vol 38 no 2-2005 84 Ekspresi produk gen laten virus epstein-barr pada karsinoma sel skuamosa rongga mulut (The expressions of latent gene product of epstein-barr virus in oral squamous cell carcinoma) Theresia Indah Budhy S Bagian Biologi Oral Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Surabaya - Indonesia ABSTRACT Squamous cell carcinoma (SCC) is a type of cancer often found in oral cavity and the area of head and neck at about 90%. Based on the geographical incidence oral SCC (OSCC) has many types of different emerging. This case probably has connection with ethnic group, habit and social and economical condition. In East Java, the incidence is about 2.64% and it increases every year. The virus is known as one of the main factors that result in this disease. Epstein-Barr virus (EBV) has potential capability of carcinogenesis. EBV is the family of herpesviridae that can infect cell through the linking of CD 21 receptor of the epithel with glycol protein 350/220 of the virus capsule. After primary infection, the virus will form latent-gene in human cell. Periodically, the latent-gene product can disturb proliferation and apoptotic regulator. In Indonesia, the expression of EBV latent geneproduct in the OSCC has not been reported yet. This study wanted to know the expression of EBV latent gene product found in the OSCC. This study found 25 cases of OSCC in which 17 were infected by EBV. Detection of EBV infection could be done by insitu hybridization to identify RNA EBV (EBER). To find the expression of EBV latent gene product, immunohistochemical analysis was done. The conclusion was that the emerging of expression of EBV latent gene product in OSCC were latent membrane protein-1 (LMP-1), EBV nuclear antigen-1 (EBNA-1) and RNA EBV (EBER). They were 28.28%, 25.26% and 46.47%. It was suggested to do the following research on OSCC infected by EBV and the emerging of expression of EBV latent gene product with regulator gene of proliferation and apoptotic in OSCC. Key words: epstein-barr virus (EBV), oral squamous cell carcinoma, LMP-1, EBNA-1, EBER Korespondensi (correspondence): Theresia Indah Budhy S, Bagian Biologi Oral, Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga. Jln. Mayjen. Prof. Dr. Moestopo No. 47 Surabaya 60132, Indonesia. PENDAHULUAN Epstein-barr virus (EBV) merupakan herpes virus gamma yang termasuk dalam famili herpesviridae dengan besar genom 172 kb. Dari seluruh gen yang ada 9 gen di antaranya diekspresikan pada limfosit B yang terinfeksi. Virus ini sering dikaitkan dengan karsinoma nasofaring, Burkitt's lymphoma. Pada karsinoma tersebut akan diekspresikan berbagai gen laten. Produk gen laten yang diekspresikan dapat mempengaruhi gen pengatur pada proliferasi dan apoptosis sel.1 Di rongga mulut kanker yang sering didapatkan adalah jenis karsinoma. Menurut Higa et al.2 karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang terjadi pada penduduk Okinawa Jepang terkait dengan infeksi EBV. Sejauh ini di Indonesia belum ada laporan produk gen laten EBV yang diekspresikan pada karsinoma sel skuamosa rongga mulut (KSSRM). Mengingat hal tersebut, maka peneliti ingin mengkaji ekspresi gen laten EBV pada KSSRM di Jawa Timur. Epstein-barr virus (EBV) yang telah menginfeksi epitel akan menetap secara laten dan secara periodik menjadi aktif. Hal ini didukung peneliti terdahulu Hu and Li3 bahwa pada Hairy