ISOLAMENTO DE UMA FRAO ENRIQUECIDA EM SINAPTOSOMAS DE CREBRO DA ABELHA APIS MELLIFERA UTILIZANDO GRADIENTE DESCONTNUO DE PERCOLL E IDENTIFICAO DE MIOSINAS V E VI Original Article 63 CRESCIMENTO E ESPORULAÇÃO DE DUAS ESPÉCIES DE Arthrobotrys CORDA EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA E DOIS AMBIENTES* GROWTH AND SPORULATION OF TWO SPECIES OF Arthrobotrys CORDA IN DIFFERENT CULTURE MEDIA AND TWO ENVIRONMENTS Pedro Luiz Martins SOARES1; Márcia de Holanda NOZAKI2; Bruno Flávio F. BARBOSA1; Jaime Maia dos SANTOS1; José Carlos BARBOSA3 1. Laboratório de Nematologia, Departamento de Fitossanidade, Universidade Estadual Paulista - UNESP, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - FCAV, Jaboticabal, SP, Brasil. pedrolms@fcav.unesp.br; 2. Laboratório de Fitopatologia, Departamento de Fitossanidade, FCAV-UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil; 3. Departamento de Ciências Exatas – UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil. * Parte da tese do primeiro autor. RESUMO: As pesquisas sobre o controle biológico de nematóides com fungos nematófagos têm se intensificado nos últimos anos. O conhecimento das condições ecológicas adequadas ao crescimento e esporulação desses fungos é um pré-requisito para obtenção de culturas puras que atendam à demanda para formulação desses organismos. Com o objetivo de avaliar o crescimento micelial e a esporulação de Arthrobotrys musiformis e A. oligospora em dois ambientes (B.O.D. a 25 ± 1ºC e ambiente do Laboratório), foram testados 20 meios de cultura preparados com materiais comumente encontrados nas comunidades e meios industrializados tradicionais, tais como ágar micológico, BDA. e CMA. Os meios foram testados em placas de Petri, sendo que o crescimento micelial dos fungos foi avaliado diariamente, durante seis dias. A esporulação foi mensurada estimando-se o número de conídios/placa, ao final do experimento. O experimento foi conduzido no delineamento inteiramente casualizado, seguindo um esquema fatorial 20 x 2 x2, correspondendo a 20 meios, dois fungos e dois ambientes, com cinco repetições. A análise de variância dos dados evidenciou diferença estatística significativa pelo Teste F, a 1% de probabilidade, para a interação meio x ambiente x fungo. Cinqüenta por cento dos meios testados foram adequados para o crescimento micelial de A. musiformis, não diferindo estatisticamente entre si, a saber: meio de farinha de mandioca (FM), polvilho doce (PD), “corn meal ágar” (CMA), aveia em flocos finos (AFF), ágar-água + dextrose (AA+D), ágar micológico (AM), batata dextrose ágar (BDA), farinha de milho (FMI), farinha de trigo (FT) e trigo para quibe (TK). Para A. oligospora, 75% dos meios testados propiciaram o crescimento máximo do fungo, no período, quais sejam: AFF, AM, FM, PD, CMA, AA+D, BDA, FT, TK, decoto de arroz (AAZ), arroz em grãos (AZG), arroz triturado (AZT), farinha de rosca (FR), farinha de aveia (FA), aveia em flocos grossos (AFG) e fubá (FU). Em relação à esporulação, os meios que se destacaram para A. musiformis, em ordem decrescente, foram: FR, TK, AFG, BDA, FA, AFF, AM, FMI, AZT e FM, variando entre 1,01 x 106 e 1,4 x 104 conídios/placa. Para a esporulação de A. oligospora o meio CMA propiciou a máxima esporulação com média estimada de 5,7 x 106 conídios/placa. No geral, os melhores meios para o crescimento micelial e esporulação de A. musiformis, também o foram para A. oligospora, mas alguns que se destacaram para A. oligospora não foram eficazes para o crescimento micelial ou a esporulação de A. musiformis, indicando que o isolado de A. musiformis utilizado é mais exigente que o de A. oligospora. Evidências do estudo indicam que, em Jaboticabal, o crescimento e a esporulação desses fungos não demandam câmaras especiais, bastando apenas adaptações de ambientes do laboratório visando o bloqueio da luz. PALAVRAS-CHAVE: Fungos nematófagos. Controle biológico. Fungos predadores. Agentes de controle biológico. Cultivo in vitro. INTRODUÇÃO Uma grande diversidade de fungos antagonistas que ocorre naturalmente no solo é capaz de se alimentar de nematóides. Esses fungos são também conhecidos como fungos nematófagos e podem ser classificados, de acordo com a estratégia de ação, em ectoparasitos ou predadores, parasitos de ovos ou ovicidas, endoparasitos e aqueles que produzem metabólicos tóxicos aos nematóides (MORGAN-JONES; RODRÍGUEZ-KÁBANA, 1987; JANSSON, 1982). Destes, os predadores são os mais promissores como agentes do controle biológico de nematóides. Destacam-se pela facilidade de se estabelecerem no solo e pelas suas habilidades saprofíticas, além da facilidade de crescimento in vitro, despertando o interesse de vários pesquisadores no mundo (GRAY, 1988; RODRIGUEZ-KÁBANA, 1991). Entre os fungos nematófagos predadores, as espécies de Arthrobotrys Corda têm sido o alvo de muitas pesquisas ao redor do mundo (CAYROL et al., 1978; SLEPETIENE et al., 1993; VOUYOUKALOU, 1993; DIAS; FERRAZ, 1994). Após o isolamento e constatação da patogenicidade desses fungos, frente às espécies de nematóides de importância