ISOLAMENTO DE UMA FRAO ENRIQUECIDA EM SINAPTOSOMAS DE CREBRO DA ABELHA APIS MELLIFERA UTILIZANDO GRADIENTE DESCONTNUO DE PERCOLL E IDENTIFICAO DE MIOSINAS V E VI Original Article 8 GERMINAÇÃO IN VITRO DE GRÃOS DE PÓLEN DE PRUNUS PERSICA (L.) BATSCH VULGARIS IN VITRO GERMINATION OF GRAINS POLLEN OF Prunus persica (L.) BATSCH vulgaris Edvan Alves CHAGAS1; Wilson BARBOSA2; Rafael PIO3; Fernando Antonio Campo DALL'ORTO1; Leandro Henrique Gulgielmin TIZATO4; Angela SAITO5; Pollyana Cardoso CHAGAS6; João Alexio SCARPARE FILHO7 1. Pesquisador Científico do Centro APTA Frutas, Instituto Agronômico-IAC, Jundiaí, SP, Brasil. echagas@iac.sp.gov.br . 2. Pesquisador Científico do IAC, Centro Experimental Central, Campinas, SP; 3. Professor Adjunto de Fruticultura, Universidade Estadual do Oeste do Paraná - UNIOESTE; 4. Estagiário do Centro APTA Frutas/IAC, Bolsista de I. C., FAPESP; 5. Estagiário do Centro APTA Frutas/IAC., Bolsista de I. C./CNPq; 6. Engenheiro Agrônomo, Mestrando do Curso de Fitotecnia da Escola Superior de Agricultura “ Luiz de Queiroz” - ESALQ, Universidade de São Paulo - USP, Bolsista FAPESP.; 7. Professor Titular de Fruticultura do Departamento de Produção Vegetal da ESALQ – USP, Piracicaba, São Paulo, Brasil. RESUMO: Objetivou-se ajustar um protocolo para a germinação in vitro de grãos de pólen de pessegueiro. Para tal, foram realizados cinco experimentos com a finalidade de se estabelecer a concentração ideal de sacarose, ágar, nitrato de cálcio, ácido bórico, o melhor valor de pH, a temperatura para germinação de grãos de pólen e o tempo de início de emissão do tudo polínico. Como material vegetal utilizou-se as cultivares Aurora 1 e Douradão. Para a cultivar Aurora 1, a maior germinação de grãos de pólen foi obtida com a utilização de 48,29 g.L-1 de sacarose, 10 g.L-1 de agar, 400 mg.L-1 de ácido bórico e pH de 5,5. Para a cultivar Douradão, a maior germinação de grão de pólen foi obtida em meio contendo 90 g.L-1 de sacarose, 10 g.L-1 de agar, 400 mg.L-1 de ácido bórico, 369 mg.L-1 de nitrato de cálcio no meio de cultura e pH 6,5. A melhor temperatura para germinação de grãos de pólen para ambas as cultivares foi 25ºC, sendo que a porcentagem de germinação de grãos de pólen aumentou diretamente proporcional ao tempo de avaliação. PALAVRAS-CHAVE: Palinologia. Pessegueiro. Cultura de tecidos. Meio de cultura. Reagentes. INTRODUÇÃO Uma das técnicas utilizadas na obtenção de novas variedades de pêssego tem sido a hibridação controlada no campo com posterior avaliação das progênies. Entretanto para se obter sucesso nos cruzamentos é importante que se detecte antes de ir para o campo a viabilidade do pólen de espécies de plantas frutíferas. Para tal, várias técnicas podem ser utilizadas (GALLETA, 1983), sendo que as mais utilizadas são aquelas in vitro, a exemplo da gota pendente (SCORZA; SHERMAN, 1995) e os meios com agar (EINHARDT et al., 2006). Assim vários estudos têm sido conduzidos no sentido de determinar qualitativa e quantitativamente os componentes necessários para a melhor composição do meio de cultura para a germinação de grãos de pólen (BARBOSA et al., 1991; NUNES et al, 2001; PIO, 2003). A sacarose utilizada no meio de cultura proporciona o equilíbrio osmótico entre o pólen e o meio de germinação, além de fornecer energia para auxiliar o processo de desenvolvimento do tubo polínico (STANLEY; LINSKENS, 1974). O agar é utilizado para solidificação do meio de cultura. Com relação à concentração, as respostas na germinação de grãos de pólen variam de acordo com a espécie de frutífera. Algumas espécies germinam melhor em meio com maior concentração de agar (FREITAS et