Microsoft Word - 12-revisado-508.doc Communication Biosci. J., Uberlândia, v. 23, n. 3, p. 94-100, July./Sept. 2007 94 EFEITO DO BENOMYL E IDENTIFICAÇÃO DE FITOPATÓGENOS EM MEIO MS PARA CONTROLE DA CONTAMINAÇÃO NA MICROPROPAGAÇÃO DE Anacardium humile (Anacardiaceae) EFFECTS OF BENOMYL AND IDENTIFICATION OF PHYTOPATHOGENS IN MS MEDIUM IN ORDER TO CONTROL CONTAMINATION IN MICROPROPAGATION OF Anacardium humile (Anacardiaceae) Luciana Nogueira LONDE1; Cristina Soares de SOUSA1; Carlos Ueira VIEIRA 1; Ana Maria BONETTI2; Warwick Estevam KERR2 1. Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética, Universidade Federal de Uberlândia - UFU, Uberlândia - MG. llonde@pop.com.br ; 2. Professor, Doutor, Instituto de Genética e Bioquímica – UFU. RESUMO: A contaminação é um dos principais problemas enfrentados na fase inicial de estabelecimento in vitro de explantes e a utilização de fungicidas no meio de cultura é uma maneira de controlar o desenvolvimento de fitopatógenos. O Benomyl é um fungicida sistêmico utilizado em cultura de tecido vegetal, que é absorvido pelas raízes e translocado para outras partes da planta. Esse trabalho teve por objetivo identificar os fungos em meio MS na micropropagação do Anacardium humile e analisar os efeitos da adição de Benomyl em meio de cultura, para controle da contaminação, in vitro. A identificação dos patógenos foi realizada em lâminas com esporos dos fungos, sob microscópio óptico. O fungo de maior prevalência foi o Aspergillus niger sendo responsável por 67% da contaminação enquanto que em 33% das amostras o fungo encontrado foi do gênero Penicilium. Os esporos foram colocados em meio MS com diferentes concentrações de benomyl. Concentrações acima de 12,0 g L-1 foram eficazes no controle do Aspergillus niger em meio MS, embora, as concentrações utilizadas não impediram a proliferação do Penicilium. PALAVRAS-CHAVE: Anacardium humile, Micropropagação, Benzimidazoles INTRODUÇÃO Anacardium humile St. Hill., conhecido como cajuzinho-do-cerrado ou cajuí é uma espécie pertencente à família Anacardiaceae, de ocorrência natural em Campo Sujo e no Cerrado do Brasil, distribuídos na Bahia, Distrito Federal, Goiás, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Mato Grosso, São Paulo e Tocantins. A espécie é conhecida com outras denominações, tais como, cajú, cajueiro-do- campo, caju-de-árvore-do-cerrado e cajuhy (LÓPEZ-NARANJO; PERNÍA, 1990; CEMIG, 2001). Por ser uma espécie rasteira, o cajuzinho- do-cerrado concorre, com outras espécies, ao título de espécie em extinção sendo, no momento, considerada rara e protegida por lei (CEMIG, 2001). O porte baixo da planta torna-a, quando comparada ao cajueiro comum, mais susceptível à ações antrópicas e ao fogo. O cajuzinho-do-cerrado tem grande importância alimentar, industrial, medicinal e econômica e a castanha tem as mesmas características e usos do cajueiro comum (Anacardium occidentale) com ampla utilização para o consumo. Como a grande maioria das espécies do cerrado, o Anacardium humile St. Hill., tem importância biológica e socioeconômica, interesses antagônicos que aumentam a necessidade de gerar informações, na tentativa de adequar a exploração econômica, de modo que não haja a utilização predatória ou até mesmo a extinção da espécie. Um problema enfrentado na fase inicial de estabelecimento do explante in vitro é a contaminação bacteriana e fúngica, principalmente, na superfície dos explantes, além da contaminação endógena. Segundo DEBERGH; ZIMMERMAN (1991) o índice de contaminação pode ser resultante das próprias matrizes ou do manuseio em laboratório. HERMAN (1996) detectou, identificou e caracterizou contaminantes na cultura de tecidos vegetais, tentando controlá-los e, até mesmo, discutir a influência de microrganismos no estabelecimento da cultura. A interação entre plantas e microrganismos pode estimular o crescimento vegetal, seja por competição com patógenos ou por indução de efeitos de outros microrganismos úteis, ocasionando benefício às plantas (ARRUDA, 2000). Os antibióticos e fungicidas são, ocasionalmente, utilizados para o controle in vitro de patógenos. POLLOCK et al. (1983) demonstraram que o uso de certos antibióticos é eficiente no controle de bactérias, entretanto, o uso deles para o controle in vitro de bactérias Received: 04/10/06 Accepted: 05/02/07 Efeito do benomyl... LONDE, L. N. