©SEEd Tutti i diritti riservati Clinical Management Issues 2010; 4(Suppl. 2) Clinical Management Issues 21 Marianna De Muro 1, Odoardo Maria Olimpieri 1, Rosa Greco 1, Lidia Altomare 1 Caso ClInICo Una donna di 42 anni giungeva alla nostra osservazione per comparsa di febbricola, aste- nia e malessere generale. La donna riferiva, inoltre, difficoltà digestive post-prandiali. L’esame obiettivo mostrava splenomega- lia (18 cm). La donna veniva, quindi, sottoposta a esami ematochimici di approfondimen- to: l’emocromo mostrava leucocitosi con 123.000 globuli bianchi/mm3; nello striscio di sangue venoso periferico erano presenti cellule immature. Nel sospetto di una patologia mielopro- liferativa, la paziente veniva sottoposta ad aspirato del midollo osseo; l’esame morfo- logico del midollo mostrava iperplasia gra- nuloblastica senza elementi indifferenziati, mentre l’analisi citogenetica convenzionale non rilevava alterazioni (cariotipo 46 XX). L’esame di citogenetica FISH su nuclei in interfase dimostrava la presenza di una traslo- cazione classica t(9;22) con delezione 9q. L’esame molecolare del sangue midollare mostrava un trascritto b2a2 e l’esame quan- titativo (RQ-PCR) evidenziava una ratio BCR-ABL/ABL del 48%. Resistenza a imatinib: opzioni diagnostiche e terapeutiche abstract We report a case of a 42-year-old woman with t(9;22) positive chronic myeloid leukemia (CML) who developed a sub-optimal response to therapy with imatinib mesylate due to M351T mutation and low plasma level of imatinib. Dose increase of imatinib resulted in toxicity. She obtained a complete molecular response to therapy with nilotinib, without adverse events. Keywords: imatinib resistance, blood level test, nilotinib Imatinib resistance: diagnostic and therapeutic choices CMI 2010; 4(Suppl. 2): 21-25 1 Area di Ematologia, Policlinico Universitario Campus Bio-Medico, Roma Corresponding author Marianna De Muro M.DeMuro@unicampus.it Perché descriviamo questo caso? I pazienti affetti da LMC possono mani- festare resistenza durante la terapia, ma tale evento non preclude il raggiungi- mento di una remissione della patologia, se vengono utilizzati i giusti strumenti diagnostici e terapeutici Caso clinico Gli elementi permettevano di porre dia- gnosi di leucemia mieloide cronica (LMC), in fase cronica. Data la gravità del caso e il forte sospetto di patologia mieloproliferativa, prima di ottenere le risposte della citogenetica e della biologia molecolare, era stata intrapresa terapia citori- duttiva con idrossiurea. Ottenuta la conferma diagnostica di LMC, nel mese successivo la terapia fu modificata sostituendo il chemiote- rapico con imatinib a dosaggio standard (400 mg/die). Nelle prime settimane di terapia non fu rilevato alcun effetto collaterale e alla ter- za settimana la paziente aveva ottenuto una risposta ematologica completa. Al 3° mese di terapia l’esame citogenetico mostrava una risposta parziale (Ph+ 25%). Disclosure Supplemento realizzato con il contributo di Novartis S.p.A. ©SEEd Tutti i diritti riservati Clinical Management Issues 2010; 4(Suppl. 