www.scielo.br/eq Volume 35, número 2, 2010 51Ecl. Quím., São Paulo, 35 - 2: 51 - 61, 2010 Artigo/Article deSenVolVimento de um método analítiCo rápido e efiCiente para a determinação de CortiCoSteróideS plaSmátiCoS por injeção direta em Coluna CromatográfiCa iSrp-C18 por Clae. E.A. Toledo-Pinto1, M.L. Menezes1, O.C.M. Pereira2 1Departamento de Química, Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista, Av. Edmundo Carrijo Coube nº 14-01, CEP 17033-360, Bauru, São Paulo, Brasil. 2Departamento de Farmacologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Distrito de Rubião Jr., s/nº, CEP 18618-000, Botucatu, São Paulo, Brasil. elianetol@hotmail.com resumo: O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um método analítico simples, rápido e eficiente para a determinação de corticosteróides (cortisona, corticosterona, acetato de hidrocortisona e acetato de dexametasona) em amostras sangüíneas de ratos empre- gando um sistema isocrático de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção ultravioleta. O método envolveu a injeção direta da amostra sangüínea em uma coluna cromato- gráfica com superfície interna de fase reversa (ISRP-C18), empregando a fase móvel composta por tampão fosfato pH 4,0: acetonitrila (65:35 v/v). A detecção dos analitos foi obtida, através de um detector de ultravioleta de comprimento de onda variável (Varian Modelo 2550) ajustado em 240 nm e um integrador SP 4400 Chromaject (Varian Associates, Inc, Sunnyvale, CA, USA). A extração do analito resultou em valores de recuperação entre 90% e 108%, e coeficiente de variação entre 1,1% a 2,5%. Os limites de detecção e quantificação do método foram de 0,02 e 0,04 µg mL-1, respectivamente. Assim, o método analítico proposto possibilitou a injeção direta (on-line) da amostra sem tratamento prévio apresentando também várias vantagens, tais como: rapidez, exatidão, precisão e especificidade. palavras-chave: corticosteróides, amostra biológica, coluna ISRP-C18, CLAE. introdução Corticosteróides Os corticosteróides também chamados de adrenocorticosteróides são hormônios de nature- za esteroídica produzidos na porção cortical das glândulas adrenais, que estão localizados exata- mente no pólo superior de ambos os rins [1]. Estes hormônios são sintetizados a partir do colesterol e constituem três famílias: os glicocorticóides, os mineralocorticóides e os andrógenos adrenais. Os glicocorticóides atuam primariamente no metabo- lismo das proteínas, carboidratos e lipídios, e os principais hormônios endógenos são o cortisol e a corticosterona, como exemplos de sintéticos: cor- tisona, prednisona, metilprednisona, dexametaso- na, entre outros [2]. Os mineralocorticóides atuam Ecl. Quím., São Paulo, 35 - 2: 51 - 61, 201052 Artigo Article quase exclusivamente em tecidos de troca iônica, reabsorvendo sódio e fluídos, excretando potássio e hidrogênio (equilíbrio eletrolítico), o principal hormônio endógeno é a aldosterona, entre os sin- téticos têm-se: 9 α-fluorocortisol e cortisona [3]. Os androgênios ou estrogênios atuam sobre as ca- racterísticas sexuais secundárias em seus órgãos específicos. Considerações sobre análise de corticosteróides Radioimunoensaio e ensaios com ligantes protéicos competitivos são freqüentemente usados como métodos de escolha para dosagem de cor- tisol em humanos. Embora estes métodos sejam muito sensíveis, não possuem alta especificidade. A necessidade de desenvolver uma metodologia mais rápida, precisa e específica para analisar cor- ticosteróides em amostras biológicas conduziu muitos pesquisadores a utilizar a cromatografia ou cromatografia líquida de alta eficiência. Usualmente para analisar corticosteróides, é necessário um pré-tratamento das amostras de urina incluindo hidrólises enzimáticas, e extração líquido-líquido (LLE) ou extração