61Eclética Química, 37, 61-67, 2012. dos fármacos disponíveis no arsenal terapêutico para o tratamento dessa doença estimulam o desenvolvimen- to de novas formas de administração de medicamentos que facilitem a adesão ao tratamento dessa doença, bem como promovam uma menor toxicidade dos mesmos. A volatilidade e a baixa hidrossolubilidade dessa sub- stância estimulam o desenvolvimento de sistemas de liberação modificada deste ativo na forma de sistemas matriciais poliméricos. Um polímero bastante utilizado na literatura científica para veiculação de fármacos é a quitosana.10 Esta substância é a forma desacetilada da quitina, que é o segundo polímero mais abundante na natureza, por isso é uma fonte renovável e de baixo custo, tendo grande importância econômica e ambiental.11 É um polímero atóxico, biocompatível e biodegradável, características desejáveis e necessárias para veiculação de fármacos, sendo utilizada em diversas formulações farmacêuticas como pós, comprimidos, emulsões e géis, além de ser utilizado em imobilizações enzimáticas.12-14 Nosso grupo de pesquisa desenvolveu formu- lações na forma de filmes, utilizando a quitosana como INTRODUÇÃO O nerolidol é um sesquisterpeno acíclico (Fig- ura 1) de origem natural encontrado em muitos óleos voláteis de plantas como Cymbopogon citratus (DC) Stapf. (capim-limão), Lavandula officinalis Chaix (al- fazema) e Jasminum sp. (jasmim).1 É um óleo amarelo claro com aroma de flores com reminiscências de rosa e maçã. É utilizado em perfumes, xampus, sabonetes e outros produtos de higiene pessoal, bem como em pro- dutos não cosméticos de limpeza, com um consumo mundial de 10-100 toneladas/ano.2 O nerolidol possui atividade antiúlcera, antimicromiana, anticancerígena e tem atividade biocida para diferentes patógenos, inclu- sive protozoários.3-7.Além disso, é utilizado como agen- te promotor de absorção de fármacos na pele, como por exemplo anti-inflamatórios como os cortiscoteróides e o dicofenaco de sódio e de anti-hipertensivos como o hidrocloridrato de verapamil.8 A utilização do nerolidol como fármaco no tratamento da leishmaniose foi recentemente estuda- da.9 A dificuldade relacionada a toxicidade da maioria This work describes the development and validation of analytical method to assay nerolidol in a hydrophilic matrix of quitosan by UV/visible spectroscopy. The method is based on the formation of purple derivative between nero- lidol and vanillin. The validated method was linear (2.5 - 50 mg mL-1 , concentration range, r > 0.99), precise (RSD 0.44% for repeatability and 0.32% for intermediate precision), accurate (100.04% recovery), robust and specific. Detection and quantitation limits were 0.74 mg mL-1 and 2.26 mg mL-1, respectively. The method is simple and fast and it was applied successfully. Alternatively, the described method may be applied for the analysis of alcohols and unsaturated lipids. Keywords: nerolidol; quitosan; spectrometric method for alcohols and lipids. DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO ESPEC- TROFOTOMÉTRICO PARA QUANTIFICAÇÃO DE NEROLIDOL EM UM DISPOSITIVO POLIMÉRICO DE LIBERAÇÃO PROLONGADA, APÓS DERIVATIZAÇÃO COM VANILINA Tatiana Gomes Ribeiro1, Juçara Ribeiro Franca1, André Mesquita Marques2, Maria Auxiliadora Coelho Kaplan2, André Augusto Gomes Faraco1 e Rachel Oliveira Castilho1,* 1UFMG - Departamento de Produtos Farmacêuticos, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais. Avenida Antônio Carlos, 6627, Pampulha, 31270-901 Belo Horizonte - MG, Brasil 2UFRJ - Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Bloco H, Ci- dade Universitária, 21941-590 Rio de Janeiro – RJ, Brasil 62Eclética Química, 37, 61-67, 2012. A formulação utilizada foi um dispositivo po- limérico de liberação prolongada, cuja matriz hidrofíli- ca é a quitosana e o fármaco é o nerolidol (mistura cis- trans, grau de pureza 98%) ambos da Sigma-Aldrich®. Para o estudo dos interferentes foram empregados os excipientes talco, amido e quitosana, os quais foram utilizados para a produção do dispositivo polimérico. A