Microsoft Word - 31-Bio_23292 934 Original Article Biosci. J., Uberlandia, v. 31, n. 3, p. 934-940 , May/June. 2015 EFEITO DE METABÓLITOS PRODUZIDOS POR Trichoderma spp. SOBRE O ÍNDICE MITÓTICO EM CÉLULAS DAS PONTAS DE RAÍZES DE Allium cepa EFFECT OF METABOLITES PRODUCED BY Trichoderma spp. ON MITOTIC INDEX IN CELLS OF Allium cepa ROOT TIPS Anderson Rossi de AGUIAR¹; Daniele AGUIAR²; Solange Bosio TEDESCO³; Antonio Carlos Ferreira da SILVA³ 1. Mestre, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil.; 2. Graduanda em Agronomia, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil. 3. Professor(a), Doutor(a), Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil. acfsilva2@uol.com.br RESUMO: Microrganismos do solo produzem metabólitos importantes para a produção de compostos biologicamente ativos. Dentre estes microrganismos, as espécies de trichoderma (Trichoderma spp.) possuem a capacidade de produzir metabólitos. A promoção do desenvolvimento de plantas por trichoderma pode estar relacionada, entre outros fatores, ao estimulo à multiplicação celular, através da produção de hormônios, entre outros. O método de avaliação do índice mitótico em raízes de Allium cepa é validado pelo Programa Internacional de Segurança Química (IPCS, OMS) e o Programa Ambiental das Nações Unidas (UNEP) como um eficiente teste para análise e monitoramento in situ. O objetivo do estudo foi selecionar cepas e produtos biológicos comerciais de trichoderma, utilizados no controle biológico de fitopatógenos que promovam o aumento do índice mitótico em células de pontas de raízes pelo sistema teste de A. cepa. Foram utilizadas cepas de Trichoderma harzianum (2B2, 2B22, 2B12); Trichoderma viride (TSM1, TSM2, C1) e os produtos biológicos comerciais de trichoderma, Agrotrich® e Trichodermil®. Os bulbos de Allium cepa foram arranjados em dez tratamentos (quatro repetições por tratamento), oito com metabólitos de cepas de Trichoderma spp. e dois controles na ausência de metabólitos. A contagem das células ocorreu na região meristemática, onde foram contadas 500 células por bulbo em cada uma das lâminas. Foram observadas as células em interfase, prófase, metáfase, anáfase e telófase, com auxílio de microscópio ótico com a objetiva de 40X. Foram contadas as células de cada uma das fases do ciclo celular estudadas, após calculou-se os índices mitóticos. A análise estatística dos dados foi realizada pelo teste χ2 (Qui-quadrado), com probabilidade de 5%, pelo programa estatístico BioEstat 4.0. Os tratamentos T1, T3 e T4 (metabólitos das cepas 2B2, 2B12 e C1 de trichoderma, respectivamente) apresentaram os maiores números de células para as fases prófase, metáfase, anáfase e telófase e alcançaram os maiores IM (χ2= 5.45 α= 0.05), (χ2= 5.0 α= 0.05) e (χ2= 3.92 α= 0.05), respectivamente. O tratamento controle T10 (meio líquido BD), apresentou o maior número de células em interfase, e o menor nas fases da divisão celular. O teste com raízes de Allium cepa possibilita selecionar cepas de trichoderma que induzem o aumento do índice mitótico em pontas de raízes pela ação de metabólitos e apresenta variabilidade entre as cepas estudadas. PALAVRAS CHAVES: Allium cepa. Divisão celular. Microrganismos. Teste vegetal. Trichoderma spp. INTRODUÇÃO Os metabólitos produzidos por microrganismos do solo representam um importante grupo para a produção de compostos biologicamente ativos (DONADIO et al., 2002), podendo ser sintetizados via ribossomal e não ribossomal (KLEINKAUF, VON DOHREN, 1996). Entre estes metabólitos se encontram os antibióticos, pigmentos, toxinas, indutores de competição ecológica, simbiose, e promotores de crescimentos de plantas (DEMAIN, 1992). Fungos do gênero Trichoderma encontram- se na rizosfera, são promotores do crescimento em espécies vegetais (MACHADO et al., 2012), e uma rica fonte de metabólitos secundários, apresentando um vasto repertório de genes supostamente envolvidos na biossíntese de peptídeos não ribossômicos, policetideos, terpenóides e pironas (MUKHERJEE et al., 2012). Segundo Melo (1998) muitas espécies de trichoderma (Trichoderma spp.) estudadas possuem a capacidade de produzir metabólitos tóxicos, tais como antibióticos e enzimas líticas degradadoras da parede celular de fungos fitopatogênicos. Conforme