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 23, n. 3, p. 94-100, July./Sept. 2007 95 contaminantes, tem sido limitado devido a toxicidade para as plantas (ARRUDA, 2000). Uma das maneiras de se controlar as contaminações fúngicas, segundo THOMSON (1993), é o uso de benomyl, nome comercial benlate (metil –1 butilcarbomoil – 2 – benzimidazol – carbamato, C14H18N4O3) que é um fungicida foliar sistêmico e não apresenta problemas de fitotoxicidade, desde que as recomendações de uso sejam respeitadas. O benomyl ou benlate pode, também, ser aplicado ao solo, ao redor das plantas, sendo absorvido pelas raízes e translocado para outras partes da planta (ISSAC, 1992). Esse fungicida suprime o crescimento do micélio pela prevenção da divisão nuclear; inibe a mitose bloqueando a formação de β-tubulina e microtúbulos quando os cromossomos estão se separando (HAMMERSACHLAG; SISLER, 1973; HOWARD; AIST, 1980; DAVIDSE, 1986; ISSAC, 1992). Na micropropagação, o benomyl além da proteção do material vegetal e do meio de cultura (PAIVA et al., 1999) possui alguns efeitos de regulador de crescimento [BECKER, apud YANG (1976)], o que se deve, provavelmente, a mudanças no ingrediente ativo do fungicida em função da autoclavagem do meio de cultura ou de outros componentes do produto comercial, os quais podem interferir no efeito hormonal do fungicida (SKENE, 1972). THOMAS (1973) sugere que a atuação hormonal do benomyl possa ser conseqüência de sua semelhança estrutural com as citocininas, entretando, alguns trabalhos mostram que o fungicida tem efeito inibitório da sobrevivência, multiplicação e crescimento de explantes (WATT, GAUNTLETT; BLAKEWAY, 1995; WU, 1996). O benlate tem sido utilizado em diversos trabalhos no controle de contaminações fúngicas do meio e do material vegetal em várias concentrações, 50 mg L-1 (HAUPTMANN et al, 1985), 0,6 g L-1 (YANG, 1976) e 2 g L-1 (HALDEMANN et al., 1987). O objetivo desse trabalho foi identificar fungos de ocorrência na micropropagação de Anacardium humile St. Hill. e analisar os efeitos da adição de benomyl ao meio de cultura MS para controle da contaminação, no cultivo in vitro da espécie. MATERIAL E MÉTODOS Devido aos altos índices de contaminação encontrados nos testes de desinfestação para o estabelecimento in vitro do cajuí, o material contaminado foi analisado para identificação dos patógenos. Foram preparadas lâminas com azul de algodão acrescidos de esporos dos fungos encontrados. As lâminas foram analisadas sob microscópio óptico, aumento de 100x. Os fungos encontrados no cultivo in vitro do cajuí foram identificados, isolados e inoculados em meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), com diferentes concentrações de benomyl (nome comercial: benlate 50% de princípio ativo - Dupont): 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0; 11,0; 13,0 e 14,0 g L-1. O meio foi esterilizado em autoclave vertical à temperatura de 121ºC, sob a pressão de 1 atm por 20 minutos . O pH do meio foi ajustado para 5,8 ± 1 e foram distribuídos 10 m L de solução em cada placa de Petri, sendo o fungicida acrescido ao meio de cultura, antes da autoclavagem. Os esporos dos fungos foram isolados e inoculados, em câmara de fluxo laminar. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com 7 repetições. Após 7 dias, o crescimento dos fungos em meio MS foi avaliado a partir dos pontos de crescimento dos fungos com Unidades Formadoras de Colônias (UFC). Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística, com a utilização dos programas SANEST com aplicação do teste de F a 1 e 5% de probabilidade, sendo transformados em 1/2x + , onde X = média das variáveis analisadas, pois não foi observado normalidade e homogeniedade nos dados originais. RESULTADOS E DISCUSSÃO Na cultura de tecidos de cajuí, os principais fungos encontrados foram o Aspergillus niger, responsável por 67% da contaminação e o outro do gênero Penicilium observado em 33% das amostras contaminadas. Verificou-se, também, a presença de ambos. O meio MS é um meio que contém concentrações relativamente altas de macronutrientes, o que favorece e explica os elevados índices de contaminação considerando a pequena exigência nutricional desses patógenos [CLUTTERBUCK (1974), ROCHA (1997) e JABOR et al. (2003)]. A análise de variância mostrou que não houve diferença significativa para as concentrações de benomyl testadas: 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0; 12,0; 13,0; 14,0 g L-1 para o Penicilium, no entanto, estas mesmas concentrações foram significativas (P<0,01) para o controle de Aspergillus niger (Tabela 1). Efeito do benomyl... LONDE, L. N. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 23, n. 3, p. 94-100, July./Sept. 2007 96 Tabela 1. Análise de variância para as concentrações de benomyl suplementados em meio MS para o controle do crescimento de Penicilium e Aspergillus niger no cultivo in vitro de Anacardium humile St. Hill (ANACARDIACEAE). UFU - Uberlândia, MG – 2007. QUADRADOS MÉDIOS Fonte de Variação GL Penicilium Aspergillus niger Benomyl 7 0,0923 ns 0,3219** Resíduo 48 0,0622 0,0303 ns: não significativo pelo teste F (P<0,05); **: significativo pelo teste de F (P< 0,01); GL : grau de Liberdade. A concentração de 2,0g L-1 do fungicida foi ineficiente no controle do crescimento de colônias dos fungos, que foi encontrado em todas as placas de Petri inoculadas. O aumento das concentrações de benomyl provocou oscilação na formação das colônias entre as concentrações de 4,0 até 10,0 g L-1, sendo a concentração de 12,0 g L-1 a mais eficiente no controle fúngico, quando se observou, em média, 0,23 colônias por placa de Petri (Tabela 2). Tabela 2. Médias ajustadas pelas equações de regressão da ocorrência de Penicilium e Aspergillus niger em meio MS sob ação de benomyl (benlate) no cultivo in vitro de Anacardium humile St. Hill. (ANACARDIACEA). UFU - Uberlândia, MG – 2007. Benomyl (g L-1) Fungo 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 13,0 14,0 Penicilium 1,0000 0,6596 0,3630 0,6596 0,3630 0,2310 0,5058 0,5058 A. niger 0,6596 0,8243 0,8243 0,8243 0,2310 0,0000 0,0000 0,0000 CV (%) 24,641 Os níveis de benomyl até 8,0 g L-1 não foram eficazes para controle da contaminação por Aspergillus niger. A dose de 10,0 g L-1 provocou diminuição do número de colônias formadas, encontrando-se 0,23 colônias por placa de Petri e doses a partir de 12 g L-1 foram muito eficazes no combate a esse fungo, não ocorrendo crescimento em nenhuma placa inoculada (Tabela 2). Aspergillus spp. são organismos que estão associados a um amplo espectro de infecções em diversos hospedeiros (REICHENBERG et al., 2002; SOUBANI; CHANDRASEKAR, 2002) e a seleção de fungos patogênicos está associada à condições ambientais como pH e temperatura (ARAÚJO; RODRIGUES, 2004). A ocorrência de fungos resistentes à substâncias do grupo dos benzimidazóis já é conhecida (FERNANDES et al., 2001), no entanto, não existem pesquisas que relatam a elevada resistência do Aspergillus niger e Penicilium às concentrações testadas, como as que encontramos em nossos experimentos. De acordo com a Figura 1, o aumento na concentração de benomyl no meio de cultura até a dose de 4,01 g L-1 proporcionou aumento na formação de esporos, atingindo média de 0,8 colônias do fungo por placa de Petri e a partir dessa dose, a formação de colônias decresceu. No estabelecimento, in vitro, de segmentos nodais de cajueiro, SILVA NETO et al. (1993) utilizaram, no meio de cultura, 50 mg L-1 de benlate, concentração que passou a fazer parte de protocolos de micropropagação de outros autores. SATO et al. (2001) utilizaram 200 mg L-1 de benlate na micropropagação de Celtis sp., verificando que essa concentração inibe o crescimento de fungos sem causar fitotoxicidade aos explantes. FERNANDES et al. (2001) estudaram o comportamento, in vitro, de isolados de Colletotrichum gloeosporioides (Penz) provenientes de frutos de pimentão, jiló e berinjela em relação a concentrações de benomyl. Verificaram que 1000µg mL-1 de benomyl não inibiram totalmente o crescimento de micélios desse fungo, sendo que os isolados originários de pimentão apresentaram maior sensibilidade ao fungicida em comparação com os demais, mesmo quando submetidos a baixas concentrações do fungicida. Efeito do benomyl... LONDE, L. N. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 23, n. 3, p. 94-100, July./Sept. 2007 97 y = 0,6299 + 0,0762x -0,0095x2 R2 = 86,03% 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Concentrações de benomyl (g L-1) C re sc im en to d e A sp er gi ll us ni ge r em m ei o M S Figura 1. Regressão para o crescimento de Aspergillus niger em meio MS com variadas concentrações de fungicida sistêmico benomyl para cultivo in vitro de Anacardium humile St. Hill (ANACARDIACEAE). UFU - Uberlândia, MG – 2007. CHIOCCHIO et al. (2000) estudando Glomus mosseae utilizaram 21,25 µg mL de benomyl, concentração que foi capaz de inibir a germinação de esporos, no entanto, para a inibição do crescimento fúngico de Glomus caledonicum, a concentração utilizada foi de 10 ng mL do fungicida. Todos os experimentos relatados na literatura, empregaram concentrações de fungicidas muito abaixo das que foram utilizados com Anacardium humile, em nossos experimentos. Em algumas espécies, a resitência aos benzimidazoles é devida a mutações no códon 198 ou 200 do gene para a β-tubulina (KOENRAADT et al., 1992). Nesse sentido alguns estudos moleculares foram realizados. Luck et al. (1994) amplificaram fragmentos do gene da β-tubulina contendo os códons 198 e 200 de resistência e sensibilidade ao benomyl a partir de isolados de Botrytis cinerea Pers, verificando que quatro isolados não cresceram em presença de 1µM de benomyl. MAY et al. (1987) estudando Aspergillus nidulans, a partir de hibridização de seu DNA, verificaram dois genes (ben A e tub C) para β- tubulina, que são expressos durante os estágios de desenvolvimento fúngico. Análises por PCR mostraram algumas variações nos produtos do isolado dessa espécie, com produtos de 480 pb para A.nidulans. Para o isolado de Penicillium digitatum o maior produto foi de 480 pb e o menor de 440 pb. Quanto à resistência em condições de campo, TU; MCNAUGHTON (1979) determinaram 13 biótipos de Colletotrichum lindemuthianum resistentes ao benlate, verificando diferenças quanto à esporulação e crescimento dos diferentes biótipos desse fungo. CONCLUSÕES Nos isolados da cultura de tecidos de Anacardium humile foram encontrados Aspergillus niger e Penicilium. O meio MS foi um substrato adequado para o desenvolvimento e manutenção dos fungos devido às baixas exigências nutricionais desses patógenos. As concentrações de benomyl testadas foram pouco eficientes no controle da contaminação em meio MS. Concentrações acima de 12,0 g L-1 de benomyl foram eficazes no controle do Aspergillus niger em meio MS, no entanto, essas concentrações são muito altas e podem causar fitotoxicidade aos explantes no cultivo in vitro. AGRADECIMENTOS A Universidade Federal de Uberlândia pelas facilidades concedidas para o desenvolvimento desse trabalho. Ao CNPq e CAPES pelos auxílio financeiro. A CAPES pela concessão de bolsa de Mestrado. Efeito do benomyl... LONDE, L. N. et al. Biosci. J., Uberlândia, v. 23, n. 3, p. 94-100, July./Sept. 2007 98 ABSTRACT:Contamination is one of the most commom problems in the initial phase of the in vitro explants. The use of fungicides is a way of controlling the development of phytopathogens. Benomyl is a systemic fungicide used in cultures of vegetal tissue, which is absorbed by the roots and directed to other parts of the plant. This work aimed at identifying the existing fungi in the MS environment in the micropropagation of Anacardium humile and analyze the effects of the addition of Benomyl for the control of the contamination, in vitro. The identification of the pathogens was done with the use of the razor with sporos of the fungi under optic microscope. The fungus with the biggest prevalence was Aspergillus niger being responsible for 67% of the contamination and the other fungus was identified as Penicilium. The spores were put in MS environment with different concentrations of benomyl. Concentrations over 12,0 g L -1 of benomyl were efficient in the control of Aspergillus niger in MS environment, however, the concentrations used didn´t impede the proliferation of Penicilium. KEYWORDS: Anacardium humile. Micropropagation. Benzimidazoles REFERÊNCIAS ARAÚJO, R.; RODRIGUES, A. G. Variability of germinative potential amog pathogenic species of Aspergillus. Journal of Clinical Microbiology, Australia, v. 42, n. 3, p. 4335-4337, april, 2004. ARRUDA, S. A. Produção de propágulos de batata doce Ipomea batatas L. obtidos in vitro e submetidos a tratamentos prévios com fungicida e bactericida. 2000. 42p. Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2000. CHIOCCHIO, V.; VENEDIKIAN, N.; MARTINEZ, A. E.; MENENDEZ, A.; OCAMPO, J. A.; GODEAS, A. Effect of the fungicide benomyl on spore germination and hyphal lenght of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mosseae. 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