificados foram visualizados por eletroforese em gel de agarose (1,5%, p/v), corados com solução de brometo de etídio (0,005%, p/v) e visualizados em fotodocumentador. O sequenciamento dos isolados identificados como S. agalactiae foi feito a partir do gene 16S rDNA pelo Centro de Recursos Biológicos e Biologia Genômica (CREBIO) da Universidade Estadual Paulista, Unesp, campus de Jaboticabal. As sequências resultantes foram comparadas com sequências bacterianas depositadas na base de dados do National Center for Biotechnology Information NCBI (LANGE et al., 2011). RESULTADOS E DISCUSSÃO Os principais sinais clínicos observados foram letargia, diminuição do apetite, desvio de coluna vertebral, exoftalmia uni ou bilateral, distensão abdominal e natação errática e circular. Na necropsia foram observadas petéquias na pele, ascite aquosa de coloração amarelada, hepatomegalia leve, vesícula biliar repleta, esplenomegalia moderada, congestão renal, encefalomalácia e congestão cerebral (Figura 1). Os sinais clínicos observados neste trabalho foram semelhantes nos peixes experimentalmente inoculados com S. difficile e S. agalactiae descritos na literatura (ELDAR et al., 1995; EVANS et al., 2002; EVANS et al., 2004) e em tilápias experimentalmente ou naturalmente infectadas por S. iniae e S. agalactiae (PERERA et al., 1994; EVANS et al., 2000; SHELBY et al., 2002; SALVADOR et al., 2005). Apesar da patogenia e achados de necropsia provocada pela infecção por S. agalactiae em tilápias ainda não estar totalmente caracterizada, as alterações iniciais em peixes infectados naturalmente foram observadas pela associação da presença das colônias bacterianas e exotoxinas com as lesões do fígado, baço, rins e cérebro (CHEN et al., 2007; SUANYUK et al., 2008; ZAMRI-SAAD et al., 2010). As bactérias causam necrose local, invadem e se multiplicam dentro de macrófagos que podem atuar como veículo do S. agalacitae, que invade a corrente sanguínea e o dissemina para vários órgãos, inclusive com transposição da barreira hematoencefálica, com características de septicemia (ELDAR et al., 1994; EVANS et al., 2001; NGUYEN et al., 2001; EVANS et al., 2002; MUSA et al., 2009). A partir de amplificação por PCR, os amplicons do fragmento 16S rDNA, das amostras indicaram que todos os peixes estavam positivos para a infecção por S. agalactiae (Tabela 1). 551 Isolamento de streptococcus... MARCUSSO, P. F. et al Biosci. J., Uberlândia, v. 31, n. 2, p. 549-554, Mar./Apr. 2015 Figura 1. Exoftalmia hemorrágica (A); cérebro hiperêmico (B); rim congesto (C); vesícula biliar repleta e esplenomegalia (D) e hepatomegalia moderada (E). Tabela 1. Proporção e percentual de isolamento do Streptococcus agalactiae nos diferentes órgãos Órgão Proporção Percentual Amostras Isolamentos Encéfalo 0,744 74,4 39 29 Rim 0,410 41,0 39 16 Fígado 0,333 33,3 39 13 Baço 0,154 15,4 39 6 Coração 0,026 2,6 39 1 Sangue 0,026 2,6 39 1 A maior frequência de isolamento foi no encéfalo (74,4%), fato que demonstra a necessidade de pesquisa do agente neste órgão quando há suspeita de estreptococose e sinais neurológicos decorrentes de meningoencefalite. Os resultados corroborando com estudos epidemiológicos que apontam o Streptococcus agalactiae como sendo o principal agente etiológico meningoencefalite em teleósteos (ELDAR et al., 1994; EVANS et al., 2006). No rim e fígado a frequência de isolamento também foi significante e da ordem de 41,0% e 33,3%, respectivamente, ficando clara a necessidade da pesquisa bacteriana também nestes órgãos, que se apresentaram macroscopicamente aumentados de volume e com retenção sanguínea. Segundo Zamri- Saad et al. (2010), o fígado de tilápias infectadas por S. agalactiae, fica congesto, com necrose focal, o rim também congesto, com hemorragia e nefrite intersticiais. Ainda que os baços dos animais apresentassem congestão, sua função como filtro que faz a depuração de bactérias da corrente sanguínea e produção de anticorpos, parece não estar comprometida, pois o isolamento do S. agalacitiae ocorreu em 15,4% e do sangue em 2,6% dos casos, semelhantes aos encontrados por Salvador et al. (2005) em tilápias oriundas da mesma região. A severidade da doença em teleósteos está relacionada a fatores como: a estirpe da bactéria, dose infectante, temperatura da água, biomassa e manejo zootécnico (CHANG; PLUMB, 1996; OBA et al., 2009), nas quais condições de alto adensamento e baixa qualidade da água causam diminuição da resistência a patógenos (EVANS et al., 2002), fato observado em algumas pisciculturas estudadas no trabalho. Estudos epidemiológicos identificaram a presença de treze biótipos diferentes de S. agalactiae isolados em teleósteos de diferentes 552 Isolamento de streptococcus... MARCUSSO, P. F. et al Biosci. J., Uberlândia, v. 31, n. 2, p. 549-554, Mar./Apr. 2015 regiões do mundo (OLIVARES-FUSTER et al., 2008). No estado do Paraná foi isolado dois biótipos de S. agalactiae em tilápia (SALVADOR et al., 2005; OLIVARES-FUSTER et al., 2008), confirmando os resultados encontrados neste trabalho. CONCLUSÃO Em tilápias do Nilo infectadas com S. agalactiae o isolamento é mais frequente no encéfalo, rim e fígado em ordem decrescente. Recomendando-se pesquisas bacteriológicas nestes órgãos. ABSTRACT: Streptococcosis is one of the major causes of mortality in tilapia’s creation in Brazil, inducing great economic losses. As soon, the study objectived to determinate the frequency of isolation and identification the Streptococcus agalactiae in organs different of Oreochromis niloticus naturally infected, derived from eight fish farms in the northern region of the state of Paraná, that presented clinical signs characteristics of streptococcal disease. However, blood samples and fragments (kidney, liver, spleen, heart and brain) were collected. These all samples were plated on solid medium of brain and heart infusion (BHI) added 5% ovine blood and incubated at 29ºC for 7 days in aerophilic conditions. Behind, the bacterial growth and from the macro and microscopic features, colonies compatibles with Streptococcus sp. gender, were selected. The species were identified by PCR reaction and confirmed by sequencing of 16S rDNA gene. The results exhibited that in tilapia of Nile infected with S. agalactiae the isolation is more common in brain, kidney and liver in descending order. KEYWORDS: Streptococcosis. 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