de fase sólida (SPE) [1, 4, 5, 6, 7]. Já a determinação de corti- costeróides em plasma por cromatografia líquida consiste em extração das proteínas e purificação dos analitos antes de injetá-los no sistema. Separação de hormônios esteróides por CLAE com detecção ultravioleta e fluorescência têm sido amplamente utilizados. Estes métodos permitem uma determinação bem específica dos corticosteróides tanto na urina como no plasma, providenciando um bom método para as análises [6]. Diferentes métodos de CLAE para separa- ção de compostos e misturas complexas de cor- ticosteróides utilizando convencionalmente fases móveis têm sido recentemente desenvolvidos e aplicados para amostras de urina, plasma e formu- lações farmacêuticas [4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11]. Em todos os métodos abordados constatou-se que hou- ve a necessidade de um pré-tratamento da amostra empregando a técnica de extração em fase sóli- da ou extração por solventes. Embora as técnicas off-line sejam mais seletivas e modernas, alguns problemas ainda persistem como, por exemplo: o tempo gasto no preparo das amostras, manuseio laborioso nesta etapa e os materiais empregados no desenvolvimento de um método, ou são des- cartáveis, ou têm tempo de vida curto. Assim, o uso de procedimentos on-line vem se destacando em decorrência de suas vantagens: eliminação dos erros humanos de manipulação, diminuição do tempo de assistência do analista durante a análi- se, minimização de perdas de analito, melhora na precisão e exatidão do método e segurança ofere- cida por esta técnica ao analista, uma vez que o manuseio de amostras perigosas ou infecciosas é reduzido [12, 13]. Os métodos supracitados não foram valida- dos corretamente, com exceção dos trabalhos de Marwah e cols. (2001), Cirimele e cols. (2000) e Hay e Morméde (1997) [4, 6, 8], fato importantís- simo em análises quantitativas e qualitativas por cromatografia e por outros métodos analíticos. O objetivo do presente trabalho foi desen- volver um método analítico simples, rápido e efi- ciente para a determinação de corticosteróides em amostras sangüíneas de ratos empregando coluna cromatográfica ISRP-C18 e análise por CLAE. materiaiS e métodoS reagentes Os padrões, cortisona, corticostero- na, acetato de dexametasona, acetato de hidrocortisona e albumina de soro huma- no foram adquiridos junto a Sigma - Al- drich Chemical Company (USA). O fos- fato monossódico 1-hidrato, acetonitrila, metanol (grau CLAE) e o dissulfito de sódio foram obtidos junto a Merck, Mer- ck KgaA (Darmsradt, Germany). A ace- tonitrila foi obtida da Carlo Erba (Milan, Italy). A água deionizada foi obtida a par- tir de um sistema de purificação Milli-Q, Ecl. Quím., São Paulo, 35 - 2: 51 - 61, 2010 53 Artigo Article adquirido da Millipore, (Millipore, Be- dford, MA, USA). As soluções-padrão foram preparadas efetuando-se a solubilização de 0,005 g de cada corticosteróide (cortisona, corticosterona, acetato de dexametasona e acetato de hidrocortisona) em 10 mL de metanol. A partir desta solução estoque (500 µg mL-1) foram realizadas diluições obtendo- se concentrações de corticosteróides para a cons- trução de curvas analíticas e determinação do li- mite de detecção. animais Foram utilizados ratos albinos adultos ma- chos, da variedade Wistar, com aproximadamente 90 dias de idade, pesando cerca de 300 gramas, fornecidos pelo Biotério Central da UNESP loca- lizado no Campus de Botucatu. