emergency 6 2008 cop tossicologia NBCR emergency care journal 35 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o IV n um er o V I • D ic em br e 20 08 • w w w .e cj .it Il botulismo infantile è una sindrome neuroparali- tica molto grave, ma caratterizzata da una bassa mortalità. I dati epidemiologici indicano che il 90% dei casi si verifica negli USA. Il motivo di ciò non è chiaro, ma potrebbe essere legato a una maggiore conoscenza della malattia da parte dei sanitari. Questo trova riscontro nella epidemiologia nazio- nale, che è la più numerosa a livello europeo e do- ve la maggior parte dei casi è stata diagnosticata in pochi ospedali, dimostrando che dopo la prima esperienza i medici sono maggiormente sensibiliz- zati verso un adeguato sospetto diagnostico. Si re- puta quindi che, soprattutto nelle forme lievi, la malattia, anche nel nostro Paese, sia sottostimata. La malattia, diversamente dal classico botulismo alimentare, non è causata dall’ingestione di tossina preformata in un alimento, ma dalla tossina botu- linica prodotta nel lume intestinale da spore neu- Il botulismo infantile: un network per migliorare la diagnosi e il trattamento di una malattia rara e sotto-diagnosticata Davide Lonati, Carlo Locatelli, Stefania Bigi, Sarah Vecchio, Valeria Petrolini, Andrea Giampreti, Lucia Fenicia*, Dario De Medici*, Luigi Manzo Servizio di Tossicologia, Centro Antiveleni di Pavia – Centro Nazionale di Informazione Tossicologica, IRCCS Fondazione Salvatore Maugeri e Università degli Studi di Pavia *Centro Nazionale di Riferimento per il Botulismo, Istituto Superiore di Sanità, Roma SINTESI Il botulismo infantile è una patologia rara e spesso sotto- diagnosticata, con una incidenza di circa 80-100 casi se- gnalati annualmente negli USA. In Italia sono stati ripor- tati in tutto 28 casi dal 1984 al 2007. A differenza del botulismo alimentare (causato dall’inge- stione di cibo contaminato da tossine botuliniche) la for- ma infantile è determinata da una “tossiemia intestinale”, causata dalla produzione in vivo della tossina a partire da spore di Clostridium botulinum colonizzanti l’intestino umano. Il dato epidemiologico più caratteristico è l’interessamen- to esclusivo di lattanti nel primo anno di vita. Il quadro cli- nico conclamato è caratterizzato da segni di disfunzione autonomica, precoce coinvolgimento dei nervi cranici e successivo quadro di paralisi flaccida discendente. La dia- gnosi può essere estremamente difficile perché il quadro cli- nico varia da forme benigne, pressoché subcliniche e auto- limitantesi, a forme rapidamente evolutive verso l’insuffi- cienza respiratoria acuta. I tipici sintomi d’esordio del bo- tulismo infantile sono, ad esempio, la stipsi, la difficoltà di alimentazione (di fatto un deficit di suzione e degluti- zione per paralisi degli ultimi nervi cranici), il pianto de- bole e l’ipotonia: queste sono però manifestazioni estrema- mente comuni e aspecifiche nel lattante, cosicché la dia- gnosi d’ingresso può essere confusa con quadri di sepsi o meningite, disidratazione severa, ipotonia da causa neuro- logica e altre patologie. Anche il quadro conclamato può essere di difficile inquadramento diagnostico, in partico- lare mimando patologie metaboliche (ad es., malattie mi- tocondriali all’esordio) o condizioni neurologiche, quali l’atrofia muscolare spinale o le poliradicolonevriti perife- riche (ad es., Guillain-Barré, Miller Fischer). rotossigene ingerite che hanno avuto la possibilità di germinare e moltiplicarsi. La fonte delle spore è ambientale e i veicoli finora individuati tramite indagini epidemiologiche e di laboratorio sono il miele e, in rarissimi casi, la pol- vere di casa. Il miele, come prodotto naturale, può veicolare spore che le api raccolgono durante la lo- ro attività e che residuano nel prodotto. L’indagine effettuata nel nostro Paese, con l’ausilio di un questionario preparato ad hoc e sottoposto a pediatri e a 250 madri presso i reparti pediatrici di alcuni ospedali italiani, ha rilevato che il 30% dei pediatri e il 100% delle madri non conosceva la ma- lattia e che il 25% delle madri somministrava il mie- le al proprio bambino e aveva avuto questa abitu- dine anche con altri figli. Si può quindi ritenere che la possibilità di sviluppare botulismo infantile per assunzione di miele sia comunque rara, data l’ele- vata percentuale di bambini che viene a contatto con tale alimento. La recente evidenza di presenza di spore di C. bo- tulinum in fiori di camomilla e altri vegetali disi- dratati utilizzati per preparare infusi ai lattanti, con- suetudine molto diffusa in diversi Paesi tra cui l’I- talia, solleva il problema di altre eventuali fonti di spore botuliniche, diverse dal miele, che potrebbe- ro rappresentare un fattore di rischio per i bimbi ed essere eventualmente sconsigliate, così