leukoplakia ditemukan partikel EBV pada hampir 100%. Genom EBV yang berada pada sel inang berbentuk latent episome.4 Latent episome ini terdiri dari beberapa produk gen yang akan diekspresikan. Produk gen tersebut akan direplikasikan selama pembelahan sel inang. Mengingat hal tersebut, maka gen EBV akan menyebabkan EBV persisten di dalam sel. Hal tersebut mempengaruhi sistem pembelahan sel. Bila keadaan ini berlanjut terus tanpa ada mekanisme protektif dan preventif maka menyebabkan progresivitas kanker semakin cepat. Pada latent episome EBV terdapat berbagai gen antara lain latent membrane protein (LMP) 1, 2A, 2B, EBV nuclear antigen (EBNA) 1, 2, 3, 4, 5, 6, LP dan EBV-RNA (EBER) 1, 2. Pada jenis kanker yang berbeda biasanya akan diekspresikan gen EBV yang berbeda. Dilaporkan oleh Shimakage et al.5 bahwa EBER banyak terkait dengan keganasan karena dapat menghambat apoptosis. Sebelumnya dilaporkan oleh Nicholson et al,6 bahwa ekspresi LMP-1 pada human cell line menyebabkan transformasi sel, sedangkan Middeldorp et al.1 mengatakan bahwa EBNA-1 banyak terkait dengan keganasan karena dapat meningkatkan aktivitas faktor transkripsi. Berdasar permasalahan tersebut maka didapatkan suatu konsep bahwa di rongga mulut keganasan yang paling 85Budhy: Ekspresi produk gen laten sering dijumpai adalah karsinoma sel skuamosa. Terkait dengan infeksi EBV, yang terdapat pada karsinoma rongga mulut akan diekspresikan berbagai produk gen laten antara lain EBER, LMP-1 dan EBNA-1. Dengan mengkaji keragaman ekspresi gen EBV pada karsinoma sel skuamosa rongga mulut diharapkan dapat digunakan sebagai upaya pencegahan dini. BAHAN DAN METODE Jenis penelitian yang dilakukan adalah eksploratif dengan menggunakan penderita karsinoma sel skuamosa rongga mulut (KSSRM) sebagai obyek penelitian. Pada penelitian ini diperiksa sebagai variabel adalah ekspresi produk gen laten virus Epstein-Barr yaitu: latent membrane protein-1 (LMP-1), EBV nuclear antigen-1 (EBNA-1) dan EBV RNA (EBER). Untuk mendapatkan sampel dilakukan secara purposive, didasarkan pada kriteria klinis dan hasil pemeriksaan histopatologis dengan diagnosis karsinoma sel skuamosa rongga mulut. Penentuan ekspresi EBER dengan menggunakan metode insitu hibridisasi. Penentuan ekspresi Latent Membrane Protein-1 (LMP-1) dengan metode imunohistokimia menggunakan antibodi monoklonal LMP-1 produksi Novo, ekspresi EBV nuclear antigen-1 (EBNA-1) dengan metode imunohistokimia menggunakan antibodi monoklonal EBNA-1 produksi Novo. Penelitian ini dilakukan di RSU. Dr. Soetomo Surabaya Jawa Timur sebagai sentra Rumah Sakit di Indonesia Bagian Timur, Laboratorium Histopatologi di Bagian Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Unair untuk pemeriksaan histopatologi dengan pengecatan Hematoksilin Eosin guna menentukan diagnosis karsinoma sel skuamosa rongga mulut, Gedung Bedah Pusat Terpadu (GBPT) RSU. Dr. Soetomo untuk melakukan biopsi operasi, Laboratorium Patobiologi di Gramik Fakultas Kedokteran Unair untuk penyimpanan jaringan segar dengan nitrogen cair dan pemeriksaan imunohistokimia. Pemeriksaan insitu hibridisasi dilakukan di laboratorium biomolekuler histologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada. Semua penderita yang memenuhi kriteria sebagai karsinoma sel skuamosa rongga mulut diikutsertakan dalam penelitian. Penderita kemudian dilakukan biopsi operasi oleh ahli bedah kanker. Semua