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de ética em Expe- rimentação Animal do Instituto de Biociências da Unesp, Botucatu. Os animais permaneceram no Biotério do Departamento de Farmacologia do Instituto de Biociências da Unesp, por um período mínimo de 10 dias, sob condições controladas de alimenta- ção, temperatura, ruído e ciclo claro-escuro para aclimatação. Estes animais foram mantidos em gaiolas coletivas, contendo cinco animais por gaiola, com livre acesso à água e alimento. instrumentação Os experimentos cromatográficos foram re- alizados sob condições isocráticas em um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (Varian Modelo 2510), equipado com uma bomba recípro- ca, um detector de ultravioleta de comprimento de onda variável (Varian Modelo 2550) ajustado em 240 nm e um integrador SP 4400 Chromaject (Varian Associates, Inc, Sunnyvale, CA, USA). As amostras e as soluções-padrão foram injetadas em uma coluna ISRP-C18 (100 mm x 4,6 mm DI), com uma válvula manual de injeção, (Rheodyne 7125, Cotati, Ca, USA), ligada a uma alça de injeção de 100 µL. Condições cromatográficas A separação de corticosteróides foi realiza- da à temperatura de 25°C constante, com vazão da fase móvel ajustado em 0,85 mL min-1. A fase mó- vel ideal encontrada foi composta por uma mis- tura de tampão fosfato pH 4,0 e acetonitrila (65: 35 v/v). O tempo de estabilização do sistema de CLAE foi de aproximadamente 15 minutos antes do início dos procedimentos experimentais. métodos imobilização da albumina de soro humano in situ sobre a superfície da fase estacionária Si-C18 O método de imobilização das proteínas in situ empregado seguiu o protocolo de Menezes e cols. (1999) e Pompon e cols. (1992) [14, 15] par- tindo de uma coluna cromatográfica C18 (100 mm x 4,6 mm DI), Phenomenex - Luna 5 µm, avaliada comercialmente, adquirida junto a Labtron Co- mércio e Representações Ltda. A determinação dos teores de proteínas imobilizadas sobre a superfície das sílicas foi de- terminada pela injeção de plasma diluído (1:100) fortificado com corticosteróides [13, 16, 17, 18] nas concentrações de 0,15, 0,30, 0,60, 1,20 e 1,6 µg mL-1. avaliação da composição da fase móvel Para a seleção da melhor fase móvel foram otimizadas as condições cromatográficas de três fases na separação dos corticosteróides, tampão fosfato pH 4,0: acetonitrila nas proporções de 50: 50, 60: 40 e 65: 35 (v/v) com uma alça de 100 µL. Para a escolha adequada da fase móvel foram Ecl. Quím., São Paulo, 35 - 2: 51 - 61, 201054 Artigo Article realizados os cálculos para determinação dos pa- râmetros cromatográficos. avaliação da vazão Para a seleção da vazão adequada para a determinação de corticosteróides foram avalia- dos os seguintes intervalos 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95 e 1,0 mL min. Avaliação da coluna cromatográfica após a imo- bilização das proteínas (HSa) A partir da otimização das condições cro- matográficas foram determinados os parâmetros cromatográficos. A medida da eficiência da co- luna, baseada em pratos teóricos (N), bem como fator de capacidade (k), assimetria de pico a 10% (As 0,1), altura equivalente de pratos teóricos (H), seletividade (α), tempo de retenção (tR) e da reso- lução (Rs) foram obtidos a partir do cromatogra- ma ilustrado na figura 1. determinação dos corticosteróides A sensibilidade do equipamento em relação aos corticosteróides foi avaliada através da deter- minação do limite de detecção (LD) e do limite de quantificação (LQ), após a escolha da fase móvel adequada. Tais parâmetros foram determinados utilizando-se concentrações decrescentes de corti- costeróides (cortisona, corticosterona, acetato de dexametasona e acetato de hidrocortisona) varian- do de 0,01 µg mL-1 a 5 µg mL-1. A linearidade do detector foi avaliada con- siderando o Fator de Resposta que representa a ra- zão entre sinal-1 (S1) e concentração-1 (C1). preparação da curva analítica As soluções padrão de corticosteróides, contendo concentrações variando de 0,01 a 5,0 µg mL-1 foram utilizadas para a construção da curva analítica. Estas foram preparadas efetuando-se a diluição da solução estoque de corticosteróides