econômica para uma dada região, a formulação em larga escala é uma etapa primordial para a adoção desse recurso no manejo de nematóides a campo. A obtenção de culturas puras dos fungos em grandes quantidades é imprescindível ao Biosci. J., Uberlândia, v. 25, n. 2, p. , Mar./Apr. 2009 Received: 17/10/07 Accepted: 20/04/08 mailto:pedrolms@fcav.unesp.br Crescimento e esporulação... SOARES, P. L. M. et al. 64 processo, já que expressivos volumes de substratos devem ser inoculados com os fungos para se obter a formulação desejada. Meios de cultura que proporcionem rápido crescimento e esporulação dos fungos são muito importantes para viabilizar o processo de produção de formulações desses agentes e fazer com que essa alternativa possa se tornar uma tecnologia inserida no processo produtivo de alimentos, assim como nas áreas urbanas infestadas de parques e jardins. A possibilidade de adição de macro e micronutrientes com a formulação dos fungos aumenta as oportunidades de se agregar valor ao produto e diminuir os custos operacionais com as fertilizações, além do fato de que a própria matéria orgânica utilizada na formulação também pode melhorar as condições físicas do solo e, por si só, favorecer o crescimento das plantas. Os meios de cultura devem apresentar características que viabilizem a sua utilização, tais como: serem de composição simples e de fácil preparação; favorecerem o rápido crescimento e esporulação dos fungos, não modificarem as características básicas dos fungos, notadamente quanto à patogenicidade e agressividade aos nematóides-alvo e terem custo igual ou menor que os meios industrializados. Atualmente, são poucas as opções de meios de cultura, utilizados para multiplicação desses fungos em placas de Petri. Em geral, os mais utilizados são: BDA (batata dextrose agar), BDA + peptona, CMA (corn meal agar), fubá + ágar e YPSS (yeast starch agar medium), conforme menção de Dias e Ferraz (1993); B.D.A. e YPSS (MACHADO; CAMPOS, 1997); B.S.A. (batata sacarose ágar), mencionado por Castro et al. (2000). Vários desses meios utilizados são industrializados. Quando não, os produtos utilizados na sua composição, podem ser sintéticos. A utilização de meios sintéticos/industrializados pode, em alguns casos, apresentar limitações, já que é possível haver dificuldades técnicas no cultivo de alguns desses organismos nesses meios (VAN GUNDY, 1985). Na literatura, são encontrados trabalhos confirmando que a temperatura de 25°C tem se mostrado a mais favorável ao crescimento de diversos fungos nematófagos (TEDFORD, 1995; VELVIS; KAMP, 1996; CASTRO et al., 2000). Cooke (1963) obteve maior crescimento micelial para um isolado de A. musiformis Drechsler a 25°C. Dias e Ferraz (1993) verificaram que, para cinco isolados de cinco espécies de Arthrobotrys, o meio YPSS ágar e a temperatura de 25°C, proporcionaram maior crescimento micelial e esporulação em relação aos demais meios testados. Apesar dos isolados serem de espécies diferentes e algum deles serem provenientes de regiões diferentes, todos se comportaram semelhantes quanto à temperatura. Castro et al. (2000) também constataram que a temperatura ótima, que permitiu a obtenção da maior massa micelial de um isolado de Arthrobotrys musiformis foi 25 °C. Em decorrência destes fatos, buscou-se neste trabalho, selecionar produtos de baixo custo e facilmente obtidos no comércio local para elaboração de meios de cultura visando os cultivos de Arthrobotrys musiformis e A. oligospora Fresenius, comparados a alguns meios industrializados (ágar micológico, CMA e BDA), em dois ambientes, quais sejam B.O.D. a 25 � 1°C e à temperatura ambiente do Laboratório. MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Nematologia do Departamento de Fitossanidade da UNESP/FCAV (Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias), Campus de Jaboticabal, SP. Os isolados utilizados foram um de Arthrobotrys musiformis e um de A. oligospora, obtidos da coleção de fungos nematófagos do Laboratório de Nematologia, oriundos das regiões de Ipameri – GO e Itiquira – MT, respectivamente. Para avaliar o efeito da temperatura sobre o crescimento micelial e esporulação desses dois fungos nematófagos, os isolados foram submetidos a dois ambientes, no escuro, a saber: ambiente controlado (B.O.D. a 25 � 1ºC) e nas condições do ambiente do Laboratório onde as médias das temperaturas mínimas e máximas no período foram 24,9°C e 26,9°C, respectivamente. Para cada regime de temperatura, foram utilizados vinte diferentes meios de cultura, sendo estes, com as respectivas composições para cada litro de meio: ágar água + dextrose 2% (AA+D: 20 g de ágar e 20 g de dextrose), decoto de arroz (AAZ: água de 60 g de arroz fervido, 20 g de ágar e 20 g de dextrose), aveia em flocos finos (AFF: 60 g de aveia em flocos finos, 20 g de ágar e 20 g de dextrose), aveia em flocos grossos (AFG: 60 g de aveia em flocos grossos, 20 g de ágar e 20 g de dextrose), ágar micológico (AM - meio industrializado da VETEC®), amido de milho (AMA: 60 g de maisena, 20 g de ágar e 20 g de dextrose), arroz em grãos (AZG: 60 g