Claydon et al. (1987), são consideradas eficientes tanto pela produção de metabólitos voláteis como de não voláteis, esta capacidade também foi evidenciada por outros autores como Bell et al. (1982), Reis et al. (1995) e Durman et al. (1999). Assim, fungos do gênero Trichoderma incluem espécies economicamente importantes por sua atuação no controle biológico, por apresentarem capacidade de produzir antibióticos e enzimas, e pela produção metabólica com atividades análogas aos hormônios vegetais (CARVAJAL et al, 2009). A promoção do desenvolvimento de plantas por Received: 11/08/13 Accepted: 10/10/14 935 Efeito de metabólitos... AGUIAR, A. R. et al. Biosci. J., Uberlandia, v. 31, n. 3, p. 934-940 , May/June. 2015 trichoderma pode estar relacionada, entre outros fatores, ao estimulo a multiplicação celular, através do aumento da disponibilidade e absorção de nutrientes pela planta, à produção de hormônios e ao aumento da superfície total do sistema radicular (LUCON, 2009; MACHADO et al., 2012). O método de avaliação do índice mitótico (IM) em raízes de Allium cepa é validado pelo Programa Internacional de Segurança Química (IPCS, OMS) e o Programa Ambiental das Nações Unidas (UNEP) como um eficiente teste para análise e monitoramento in situ (CABRERA; RODRIGUEZ, 1999). Este sistema teste vegetal de Allium cepa é utilizado com regularidade para estudos dos efeitos de extratos vegetais (FACHINETTO et al., 2007), utilizando o índice mitótico como indicador de proliferação adequada das células, os resultados podem ser relacionados a culturas de linfócitos (GADANO et al., 2002). Pesquisadores realizam de forma conjunta teste animal in vitro e os resultados obtidos são similares aos testes utilizando sistema teste vegetal in vivo (TEIXEIRA et al., 2003), propiciando informações de grande importância. Desta forma, o presente estudo objetivou a seleção de cepas do agente biológico trichoderma que promovam, através de seus metabólitos, o aumento do índice mitótico em células de pontas de raízes pelo sistema teste de Allium cepa. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Citogenética Vegetal e Genotoxidade e no Laboratório de Interação Planta- Microrganismos, Departamento de Biologia, da Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria/RS (UFSM). Cepas de Trichoderma spp. Foram utilizadas cepas de trichoderma, pertencentes ao Laboratório Planta Microrganismos, de Trichoderma harzianum (2B2, 2B22, 2B12); Trichoderma viride (TSM1, TSM2, C1) e os produtos comerciais Agrotrich® (cepas de Trichoderma harzianum e Trichoderma viride, 1.106 UFC.g-1, Agri Haus do Brasil) e Trichodermil® WP Organic (cepa especial de Trichoderma harzianum, 500. 106 conídios viáveis.g-1, Itaforte Bioprodutos,). Bulbos de Cebola Foram utilizados 40 bulbos de cebola (Allium cepa) orgânicos livres de agentes genotóxicos. Preparo dos metabólitos das cepas de trichoderma spp. Para o preparo dos metabólitos das cepas de trichoderma foram colocados para cada isolado um disco de meio de cultura BDA (batata-dextrose- ágar), contendo micélio e esporos, em recipientes plásticos de 1.000 mL esterilizados contendo meio líquido BD (batata-dextrose) e incubados por 10 dias sob agitação em mesa orbital (Modelo TE-141, Marca TECNAL) em temperatura ambiente (25°C) e fotoperíodo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro, posteriormente, os meios de cultura foram filtrados, para separar os metabólitos da massa micelial e esporos, sendo que imediatamente os bulbos de Allium cepa (quatro repetições por tratamento) foram dispostos nos recipientes contendo meios de culturas BD filtrados com e sem metabólitos das cepas de Trichoderma spp. para enraizar. Os bulbos foram mantidos nos meios de cultura, entre 5 a 7 dias, até a germinação das radículas. Os 40 bulbos colocados para enraizar formaram os seguintes tratamentos: T1- metabólitos da cepa 2B2; T2- metabólitos da cepa 2B22; T3- metabólitos da cepa 2B12; T4- metabólitos da cepa C1; T5- metabólitos da cepa TSM1; T6- metabólitos da cepa TMS2; T7- metabólitos do produto Trichodermil®; T8- metabólitos do produto Agrotrich®; T9- controle 1 - somente água; T10- controle 2 - somente meio liquido BD (batata- dextrose). Os bulbos foram submetidos aos tratamentos para o enraizamento, e após, as radículas