penderita yang dilakukan biopsi operasi telah menandatangani lembar persetujuan (informedconcent). Unit analisis penelitian berupa jaringan hasil biopsi operasi dengan ukuran volume sampel minimal 1 × 1 × 1 mm. Kriteria sampel: 1) umur antara 30–70 tahun; 2) bangsa Indonesia suku Jawa; 3) tidak menderita tumor dan keganasan lain; 4) secara klinis tidak menderita infeksi dan kondisi umum baik; 5) penderita dari instalasi Bedah Onkologi Kepala Leher RSU Dr. Soetomo yang datang untuk pertama kali dengan diagnosa karsinoma sel skuamosa rongga mulut. Cara kerja: pengambilan spesimen biopsi kanker rongga mulut dilakukan di gedung Bedah Pusat Terpadu (GBPT) RSU Dr. Soetomo Surabaya, oleh tim dokter bedah kepala dan leher yang diberi wewenang membantu penelitian. Hasil biopsi segera dimasukkan ke dalam nitrogen cair dengan suhu -170° C dan menunggu proses pemeriksaan. Pewarnaan imunohistokimia: 1) spesimen biopsi mukosa rongga mulut setelah difiksasi dengan buffer formalin selanjutnya dilakukan dehidrasi dan pembuatan blok parafin menggunakan metode baku. Selanjutnya disiapkan kaca obyek yang telah dilapisi poli L lisin, pemotongan blok parafin menggunakan mikrotom dengan ketebalan 5 μm, potongan jaringan ditebarkan atau diapungkan pada permukaan bak pemanas berisi air hangat, selanjutnya jaringan yang telah menempel pada slide dilakukan deparafinisasi dan sediaan siap untuk dilakukan pewarnaan; 2) pewarnaan dilakukan dengan menggunakan antibodi monoklonal LMP-1 dan EBNA-1 dengan teknik Avidin Biotin Complex (Novo Castra Biotin System), bertujuan supaya hasil pewarnaan menjadi lebih kuat dan jelas karena telah teramplifikasi. Teknik insitu hibridisasi sesuai dengan metode yang dipublikasikan oleh DAKO, untuk menganalisis RNA. Teknik produk DAKO yaitu menggunakan probe peptida nucleic acid (PNA) EBV-RNA (EBER) yang telah dicoba dengan jaringan atau sel yang berisi EBV, CMV, HHV, HSV, VZV, HBV namun hanya positif pada jaringan yang terinfeksi EBV. Pembuatan slide preparat berasal dari jaringan segar, dicelupkan dalam cryomatix, kemudian dilakukan potong beku setebal 5 μm. Teknik ini didasarkan pada pembentukan dupleks antara dua untai asam nukleat yang komplementer, kemudian terjadi pasangan secara tepat antara dua untai DNA RNA yang komplementer. Ada 3 unsur yang penting yaitu: DNA pelacak, DNA target dan deteksi signal. Langkah kerja: 1) denaturasi fragmen DNA sehingga menjadi rantai tunggal dengan memberi 150 μl proteinase K terlarut TBS; 2) kemudian dilakukan hibridisasi dengan memberi fluorescent conjugated PNA probe maka DNA pelacak mencari pasangannya yang komplementer, dengan memasukkan slide dalam inkubator temperatur 55° C selama 1,5 jam; 3) tahap berikutnya adalah deteksi signal, sebelumnya harus dicuci dengan astringent wash solution selama 25 menit pada suhu 55° C, deteksi signal ini dengan memberi enzim biotin- fosfatase (anti FITC/AP). AP ini yang akan mengubah substrat menjadi senyawa yang memancarkan sinar yang tidak larut dan tetap ada pada tempat DNA hibrid. Hasil hibridisasi ini dapat stabil selama 1 tahun pada suhu kamar, selain itu dapat dihitung perubahan warna atau sinar yang terpancar dalam beberapa jam. Teknik ini sangat peka oleh karena hanya bereaksi pada DNA target saja. Penilaian hasil pewarnaan secara mikroskopis dilakukan secara kualitatif dengan melihat intensitas penyerapan warna, serta secara kuantitatif dengan menghitung jumlah sel yang positif menyerap warna. Setelah pemeriksaan mikroskopis, selanjutnya dilakukan pengambilan dokumentasi mikrofoto dengan kamera digital Pentax Optio 230 2.0 mega pixel, film Kodak Asa 200 dicetak pada kertas dengan pantulan cahaya minimal. 