de grãos de arroz cozido, 20 g de ágar e 20 g de dextrose), arroz triturado (AZT: 60 g de arroz cozido e triturado, 20 g de ágar e 20 g de dextrose), batata-dextrose-ágar (BDA - meio industrializado da BIOLIFE®), batata- dextrose-ágar mais levedura (BDA+L: 200 g de batata, 20 g de dextrose, 20 g de ágar e 50 g de levedura), corn meal agar (CMA - meio industrializado da GIBCO®), farinha de aveia (FA: 60 g de farinha de aveia, 20 g de dextrose e 20 g de ágar), farinha de mandioca (FM: 60 g de farinha de mandioca, 20 g de dextrose e 20 g de ágar), farinha de milho (FMI: 60 g de farinha de milho, 20 g de dextrose e 20 g de ágar), farinha de rosca (FR: 60 g de farinha de rosca, 20 g de Biosci. J., Uberlândia, v. 25, n. 2, p. , Mar./Apr. 2009 Crescimento e esporulação... SOARES, P. L. M. et al. 65 dextrose e 20 g de ágar), farinha de trigo (FT: 60 g de farinha de trigo, 20 g de dextrose e 20 g de ágar), fubá (FU: 60 g de fubá, 20 g de dextrose e 20 g de ágar), polvilho azedo (PA: 60 g de polvilho azedo, 20 g de dextrose e 20 g de ágar), polvilho doce (PD: 60 g de polvilho doce, 20 g de dextrose e 20 g de ágar) e trigo para quibe (TK: 60 g de trigo para quibe, 20 g de dextrose e 20 g de ágar). Cada um dos meios foram pré-aquecidos em banho-maria e autoclavados à 120 °C e 1 kgf/cm2 por 20 minutos. Foi utilizado o meio BDA para o desenvolvimento da colônia micelial dos fungos durante 15 dias. Discos miceliais de 5 mm de diâmetro, obtidos dos bordos da colônia com furador de metal(, dos bordos da colônia,) foram transferidos para o centro de cada placa de Petri descartável, contendo cada um dos meios mencionados anteriormente, com auxílio de uma alça de metal, em condições assépticas e, a seguir, foram incubados nas condições mencionadas. Com uma caneta de transparência para retro- projetor, foram feitos traços a partir do centro até o bordo das placas. As medições do diâmetro do crescimento micelial, sobre os traços previamente marcados, foram feitas com auxílio de uma régua, diariamente, até que o crescimento do micélio de um dos isolados, em algum dos tratamentos, atingisse as bordas da placa de Petri. Além dessa avaliação, ao término das medições do crescimento micelial, foi realizada a avaliação da esporulação por meio da contagem de conídios em câmara de Newbauer com auxílio de um microscópio óptico composto com aumentos de 200 X. Uma suspensão de cada repetição em cada tratamento foi obtida por meio da adição de 10 mL de água destilada esterilizada à placa e o revolvimento das colônias com auxílio de um pincel. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, seguindo o esquema fatorial 20 x 2 x 2 com cinco repetições para cada tratamento. RESULTADOS E DISCUSSÃO Na Tabela 1 estão as análises de variância dos dados relativos ao crescimento micelial de A. musiformis e A. oligospora nas condições do estudo durante 6 dias, assim como a interação meio x ambiente x fungo. No primeiro dia de avaliação, a análise de variância do crescimento micelial dos fungos nos diferentes meios apresentou diferença estatística significativa a 1% de probabilidade (Tabela 1). A maior média do crescimento micelial foi obtida em AA+D com 0,92 cm, para A. musiformis, apresentando diferença estatística significativa pelo teste de Tukey a 1% de probabilidade dos demais meios com exceção de AFF, AMA, AZG, AZT, BDA, CMA, FA, FM, FT, PD e TK. Com relação a A. oligospora, a maior média foi obtida no meio AZG, com 0,63 cm, diferindo estatisticamente dos demais meios, exceto para AAZ. Quanto à comparação entre os ambientes, não houve diferença estatística significativa, para A. musiformis, mas houve para A. oligospora a 1% de probabilidade, com a maior média de 0,23 cm para o crescimento no ambiente do laboratório. Na interação meio x ambiente, não houve diferença estatística significativa para A. musiformis, mas houve para A. oligospora, a 1% de probabilidade. Para a comparação entre os fungos, houve diferença estatística significativa a 1% de probabilidade, sendo que A. musiformis apresentou maior média de crescimento com 0,39 cm. Na comparação entre os ambientes, houve diferença estatística significativa a 1% de probabilidade, com maior média 0,33 cm para o laboratório. Quanto às interações, apenas para fungo X meio foi significativo a 1% de probabilidade (Tabela 1). Para o segundo dia de avaliação, a análise de variância do crescimento micelial dos fungos nos diferentes meios apresentou diferença estatística significativa a 1 % de probabilidade. Para A. musiformis, o meio que propiciou a maior média do crescimento micelial foi FA com 2,82 cm. Contudo, não diferiu de AFF, AFG, AM, BDA, FM, FT, PD e TK, mas diferiu dos demais. Para A. oligospora, a melhor média foi obtida no meio AZG com 2,63 cm, não diferindo apenas de AZT. Entretanto, diferiu dos demais meios testados. Quanto à comparação entre os ambientes, também se constatou diferença estatística significativa a 1 % de probabilidade. A comparação entre as médias pelo teste de Tukey a 1% de probabilidade evidenciou que ambos os fungos cresceram mais no ambiente do Laboratório