al., 2006b), enquanto outras, necessitam de quantidades menores (CHAGAS et al., 2006a). O emprego de cálcio e boro no meio de cultura é importante para promover a germinação e alongamento do tubo polínico (KWACK; BREWBAKER, 1963; SAHAR; SPIEGEL, 1980). Entretanto, em nespereira (CAVALLARI et al., 2006) e pereira (FREITAS et al., 2006a) constatou- se que o requerimento de cálcio e boro depende da variedade utilizada. O pH é também fator importante do meio de cultura. Além de influenciar na disponibilidade de nutrientes e fitorreguladores, o pH interfere no grau de solidificação do agar (PASQUAL et al., 2002). Outros fatores de grande relevância que influenciam significativamente na germinação dos grãos de pólen são, a temperatura e o tempo necessário para sua germinação. O conhecimento do início da emissão do tubo polínico e de sua estabilização em trabalhos de palinologia é de grande importância, pois permite determinar o tempo ideal para avaliação dos testes de viabilidade após a inoculação o que proporciona melhor qualidade das polinizações controladas. Biosci. J., Uberlândia, v. 25, n. 5, p. 8-14, Sept./Oct. 2009 Received: 05/05/08 Accepted: 06/11/08 mailto:echagas@iac.sp.gov.br Germinação in vitro... CHAGAS, E. A. et al. 9 Neste contexto, objetivou-se ajustar um protocolo para a germinação in vitro dos grãos de pólen de pessegueiro cultivares Aurora 1 e Douradão. MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizadas anteras retiradas de flores em estádio “balão” das cultivares Aurora 1 e Douradão, e colocadas em placas de Petri com papel de filtro e mantidas à temperatura de 26oC, durante 12 horas, para a completa deiscência e liberação de grãos de pólen. O políneo (massa viscosa de grãos de pólen fortemente aderidos) foi utilizado para a instalação dos seguintes experimentos: 1) concentrações de sacarose (0, 30, 60 e 90 g.L-1) e agar (4, 6, 8 e 10 g.L-1); 2) concentrações de nitrato de cálcio (0, 200, 400 e 800 mg.L-1) e ácido bórico (0, 400, 800 e 1200 mg.L-1); 3) valores de pH (4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 e 6,5); 4) temperaturas (20; 25; 30 e 35) e; 5) tempo de emissão do tubo polínico (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 12 horas após a inoculação). Para cada experimento, 20 ml de meio de cultura, constituído pelos diferentes tratamentos de acordo com cada experimento, foram vertidos em placas de Petri. Após solidificado, os polínios de cada variedade foram distribuídos sobre a superfície do meio com auxílio de um pincel, de modo a promover distribuição homogênea. As culturas foram mantidas a 27oC e fotoperíodo de 24 horas, com exceção do experimento de diferentes temperaturas. Com auxílio de lupa binocular com objetiva de 10 X, avaliou-se a porcentagem de grãos de pólen germinados, após 24 horas de incubação, com exceção do experimento cinco (tempo de emissão do tubo polínico), que foi avaliado em intervalos pré-estabelecidos. Foram considerados germinados os grãos de pólen cujo comprimento do tubo polínico tivesse o dobro do seu próprio diâmetro. Em todos os experimentos, o delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial de acordo com cada experimento para se estudar as interações entre os fatores testados, com quatro repetições e 100 grãos de pólen por parcela. Os dados foram submetidos à análise de variância, as médias comparadas pelo teste de Tukey à 5% de probabilidade e os dados quantitativos submetidos a regressão. As análises foram realizadas pelo Programa Computacional Sistema para Análise de Variância - SISVAR (FERREIRA, 2000). RESULTADOS E DISCUSSÃO Concentrações de agar e sacarose Para a variedade Aurora 