2)22 Resistenza a imatinib: opzioni diagnostiche e terapeutiche Al 6° mese di terapia la paziente aveva ottenuto una risposta citogenetica completa (RCC, Ph+ 0%). Al 12° mese di terapia persisteva la RCC. L’analisi molecolare quantitativa mostrava una ratio BCR-ABL/ABL pari a 1,2%. Al 18° mese di terapia l’analisi molecolare quantitativa evidenziava una ratio in ascesa (2,4%), RCC persistente. Considerando l’incremento della ratio quantitativo, la paziente è stata sottoposta a dosaggio del livello plasmatico di imatinib (BLT) e a screening mutazionale, mediante tecnica Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC). Il BLT, eseguito 2 volte consecutivamente, evidenziava una concentrazione plasmatica di imatinib pari a 850 ng/ml e 940 ng/ml, valori inferiori rispetto alla soglia ritenuta efficace (1.002 ng/ml). Lo screening mutazionale evidenziava la mutazione M351T del dominio catalitico di BCR-ABL. La presenza di un dosaggio plasmatico del farmaco inferiore rispetto a quello reputato efficace e la presenza di una mutazione che rendeva la paziente potenzialmente respon- siva a imatinib a dosaggio maggiore rispetto a quello standard suggerivano di incremen- tare il farmaco al dosaggio di 600 mg/die. Dopo tre mesi di terapia l’esame mole- colare evidenziava nuovamente una ratio di 2,5%. A 6 mesi dall’aumento del dosaggio la ratio era pari al 3%, con persistenza del- la mutazione evidenziata precedentemente. La paziente iniziò inoltre a manifestare effetti collaterali legati a imatinib, quali ri- tenzione idrica e crampi muscolari, sintomi mai presentati prima. In considerazione della resistenza alla terapia effettuata, degli effetti collaterali e della mutazione M351T, si decideva di in- terrompere definitivamente imatinib e ini- ziare nilotinib, inibitore delle tirosin chinasi di seconda generazione, al dosaggio standard di 400 mg/bid. A 3 mesi dall’assunzione la ratio era pari a 0,1%, raggiungendo una risposta molecolare maggiore secondo l’International Scale. Dopo 6 mesi l’analisi molecolare quan- titativa evidenziava una ratio pari a 0,01%. La ritenzione idrica sviluppata con imatinib non venne più riscontrata, mentre solo nelle prime settimane di assunzione la paziente riferì cefalea. Domande da porsi Come gestire la “risposta sub-ottimale”? y Qual è l ’utilità dello studio mutazionale y e del BLT? Come interpretare i risultati delle ana- y lisi? Come scegliere il farmaco di seconda li- y nea? Discussione La leucemia mieloide cronica (LMC) è una patologia ematologica derivata dalla trasformazione neoplastica della cellula sta- minale pluripotente. È caratterizzata dalla presenza della traslocazione t(9;22) (cromo- soma Philadelphia) nel clone neoplastico. Il cromosoma Philadelphia è il risultato della fusione fra il gene BCR (Brekpoint Cluster Region) situato sul cromosoma 22, e il gene ABL (Abelson Leukemia virus), situato sul cromosoma 9; ne deriva l’oncogene di fu- sione BCR-ABL. La proteina codificata dall’oncogene, BCR-ABL, è una tirosin chinasi citoplasma- tica costitutivamente attivata, attualmente considerata la principale causa della LMC. La LMC è caratterizzata da tre fasi [1]: fase cronica y : leucocitosi neutrofila (12- 1.000 x 109/l), con neutrofili presenti nelle varie fasi maturative. Possono essere pre- senti basofilia assoluta e/o eosinofilia; in alcuni casi è presente monocitosi assoluta. La quota di blasti nel sangue venoso peri- ferico non supera il 2%. La conta piastri- ne è variabile: da valori normali a valori elevati (1.000 x 109/l), la trombocitope- nia è meno frequente. Nel midollo osseo è presente un’iperplasia granuloblastica, con una quota di blasti minore al 10%. È spesso presente splenomegalia; fase accelerata y , con presenza di uno dei seguenti parametri: persistenza/incremento dei globuli 1. bianchi >10 x 109/l e/o persistenza/in- cremento della splenomegalia; persistenza della piastrinosi (> 1.000 x 2. 