que na B.O.D., sendo que para A. musiformis a média foi de 2,20 cm e para A. oligospora foi de 1,92 cm. Para a interação meio x ambiente, também houve diferença significativa, sendo a 1% para A. musiformis e a 5% para A. oligospora. Para a comparação entre os fungos, houve diferença estatística significativa a 1% de probabilidade, sendo que a maior média foi obtida para A. musiformis com 2,05 cm. Na comparação entre os ambientes, houve diferença estatística significativa a 1% de probabilidade, sendo que maior média foi obtida para o laboratório. Quanto às interações, apenas para fungo x meio foi significativo a 1% de probabilidade (Tabela 1). Biosci. J., Uberlândia, v. 25, n. 2, p. , Mar./Apr. 2009 Crescimento e esporulação... SOARES, P. L. M. et al. 66 6 Tabela 1. Comparações de médias do crescimento micelial (cm) de um isolado de Arthrobotrys musiformis (Ipameri – GO) e um de A. oligospora (Itiquira – MT) em 20 meios de cultura e dois ambientes (B.O.D. 25 � 1ºC e ambiente do Laboratório) no escuro, diariamente, durante seis dias CRESCIMENTO MICELIAL 1º DIA 2º DIA 3º DIA MEIO (M) Arthrobotrys musiformis Arthrobotris oligospora Arthrobotrys musiformis Arthrobotris oligospora Arthrobotrys musiformis Arthrobotris oligospora Ágar água + dextrose (AA+D) 0,92 a 0,26 bc 2,10 cdef 2,08 bcde 3,51 cd 4,09 bcdef Decoto de arroz (AAZ) 0,24 bcd 0,37 ab 1,78 efg 2,25 bc 2,79 ef 4,63 ab Aveia em flocos finos (AFF) 0,69 abc 0,12 bc 2,78 ab 2,17 bcd 4,42 ab 4,37 bcd Aveia em flocos grssos (AFG) 0,28 bcd 0,00 c 2,49 abcd 1,88 defg 4,06 abc 4,30 bcde Ágar micológico (AM) 0,00 d 0,06 bc 2,34 abcde 1,95 cdefg 3,91 bcd 4,19 bcdef Amido de milho (AMA) 0,39 abcd 0,06 bc 1,11 h 1,41 hi 1,79 h 2,94 g Arroz em grãos (AZG) 0,46 abcd 0,63 a 1,58 fgh 2,63 a 2,70 efg 5,18 a Arroz triturado (AZT) 0,42 abcd 0,29 bc 1,37 gh 2,32 ab 2,07 gh 4,70 ab Batata-dextrose-ágar (BDA) 0,50 abcd 0,00 c 2,40 abcd 1,70 fgh 3,97 abcd 3,52 fg Batata-dextrose-ágar + Levedura (BDA + L) 0,06 d 0,00 c 1,17 h 0,75 j 2,40 fgh 1,59 h Corn meal agar (CMA) 0,40 abcd 0,12 bc 2,05 def 1,90 cdefg 3,59 cd 3,55 efg Farinha de aveia (FA) 0,48 abcd 0,23 bc 2,82 a 2,03 bcdef 4,10 abc 4,11 bcdef Farinha de mandioca (FM) 0,34 abcd 0,19 bc 2,40 abcd 1,96 cdefg 4,39 ab 4,02 bcdef Farinha de milho (FMI) 0,23 bcd 0,00 c 2,24 bcde 1,30 i 4,06 abc 2,94 g Farinha de rosca (FR) 0,31 abcd 0,00 c 1,26 gh 1,63 ghi 2,01 gh 3,73 def Farinha de trigo (FT) 0,46 abcd 0,25 bc 2,40 abcd 2,14 bcd 4,12 abc 4,42 abcd Fubá (FU) 0,16 cd 0,06 bc 1,95 def 1,78 efg 3,34 de 3,86 cdef Polvilho azedo (PA) 0,12 cd 0,00 c 1,35 gh 0,59 j 2,22 fgh 1,09 h Polvilho doce (PD) 0,54 abcd 0,00 c 2,65 abc 1,70 fgh 4,63 a 3,80 cdef Trigo para quibe (TK) 0,83 ab 0,30 bc 2,81 a 1,62 ghi 4,50 ab 4,55 abc Teste F 3,71 ** 7,61 ** 26,75 ** 53,47 ** 45,92 ** 45,79 ** dms (Tukey 5%) 0,6299 0,3105 0,5670 0,3453 0,7075 0,7563 AMBIENTE (A) Laboratório 0,43 a 0,23 a 2,20 a 1,92 a 3,74 a 4,04 a B.O.D. 0,35 a 0,06 b 1,90 b 1,62 b 3,12 b 3,51 b Teste F 1,82 NS 41,28 ** 37,71 ** 127,45 ** 100,58 ** 63,92 ** dms (Tukey 5%) 0,1091 0,0538 0,0983 0,0598 0,1226 0,131 INTERAÇÃO Teste F (M X A) 0,75 ns 3,88 ** 2,38 ** 1,88 * 5,32 ** 1,36 NS CV (%) 99,11 130,57 17,11 11,95 12,78 12,40 FUNGO (F) Arthrobotrys musiformis 0,39 a 2,05 a 3,43 b Arthrobotris oligospora 0,14 b 1,79 b 3,78 a Teste F 64,16 ** 82,33 ** 59,35 ** dms (Tukey 5%) 0,0606 0,0573 0,0894 Crescimento e esporulação... SOARES, P. L. M. et al. 67 6 AMBIENTE (A) Laboratório 0,33 a 2,08 a 3,89 a B.O.D. 0,20 b 1,76 b 3,31 b Teste F 16,40 ** 123,57 ** 161,03 ** dms (Tukey 5%) 0,0606 0,0573 0,0894 INTERAÇÕES Teste F (F X M) 2,82 ** 22,90 ** 29,77 ** Teste F (F X A) 2,66 NS 0,39 NS 1,03 NS Teste F (M X A) 1,67 NS 1,77 NS 2,59 NS Teste F (F X M X A) 1,06 NS 2,72 NS 3,83 NS CV (%) 113,72 15,13 12,59 Médias seguidas pela mesma letra minúscula, na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade;** Significativo a 1% de probabilidade; * Significativo a 5% de probabilidade; NS (não significativo). Tabela 1...Continuação. Comparações de médias do crescimento micelial (cm) de um isolado de Arthrobotrys musiformis (Ipameri – GO) e um de A. oligospora (Itiquira – MT) em 20 meios de cultura e dois ambientes (B.O.D. 25 � 1 ºC e ambiente do Laboratório) no escuro, diariamente, durante seis dias CRESCIMENTO MICELIAL 4º DIA 5º DIA 6º DIA MEIO (M) Arthrobotrys musiformis Arthrobotris oligospora Arthrobotrys musiformis Arthrobotris oligospora Arthrobotrys musiformis Arthrobotris oligospora Ágar água + dextrose (AA+D) 4,98 b 5,90 cdefg 6,31 bcd 7,62 cdefg 7,96 ab 8,45 a Decoto de arroz (AAZ) 3,39 cd 6,63 ab 3,80 fg 8,50 a 4,18 f 8,50 a Aveia em flocos finos (AFF) 5,58 ab 6,07 bcdef 6,63 abcd 7,88 abcde 7,99 ab 8,50 a Aveia em flocos grssos (AFG) 5,17 b 5,51 efghi 6,15 cd 7,44 defghi 6,82 c 8,43 a Ágar micológico (AM) 5,38 b 6,14 bcd 6,95 abc 7,82 bcdef 7,96 ab 8,50 a Amido de milho (AMA) 2,25 f 3,81 j 2,59 h 5,16 j 3,19 g 5,92 c Arroz em grãos (AZG) 3,20 cde 7,08 a 4,10 efg 8,38 ab 4,71 def 8,50 a Arroz triturado (AZT) 3,15 cde 6,47 bc 3,83 fg 8,05 abcd 4,90 def 8,50 a Batata-dextrose-ágar (BDA) 5,51 ab 5,13 hi 6,64 abcd 6,88 i 7,91 ab 8,29 a Batata-dextrose-ágar + Levedura (BDA + L) 3,75 c 2,48 k 4,61 ef 3,58 k 5,37 de 4,57 d Corn meal agar (CMA) 5,31 b 5,13 i 6,65 abcd 7,10 ghi 8,15 a 8,40 a Farinha de aveia (FA) 5,43 b 5,72 defgh 6,34 bcd 7,33 efghi 7,21 bc 8,44 a Farinha de mandioca (FM) 5,83 ab 6,10 bcde 7,25 a 8,12 abc 8,50 a 8,50 a Farinha de milho (FMI) 5,36 b 4,34 j 6,67 abcd 5,54 j 7,87 ab 6,89 b Farinha de rosca (FR) 2,49 ef 5,65 defghi 3,38 gh 7,56 cdefgh 4,65 ef 8,50 a Farinha de trigo (FT) 5,06 b 6,20 bcd 5,98 d 7,84 bcdef 7,84 ab 8,50 a Fubá (FU) 3,96 c 5,48 fghi 4,82 e 7,20 fghi 5,53 d 8,30 a Polvilho azedo (PA) 2,56 def 1,40 l 3,53 g 1,70 l 4,42 f 2,18 e Polvilho doce (PD) 6,29 a 5,41 ghi 7,43 a 6,95 hi 8,35 a 8,16 a Trigo para quibe (TK) 5,28 b 5,80 defg 7,18 ab 7,20 fghi 7,77 ab 8,27 a Teste F 56,94 ** 141,47 ** 76,77 ** 176,85 ** 114,46 ** 379,62 ** dms (Tukey 5%) 0,8521 0,5931 0,892 0,6517 0,8217 0,4351 68 6 SOARES, P. L. M. et al. Crescimento e esporulação... AMBIENTE (A) Laboratório 4,87 a 5,61 a 6,05 a 7,15 a 7,01 a 7,79 a B.O.D. 4,12 b 5,03 b 5,03 b 6,63 b 6,11 b 7,63 b Teste F 98,63 ** 124,45 ** 171,36 ** 83,20 ** 156,38 ** 16,27 ** dms (Tukey 5%) 0,1476 0,1028 0,1546 0,1129 0,1424 0,0754 INTERAÇÃO Teste F (M X A) 7,31 ** 3,18 ** 7,36 ** 3,25 ** 13,92 ** 6,97 ** CV (%) 11,74 6,90 9,97 5,86 7,76 3,49 FUNGO (F) Arthrobotrys musiformis 4,49 b 5,54 b 6,56 b Arthrobotris oligospora 5,32 a 6,89 a 7,71 a Teste F 328,60 ** 776,03 ** 794,62 ** dms (Tukey 5%) 0,0896 0,0953 0,0802 AMBIENTE (A) Laboratório 5,24 a 6,60 a 7,40 a B.O.D. 4,58 b 5,83 b 6,87 b Teste F 210,95 ** 254,43 ** 167,42 ** dms (Tukey 5%) 0,0896 0,0953 0,0802 INTERAÇÕES Teste F (F X M) 58,42 ** 76,78 ** 97,88 ** Teste F (F X A) 3,16 NS 26,93 ** 83,97 ** Teste F (M X A) 4,54 ** 3,85 ** 8,82 ** Teste F (F X M X A) 7,39 ** 8,01 ** 15,97 ** CV (%) 9,27 7,79 5,71 Médias seguidas pela mesma letra minúscula, na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade; ** Significativo a 1% de probabilidade; * Significativo a 5% de probabilidade; NS (não significativo). Crescimento e esporulação... SOARES, P. L. M. et al. 69 No terceiro dia de avaliação, a análise de variância da média do crescimento micelial dos fungos nos diferentes meios também diferiu entre os meios a 1% de probabilidade. Para A. musiformis, a comparação das médias do crescimento nos diferentes meios evidenciou que PD proporcionou a maior média com 4,63 cm, não diferindo dos meios AFF, AFG, BDA, FA, FM, FMI, FT e TK. A maior média para A. oligospora foi de 5,18 cm, com o meio AZG, não diferindo de AAZ, AZT, FT e TK. Para à comparação entre os ambientes, também houve diferença significativa para ambos, sendo que as maiores médias foram obtidas no ambiente do Laboratório, sendo que para A. musiformis e A. oligospora as médias foram de 3,74 e 4,04 cm, respectivamente. A interação meio x ambiente diferiu a 1% de probabilidade somente para A. musiformis. Na comparação entre os fungos, ocorreu diferença estatística significativa a 1% de probabilidade, sendo que a maior média foi de 3,78 cm para A. oligospora. Para a comparação entre os ambientes, houve diferença estatística significativa a 1% de probabilidade, sendo que o laboratório apresentou maior média com 3,89 cm. Quanto às interações, apenas para fungo x meio foi significativo a 1% de probabilidade (Tabela 1). No quarto dia de avaliação, a análise de variância das médias do crescimento dos fungos nos diferentes meios apresentou diferença a 1% de probabilidade para ambos os fungos. O meio PD proporcionou a maior média de crescimento com 6,29 cm para A. musiformis, não diferindo, apenas, dos meios AFF, BDA e FM. Para A. oligospora o meio AZG foi o que proporcionou a maior média com 7,08 cm, não diferindo apenas de AAZ. Na comparação entre os ambientes, também houve diferença significativa para ambos a 1% de probabilidade, no ambiente de Laboratório, com a média de 4,87 cm para A. musiformis e 5,61 cm, para A. oligospora. Com a interação meio x ambiente, também houve diferença estatística significativa para ambos os fungos, a 1% de probabilidade. Para a comparação entre os fungos, também houve diferença estatística significativa a 1% de probabilidade, com a maior média de 5,32 cm para A. oligospora. Na comparação entre os ambientes, houve diferença estatística significativa a 1% de probabilidade, com maior média 5,24 cm para o laboratório. Quanto às interações, fungo x meio, meio x ambiente e fungo x meio x ambiente, foram significativas a 1% de probabilidade, para fungo x ambiente foi não significativo (Tabela 1 ... Continuação). No quinto dia de avaliação, a análise de variância da média do crescimento micelial dos fungos também diferiu entre os meios a 1% de probabilidade. Para A. musiformis, a maior média foi obtida com o meio PD com 7,43 cm, não diferindo de AFF, AM, BDA, CMA, FM, FMI e TK. Com A. oligospora, a maior média foi de 8,50 cm para o meio AAZ, não diferindo apenas de AFF, AZG, AZT e FM. Na comparação entre os ambientes, também houve diferença significativa a 1% de probabilidade para ambos os fungos, no ambiente do Laboratório, com uma média de 6,05 cm para A. musiformis e 7,15 cm para A. oligospora. Para a interação meio x ambiente, também houve diferença estatística significativa para ambos os fungos a 1% de probabilidade. Para a comparação entre os fungos, também houve diferença estatística significativa a 1% de probabilidade, com a maior média de 6,89 cm para A. oligospora. Na comparação entre os ambientes, houve diferença estatística significativa a 1% de probabilidade, com maior média 6,60 cm para o laboratório. Quanto às interações, todas (fungo x meio, fungo x ambiente, meio x ambiente e fungo x meio x ambiente), foram significativas a 1% de probabilidade (Tabela 1 .