preparada previamente. Estas amostras foram injetadas cinco vezes diretamente ao sistema de cromatografia líquida equipado com uma coluna cromatográfica ISRP-C18. Fortificação das amostras de plasma As amostras de plasmas foram diluídas em água destilada (1:100 v/v), com o intuito de as- segurar que os metabólitos e as proteínas fossem eluídas rapidamente da coluna cromatográfica. A essas amostras de plasmas diluídos foram adicio- nados dissulfito de sódio (0,01 g de dissulfito de sódio para cada 10 mL água) para evitar a decom- posição dos corticosteróides no plasma e também foram adicionadas quantidades conhecidas de cor- ticosteróides. As concentrações obtidas foram 0,1, 0,2, 0,4, 0,8 e 1,6 µg mL-1 para a curva padrão da fortificação e 0,15, 0,30, 0,60, 1,20 e 1,60 µg mL-1 para a determinação da fortificação em amostras de plasma. Utilizaram-se seis amostras de plasma de rato que foram injetadas diretamente no sistema CLAE equipado com uma coluna cromatográfica ISRP-C18. avaliação da recuperação de corticosteróides nas amostras de plasma Para avaliar o efeito da matriz biológica na calibração do método, amostras de plasma de rato foram fortificadas com as concentrações de 0,15, 0,30, 0,60, 1,20 e 1,60 µg mL-1 de corticos- teróides. Os experimentos de recuperação foram avaliados injetando-se cinco replicatas para cada concentração das amostras sangüíneas. Foram realizadas análises em branco (ma- triz isenta de fármacos) para cada amostra plas- mática. Verificou-se também o efeito do dissulfito de sódio nas amostras plasmáticas. estresse agudo induzido por natação Ecl. Quím., São Paulo, 35 - 2: 51 - 61, 2010 55 Artigo Article Os animais foram submetidos a uma única sessão de natação com duração de 5, 15, 30 ou 50 minutos. A natação foi efetuada em uma cuba de vidro (45 cm x 35 cm x 33 cm) contendo água à temperatura de 24 ºC [27]. Para garantir que os animais nadassem durante todo o período estipu- lado, cada animal teve em sua cauda um anel me- tálico pesando cerca de 2% do seu peso corporal. Imediatamente após a sessão de estresse, os ani- mais foram decapitados em guilhotina. Coleta e estocagem de sangue As amostras sangüíneas (5-6 mL) foram obtidas do tronco encefálico logo após a decapi- tação dos ratos em frascos heparinizados, sendo centrifugadas a 2.000 r.p.m., durante 20’ a 2°C, o plasma obtido foi estocado à -20°C. Os frascos contendo plasma foram acondicionados em um container (recipiente isotérmico com tº estável) para transportar do Departamento de Farmacolo- gia do Instituto de Biociências da Unesp de Botu- catu para o Departamento de Química da Faculda- de de Ciências da Unesp de Bauru. reSultadoS e diSCuSSão A fase móvel mais adequada para a separa- ção de corticosteróides foi composta por solução tampão fosfato pH 4,0 e acetonitrila (65: 35 v/v). De acordo com dados da literatura, a fase móvel composta por acetonitrila e água é muito comum para a determinação de corticosteróides em flui- dos biológicos [6, 9, 19], além de ser usada para controlar a seletividade e a separação de amostras no modo reverso de eluição [20]. Na tentativa de se buscar, a melhor resolu- ção para os corticosteróides foram realizados es- tudos quanto às proporções da fase móvel, assim empregou-se as seguintes: tampão fosfato pH 4,0: acetonitrila: 60: 40 (v/v) e 65: 35 (v/v). Para cada proporção das fases móveis foram efetuados os cálculos dos parâmetros cromatográficos e assim foi possível optar pela proporção 65: 35 (v/v), na qual apresentou uma excelente eficiência na sepa- ração dos corticosteróides e tempo de análise de 20 minutos, no máximo figura 1. Vale ressaltar que a amostra de plasma foi diluída 1: 100, para que se pudesse assegurar que os metabólitos e pequenas concentrações de pro- teínas fossem eluídos rapidamente da coluna cro- matográfica. A