come il miele, almeno in un determinato periodo di vita. Recentemente è stato dimostrato, in seguito all’i- solamento di due ceppi risultati poi identici dopo subtipizzazione molecolare, che anche la polvere di casa può costituire un veicolo di spore di clostridi neurotossigeni. In Italia i casi più recenti sono sta- ti correlati a lavori di ristrutturazione domestica e, anche se non dimostrati, si sospetta l’inalazione co- me via di contagio. Appare pertanto utile un’attività di informazione/ formazione indirizzata a pediatri, neonatologi, neu- rologi, tossicologi clinici, rianimatori e medici d’urgenza sui vari aspetti della sindrome al fine di indirizzarne eventualmente il sospetto diagnosti- co. Se, ad esempio, il miele risulta al momento l’u- nico alimento correlato all’insorgenza di botulismo infantile, esso può essere eliminato dalla dieta dei lattanti senza particolari problemi. Per ottenere ciò occorre una campagna di informazione presso ge- nitori, pediatri e medici ospedalieri sulla malattia e sui fattori di rischio a essa correlati. D’altra parte, nell’indirizzare le madri in tal senso, i pediatri do- vrebbero illustrare con chiarezza il significato di questa restrizione alimentare eliminando dubbi sul- la intrinseca tossicità o pericolosità del miele e cir- coscrivendo chiaramente il problema a bambini al di sotto di un anno di età. Anche la reale correlazione consumo di miele-in- sorgenza della malattia andrebbe meglio valutata mediante prove di subtipizzazione molecolare dei ceppi isolati dal miele e dalle feci per stabilirne l’i- dentità, qualora si tratti naturalmente di ceppi ap- partenenti allo stesso sierotipo. Definizione di caso La definizione di caso di botulismo infantile adot- tata dal CDC di Atlanta e da alcuni Paesi europei, tra cui l’Italia, è la seguente: «malattia dei neonati caratterizzata da costipazione e difficoltà di suzione che può essere seguita da progressiva debolezza, difficoltà di respirazione e morte». I criteri per la diagnosi di laboratorio sono: 1. presenza di tossine botuliniche nelle feci o nel siero; 2. isolamento di un clostridio produttore di tossi- ne botuliniche dalle feci. Un caso viene classificato come confermato se ri- sulta clinicamente compatibile, se viene conferma- to in laboratorio e se si è verificato in un bambino con età inferiore a un anno1,2. Epidemiologia Globalmente più di 3100 casi di botulismo infanti- le sono stati diagnosticati dal 1976 al 2007. La mag- gior incidenza si è riscontrata negli USA, dove la forma infantile è la più frequente con 80-110 casi l’anno e un totale di circa 2600 casi dal 1976 al 2007 (incidenza di circa 2 per 100.000 nati-vivi); seguono l’Argentina con 366 casi dal 1982 al 2005, l’Australia con 32 casi dal 1978 al 2006, l’Italia con 28 casi dal 1984 al 2007 (incidenza di circa 0,2 per 100.000 nati-vivi) e il Canada con 27 casi dal 1979 al 20063-5. Per quanto riguarda l’Unione Europea (UE), dal 1978 al 2007 sono stati registrati 71 casi in 14 nazioni. In Italia dal 1984 a oggi si sono verificati 28 casi di botulismo infantile, dei quali uno correlato a un ca- so di SIDS. La casistica del nostro Paese è la più nu- merosa nell’ambito della UE. Nei pochi casi in cui è stato formulato il sospetto diagnostico, la diagno- si clinica è sempre stata confermata dai dati di la- boratorio presso il Centro Nazionale di Riferimen- to per il Botulismo. In particolare, la procedura pre- vede l’analisi dei tamponi rettali, quando non sia possibile ottenere il campione fecale a causa della stipsi. Dai dati epidemiologici nazionali risulta inoltre che, dei 28 pazienti, 17 avevano ingerito del Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. 36 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o IV n um er o V I • D ic em br e 20 08 • w w w .e cj .it tossicologia NBCR Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. tossicologia NBCR 37 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o IV n um er o V I • D ic em br e 20 08 • w w w .e cj .it miele e in 13 casi è stato possibile analizzare residui dell’alimento reperiti nell’abitazione del bambino. In 4 casi sono state isolate spore di Clostridium bo- tulinum ma solo in un caso si trattava dello stesso sierotipo di quello delle spore isolate dalle feci6. Veicolo delle spore Le spore dei clostridi neurotossigeni sono presenti normalmente in tutti i tipi di ambiente, sia terre- stre sia acquatico. Pertanto il suolo e la polvere gio- cano sicuramente un ruolo critico quale sorgente di clostridi per i bimbi costituendo una fonte dalla quale le spore, ingerite o inalate, raggiungono l’in- testino. Lo studio dei casi di botulismo infantile ha permesso di correlare l’insorgenza della malattia con l’inalazione di spore presenti nell’ambiente cir- costante il bimbo. Spore tossigene dello stesso tipo di quelle identificate