86 Maj. Ked. Gigi. (Dent. J.), Vol. 38. No. 2 April–Juni 2005: 84–87 Etik penelitian dilaksanakan sesuai dengan kaidah yang berlaku. Ethical clearance dari komisi etik yang memenuhi Declaration of Helsinski. HASIL Mengingat pengambilan sampel secara purposive maka semua kasus yang memenuhi kriteria diikutkan dalam penelitian. Didapatkan 25 kasus KSSRM yang teridiri 17 kasus terinfeksi EBV, 8 kasus tidak terinfeksi. Tabel 1. Perbedaan ekspresi LMP-1, EBER dan EBNA-1 pada karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang terinfeksi dan tidak terinfeksi Dari hasil penelitian terhadap 17 kasus karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang terinfeksi EBV. Ditemukan ekspresi gen latent membrane protein-1 (LMP-1) 28,28% (gambar 2), EBER (gambar 1) sebesar 46,47% dan EBV nuclear antigen-1 (EBNA-1) 25,26% (gambar 3), dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 2. Jumlah anggota sampel KSSRM dengan ekspresi gen EBV (LMP-1, EBER dan EBNA-1). Berdasarkan keragaman genetik EBV yang diekspresikan, tampak terdapat perbedaan kuantitatif ekspresi genetik tersebut. Dari 17 kasus di atas, sebanyak 5 kasus KSSRM diekspresikan 3 ragam ekspresi gen laten EBV baik LMP-1 maupun EBNA-1 dan EBER, 2 kasus diekspresikan LMP-1 saja, dan 2 kasus hanya dieskpresikan EBNA-1, sedangkan yang diekspresikan EBER sebanyak 4 kasus, 2 kasus diekspresikan dua gen laten yaitu LMP-1 dan EBER. Gambar 1. Sel kanker dengan insitu hybridization EBER, inti berwarna coklat kehitaman dan kecil (pembesaran 400 kali). Gambar 2. Sel kanker dengan ekspresi LMP-1, menggunakan monoclonal antibody LMP-1, pada membran inti berwarna coklat kehitaman (pembesaran 400 kali). Gambar 3. Sel kanker dengan ekspresi EBNA-1, menggunakan monoclonal antibody EBNA-1, pada inti berwarna coklat kehitaman (pembesaran 400 kali). 87Budhy: Ekspresi produk gen laten PEMBAHASAN Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan di Rumah Sakit Dr. Soetomo Surabaya yang merupakan sentra seluruh rumah sakit di Indonesia bagian Timur, ditemukan 3 ragam produk gen laten EBV yang diekspresikan yaitu LMP-1, EBER dan EBNA-1 pada KSSRM. Hal ini sesuai dengan pendapat Nicholson et al.6 bahwa LMP-1 dapat menyebabkan transformasi sel. Demikian pula laporan Gonzales et al.7 bahwa pada KSSRM penduduk Eropa ditemukan ekspresi LMP-1. Walaupun jumlah yang ditemukan di Eropa lebih banyak dibandingkan temuan peneliti kemungkinan berbagai faktor lain yang mempengaruhi. Ekspresi isolat EBV juga dipengaruhi oleh faktor ras genetik dan geografis.8 Ragam genetik EBV lain yang diekspresikan pada KSSRM yang ditemukan di RSU. Dr. Soetomo adalah EBV nuclear antigen-1 (EBNA-1). Dibandingkan dengan jumlah LMP-1, ternyata EBNA-1 lebih kecil diekspresikan pada KSSRM. Keadaan ini mendukung laporan terdahulu oleh Middeldorp et al.,1 bahwa EBNA-1 banyak terkait dengan keganasan karena dapat meningkatkan aktivitas faktor transkripsi, namun ekspresi gen ini sangat spesifik hanya terdapat pada jenis kanker tertentu saja. Mengingat hal itu, maka diduka KSSRM adalah salah satu jenis kanker yang dipergunakan oleh ekspresi EBNA-1. Dengan