foram coletadas e fixadas em etanol: ácido acético (3:1) e a seguir conservadas em álcool 70% sob refrigeração a 10 °C. Análise da divisão celular das raízes dos bulbos de cebola Para o preparo das lâminas utilizou-se radículas previamente conservadas em etanol 70%, as quais foram hidrolisadas em HCl 1N por 5 minutos, e em seguida foram lavadas em água destilada e coradas com orceína acética 2% pela técnica de esmagamento (adaptada de GUERRA e SOUZA, 2002). Foi realizada a contagem das células, onde foram contadas 500 células por bulbo em cada uma das lâminas, quatro lâminas por bulbo. Foram examinadas observando-se as células em interfase, prófase, metáfase, anáfase e telófase, com auxílio de microscópio ótico com a objetiva de 40X. Foram contadas as células de cada uma das fases do ciclo celular estudadas: interfase e divisão (prófase, metáfase, anáfase e telófase), após calculou-se os índices mitóticos. Fez-se análise estatística dos 936 Efeito de metabólitos... AGUIAR, A. R. et al. Biosci. J., Uberlandia, v. 31, n. 3, p. 934-940 , May/June. 2015 dados pelo teste χ2 (Qui-quadrado), com probabilidade de 5%, pelo programa estatístico BioEstat 4.0. Após a análise, algumas lâminas foram seladas com cimento galvanizante VIPAL® e foram armazenadas em geladeira por um dia e então foi realizada a montagem de lâminas permanentes com o uso de meio de inclusão rápida (ENTELLAN®). RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos a partir da análise de células de Allium cepa são apresentados nas Tabelas 1 e 2. O número total de células analisadas (2000 células) e o número de células nas diferentes fases do ciclo celular: interfase, prófase, metáfase, anáfase e telófase, obtidas a partir de pontas de raízes de cebola tratadas com metabólitos produzidos por cepas de Trichoderma sp. podem ser observados na Tabela 1. Os tratamentos T1, T3 e T4 (metabólitos das cepas 2B2, 2B12 e C1 de trichoderma, respectivamente) apresentaram os menores números de células em interfase e os maiores para as fases prófase, metáfase, anáfase e telófase (Tabela 1). O tratamento controle T10 (meio líquido BD), apresentou o maior número de células em interfase (1962 células), e o menor nas fases da divisão celular. Um maior número de células em interfase (1958 de células) também foi observado para o tratamento controle T9 (água). Os tratamentos- controle T10 e T9 (meio liquido BD batata-dextrose e água, respectivamente) apresentaram pouca diferença em relação aos tratamentos com metabólitos T8 (Agrotrich®), T7 (Trichodermil®), T6 (isolado TSM2), T5 (isolado TSM1) e T2 (isolado 2B22) que apresentaram 1940, 1961, 1959, 1947 e 1947 células em interfase, respectivamente, portanto esses tratamentos apresentaram os menores números de células em divisão (Tabela 1) em prófase, metáfase, anáfase e telófase. Tabela 1. Número de células no ciclo celular (interfase, prófase, metáfase, anáfase e telófase) em pontas de raízes de cebola tratadas com metabólitos produzidos por cepas de Trichoderma spp. Número de células nas fases do ciclo celular Tratamentos Interfase Prófase Metáfase Anáfase Telófase T1 1891 46 35 12 16 T2 1947 21 15 9 8 T3 1892 48 32 13 15 T4 1921 33 25 9 12 T5 1947 23 17 6 7 T6 1959 19 11 5 6 T7 1961 18 11 4 6 T8 1940 15 26 9 10 T9 1958 9 15 6 12 T10 1962 25 3 5 5 T1- metabólitos do isolado 2B2; T2- metabólitos do isolado 2B22; T3- metabólitos do isolado 2B12; T4- metabólitos do isolado C1; T5- metabólitos do isolado TSM1; T6- metabólitos do isolado TMS2; T7- metabólitos do produto Trichodermil®; T8- metabólitos do produto Agrotrich®; T9- controle 1 - somente água; T10- controle 2 - somente meio BD (batata-dextrose). A Tabela 2 apresenta o total médio do índice mitótico (IM), o número total de células analisadas, e o número total de células em divisão celular, tanto para os bulbos controle como para os bulbos tratados com os metabólitos de trichoderma. Conforme esperado, os tratamentos T1, T3 e T4 (metabólitos das cepas 2B22, 2B12 e C1, respectivamente) alcançaram os maiores IM (χ2= 5.45 α= 0.05), (χ2= 5.4 α= 0.05) e (χ2= 3.92 α= 0.05), respectivamente, diferindo estatisticamente dos tratamentos controles na ausência de metabólitos de diferentes cepas (2,07 e 1,87% para T9 e T10, respectivamente), demonstrando serem cepas