- continuação). No sexto e último dia de avaliação, a análise de variância da média do crescimento micelial dos fungos também diferiu entre os meios, a 1% de probabilidade. Para A. musiformis a maior média foi de 8,35 cm, para o meio FM, não diferindo de AA+D, AFF, AM, BDA, CMA, FMI, FT, PD e TK. Para A. oligospora, as maiores médias variaram de 8,16 a 8,50 cm nos meios AA+D, AAZ, AFF, AFG, AM, AZG, AZT, BDA, CMA, FA, FM, FR, FT, FU, PD e TK, não diferindo entre eles, mas diferindo dos demais. Na comparação entre os ambientes, também apresentou diferença significativa a 1% de probabilidade para ambos os fungos no ambiente de Laboratório, sendo que a média para A. musiformis foi de 7,01 cm e para A. oligospora foi de 7,79 cm. A interação meio x ambiente também apresentou diferença significativa a 1% de probabilidade para ambos os fungos. Para a comparação entre os fungos, também ocorreu diferença significativa a 1% de probabilidade, sendo que a maior média foi para A. oligospora com 7,71 cm. Na comparação entre os ambientes, houve diferença estatística significativa a 1% de probabilidade, com maior média 7,40 cm para o laboratório. Quanto às interações, todas (fungo x meio, fungo x ambiente, meio x ambiente e fungo x meio x ambiente), foram significativas a 1% de probabilidade (Tabela 1 ... Continuação). A Tabela 2 contém a análise de variância dos dados relativos à esporulação dos isolados de A. musiformis e de A. oligospora incluídos nos diferentes meios de cultura testados, evidenciando diferença significativa a 1% de probabilidade pelo Teste F. Biosci. J., Uberlândia, v. 25, n. 2, p. 63-74, Mar./Apr. 2009 Crescimento e esporulação... SOARES, P. L. M. et al. 70 Tabela 2. Comparações de médias da esporulação por placa de um isolado de Arthrobotrys musiformis (Ipameri – GO) e um de A. oligospora (Itiquira – MT) em 20 meios de cultura e dois ambientes (B.O.D. 25 � 1 ºC e ambiente do Laboratório) no escuro, após seis dias de crescimento micelial FUNGO (F) MEIO (M) Arthrobotrys musiformis ¹ Arthrobotrys oligospora Ágar água + dextrose (AA+D) 009650 cd 006900 c Decoto de arroz (AAZ) 000000 f 041650 bc Aveia em flocos finos (AFF) 031950 abc 046550 bc Aveia em flocos grssos (AFG) 053750 ab 039000 bc Ágar micológico (AM) 031900 abc 037635 bc Amido de milho (AMA) 000000 f 006100 c Arroz em grãos (AZG) 004200 e 049600 bc Arroz triturado (AZT) 026700 abc 076850 bc Batata-dextrose-ágar (BDA) 042650 ab 050700 bc Batata-dextrose-ágar + Levedura (BDA + L) 002200 d 038450 bc Corn meal agar (CMA) 004150 d 570800 a Farinha de aveia (FA) 036350 abcd 042200 bc Farinha de mandioca (FM) 014550 abc 032550 bc Farinha de milho (FMI) 027150 ab 052550 bc Farinha de rosca (FR) 101000 a 108600 b Farinha de trigo (FT) 009450 bc 038350 bc Fubá (FU) 008300 e 036300 bc Polvilho azedo (PA) 000000 f 000000 c Polvilho doce (PD) 006100 cd 001850 c Trigo para quibe (TK) 083950 a 014300 bc Teste F 122,19 ** 40,65 ** dms (Tukey 5%) 0,7474 97434 AMBIENTE (A) Laboratório 27020 a 52816 b B.O.D. 22380 b 76278 a Teste F 38,22 ** 7,53 ** dms (Tukey 5%) 0,1295 16882 INTERAÇÃO Teste F (M X A) 20,47 ** 2,14 ** CV (%) 14,19 93,64 FUNGO (F) Arthrobotrys musiformis 24700 b Arthrobotrys oligospora 64547 a Teste F 431,23 ** dms (Tukey 5%) 0,0847 AMBIENTE (A) Laboratório 39918 b B.O.D. 49329 a Teste F 9,76 ** dms (Tukey 5%) 0,0847 INTERAÇÕES Teste F (F X M) 57,84 ** Teste F (F X A) 39,58 ** Teste F (M X A) 12,85 ** Teste F (F X M X A) 12,13 ** CV (%) 11,59 ¹ Para a análise estatística, os dados foram transformados em Log (x+1); Médias seguidas pela mesma letra maiúscula, na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade;** Significativo a 1% de probabilidade A comparação entre as médias pelo teste de Tukey a 1% de probabilidade para A. musiformis revelou que a máxima esporulação desse fungo foi obtida no meio FR, equivalente a 1,01 x 105 conídios/placa. Contudo, não houve diferença significativa em relação aos meios AFF, AFG, AM, Biosci. J., Uberlândia, v. 25, n. 2, p. 63-74, Mar./Apr. 2009 Crescimento e esporulação... SOARES, P. L. M. et al. 71 AZT, BDA, FA, FM, FMI e TK. Nos meios AAZ, AMA e PA o fungo não esporulou. A maior média para A. oligospora foi de 5,71 x105 conídios/placa, obtidos no meio CMA, diferindo de todos os demais meios. Também, não houve esporulação desse isolado de A. oligospora no meio PA. Na comparação entre os