109/l), non controllata dalla terapia; persistenza della piastrinopenia non 3. correlata alla terapia (< 100 x 109/l); evoluzione clonale citogenetica rispetto 4. al cariotipo della diagnosi; ©SEEd Tutti i diritti riservati Clinical Management Issues 2010; 4(Suppl. 2) 23 M. De Muro, O. M. Olimpieri, R. Greco, L. Altomare basofili ≥ al 20% nel sangue venoso 5. periferico; 10-19% di mieloblasti nel sangue veno-6. so periferico o nel midollo osseo; fase blastica y : blasti ≥ 20% di cellule nel sangue ve-1. noso periferico o delle cellule nucleate nel midollo osseo; proliferazione di blasti in sede extra-2. midollare. Attualmente la terapia di scelta per la fase cronica è rappresentata da imatinib mesilato, al dosaggio standard di 400 mg/die. Imatinib è un inibitore della tirosin chinasi [2]. Durante la terapia i pazienti devono essere sottoposti a controlli ematologici, citoge- netici e molecolari per la valutazione della risposta alla terapia stessa. La nostra paziente è stata sottoposta ai controlli previsti, mostrando una rapida ri- sposta sia ematologica sia citogenetica, ma la presenza del trascritto valutato mediante biologia molecolare quantitativa positiva al 12° mese di trattamento permetteva di clas- sificarla come un paziente warning, ovvero un paziente che non ha avuto una buona risposta al trattamento e che necessita di un monitoraggio stretto [4]. La ripetizione al 18° mese di terapia dell’analisi molecolare quantitativa evidenziava una ratio in ascesa (2,4%), nonostante la risposta citogenetica completa: per tale motivo la paziente pre- sentava una risposta sub-ottimale alla te- rapia. La risposta sub-ottimale significa che il paziente può ancora trarre beneficio da imatinib nonostante l’outcome a lungo termine non sia ottimale. Recentemente Marin e collaboratori hanno stratificato i pazienti affetti da LMC dell’Hammersmith Hospital in base ai criteri ELN (European LeukemiaNet), evidenziando una sovrap- posizione nelle definizioni di fallimento e risposta sub-ottimale [5]. L’incidenza di risposta sub-ottimale in cor- so di terapia con imatinib, secondo gli studi ELN del 2006, è pari a circa il 20% [4]. I pazienti con risposta sub-ottimale pos- sono giovare di trattamento con imatinib a dosaggio maggiore se non hanno sviluppato resistenza al farmaco. Il dosaggio plasmatico di imatinib, valutato con il BLT, al di sotto della soglia ritenuta terapeutica, può sup- portare ulteriormente la decisione di incre- mentare il dosaggio del farmaco. Il problema dell’insorgenza delle muta- zioni nel dominio chinasico di BCR-ABL, ovvero nel sito di legame di imatinib con la proteina, rappresenta una questione aperta. L’incidenza di resistenza a imatinib dovu- ta a mutazioni riportata in letteratura è pari a circa il 40-50% nella fase cronica di ma- lattia. In letteratura sono ormai note più di 90-100 mutazioni ed è conosciuto l’IC50 di ciascuna mutazione: alcune rispondono a un incremento di dosaggio del farmaco, altre ai nuovi farmaci inibitori delle chinasi; la mu- tazione T315I conferisce resistenza a tutti i farmaci attualmente disponibili. Tipo di risposta Definizione Ematologica completa (CHR) Globuli bianchi < 10 x 10 y 9/l Basofili < 5% y Assenza di mielociti, mieloblasti, promielociti y Piastrine < 450 x 10 y 9/l Milza non palpabile y Citogenetica Completa (CCgR) y assenza del cromosoma Philadelphia Parziale (PCgR) y Philadelphia + compreso fra 1-35% Minore (mCgR) y Philadelphia + compreso fra 36-65% Minima (minCgR) y Philadelphia + compreso fra 66-95% Nessuna (no CgR) y Philadelphia + > 95% Molecolare Completa(CMoIR) y trascritto BCR-ABL mRNA non rintracciabile con RT-Q-PCR e/o nested PCR in