capazes de aumentar o índice mitótico podendo interferir na divisão celular. Por sua vez, os metabólitos das cepas 2B22, TSM1, TSM2, produto Trichodermil® e o produto Agrotrich®, em relação aos tratamentos controle não apresentaram diferenças significativas para os índices mitóticos, não interferindo, portanto, no aumento da divisão celular em pontas de raízes, o que demonstra que a capacidade de aumentar o índice mitótico é uma característica variável entre as cepas estudadas. Os tratamentos com os menores IM alcançaram valores 937 Efeito de metabólitos... AGUIAR, A. R. et al. Biosci. J., Uberlandia, v. 31, n. 3, p. 934-940 , May/June. 2015 de (χ2= 1.92 α= 0.05) e (χ2= 1.87 α= 0.05), tratamento 7 e 10, respectivamente. Tabela 2. Índice mitótico de células de pontas de raízes de cebola tratadas com metabólitos produzidos por cepas de Trichoderma spp. Tratamentos Número Total de Células Células em Divisão % Índice Mitótico T1 2000 109 5,45 a T2 2000 53 2,62 d T3 2000 108 5,40 a T4 2000 79 3,92 bc T5 2000 53 2,62 d T6 2000 41 2,02 d T7 2000 39 1,92 d T8 2000 60 2,97 cd T9 2000 42 2,07 d T10 2000 38 1,87 d Porcentagens seguidas da mesma letra (a, b, c ou d) não diferem significativamente ao nível de 5%, pelo teste χ2. A análise do ciclo celular de células meristemáticas de raiz de A. cepa, com o sistema teste vegetal, serve como indicativo para avaliar o desempenho dos metabólitos produzidos por trichoderma na promoção da divisão celular de pontas de raízes, utilizando o índice mitótico como indicador de proliferação das células. Chauhan et al.(1999) relataram que testes com extratos vegetais têm apresentado efeitos similares em células de plantas e animais. Fungos do gênero Trichoderma encontram- se na rizosfera e podem promover o crescimento radicular em espécies vegetais (MACHADO et al., 2012) possivelmente pela capacidade de produção metabólica (ALTAMORE et al., 1999; FILHO et al., 2008), assim induzindo a multiplicação celular. Carvajal et al. (2009), avaliaram a produção de metabólitos de 101 cepas de trichoderma da Colômbia, 20% das cepas foram capazes de produzir formas solúveis de fosfato de rocha fosfática, 8% das amostras avaliadas mostraram capacidade de produzir sideróforos consistentes para converter ferro a formas solúveis, 60% produziram ácido indol-3-acético (IAA) ou análogos a auxina. A produção destes metabólitos é uma característica de cepas específicas, como foi verificado no presente trabalho, demonstrando haver diferença no comportamento das cepas de trichoderma em relação à síntese metabólica (FILHO et al., 2008). Em estudos realizados com Arabidopsis thaliana investigaram o papel da auxina produzida e isolada de Trichoderma spp. na regulação do crescimento e desenvolvimento da planta em resposta à inoculação de Trichoderma. virens e Trichoderma atroviride desenvolvendo um sistema de interação fungo-planta, o qual resultou em características fenotípicas relacionadas com a auxina, como o aumento da produção de biomassa e estimulação do desenvolvimento das raízes laterais (CONTRERAS-CORNEJO, 2009). Diversos trabalhos mostram o efeito benéfico de espécies de Trichoderma na promoção do desenvolvimento vegetal. Filho et al. (2008) concluíram que o isolado CEN 262 de Trichoderma spp. proporcionou maior índice de desenvolvimento de partes aéreas de mudas de eucalipto. Reguladores vegetais podem incrementar o crescimento e o desenvolvimento vegetal, estimulando a divisão celular, a diferenciação e o alongamento celular, podendo, também, aumentar a absorção e a utilização de água e nutrientes pelas plantas (Vieira; Castro 2004), espécies de trichoderma produzem metabólitos cujas atividades são análogas a estes reguladores de crescimento (CARVAJAL et al, 2009). Em estudo realizado por Fortes et al. (2007) foi observado que a sobrevivência de microestacas de um clone de Eucalyptus sp. aumentou por meio do tratamento com cepas de Trichoderma spp. e também promoveu um aumento na porcentagem de enraizamento, comprovando que algumas linhagens aumentam a superfície total do sistema radicular, possibilitando um maior acesso aos elementos minerais (HARMAN, 2004). Os resultados apresentados nesse trabalho indicam que há diferença no comportamento dos metabólitos das diferentes cepas testadas de trichoderma