solução tampão foi produzida através de uma mistura dos reagentes difosfato e monofosfato de sódio em água destilada com um pH 7,4, sendo denominado doravante tampão PBS. Todos os reagentes utilizados foram de grau P.A. Equipamentos As medidas espectrométricas foram realiza- das no espectrômetro UV/visível Shimadzu, modelo 160 A, fabricado no Japão. Para o estudo da robustez e da precisão intermediária foi utilizado o espec- trômetro Hitachi, modelo UV-2900. Para a agitação das amostras foi utilizado o aparelho de Ultrassom Unique, modelo Ultra Cleaner. Para o aquecimento das amostras foi utilizado o banho Maria Fanem. As massas foram medidas em balança digital analítica Sartorius, modelo BP 2215 e os volumes em pipetas automáticas calibradas HTL. Desenvolvimento do método Preparo do reagente Foram adicionados 5 mg de vanilina em 1 mL de ácido sulfúrico 96%. O reagente foi armazenado em frasco âmbar. Estabilidade do reagente Para a avaliação do tempo de estabilidade do reagente, foram preparados 250 mL da solução reagen- te. O reagente previamente preparado (1 mL) foi adi- cionado a 1 mL da solução de nerolidol (25,0 mg mL-1) em tampão PBS. A mistura foi agitada e submetida a aquecimento de 50 ºC por 10 min em banho maria. A medida de absorção no espectrofotômetro foi realizada imediatamente em l 542 nm. O branco foi feito, empre- gando-se 1 mL de tampão PBS com 1 mL do reagente, seguindo-se o mesmo procedimento da solução amos- tra. Repetiu-se esse procedimento de dez em dez minu- tos durante quatro horas. matriz polimérica, para veicular esse princípio ativo e realizar testes de atividade leishmanicida in vitro e in vivo. A forma farmacêutica de filmes contendo ner- olidol não se encontra inscrita, até o presente momento, nos compêndios oficiais, não havendo inclusive méto- dos de quantificação na literatura desse princípio ativo em formulações. Há descrições da análise do nerolidol em diversos óleos essenciais por cromatografia gaso- sa acoplada à espectroscopia de massas (CG/MS)15,16 e cromatorafia líquida de alta eficiência (CLAE).17 A cromatografia gasosa (detecção por ion- ização de chama) e a cromatografia gasosa acoplada à espectroscopia de massas são as técnicas mais indica- das para análises quantitativas e qualitativas de substân- cias lipofílicas, como os óleos voláteis e seus constitu- intes isoladamente.18,19 Trabalhos recentes demonstram análise de óleos essenciais por CLAE e detecção em ar- ranjo de diodos (DAD).17,20 Esses métodos são sensíveis o suficiente para a determinação de pequenas quanti- dades de amostra, entretanto, muitas vezes, não são sim- ples, rápidos e de baixo custo para serem adotados em análises de rotina. Tendo em vista o grande número de métodos espectrofotométricos no UV/visível utilizados, devido à simplicidade, economia, precisão, robustez e rapidez dessa técnica,21 o presente trabalho teve como objetivo desenvolver e validar um método analítico por espectro- fotometria no UV/visível, baseado nas reações de Ko- marowsky22 e da sulfo-fosfo-vanilina,23,24 para quantifi- cação do nerolidol em filmes poliméricos de quitosana de liberação prolongada, aplicando-o para os ensaios de liberação in vitro das formulações desenvolvidas. Além disso, esse método tem potencialidade de aplicação na análise de álcoois e lipídeos não saturados. Figura 1 PARTE EXPERIMENTAL Reagentes OH OHA B 63Eclética Química, 37, 61-67, 2012. plando concentrações de 2,5; 5; 10; 15, 25, 50 mg mL-1. Foi adicionado a solução de nerolidol em tampão PBS a ser quantificada, 1 mL da solução reagente. A mis- tura foi agitada e submetida a aquecimento de 50 ºC por 10 min em banho maria. Foi realizada a medida de absorção no espectrofotômetro em l 542 nm. O branco foi feito, empregando-se 1 mL de tampão PBS com 1 mL do reagente, seguindo-se o mesmo procedimento da solução amostra. A equação da reta foi determinada at- ravés do estudo de regressão linear. Foram feitas duas curvas analíticas em dias diferentes. Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) Foram calculados a partir do desvio padrão do intercepto de b (d) e do coeficiente angular (s) da curva analítica de calibração,26 através das equações 1 e 2, respectivamente: LD = 3,3 d (1) S LQ = 10 d (2) S Precisão A precisão intra-ensaio (repetibilidade) foi avaliada através da análise de seis soluções de amostra (25 mg mL-1) no mesmo dia e com o mesmo analista. A precisão intermediária foi determinada pela análise de seis medidas de soluções na mesma concentração (25 mg mL-1) em dias diferentes e em equipamento difer- ente, e então feita à análise estatística (DPR) dos resul- tados obtidos nos dois dias (n = 12). Exatidão Esse parâmetro foi determinado por intermédio da adição da solução padrão de nerolidol a uma mistura dos componentes da formulação. Quantidades conheci- das do padrão nerolidol foram adicionadas ao disposi- tivo polimérico placebo, de modo a obter soluções com as concentrações baixa, média e alta: 17,5; 25 e 32,5 mg mL-1, respectivamente 70%, 100% e 130% da con- centração de trabalho, com 3 réplicas cada. Posterior- mente o reagente foi adicionado. A mistura foi agitada e submetida a aquecimento (50 ºC) por 10 min em banho maria. Foi realizada a medida da leitura de absorção no Validação do método O método analítico foi validado de acordo com as especificações recomendadas pela Resolução RE nº 899 de 29 de maio de 2003 da Anvisa25 e pelo Guia ICH Q2B.26 Os parâmetros de validação avaliados foram: es- pecificidade, linearidade, limites de detecção e quanti- ficação, precisão intra-corrida (repetibilidade), precisão inter-corrida (intermediária), exatidão e robustez. Preparo da solução de trabalho Foram pipetados, exatamente, 29,15 mL de nerolidol para balão volumétrico de 250 mL e foram adicionados 230 mL de tampão PBS. Submeteu-se ao ultrasom por dez minutos e completou-se o volume com o mesmo solvente, obtendo-se solução a 100 mg mL-1. A partir dessa solução foram preparadas amostras com diferentes concentrações. Preparo da solução amostra O preparo da solução amostra foi feito através da adição da solução de trabalho do nerolidol de con- centração conhecida em tampão PBS a uma formulação placebo. Foi adicionado o reagente na proporção de 1:1. A mistura foi agitada e submetida a aquecimento de 50 ºC por 10 min em banho maria. Foi realizada imediat- amente a medida de absorção no espectrofotômetro no comprimento de onda de 542 nm. O branco foi feito, empregando-se a formulação placebo, sem o nerolidol, com o reagente, seguindo-se o mesmo procedimento da solução amostra. Especificidade A especificidade do método foi avaliada através de análises comparativas entre as formulações sem ner- olidol (placebo) e as contendo nerolidol. Adicionou-se a cada formulação 1 mL do reagente, seguido de 1 mL do tampão. A mistura foi agitada e submetida a aquecimen- to de 50 ºC por 10 min em banho maria. Foi realizada a medida de absorção no espectrofotômetro em l 542 nm. Espectros de absorção na região UV/visível foram traçados na faixa de l 200 a 900 nm. Linearidade Foi verificada através da construção de uma curva analítica de calibração em quintuplicata, contem- 64Eclética Química, 37, 61-67, 2012. co da hidroxila do nerolidol no carbono carbonílico da vanilina (substância 4); (c) prototropismo, seguido da perda de água, dando origem a substância (6) estabili- zada por ressonância e com absorção em torno de l 542 nm. Uma proposta alternativa que explicaria o fenôme- no químico é baseada na reação de Knight24 em que uma sequência de dois passos são fundamentais (Figura 3): (a) adição eletrofílica do próton, proveniente do meio ácido, na ligação dupla do nerolidol, formando um car- bocátion (substância 7); (b) reação do carbocátion com a vanilina, dando origem a substância (6). Figura 2 Figura 3 No desenvolvimento do método foram avali- ados várias proporções dos reagentes, uma mistura de vanilina e ácido sulfúrico, e o nerolidol, otendo-se uma proporção de 1:1 de reagente e solução aquosa do ner- olidol. Além disso, avaliou-se-também diferentes tem- peraturas de aquecimento, concluindo-se que a melhor para que a reação