resolução mede a qualidade da separa- ção, que pode ser melhorada com a definição da vazão através da coluna no sistema cromatográ- fico. Desta maneira, a vazão foi avaliada em um intervalo de 0,70 a 1,0 mL min-1. Todas as vazões apresentaram uma boa resolução, entretanto a tí- tulo de tempo de análise e se tratando de fluido biológico, na qual a saída do plasma é em torno de dois minutos, optou-se pela vazão de 0,85 mL min-1. No decorrer da fase experimental observa- se que houve um pequeno aumento no tempo de retenção dos analitos (corticosteróides), fato que pode estar relacionado ao acúmulo de amostras plasmáticas injetados na coluna cromatográfica. O desempenho da coluna cromatográfi- ca Luna-Phenomenex ISRP-C18 - 5 µm (100 mm x 4,6 mm DI) foi avaliada em função dos parâ- metros apresentados na tabela 1 (tempos de re- tenção (tR), número de pratos teóricos (N), altura equivalente a um prato teórico (H), resolução (Rs), seletividade (α), fator de capacidade (k) e assime- tria de pico (As) dos diferentes corticosteróides), calculados a partir da figura 1. De acordo com os resultados obtidos pode-se constatar bom desem- penho cromatográfico, uma vez que a imobiliza- ção da HSA sobre a superfície externa das partí- culas esféricas da fase estacionária C18 auxiliou na obtenção de picos bem resolvidos e separação dos corticosteróides do plasma. Ecl. Quím., São Paulo, 35 - 2: 51 - 61, 201056 Artigo Article tabela 1. Parâmetros cromatográficos calculados para os corticosteróides, a partir do cromatograma ilus- trado na figura 1. analito tr (min) n H (mm) rs α K as Cortisona 3,18 1401 0,1 - 1,8 2,8 1 Corticosterona 5,04 880 0,1 4,1 1,5 5,1 1 ac. Hidrocortisona 7,29 1178 0,1 5 1,8 7,8 1 ac. dexametasona 12,48 863 0,1 9,4 - 14 1 13 figura 1. Cromatograma obtido após injeção de 100 L de plasma diluído 1: 100 v/v fortificado com uma solução de 0,60 g mL-1 de corticosteróides (1-cortisona, 2- corticosterona, 3-acetato de hidrocortisona e 4-acetato de dexametasona) empregando fase móvel composta por tampão fosfato pH 4,0: acetonitrila (65: 35 v/v), vazão de 0,85 mL min-1 e detecção a 240 nm. tabela 1. Parâmetros cromatográficos calculados para os corticosteróides, a partir do cromatograma ilustrado na figura 11. analito tr (min) n H (mm) rs �� K as Cortisona 3,18 1401 0,1 - 1,8 2,8 1 Corticosterona 5,04 880 0,1 4,1 1,5 5,1 1 ac. Hidrocortisona 7,29 1178 0,1 5 1,8 7,8 1 ac. dexametasona 12,48 863 0,1 9,4 - 14 1 0 5 10 15 figura 1. Cromatograma obtido após injeção de 100 µL de plasma diluído 1: 100 v/v fortificado com uma solução de 0,60 µg mL-1 de corticosteróides (1-cortisona, 2-corticosterona, 3-acetato de hidrocortisona e 4-acetato de dexametasona) empregando fase móvel composta por tampão fosfato pH 4,0: acetonitrila (65: 35 v/v), vazão de 0,85 mL min-1 e detecção a 240 nm. Ecl. Quím., São Paulo, 35 - 2: 51 - 61, 2010 57 Artigo Article Analisando as equações das retas obtidas (figura 2), observou-se que o modelo linear para a determinação de corticosteróides por CLAE com detector ultravioleta é adequado, já que os coeficientes de correlação foram 0,9991 para a cortisona, 0,9996 para a corticosterona e o acetato de dexametasona e 0,9993 para o acetato de hidrocortisona, como pode ser observado na tabela 2. Estes valores expressam a relação entre e as áreas dos picos cromatográficos nos intervalos utilizados (y) e as concentrações dos corticosteróides (x). A relação de x e y na curva é expressa como r2 (coeficiente de correlação), onde os valores ideais esperados são 1 e –1, ou seja, quanto mais próximo da unidade, maior a probabilidade de existir uma relação linear bem definida [21, 22]. Entretanto, a linearidade é melhor avaliada pelo coeficiente de variação (CV%) do fator de resposta (área/concentração), sendo que o CV deverá ser inferior a 5%. 