1, maior germinação de grãos de pólen (55,42%) foi obtido utilizando-se a concentração de 48,29 g.L-1 de sacarose combinado com 10 g.L-1 de agar (Figura 1A). Resultado semelhante também foi observado utilizando-se 90 g.L-1 de sacarose e 6 g.L-1. Chagas et al. (2007), estudando a germinação in vitro de grãos de pólen de pereiras, verificaram que a concentração de 10 g.L-1 de agar combinada com 47,78 g.L-1 para proporcionaram os melhores resultados para a pereira ‘Taiwan Nashi-C’. Figura 1. Porcentagem de grãos de pólen germinados in vitro de pessegueiro ‘Aurora 1’ (1A) e ‘Douradão’ (1B) quando submetidas a diferentes concentrações de agar e sacarose. y 4g.L-1 agar = -0,0047x2 + 0,3333x + 44,75 R2 = 0,71 ___ y 6g.L-1 agar = 0,0053x2-0,2238x + 30,538 R2 = 0,95 __ __ y 8g.L-1 agar = -0,0113x2 + 1,0213x+31,888 R2 = 0,64 ---- y 10g.L-1 agar=-0,0138x2+1,3329x+23,238 R2=0,79 __ _ __ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 30 60 90 Sacarose (g.L-1) 4 6 8 10 y 4 g.L-1 agar = 0,345x + 13,1 R2 = 0,86 ___ y 6 g.L-1 agar = -0,0049x2+0,5058x+21,925 R2 = 0,66 __ __ y 8 g.L-1 agar = 0,004x2 - 0,2454x + 27,013 R2 = 0,77 ---- y 10g.L-1 agar = 0,5567x + 12,325 R2 = 0,85 __ _ __ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 30 60 90 Sacarose (g.L-1) 4 6 8 10 A B Biosci. J., Uberlândia, v. 25, n. 5, p. 8-14, Sept./Oct. 2009 Germinação in vitro... CHAGAS, E. A. et al. 10 Para a variedade Douradão, melhor resultado (71% de germinação) foi obtido com 90 g.L-1 de sacarose combinado com 10 g.L-1 de agar. Resultado semelhante foi obtido na germinação de grãos de pólen de porta-enxerto de pereira ‘Taiwan Mamenashi’ (CHAGAS et al., 2007). A dose de 90 g.L-1 de desse carboidrato também proporcionou bons resultados quando combinado com 4 e 8 g.L-1 de agar. Por outro lado, a utilização de 6 g.L-1 de agar proporcionou a menor porcentagem de germinação de grãos de pólen para todas as doses de sacarose testadas (Figura 1B). Concentrações de nitrato de cálcio e ácido bórico Verificou-se, de maneira em geral, que a adição de nitrato de cálcio afetou significativamente a germinação in vitro de grãos de pólen da cultivar Aurora 1, sendo que os melhores resultados foram observados na sua ausência. Para esta cultivar maior porcentagem de germinação foi constatada quando adicionou-se 400 mg.L-1 de ácido bórico na ausência de nitrato de cálcio (Figura 2A). Resultado semelhante foi observado para a germinação in vitro de grãos de pólen de pereira onde constataram que não há necessidade da adição desse reagente para a germinação in vitro de grãos de pólen dos porta- enxertos ‘Taiwan Mamenashi’ e ‘Taiwan Nashi-C’ (CHAGAS et al., 2007). y 0 mg.L-1 H3BO3 = -0,024x + 20,15 R 2 = 0,70 ___ y 400 mg.L-1 H3BO3 = 0,00007x 2 - 0,0686x + 27,05 R2 = 0,77 __ __ y 800 mg.L-1 H3BO3 = 0,0041x - 0,3 R 2 = 0,94 ---- y 1200 mg.L-1 H3BO3 = -0,0146x + 15,75 R 2 = 0,74 __ _ __ -5 0 5 10 15 20 25 30 0 200 400 600 800 Nitrato de Cálcio (mg.L-1) 0 400 800 1200 y 0 mg.L-1 H3BO3 = -0,0103x + 12,4 R 2 = 0,7116 ____ y 400 mg.L-1 H3BO3 = -0,00005x 2 + 0,0369x + 23,298 R2 = 0,8714 __ __ y 800 mg.L-1 H3BO3 = -0,0213x + 21,2 R 2 = 0,7389 ---- y 1200 mg.L-1 H3BO3 = -0,0198x + 18,25 R 2 = 0,7761 __ _ __ 0 5 10 15 20 25 30 35 0 200 400 600 800 Nitrato de Cálcio (mg.L-1) G er m in aç ão ( % )r 0 400 800 1200 A B Figura 2. Porcentagem de germinação in vitro de grãos de pólen de pessegueiro variedade Aurora 1 (1A) e Douradão (1B) quando submetidas a diferentes concentrações de nitrato de cálcio e ácido bórico. Para a cultivar Douradão verificou-se efeito semelhante. Exceto para a concentração de 400 mg.L-1 de ácido bórico que, quando combinado com 