de derivatização ocorresse de forma espectrofotômetro em l 542 nm. O branco foi feito em- pregando-se a formulação placebo sem o nerolidol, se- guindo-se o mesmo procedimento da solução amostra. A exatidão foi expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente: 100 teóricaãoConcentraç alexperimentmédia ãoConcentraçExatidão ×= (3) Robustez As condições analíticas deliberadamente varia- das para avaliação da robustez foram: variação da tem- peratura de aquecimento da reação (49 °C, 50 °C e 51 °C), variação do pH da solução de nerolidol ( pH 7,3; 7,4 e 7,5) e equipamentos diferentes (Shimadzu e Hi- tachi).25 A concentração do padrão de trabalho de ner- olidol utilizada foi de 25 mg mL-1 e cada condição foi avaliada com um n = 6. Análise estatística A análise estatística dos dados foi realizada por ANOVA, com resultados considerados significativos quando a probabilidade é inferior a 5% (p < 0,05), teste t de Student e teste de Tukey com nível de significância a = 0,05. Os oultliers, no estudo de estabilidade do re- agente, foram analisados através de boxplot com ajuda do programa Minitab. RESULTADOS E DISCUSSÃO Desenvolvimento e otimização do método O nerolidol é um álcool terciário, volátil, com cadeia carbônica de quinze átomos e três insaturações não conjugadas (Figura 1). Explorando-se essas carac- terísticas químicas buscou-se um método para quantifi- car o nerolidol em baixas concentrações de forma ráp- ida, simples, precisa, e barata e para isso propôs-se um método espectrofotométrico no UV/visível utilizando a derivatização do nerolidol com a vanilina em meio áci- do. Foram feitas também duas propostas mecanis- ticas para explicar as bases químicas do novo método. Na primeira proposta (Figura 2) a reação pode ser es- quematizada em três passos: (a) protonação do grupo aldeído da vanilina (substância 2); (b) ataque nucleofíli- OH OCH3 H O H+ OH OCH3 H O H 1 2 ROH 4 H OH OCH3 H O H O R 5 O OCH3 H O H O R H H 6 O OCH3 H O R R = HO 3 H2O, H+ 3 HO H+ HO 7 1 OH OCH3 H O O OCH3 H O OH H 8 O OCH3 O OH 6 H+ 65Eclética Química, 37, 61-67, 2012. O método demonstrou ser sensível a baixas concentrações, tendo como valor de limite de detecção 0,74 mg mL-1 e limite de quantificação 2,26 mg mL-1. Os resultados de repetibilidade e precisão in- termediária foram expressos em termos de desvio pa- drão relativos (DPR) (Tabela 2). Neste ensaio foram utilizadas seis determinações a 100% da concentração de trabalho e observada à diferença entre as repetições. A repetibilidade e a precisão intermediária apresentam DPR de 0,44 e 0,32, respectivamente. Os valores obti- dos são inferiores a 5%, limite máximo aceito para esse parâmetro.25 A análise ANOVA demonstrou que não há diferenças estatísticas entre as análises dos diferentes períodos para p = 0,05. Esses resultados de doseamento de nerolidol obtidos com o método proposto apresentam elevado grau de concordância. Tabela 2. Resultados da repetibilidade e precisão intermediária para o método de doseamento do nerolidol em tampão PBS pH = 7,4 por espectrofotometria A porcentagem média para a exatidão foi de 100,04% e o DPR de 0,65% (Tabela 3). Através do teste t de Student, pode-se afirmar que o valor encontrado é estatisticamente igual a 100% com significância de p = 0,05. Além disso, esse resultado demonstra que não há interferências dos excipientes da forma farmacêutica no doseamento do produto final. Portanto, o método é exato. A avaliação da robustez de um método per- rápida e que o nerolidol, uma substância volátil, não fosse perdido era um aquecimento a 50 °C por 10 min. Após o desenvolvimento do método, buscou-se validá-lo, a fim de que o novo método estivesse adequa- do aos ensaios propostos. Para isso, utilizou-se como formulação modelo o nerolidol em um dispositivo po- limérico cuja matriz polimérica é a quitosana (matriz hidrofílica). Estabilidade do reagente A estabilidade do reagente foi avaliada durante 4 horas com leituras sequenciais de dez em dez minu- tos. Analisou-se os resultados nesse intervalo de tempo através de boxplott do programa