due campioni consecutivi di sangue di adeguata qualità (sensibilità > 104) Maggiore (MMoIR) y Ratio BCR-ABL su ABL ≤ 0,1% della International Scale Tabella I Definizione di risposta ematologica, citogenetica e molecolare [3] RT-Q-PCR = Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Risposta Descrizione del monitoraggio Ematologica Alla diagnosi e ogni 15 giorni fino al raggiungimento della risposta ematologica completa (CHR); successivamente ogni 3 mesi o quando richiesto Citogenetica Alla diagnosi, a 3 e a 6 mesi. Successivamente ogni 6 mesi fino al raggiungimento e conferma della risposta citogenetica completa (CCgR). Successivamente ogni 12 mesi, se non può essere eseguito il controllo molecolare regolare; sempre nel sospetto di fallimento terapeutico (resistenza primaria o secondaria), e per la comparsa di anemia, leucopenia, piastrinopenia inspiegata Molecolare con RT-Q-PCR Ogni 3 mesi fino al raggiungimento e conferma della risposta molecolare maggiore (MMoIR). Successivamente almeno ogni 6 mesi Molecolare con analisi mutazionale Nel caso di risposta sub-ottimale o fallimento. Sempre prima di iniziare terapia con un altro inibitore Tabella II Timing del monitoraggio della risposta alla terapia con imatinib in corso di LMC [3] RT-Q-PCR = Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction ©SEEd Tutti i diritti riservati Clinical Management Issues 2010; 4(Suppl. 2)24 Resistenza a imatinib: opzioni diagnostiche e terapeutiche Nel caso della mutazione M351T, l’IC50 è pari a 820 ng/ml, valore che ci ha consentito di ottimizzare la dose; inoltre questa muta- zione rende il soggetto suscettibile a terapia con nilotinib (inibitore della tirosin chinasi di seconda generazione) [6]. Il BLT è uno strumento valido nei casi di pazienti resistenti con mutazioni sensibili a imatinib o senza alcuna mutazione in cui il sottodosaggio del farmaco è causa della resistenza. Il BLT può essere utile quindi per valutare: l’assorbimento del farmaco; y l’ aderenza alla terapia; y il possibile sviluppo di interazioni farma- y cologiche che riducono/aumentano l’as- sorbimento di imatinib. Trova inoltre impiego nella diagnosi di eventi avversi gravi legati al sovradosaggio di imatinib [7-9]. Nel nostro caso la mutazione M351T [6], e il basso livello plasmatico hanno giustifi- cato l’incremento del dosaggio del farmaco. Il nostro tentativo, tuttavia, è stato vano per assenza di risposta molecolare e insorgenza di effetti collaterali. La resistenza alla terapia e l’intolleranza a imatinib a dosaggi maggiori di 400 mg/die (comparsa di effetti collaterali) imponevano una nuova decisione terapeutica. La mutazione sviluppata dalla paziente rendeva possibile la somministrazione di nilotinib, un inibitore della tirosin chinasi che si è dimostrato 30-50 volte più potente di imatinib, con alta selettività e affinità per BCR-ABL, maneggevole e ben tollerato [10,11]. La somministrazione di questo nuovo farmaco ha consentito il raggiungimento della risposta molecolare completa in tem- pi brevi. BIBlIogRafIa Swerdlow SH, Ciampo E, Lee H, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H. WHO Classification of tumors 1. of haematopoietic and lymphoid tissue. Geneva: WHO, 2008; 4th edition Hochhaus2. A, O’Brien SG, Guilhot F, Druker BJ, Branford S, Foroni L et al. Six-year follow-up of patients receiving imatinib for the first-line treatment of chronic myeloid leukemia. Leukemia 2009; 23: 1054-61 Risposte alle domande emerse nel corso del caso clinico La “risposta sub-ottimale” y necessita di una attenta valutazione in