369 mg.L-1 de nitrato de cálcio proporcionou o melhor resultado na germinação in vitro de grãos de pólen (Figura 2B). Para todas as demais concentrações de ácido bórico testadas, houve um decréscimo na porcentagem de germinação a medida em que se elevava a concentração de nitrato de cálcio no meio de cultura (Figura 2B). Ajuste do pH Verifica-se através da Figura 3 que houve um efeito positivo do pH na germinação in vitro das cultivares de pessegueiro testadas. Para variedade Douradão, observou-se aumento na porcentagem de grãos de pólen germinado a medida em que se eleva o valor de pH, até o valor máximo testado (6,5). Para a variedade Aurora 1, o melhor ajuste de pH foi de 5,5. Valores abaixo e acima desses pH proporcionaram menores taxas de germinação. HE et al. (2005), também verificaram ao estudar a viabilidade de grãos de pólen de várias espécies de Prunus que o melhor pH situou-se próximo de 5,8. Segundo Pierik (1987) o pH que proporciona um crescimento adequado da maioria das espécies, situa-se na faixa de 5 a 6,5. Valores acima desses podem ocasionar uma paralisação do crescimento e desenvolvimento in vitro (MURASHIGE, 1974). Chagas et al. (2006b), observaram que o melhor ajuste de pH no meio de cultura para germinação in vitro de grãos de pólen de nectarineiras foi de 6,5. No presente trabalho, de modo geral, constatou-se que valores de pH entre 5,5 e 6,5 foram os que proporcionaram as maiores taxas de germinação para ambas as variedades. Biosci. J., Uberlândia, v. 25, n. 5, p. 8-14, Sept./Oct. 2009 Germinação in vitro... CHAGAS, E. A. et al. 11 y Aurora 1= -6,9821x2 + 77,627x - 187,84 R2 = 0,68 ___ y Douradão = 3,5714x + 10,167 R2 = 0,81 ----- 0 5 10 15 20 25 30 35 40 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 pH G er m in aç ão ( % Aurora 1 Douradão Figura 3. Porcentagem de germinação in vitro de grãos de pólen germinados de pessegueiro ‘Aurora 1’ e ‘Douradão’ quando submetidos a diferentes valores de pH. Temperatura Para as cultivares Aurora 1 e Douradão, as melhores temperaturas para germinação de grãos de pólen foram àquelas situadas entre 20 e 30oC, as quais não diferiram entre si. Para as cultivares Aurora 1 e Douradão, as maiores porcentagens de germinação (62 e 48%) foram obtidas quando o pólen foi colocado para germinar em B.O.D. com 25oC, respectivamente. Entretanto, essa diferença não foi comprovada estatisticamente (Tabela 1). Este resultado está de acordo com os obtidos por DU et al. (2006). Estes autores verificaram que a melhor temperatura para germinação in vitro de grãos de pólen de Prunus mume foi a de 25oC. Tabela 1. Porcentagem de grãos de pólen de pessegueiro ‘Aurora 1’ e ‘Douradão’ germinados in vitro em função de diferentes temperaturas. Cultivares Aurora 1 Douradão Temperaturas oC Porcentagem de Germinação 20 48,25abAB 27,50 abB 25 62,00aA 48,00aAB 30 45,25abA 40,25 aA 35 31,75bA 16,75 bAB * Médias seguidas da mesma letra em minúscula na coluna e maiúsculo na linha, não diferem significativamente entre si pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade. A temperatura de 35oC não foi adequada para a germinação dos grãos de pólen das duas cultivares testadas, proporcionando os menores percentuais de germinação (Tabela 1). Weinbaum et al. (1984), estudando o efeito da temperatura em várias espécies de Prunus, verificaram que a máxima germinação de grãos de pólen ocorreu quando os polens foram postos a germinar em ambientes com temperaturas entre 16 e 230C. Os mesmos autores ainda verificaram que em pêssego, cultivar ‘Okinawa’, a porcentagem de grãos de pólen germinados decresceu quando submetidos a temperaturas acima de 280C. Tempo de