14 figura 2. Curvas analíticas de acetato de cortisona, corticosterona, acetatos de dexametasona e hidrocortisona os parâmetros obtidos após a regressão linear. Valores obtidos após a injeção de 100 L da solução padrão de cada costicosteróide no sistema cromatográfico no intervalo de concentração de 0,02 a 5,00 g mL-1. * média de 5 replicatas para cada concentração. tabela 2. Equação da curva analítica dos corticosteróides. analito equação de regressão linear Coeficiente correlação Coeficiente variação Cortisona y = -314,61+37986,33.x 0,9991 2,5 Corticosterona y = 589,67+75210,15.x 0,9996 1,1 ac. Hidrocortisona y = -222,30+65160,41.x 0,9993 1,6 ac. dexametasona y = -368,16+85426,52.x 0,9996 1,4 x é expresso em g mL-1 e y é expresso em unidade de área. 0 1 2 3 4 5 0 50000 100000 150000 200000 B Data1B Á re a C or tis on a Concentração Cortisona (ug mL -1) 0 1 2 3 4 5 -50000 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 B Data1B Á re a C or tic os te ro na Concentração Corticosterona (ug mL -1) 0 1 2 3 4 5 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 B Data1B Á re a Ac . H id ro co rt is on a Concentração Ac. Hidrocortisona (ug mL-1) 0 1 2 3 4 5 0 100000 200000 300000 400000 500000 B Data1B Ár ea A c. D ex am et as on a Concentração Ac. Dexametasona (ug mL-1) figura 2. Curvas analíticas de acetato de cortisona, corticosterona, acetatos de dexametasona e hidrocor- tisona os parâmetros obtidos após a regressão linear. Valores obtidos após a injeção de 100 µL da solução padrão de cada costicosteróide no sistema cromatográfico no intervalo de concentração de 0,02 a 5,00 µg mL-1. * média de 5 replicatas para cada concentração. Ecl. Quím., São Paulo, 35 - 2: 51 - 61, 201058 Artigo Article tabela 2. Equação da curva analítica dos corticosteróides. analito equação de regressão linear Coeficiente correlação Coeficiente variação Cortisona y = -314,61+37986,33.x 0,9991 2,5 Corticosterona y = 589,67+75210,15.x 0,9996 1,1 ac. Hidrocortisona y = -222,30+65160,41.x 0,9993 1,6 ac. dexametasona y = -368,16+85426,52.x 0,9996 1,4 x é expresso em µg mL-1 e y é expresso em unidade de área. Diante dos resultados obtidos na figura 2 e tabela 2, pode observar que para todos os corti- costeróides o coeficiente de variação esteve abai- xo de 5% e o coeficiente de correlação (r) supe- riores a 0,999, indicando que há linearidade entre as concentrações (x) e as áreas (y) dos picos no intervalo utilizado [23, 24]. Com a aplicação da regressão linear con- cluiu-se que se pode trabalhar com concentrações de corticosteróides (0,02, 0,04, 0,08, 0,16, 0,31, 0,63, 1,0, 1,25, 2,50, 3,75, e 5,0 µg mL-1) nos ex- tremos da reta obtida e dentro da mesma com va- lores de coeficiente de variação aceitáveis. O procedimento de extração dos corticos- teróides foi realizado utilizando o plasma. Na di- luição das amostras de plasmas em água destila- da (1:100) foram adicionados dissulfito de sódio (0,01 g de dissulfito de sódio para cada 10 mL água), para evitar a decomposição dos corticos- teróides no plasma. O sal dissulfito de sódio atua como agente antioxidante, sendo muito utilizado na indústria alimentícia, como conservante de ali- mentos processados para prevenir o crescimento de bactérias tóxicas [25]. Sem a adição do dissul- fito de sódio junto à diluição do plasma observou- se que os corticosteróides eram decompostos. Outros métodos para evitar a decomposição dos corticosteróides foram utilizados como manter as amostras em gelo sob abrigo de luz. Acredita-se que alguma enzima presente no plasma estava de- compondo os corticosteróides adicionados. Vale ressaltar que o dissulfito de sódio não afetou a análise dos corticosteróides. Para a validação do método foi avaliada a seletividade e a recuperação. Para avaliar a sele- tividade do método proposto foram comparados