diketemukan ekspresi EBNA-1 pada KSSRM merupakan hal baru. Gen EBNA-1 ini menyandi faktor transaktivator yang dibutuhkan untuk replikasi DNA, selain itu dapat berikatan dengan RNA melalui regio pengulangan Gly- Ala. Keberadaan EBNA-1 secara laten akan mempertahankan hidup EBV. EBNA-1 juga akan mengaktifkan faktor transkripsi, baik untuk EBNA-1 sendiri maupun EBNA yang lain, seperti EBNA 2A, 2B.3 Pada penelitian ini didapatkan ekspresi EBER yang paling banyak dibanding gen laten lainnya. Hal ini dapat dimengerti bahwa EBER pada fase laten akan ditranskripsi dalam jumlah banyak yaitu 106–107 per sel. EBER mempunyai kemampuan mengaktifkan transkripsi terhadap genom virus yang lain yaitu, latent membran protein (LMP) dan EBV nuclear antigen (EBNA). Mengingat hal itu maka keberadaan EBER di dalam sel inang akan semakin meningkatkan aktivitas virus. Selain itu EBER berperan terhadap transkripsi dan menghambat apoptosis. Hal ini didukung oleh Komano and Takada9 bahwa ekspresi EBER meningkatkan ekspresi bcl-2. Peningkatan ekspresi bcl-2 ini akan menghambat pelepasan cytochrom-C sehingga tidak terjadi cascade caspase. Hal ini menyebabkan tidak terjadi apoptosis. Pada penelitian ini juga ditemukan kasus KSSRM dengan dua ragam genetik EBV yang diekspresikan secara bersama. Keadaan ini semakin memperkuat laporan sebelumnya bahwa genom EBV bila berada pada sel inang berbentuk latent episome terdiri dari beberapa ragam genetik yang akan diekspresikan. Keberadaan keragaman gen laten EBV tersebut akan menyebabkan proliferasi sel inang berlebihan. Hal ini memicu karsinogenesis dan mempercepat progresivitas. Karsinogenesis terjadi melalui berbagai tahapan atau multistep dan multi hits.10,11,12 Berbagai faktor penyebab yang kompleks juga merupakan hal yang perlu dikaji lebih jauh. Selain itu berbagai faktor genom regulator yang mengatur proses proliferasi sel dan apoptosis sangat penting peranan terhadap karsinogenesis. Mengingat hal tersebut maka perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mengetahui peran tiap ekspresi gen laten EBV terhadap gen regulator proliferasi dan apoptosis. Seperti onkogen, supresor gen, gen repair. Hal ini untuk membuktikan pendapat King10 bahwa karsinogenesis terjadi karena ketidak seimbangan antara proliferasi dan apoptosis sel, serta keberadaan mutasi gen. Dapat disimpulkan bahwa pada karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang ditemukan di RSU. Dr. Soetomo yang merupakan sentra seluruh rumah sakit di Indonesia Timur diekspresikan tiga ragam gen EBV yaitu latent membrane protein-1 (LMP-1), EBV RNA (EBER) dan epstein barr nuclear antigen-1 (EBNA-1). Disarankan perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mengetahui peran ekspresi genetik EBV terhadap gen regulator proliferasi dan apoptosis sel kanker. DAFTAR PUSTAKA 1. Middeldorp JM, Antoinette ATP. Brink, Adrian JC van den Brule, Chris JLM Meiger. Pathogenic roles for epstein-barr virus (EBV) gene product in EBV– associated proliverative disorder. Oncol– hematology 2003; 45: 1–36. 2. Higa M, Kinjo T, Kamiyama K, Iwamasa T, Hamada T, Iyama K. Epstein-Barr Virus Subtype in EBV related oral squamous cell carcinoma in okinawa, a sub tropical island in southern Japan, compared with Kitakyusu and Kumamoto in mainland Japan. J clin Pathol 2002; 55: 414–23. 3. Hu, Li Fu. Nasopharyngeal carcinoma and epstein-barr virus. Microbiology and Tumor Biology Center, Karolinska Institute. Stokholm 1996; 15–25. 