em relação ao índice mitótico de Allium 938 Efeito de metabólitos... AGUIAR, A. R. et al. Biosci. J., Uberlandia, v. 31, n. 3, p. 934-940 , May/June. 2015 cepa, e que houve estimulo da divisão celular das raízes de Allium cepa. Em estudo com extrato de plantas medicinais, Camparoto et al (2002), pesquisaram o efeito sobre células de pontas de raízes utilizando o teste de Allium cepa, ao contrario do observado para os metabólitos de trichoderma, as infusões causaram declínio do número de células em divisão em relação aos controles. Os resultados obtidos para o índice mitótico a partir de estudos utilizando o sistema teste de Allium cepa, bem como na literatura (FACHINETTO et al., 2007), são considerados satisfatórios como indicativos de potencial proliferativo dos indutores de plantas sobre as células como no caso do presente trabalho, em que observou-se a interferência de metabólitos produzidos por cepas de Trichoderma spp em pontas de raízes. O teste com raízes de Allium cepa utilizado para a observação do aumento do índice mitótico poderá auxiliar outros experimentos de seleção in vitro e ex vitro com cepas do bioagente trichoderma, promotores de enraizamento e crescimento. CONCLUSÃO O teste com raízes de Allium cepa possibilita selecionar cepas de Trichoderma spp. que induzem o aumento do índice mitótico em pontas de raízes pela ação de metabólitos. A capacidade de aumentar o índice mitótico de células de pontas de raízes de Allium cepa apresenta variabilidade entre as cepas de trichoderma estudadas. ABSTRACT: Soil microorganisms produce metabolites important for the production of biologically active compounds. In relation to these organisms, species of trichoderma (Trichoderma spp.) have the ability to produce metabolites. Promoting the development of plants by trichoderma may be related, among other factors, to stimulate cell proliferation through the production of hormones, among others. The method of evaluation of mitotic index in Allium cepa roots is validated by the International Programme on Chemical Safety (IPCS, WHO) and United Nations Environment Programme (UNEP) as an effective test for in situ analysis and monitoring. The aim of the study was to select strains and commercial biological products trichoderma used in biological control of plant pathogens that promote increased mitotic index in cells of the root tips of A. cepa test system. Strains of Trichoderma harzianum (2B2, 2B22, 2B12) and Trichoderma viride (TSM1, TSM2, C1) and the biological products commercials Agrotrich® and Trichodermil® of trichoderma were used. The bulbs of Allium cepa were arranged in ten treatment (four replicates per treatment), eight with metabolite of Trichoderma spp. and two controls in the absence of metabolites. Cell counts occurred on the meristematic region where 500 cells were counted for each bulb on the blades. Cells were observed in interphase, prophase, metaphase, anaphase and telophase, with the aid of an optical microscope with a 40X objective. The cells were counted in each phase of the cell cycle analyzed and after it was calculated mitotic rates. Statistical analysis of data was performed by χ2 test (chi-square), with a probability of 5%, the statistical program BioEstat 4.0. Treatments T1, T3 and T4 (metabolites of isolates 2B2, 2B12 and C1 of trichoderma, respectively) showed higher cell numbers for the phases prophase, metaphase, anaphase and telophase and reached the highest IM (χ2= 5.45 α= 0.05), (χ2= 5.0 α= 0.05) e (χ2= 3.92 α= 0.05, respectively. The T10 control (liquid medium BD), had the highest number of interphase cells, and the lower phases of cell division. The test with Allium cepa roots enables selecting trichoderma isolates that induce increased mitotic index in root tips by the action of metabolites and shows variability among the isolates studied. KEYWORDS: Allium cepa. Cell division. Microorganisms. Test plants. Trichoderma spp. REFERÊNCIAS ALTAMORE, C.; NORVELL, W. A.; BJÖRKMAN, T.; HARMAN, G. E. Solubilization of phosphates and micronutrients by the plant-growth-promoting and biocontrol fungus Trichoderma harzianum Rifai 1295-22. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 65, n. 7, p. 2926- 2933, 1999. BELL, D. 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