os cromatogramas das amostras testemunhas e das amostras fortificadas. De acordo com os resulta- dos obtidos nenhum interferente elui no tempo de retenção das substâncias de interesse. O método proposto para este estudo conseguiu atingir 0,02 µg mL-1 e 0,04 µg mL-1 para os limites de detec- ção e para o de quantificação, respectivamente. Nossos resultados mostram-se melhores que os apresentados por [26], onde o limite de detecção e quantificação foram de 0,1 µg mL-1 e 0,2 µg mL-1, respectivamente.Vale ressaltar que a metodologia proposta no presente trabalho não necessita do pré-tratamento da amostra, fato que pode ser im- prescindível em análises de substâncias bioativas presentes em fluidos biológicos. Os métodos que empregam raidioimuno- ensaio para a determinação de corticosteróides em fluidos biológicos chegam a detectar níveis na ordem de ng mL-1, entretanto não possuem especificidade quando comparados aos métodos cromatográficos [11, 27, 28, 29, 30]. Deste modo, o método proposto pode ser uma alternativa na determinação de corticosteróides em laboratórios de análises clínicas, além de ser seguro para as pessoas que o manipulam já que não se trabalha com radioatividade. Outra desvantagem do radioi- munoensaio é a importação dos kits de reagentes e o número limitado de análises, sendo muitas vezes economicamente inviáveis. Assim, a metodologia proposta possui um custo relativamente menor se comparado ao radioimunoensaio, principalmente se o laboratório possuir um aparelho de cromato- grafia líquida de alta eficiência. De acordo com o roteiro de validação de métodos analíticos [31, 32, 33] as recuperações devem estar entre 70 a 110%. Em nossos resulta- dos, a recuperação dos corticosteróides em plasma fortificado de rato ficou entre 90% e 108%, com CV entre 1,1 e 2,5 %, como pode ser observado nas tabelas 2 e 3, para os níveis de fortificações de 0,15, 0,30, 0,60, 1,2 e 1,60 µL mL -1. Ecl. Quím., São Paulo, 35 - 2: 51 - 61, 2010 59 Artigo Article tabela 3. Recuperação R (%) dos corticosteróides (µg mL-1) em plasma de rato fortificado. Cortisona Corticosterona acetato de Hidrocortisona acetato de dexametasona Conc (µg ml-1) r (%) dpr r (%) dpr r (%) dpr r (%) dpr 1,6 97 11,6 94 9,5 90 9,1 97 12,7 1,2 103 7,7 103 4,4 98 6,6 103 7,8 0,6 97 10,8 106 4,4 101 5,7 106 6,3 0,3 103 4,4 108 5,7 107 5,8 105 7,5 0,15 102 6,9 102 8,9 105 4,0 105 4,5 Os resultados estão expressos em média, o desvio-padrão relativo é expresso pelo desvio-padrão divi- dido pela % de recuperação x 100. Foram consideradas 5 análises para cada concentração de corticos- teróides. Várias técnicas para a determinação de corticosteróides em fluidos biológicos necessitam do pré- tratamento da amostra [6, 9, 19, 26, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41] seja através de métodos de extração em fase sólida ou extração por solventes (diclorometano, acetato de etila, metanol, entre outros). Vale ressaltar que o pré-tratamento da amostra pode induzir a alguns problemas, como: o tempo dispensado no processo, manuseio laborioso, erros de manipulação, contaminação por outros agentes, alto custo, de- composição de alguns compostos, entre outros. Esses fatores são imprescindíveis em análises rotineiras de um grande número de amostras. O presente método analítico desenvolvido dispensa o pré-tratamento da amostra, fato importantíssimo no diagnóstico e no tratamento de doenças endócrinas relacionadas com os corticosteróides, na qual se faz necessário a rapidez na quantificação destes hormônios. Para validar o método utilizou-se a dosagem dos níveis plasmáticos de corticosterona; hormônio secretado em ratos; após estresse agudo induzido por natação, no qual observou-se um aumento significativo em todos os tempos (5, 15, 30 e 50 minutos) quando comparados ao grupo controle, não