ambientes, também houve diferença significativa a 1% de probabilidade para ambos os fungos. Para A. musiformis, ocorreu maior esporulação média no ambiente do Laboratório, com 2,7020 x 104 conídios/placa, enquanto a maior esporulação de A. oligospora foi obtida em B.O.D. a 25 � 1 ºC com 7,6278 X 104 conídios/placa. A interação meio x ambiente, também foi significativa pelo Teste F a 1% de probabilidade, para ambos os fungos. Para a comparação entre os fungos, houve diferença significativa a 1% de probabilidade, sendo a maior média de 6,4547 x 104 conídios/placa obtida com A. oligospora e para A. musiformis foi de apenas 2,4700 x 104 conídios/placa. Na comparação emtre os ambientes, houve diferença estatística significativa a 1% de probabilidade, sendo que a maior média foi obtida na B.O.D. com 4,9329 x 104 conídios/placa e no ambiente foi de apenas 3,9918 x 104 conídios/placa. Quanto às interações, todas (fungo x meio, fungo x ambiente, meio x ambiente e fungo x meio x ambiente), foram significativas a 1% de probabilidade (Tabela 2). No presente estudo, 50% dos meios testados foram adequados para o crescimento micelial de A. musiformis, uma vez que proporcionaram crescimento micelial entre 7,0 e 8,5 cm, não diferindo estatisticamente entre si (FM, PD, CMA, AFF, AA+D, AM, BDA, FMI, FT e TK). Para A. oligospora, 75% dos meios testados propiciaram o crescimento do fungo variando entre 8,0 e 8,5 cm (crescimento máximo), no período da avaliação, a saber: AAZ, AFF, AM, AZG, AZT, FM, FR, FT, AA+D, FA, AFG, CMA, FU, BDA, TK e PD. Em relação à esporulação, os meios que se destacaram para A. musiformis, em ordem decrescente, foram: FR, TK, AFG, BDA, FA, AFF, AM, FMI, AZT e FM, variando entre 1,01 x 106 e 1,4 x 104 conídios/placa. Para a esporulação de A. oligospora, o meio CMA foi o mais adequado, tendo sido obtidos 5,7 x 106 conídios/placa. Em estudo similar, Dias e Ferraz (1993) observaram que, para diferentes espécies de Arthrobotrys, entre as quais figurava um isolado de A. musiformis, os meios BDA, CMA e o meio de fubá propiciaram a máxima esporulação dos isolados testados. Nos estudos realizados por Bernardo (2002), envolvendo quatro espécies de fungos nematófagos, inclusive um isolado de A. musiformis e um de A. oligospora, o crescimento micelial de ambos foi semelhante nos meios BDA e CMA. Quanto à esporulação, A. oligospora esporulou nos dois meios, como observado no presente estudo. Entretanto, A. musiformis só esporulou em BDA, diferindo dos resultados obtidos no presente estudo, cuja esporulação do isolado de A. musiformis foi estatisticamente maior em BDA que em CMA. No geral, os melhores meios para o crescimento micelial e esporulação de A. musiformis, no estudo em questão, também foram os melhores para A. oligospora, mas alguns que se destacaram para A. oligospora não foram eficazes para o crescimento micelial ou a esporulação de A. musiformis, indicando que o isolado de A. musiformis estudado é mais exigente que o de A. oligospora. Os dados obtidos no presente estudo confirmaram que os meios adequados para o crescimento micelial dos fungos não favoreceram a esporulação e vice-versa, conforme também fora observado por Dias e Ferraz (1993). Por conseguinte, a escolha do meio para obtenção de culturas puras dos fungos que seriam utilizadas no processo de formulação deve levar em conta o tipo da formulação pretendida, uma vez que os fungos podem ser formulados tanto à base de conídios quanto de micélio (SALGADO; CAMPOS, 1993; ROBINSON; JAFFEE, 1996; CARNEIRO; GOMES, 1993; CARNEIRO; KULCZYNSKI, 1993; MACHADO; CAMPOS, 1997). Quanto aos dois ambientes testados no estudo, o que proporcionou a maior média no crescimento micelial, em todas as avaliações foi o ambiente do Laboratório. Quanto à esporulação, o ambiente do Laboratório foi mais adequado para A. musiformis, enquanto A. oligospora esporulou mais em B.O.D. (25 � 1 ºC). Os dados evidenciaram que os isolados dos fungos incluídos no estudo têm exigências ecológicas distintas, conforme já havia sido observado por outros autores (DIAS; FERRAZ, 1993), indicando que as exigências ecológicas desses fungos devem ser determinadas em cada caso, tanto para espécies quanto para os isolados de uma mesma espécie (OLTHOF; ESTEY, 1965). Além disso, informações sobre o efeito de fatores ecológicos no crescimento e na atividade desses fungos podem ser usadas vantajosamente, para melhorar sua eficiência no controle de nematóides (DUDDINGTON, 1955). O sucesso no estabelecimento de fungos nematófagos no solo, depende de uma base nutricional que lhes garanta vantagens competitivas sobre a biota do solo, conforme menção de Kerry et al. (1984). CONCLUSÔES Os dados obtidos no presente estudo indicaram que para a produção em de grandes quantidades de inóculo desses fungos existem várias opções de meios de cultura que podem ser preparados com materiais facilmente encontrados e de custo Biosci. J., Uberlândia, v. 25, n. 2, p. 63-74, Mar./Apr. 2009 Crescimento e esporulação... SOARES, P. L. M. et al. 72 Em geral, os melhores meios para o crescimento micelial e esporulação