quanto il paziente non ha raggiunto il target terapeutico, quindi potrebbe, potenzialmente, evolvere perdendo la risposta ottenuta. Bisogna quindi decidere, utilizzando gli strumenti diagnostici a dispo- sizione, l ’atteggiamento terapeutico più corretto da adottare Lo studio mutazionale e il BLT y rappresentano i due strumenti attualmente disponibili per valutare sia la causa dell ’assenza/perdita della risposta alla terapia, sia il tipo di ap- proccio terapeutico da adottare L’ analisi mutazionale y ci fornisce: indicazioni rispetto alla presenza o meno di una mutazione y il tipo di mutazione y l ’eventuale sensibilità della mutazione a imatinib, giustificando un eventuale incre- y mento del farmaco la sensibilità della mutazione ad altri tipi di inibitori della tirosin chinasi di seconda y generazione, indicando, quindi, il farmaco da adottare Il BLT y consente di valutare se il dosaggio plasmatico di imatinib risulta entro il range terapeutico, permettendo di diagnosticare sia sottodosaggi che rendono inefficace la tera- pia (in caso, per esempio, di scarsa aderenza alla terapia o interazione tra farmaci), sia sovradosaggi che causano reazioni avverse Il farmaco di seconda linea y nel paziente resistente a imatinib deve essere scelto in base alla capacità di bypassare la resistenza indotta dalla mutazione che ha reso inefficace imatinib [6] ©SEEd Tutti i diritti riservati Clinical Management Issues 2010; 4(Suppl. 2) 25 M. De Muro, O. M. Olimpieri, R. Greco, L. Altomare Baccarani M, Cortes J, Pane F, Niederwieser D, Saglio G, Apperley J et al. Chronic myeloid 3. leukemia: an update of concepts and management recommendations of European LeukemiaNet. J Clin Oncol 2009; 27: 6041-51 Baccarani M, Saglio G, Goldman J, Hochhaus A, Simonsson B, Appelbaum F et al. Evolving 4. concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet. Blood 2006; 108: 1809-20 Marin D, Milojkovic D, Olavarria E, Khorashad JS, de Lavallade H, Reid AG et al. European 5. LeukemiaNet criteria for failure or suboptimal response reliably identify patients with CML in early chronic phase treated with imatinib whose eventual outcome is poor. Blood 2008; 112: 4437-44 O’Hare T, Eide CA, Deininger MW. Bcr-Abl kinase domain mutations, drug resistance, and 6. the road to a cure for chronic myeloid leukemia. Blood 2007; 110: 2242-9 Picard S, Titier K, Etienne G, Teilhet E, Ducint D, Bernard MA et al. Trough imatinib plasma 7. levels are associated with both cytogenetic and molecular responses to standard-dose imatinib in chronic myeloid leukaemia. Blood 2007; 109: 3496-9 Larson RA, Druker BJ, Guilhot F, O’Brien SG, Riviere GJ, Krahnke T et al. Imatinib 8. pharmacokinetics and its correlation with response and safety in chronic-phase chronic myeloid leukemia: a subanalysis of the IRIS study. Blood 2008; 111: 4022-8 Soverini S, Colarossi S, Gnani A, Rosti G, Castagnetti F, Poerio A et al. Contribution of ABL 9. kinase domain mutations to imatinib resistance in different subsets of Philadelphia-positive patients: by the GIMEMA Working Party on Chronic Myeloid Leukemia. Clin Cancer Res 2006; 12: 7374-9 Jabbour E, Hochhaus A, Cortes J, La Rosée P, Kantarjian HM. Choosing the best treatment 10. strategy for chronic myeloid leukemia patients resistant to imatinib: weighing the efficacy and safety of individual drugs with BCR-ABL mutations and patient history. Leukemia 2010; 24: 6-12 Breccia M, Alimena G. Nilotinib therapy in chronic myelogenous leukemia: the strength of 11. high selectivity on BCR-ABL. Curr Drug Targets 2009; 10: 530-6