havendo diferenças significativas entre os tempos confrome a tabela 4. tabela 4. Níveis plasmáticos de corticosterona (µg mL-1) do grupo controle e dos submetidos ao estresse agudo induzido por natação por 5’, 15’, 30’ e 50 ‘. grupoS níveis plasmáticos de Corticosterona níveis plasmático de Corticosterona (diluição 1:50) Controle 0,4 ± 0,1 0,008 ± 0,002 en 05’ 5,1 ± 1,2 0,102 ± 0,03 en 15’ 4,7 ± 2,7 0,094 ± 0,05 en 30’ 4,9 ± 2,7 0,098 ± 0,05 en 50’ 4,7 ± 2,0 0,094 ± 0,04 Valores expressos como média ± erro padrão de 5 experimentos tanto do grupo controle como do gru- po submetido ao estresse induzido por natação. p < 0.05, ANOVA seguida de Tukey-Kramer. Ecl. Quím., São Paulo, 35 - 2: 51 - 61, 201060 Artigo Article O aumento dos níveis de glicocorticóides é considerado um mecanismo endócrino de primei- ra linha para defender o organismo contra as con- dições estressantes [42]. O aumento de glicocorti- cóides está relacionando a rápida mobilização de gorduras de suas reservas celulares, tornando-os disponíveis para o fornecimento de energia e para a síntese de outros compostos, incluindo glicose, necessários para os diferentes tecidos do organis- mo [43, 44]. Assim, os resultados obtidos foram próxi- mos aos encontrados em métodos descritos pela literatura especializada, mostrando-se em concor- dância com os valores aceitáveis para a validação de nova metodologia em amostras biológicas. ConCluSão Na determinação de corticosteróides em plasma de ratos, foi observado o efeito de matriz, na qual a avaliação da recuperação de corticoste- róides foi ajustada utilizando o método de adição padrão, o qual foi empregado com sucesso para a avaliação das amostras reais. Os resultados obtidos através do estudo de recuperação estão de acordo com valores aceitá- veis para a validação de uma nova metodologia analítica em amostras biológicas, assegurando a eficiência e a confiabilidade do método. O método analítico proposto para a de- terminação de corticosteróides em amostras de plasma empregando um sistema isocrático de cromatografia líquida de alta eficiência com um detector UV-visível e a aplicação de uma coluna cromatográfica ISRP-C18 possibilitou a injeção di- reta (on-line) da amostra sem tratamento prévio, constituindo um método simples, rápido, exato e preciso. agradeCimentoS Os autores agradecem a CAPES pelo apoio financeiro, para o desenvolvimento deste traba- lho. abstract: The present work had as aim the development of simple an analytical method, fast efficient and the determination of corticosteroids (cortisone, corticosterone, acetate of hidro- cortisone and acetate of dexametasone) in sanguine samples of rats using an isocratic system of liquid chromatography of high efficiency (CLAE) with ultraviolet detention. The method involved direct injection of sanguine sample in a chromatographic column with internal sur- face of phase reverse (ISRP-C18), using the composed mobile phase for drain plug phosphate pH 4,0: acetonitrile (65:35 v/v). The detention the analytes was obtained using an ultraviolet detector of changeable wave length (Varian Model 2550) adjusted in 240 nm and a 4400 in- tegrator SP Chromaject (Varian Associates, Inc., Sunnyvale, CA, USA). The extraction of the analyte resulted in recovery values between 90% and 108%, and variation coefficient enter 1,1% and 2.5%. The detention and quantification limits of the method were 0,02 and 0,04 µg mL-1, respectively. In conclusion, the analytical method possible the direct injection (on-line) of the sample without previous treatment also presenting some advantages, such as: fast, exact- ness, precision and specific. Keywords: corticosteroids, sanguine samples, column ISRP- C18, CLAE. referÊnCiaS [1] K. SHIMADA, K. MITAMURA, T. HIGASHI. J. 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