de A. musiformis também o foram para A. oligospora, mas alguns que se destacaram para A. oligospora não foram eficazes para o crescimento micelial ou a esporulação de A. musiformis, indicando que o isolado de A. musiformis estudado é mais exigente que o de A. oligospora. Além disso, os dados indicaram que, nas condições climáticas de Jaboticabal, não se faz necessária a utilização de câmaras especiais para o crescimento desses fungos. Adaptações simples de uma sala no laboratório visando o bloqueio da luz podem ser satisfatórias. menor que os meios industrializados, tais como BDA e CMA. Cinqüenta por cento dos meios testados propiciaram o crescimento micelial máximo de A. musiformis, a saber: meio de farinha de mandioca (FM), polvilho doce (PD), “corn meal ágar” (CMA), aveia em flocos finos (AFF), ágar-água + dextrose (AA+D), ágar micológico (AM), batata dextrose ágar (BDA), farinha de milho (FMI), farinha de trigo (FT) e trigo para quibe (TK). Para A. oligospora, 75% dos meios testados propiciaram o crescimento máximo do fungo, no período, quais sejam: AFF, AM, FM, PD, CMA, AA, BDA, FT, TK, AAZ, AZG, AZT, FR, FA, AFG e FU. Em relação à esporulação, os meios que se destacaram para A. musiformis, em ordem decrescente, foram: FR, TK, AFG, BDA, FA, AFF, AM, FMI, AZT e FM, variando entre 1,01 x 106 e 1,4 x 104 conídios/placa. Para a esporulação de A. oligospora, o meio CMA propiciou a máxima esporulação com média estimada de 5,7 x 106 conídios/placa. AGRADECIMENTOS À FAPESP pelas concessões da bolsa de Doutorado (Processo: 03/05677-7) do primeiro autor e auxílio à pesquisa (Processo: 03/12573-3) para realização do presente trabalho. ABSTRACT: The researches on the biological control of nematodes with nematophagous fungi has been intensified in recent years. The knowledge of the ecological conditions for the growth and sporulation of these fungi is a prerequisite for attainment of pure cultures needed to attend the demand for formulation of these organisms. With the objective to evaluate the micelial growth and sporulation of Arthrobotrys musiformis and A. oligospora in two environments (B.O.D at 25 ± 1ºC and the environment of the Laboratory), 20 cultures media prepared with common materials found in the communities and industrialized media such as mycological agar, PDA and CMA were evaluated. The media were tested in Petri dishes, being the micelial growth of the fungi evaluated daily, during six days. The measured sporulation at the end of the experiment was done by estimation of the number of conidia/Petri dish. The experiment was carried out in a random design following a factorial arrangement of 20 x 2 x 2, corresponding to 20 media, two fungi and two environments, with five replicates. The variance analysis of the data evidenced significant statistical difference by the F Test, at 1% probability, among media x fungi x environment interaction. Fifty percent of the tested media provided the adequate micelial growth of A. musiformis and there was no statistical difference among them, namely: cassava meal (FM), sweet starch (PD), “corn meal agar” (CMA), oat in fine flakes (AFF), agar-water + dextrose (AA+D), mycological agar (AM), potato dextrose agar (BDA), meal of maize (FMI), flour of wheat (FT) and wheat for kibble (TK). In relation to A. oligospora, 75% of the tested media promoted the maximum growth of the fungus, which are: AFF, AM, FM, PD, CMA, AA+D, BDA, FT, TK, the water from the decoction of rice (AAZ), rice in grains (AZG), triturated rice (AZT), thread flour (FR), oats flour (FA), oats in thick flakes (AFG) and flour of maize (FU). In relation to the sporulation the media that had better role for A. musiformis, in decreasing order, were: FR, TK, AFG, BDA, FA, AFF, AM, FMI, AZT and FM, varying between 1,01 x 106 and 1,4 x 104 conidia/Petri dish. For the A. oligospora sporulation, the CMA medium provided the maximum level with an estimated average of 5,7 x 106 conidia/Petri dish. In the general, the best media for the micelial growth and sporulation of A. musiformis had also been the best for A. oligospora. However, some that had been the best for the A. oligospora did not had been efficient for the micelial growth or the sporulation of A. musiformis, indicating that the isolate of A. musiformis in case is more demanding than that A. oligospora one. The evidences from the study indicate that, in Jaboticabal, São Paulo state, the growth and the sporulation of these fungi do not demand special chambers. Some adaptations of an environment at the laboratory, enough to obliterate the light are sufficient. KEYWORDS: Nematophagous. Fungi. Biological control. Trap fungi. Biological control. Biological control agents. In vitro cultivation. Biosci. J., Uberlândia, v. 25, n. 2, p. 63-74, Mar./Apr. 2009 Crescimento e esporulação... SOARES, P. L. M. et al. 73 REFERÊNCIAS BERNARDO, E. R. DE A. Eficácia do controle biológico de Rotylenchulus reniformis (Linford e Oliveira, 1940) em algodoeiro (Gossypium hirsutum L.) com fungos nematófagos. 2002. 74 f. 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