Minitab e não se ob- servou oultlier. Esse fato demonstrou a estabilidade no intervalo de tempo de 4 horas do reagente proposto. Validação do método Para a especificidade espectros de absorção na região UV/visível da solução amostra de nerolidol (25,0 mg mL-1; 100% da concentração de trabalho) e da for- mulação placebo, em tampão PBS, foram traçados na faixa de l 200 a 900 nm. Os espectros de absorção obti- dos demonstraram que os excipientes presentes na for- mulação não apresentam absortividade em l 542 nm (≤ 0,001A), sendo o método específico para o doseamento do nerolidol nesse comprimento de onda. Para a linearidade foram feitas curvas de cal- ibração em dias diferente. As equações da reta, calcu- ladas por regressão linear, pelo método dos mínimos quadrados, podem ser visualizadas na Tabela 1. Os co- eficientes de correlação foram superiores a 0,99. Os re- sultados da análise estatística indicam ajuste adequado dos dados aos modelos de regressão linear, sendo méto- do linear na faixa de concentração de 2.5 - 50 mg mL-1. Tabela 1. Dados referentes à linearidade para o método de doseamento do nerolidol em tampão PBS pH = 7,4 por espectrofotometria no visível 66Eclética Química, 37, 61-67, 2012. Tabela 4. Resultados da robustez para o método de doseamento do nerolidol em tampão PBS pH = 7,4 por espectrofotometria no visível CONCLUSÃO Neste trabalho foi possível desenvolver um método espectrofotométrico na região do UV/visível para o doseamento do nerolidol em uma matriz hi- drofílca de quitosana por derivatização do fármaco com a vanilina em meio ácido. O método desenvolvido mostrou-se simples, preciso, rápido e sensível a baixas concentrações. A val- idação comprovou que método é seletivo e robusto com relação à mudança de temperatura, pH e equipamento, podendo ser utilizado no controle de qualidade dessa formulação e de outras formulações que usem como fár- maco o nerolidol. Alternativamente, o método descrito pode ser aplicado à análise de álcoois ou lipídeos não saturados. AGRADECIMENTOS A FAPEMIG e ao CNPq pelo apoio financeiro. REFERÊNCIAS 1. Dewick M. P., Medicinal Natural Products – a Biosyn- thetic Approach, John mite identificar parâmetros críticos do procedimen- to analítico que possam influenciar negativamente na sua exatidão e precisão. Uma vez identificados, esses parâmetros devem ser controlados e precauções devem ser incluídas no procedimento analítico. Tabela 3. Resultados da exatidão para o método de doseamento do nerolidol em tampão PBS pH = 7,4 por espectrofotometria no visível Foram avaliadas pequenas e deliberadas variações na metodologia analítica: temperatura de aquecimento da reação, pH do PBS utilizado para dis- solução da formulação com nerolidol e leituras de ab- sorbância em diferentes equipamentos. Os dados exper- imentais obtidos indicaram que estas modificações não influenciaram significativamente os resultados (Tabela 4). Os dados ajustaram-se adequadamente ao modelo ANOVA, teste de Tukey, com significância de p = 0,05. A partir dos resultados, verificou-se não haver diferença estatisticamente significativa entre os resultados do do- seamento obtido em cada uma das condições avaliadas. 67Eclética Química, 37, 61-67, 2012. dação de métodos analíticos e bioanalíticos. Ministério da Saúde: Brasil, 2003. 26. ICH - International Conference on Harmonization of Technical Requirements for registration of Pharma- ceutical for Human Use: Q2B – validation of analytical procedures: text and methodology, 1996. Wiley & Sons Ltd, United Kingdom, 2009. 2. D. McGinty, C. S. Letizia, A. M., Food Chem. Toxicol. 48, (2010) S43. 3. F. C. Klopell, M. Lemos, J. P. Sousa, E. Comunello, E. L. Maistro, J. K. Bastos, S. F. de Andrade, Z. Natur- forsch. 62, (2007) 537. 4. S. Lee, J. Han, G. Lee, M. Park, I. Choi, K. Na, E. Jeung, Model. Biol. Pharm. Bull. 30, (2007) 184. 5. L. W. Wattenberg, Carcinogenesis 12, (1991) 151. 6. C. S. de Macedo, M. L. Uhrig, E. A. Kimura, A. M. Katzin, FEMS Microbiol. Lett. 207, (2002) 13. 7. G. H. 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