4. Aitken C, Senggupta SK, Aedes C, Moss DJ, Scully TB. Heterogeneity within the epstein-barr virus nuclear antigen 2 gene ini different strain of epstein-barr virus. J Gen Virol 1994; 75: 95–100. 5. Shimakage M, Horri K, Tempaku A, Kakudo K, Shirosaka T, Sasagawa T. Association of EBV with oral Cancers. Hum Pathol 2002 Jun; 33(6): 608–14. 6. Nicholson LJ, Hopwood P, Johannessen I, Salisbury JR, Codd J, Thorley-Lawson D, Crawford H. Epstein-barr virus latent membrane protein does inhibit differentiation and induces tumorigenicity of human epithelial cells. Oncogenesis 1997; 15: 275–83. 7. Gonzales, M, Gutirezz, Rodriquez, Avila R, Archilla R. Epstein- barr virus latent membrane protein-1 (LPM-1) expression in oral squamous cell carcinoma Laryngoscope 2002; 112(3): 482–87. 8. Degreef H and the Famciclovir Herpes Clinical Study Group. Famciclovir, a new oral antiherpes drugs: result of the first controlled clinical study demonstrating its efficacy and safety in the treatment of uncomplicated herpes zoster in immunocompetent patients. Int J Antimocrob Agent 1994; 4: 241–6. 9. Komano Jun, Kenzo Takada. Role of bcl-2 in epstein-barr virus- induced malignant conversion of Burkitt's Lymphoma cell line Akata. J of Virology 2001 Feb; 1561–4. 10. Mendelson J, Howley PM, Israel M, liotta LA. Tumor suppressor genes. In the molecular basis of cancer. Philadelphia: WB Saunders Co; 1995. p. 86–100. 11. King, Roger JB. Growth: a balance of proliferation, death and differentiation in cancer biology. 2nd ed. Prentice Hall; 2000. p. 146–70. 12. Putra ST. Biologi molekuler kedokteran. Edisi 1. Surabaya: Airlangga University; 1997. p. 59–89. << /ASCII85EncodePages false /AllowTransparency false /AutoPositionEPSFiles true /AutoRotatePages /All /Binding /Left /CalGrayProfile (Dot Gain 20%) /CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2) /sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CannotEmbedFontPolicy /Warning /CompatibilityLevel 1.4 /CompressObjects /Tags /CompressPages true /ConvertImagesToIndexed true /PassThroughJPEGImages true /CreateJDFFile false /CreateJobTicket false /DefaultRenderingIntent /Default /DetectBlends true /DetectCurves 0.0000 /ColorConversionStrategy /LeaveColorUnchanged /DoThumbnails false /EmbedAllFonts true /EmbedOpenType false /ParseICCProfilesInComments true /EmbedJobOptions true /DSCReportingLevel 0 /EmitDSCWarnings false /EndPage -1 /ImageMemory 1048576 /LockDistillerParams false /MaxSubsetPct 100 /Optimize true /OPM 1 /ParseDSCComments true /ParseDSCCommentsForDocInfo true /PreserveCopyPage true /PreserveDICMYKValues true /PreserveEPSInfo true /PreserveFlatness true /PreserveHalftoneInfo false /PreserveOPIComments false /PreserveOverprintSettings true /StartPage 1 /SubsetFonts true /TransferFunctionInfo /Apply /UCRandBGInfo /Preserve /UsePrologue false /ColorSettingsFile () /AlwaysEmbed [ true ] /NeverEmbed [ true ] /AntiAliasColorImages false /CropColorImages true /ColorImageMinResolution 300 /ColorImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleColorImages true /ColorImageDownsampleType /Bicubic /ColorImageResolution 300 /ColorImageDepth -1 /ColorImageMinDownsampleDepth 1 /ColorImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeColorImages true /ColorImageFilter /DCTEncode /AutoFilterColorImages true /ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG /ColorACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /ColorImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000ColorACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000ColorImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasGrayImages false /CropGrayImages true /GrayImageMinResolution 300 /GrayImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleGrayImages true /GrayImageDownsampleType /Bicubic /GrayImageResolution 300 /GrayImageDepth -1 /GrayImageMinDownsampleDepth 2 /GrayImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeGrayImages true /GrayImageFilter /DCTEncode /AutoFilterGrayImages true /GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG /GrayACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /GrayImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000GrayACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000GrayImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasMonoImages false /CropMonoImages true /MonoImageMinResolution 1200 /MonoImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleMonoImages true /MonoImageDownsampleType /Bicubic /MonoImageResolution 1200 /MonoImageDepth -1 /MonoImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeMonoImages true /MonoImageFilter /CCITTFaxEncode /MonoImageDict << /K -1 >> /AllowPSXObjects false /CheckCompliance [ /None ] /PDFX1aCheck false /PDFX3Check false /PDFXCompliantPDFOnly false /PDFXNoTrimBoxError true /PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXSetBleedBoxToMediaBox true /PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXOutputIntentProfile () /PDFXOutputConditionIdentifier () /PDFXOutputCondition () /PDFXRegistryName () /PDFXTrapped /False /Description << /CHS /CHT /DAN /DEU /ESP /FRA /ITA /JPN /KOR /NLD (Gebruik deze instellingen om Adobe PDF-documenten te maken voor kwaliteitsafdrukken op desktopprinters en proofers. De gemaakte PDF-documenten kunnen worden geopend met Acrobat en Adobe Reader 5.0 en hoger.) /NOR /PTB /SUO /SVE /ENU (Use these settings to create Adobe PDF documents for quality printing on desktop printers and proofers. Created PDF documents can be opened with Acrobat and Adobe Reader 5.0 and later.) >> /Namespace [ (Adobe) (Common) (1.0) ] /OtherNamespaces [ << /AsReaderSpreads false /CropImagesToFrames true /ErrorControl /WarnAndContinue /FlattenerIgnoreSpreadOverrides false /IncludeGuidesGrids false /IncludeNonPrinting false /IncludeSlug false /Namespace [ (Adobe) (InDesign) (4.0) ] /OmitPlacedBitmaps false /OmitPlacedEPS false /OmitPlacedPDF false /SimulateOverprint /Legacy >> << /AddBleedMarks false /AddColorBars false /AddCropMarks false /AddPageInfo false /AddRegMarks false /ConvertColors /NoConversion /DestinationProfileName () /DestinationProfileSelector /NA /Downsample16BitImages true /FlattenerPreset << /PresetSelector /MediumResolution >> /FormElements false /GenerateStructure true /IncludeBookmarks false /IncludeHyperlinks false /IncludeInteractive false /IncludeLayers false /IncludeProfiles true /MultimediaHandling /UseObjectSettings /Namespace [ (Adobe) (CreativeSuite) (2.0) ] /PDFXOutputIntentProfileSelector /NA /PreserveEditing true /UntaggedCMYKHandling /LeaveUntagged /UntaggedRGBHandling /LeaveUntagged /UseDocumentBleed false >> ] >> setdistillerparams << /HWResolution [2400 2400] /PageSize [612.000 792.000] >> setpagedevice