emissão do tubo polínico Verificou-se que o início da germinação dos grãos de pólen das cultivares testados ocorreu uma hora após a inoculação (Figura 4). Biosci. J., Uberlândia, v. 25, n. 5, p. 8-14, Sept./Oct. 2009 Germinação in vitro... CHAGAS, E. A. et al. 12 yAurora = 2,4134x + 12,92 R2 = 0,63 ____ yDouradão = 2,1207x + 8,0645 R2 = 0,75 ------ 0 10 20 30 40 50 60 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Tempo de Início de Germinação (horas após a inoculação) Aurora 1 Douradão Figura 4. Porcentagem de grãos de pólen de nectarinas ‘Centenária’ e ‘Colombina’ e pessegueiro ‘Aurora 1’ e ‘Douradão’ germinados in vitro em função do tempo de início de germinação. Barbosa et al. (1990), afirmam que para pessegueiro, a germinação ocorre pouco tempo após a inoculação, por volta de 60 minutos. Observou-se também que houve um crescimento linear da porcentagem de germinação à medida que se avançou no período de avaliação. Após 12 horas da inoculação, constatou-se uma porcentagem de 34,75 e 49,75% para as cultivares Douradão e Aurora 1 (Figura 4). Esses dados estão de acordo com diversos trabalhos realizados com o gênero Prunus. DU et al. (2006), também observaram que a germinação e o crescimento de grãos de pólen de três cultivares de umezeiro também ocorreram por volta de 0 e 12 horas após a inoculação. CONCLUSÕES Para a cultivar Aurora 1, maior germinação de grãos de pólen foi obtido com a utilização de 48,29 g.L-1 de sacarose, 10 g.L-1 de agar, 400 mg.L- 1 de ácido bórico e pH de 5,5. Para a cultivar Douradão, maior germinação de grão de pólen foi obtido em meio contendo 90 g.L-1 para ‘Douradão’, 10 g.L-1 de agar, 400 mg.L-1 de ácido bórico, 369 mg.L-1 de nitrato de cálcio no meio de cultura e pH 6,5. A melhor temperatura para germinação de grãos de pólen para as cultivares Aurora 1 e Douradão foi 25ºC, sendo que a porcentagem de germinação de grãos de pólen aumentou diretamente proporcional ao tempo de avaliação. ABSTRACT: The objective was to adjust a protocol for peach pollen grains in vitro germination. For that, were realized five experiments with the purpose of establish the ideal concentration of sucrose, agar, calcium nitrate, boric acid, the best pH value, the germination temperature and the polinic tube emission time. As vegetal material, was used the Aurora 1 and Douradão cultivars. For the Aurora 1 cultivar, higher germination of pollen grains was obtained with the use of 48,29 g.L-1 of sucrose, 10 g.L-1 of agar, 400 mg.L-1 of boric acid and pH 5,5. For the Douradão cultivar, higher germination was obtained on medium containing 90 g.L-1 of sucrose, 10 g.L-1 of agar, 400 mg.L-1 of boric acid, 369 mg.L-1 of calcium nitrate and pH 6,5. The best temperature for the germination of the pollen grains for both cultivars was 25º C, being the pollen grains germination percentage raising proportionally directly to the evaluation time. KEYWORDS: Palynology. Peach. Tissue culture. Culture medium. Reagents. Biosci. J., Uberlândia, v. 25, n. 5, p. 8-14, Sept./Oct. 2009 Germinação in vitro... CHAGAS, E. A. et al. 13 REFERÊNCIAS BARBOSA, W.; CAMPO-DALL’ORTO, F. A.; OJIMA, M.; SAMPAIO, V. R.; BANDEL, G. Ecofisiologia do desenvolvimento vegetativo e reprodutivo do pessegueiro em região subtropical. Campinas, Instituto Agronômico, 1990, 37p. (Documentos IAC, 17). BARBOSA, W.; DALL'ORTO, F. A. C.; OJIMA, M.; MARTINS, F. G.; SANTOS, R. R.; SABINO, J. C. Polinização das frutíferas de caroço, ameixeira, nectarineira e pessegueiro. O Agronômico, Campinas, v. 43, n. 1, p. 3-13. 1991. CAVALLARI, L. L.; PIO, L. A. S.; CHAGAS, E. A.; PASQUAL, M. 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