nelle feci del paziente sono state infatti identificate nel suolo e nella polvere dell’aspirapolvere utilizzato in ambiente domestico, dimostrando la possibilità di contaminazione am- bientale7. Questa via è stata sospettata anche per quanto riguarda i casi italiani. Nel corso dello stu- dio degli ultimi casi è emerso che nella abitazione dei soggetti erano stati effettuati, nei giorni prece- denti l’inizio della sintomatologia, lavori di ristrut- turazione con evidente incremento dei livelli di polvere presenti nell’aria, anche se indagini di la- boratorio fatte al fine di individuare il veicolo am- bientale delle spore avevano dato esito negativo. Il miele rimane il solo veicolo alimentare sicura- mente correlato al botulismo infantile da evidenze epidemiologiche e di laboratorio6,8,9. I bimbi sono esposti al miele principalmente quando viene posto sul succhiotto per tranquillizzarli e quando viene addizionato come dolcificante nel latte in polvere e negli infusi. Il miele, può essere contaminato da spore di clo- stridi di origine ambientale, probabilmente da pol- line e nettare inquinati trasportati dalle api botti- natrici. Indagini effettuate in diversi Paesi su campioni di miele in commercio hanno evidenziato la presenza di spore di C. botulinum nel 2-14% dei campioni esaminati, con una notevole variazione tra le diffe- renti aree geografiche10-14. Ricerche effettuate, in- vece, su campioni di miele associati a casi di botu- lismo infantile hanno rilevato cariche in C. botuli- num notevolmente elevate, fino a circa 104 spo- re/kg, anche se la ragione non è chiara15,16. Infatti, i livelli di pH (3,4-5,5) e di AW (0,5-0,6) (Activity Water: quantità di acqua libera disponibile per la crescita batterica) nel prodotto finale sono sicura- mente inibenti la crescita e la tossinogenesi di C. botulinum, benché le spore rimangano vitali. Inol- tre, i trattamenti convenzionali utilizzati per di- struggere le spore negli alimenti non possono esse- re usati nel caso del miele perché altererebbero le caratteristiche organolettiche del prodotto, renden- dolo non idoneo al consumo umano. Un recente studio effettuato in Argentina ha evi- denziato la presenza di spore di C. botulinum in campioni di camomilla e altri vegetali disidratati utilizzati per preparare infusi normalmente sommi- nistrati dalle madri ai lattanti17. La malattia: patogenesi e spettro clinico Il botulismo infantile è la forma intestinale di botu- lismo che colpisce i lattanti al di sotto di un anno di età. Tale sindrome, riconosciuta per la prima vol- ta in California nel 1976, è causata da clostridi neu- rotossigeni (Clostridium botulinum e più rararamen- te Clostridium butyricum o Clostridium baratii) che vengono ingeriti sottoforma di spore, sopravvivono all’acidità gastrica e raggiungono l’intestino18. In conseguenza dell’immaturità della flora intestinale dell’ospite e quindi della competizione batterica, le spore possono germinare, moltiplicarsi, colonizza- re temporaneamente il lume intestinale a livello del colon e produrre in situ la neurotossina. La mucosa intestinale non viene interessata dall’infezione e la sindrome è stata definita una “tossiemia intestina- le”4,18. La tossina viene quindi assorbita dalla mu- cosa e, attraverso il circolo sanguigno, raggiunge le terminazioni nervose periferiche dove taglia, per via enzimatica, specifiche proteine target implicate nel processo di neuroesocitosi. Viene quindi bloccata la trasmissione nervosa, il che si manifesta con una paralisi flaccida simmetrica discendente, caratteri- stica di tutte le forme di botulismo19. I primi sintomi a comparire sono la costipazione, la difficoltà di suzione, l’alterazione del tono del pianto e la letargia. In particolare, nella maggior parte dei casi è proprio la costipazione il primo se- gno che può essere sottovalutato sia dai genitori sia dai medici nella raccolta anamnestica. Al contrario, i genitori riferiscono prontamente la difficoltà di suzione, identificata dalle madri per la comparsa di dolore, sensazione di tensione e ingorgo mamma- rio. Possono poi presentarsi ptosi, midriasi, disfa- gia, ipotonia diffusa con difficoltà a mantenere il busto eretto (floppy-baby), perdita del controllo del capo fino al coma e all’arresto respiratorio20. Lo spettro clinico della malattia può essere caratte- rizzato da forme molto lievi e poco sintomatiche a forme fatali con decorso fulminante18. Vi è sicura- mente una sottostima delle forme molto lievi e sub- cliniche che non necessitano del ricovero ospeda- liero. In rari casi la malattia è molto grave e indi- stinguibile dalla Sudden Infant Death Syndrome (SIDS)21. Il paziente durante la malattia mantiene lo stato di coscienza integro e non sviluppa iperter- mia (parametri utili nella diagnostica differenziale). Attualmente in Italia il trattamento aspecifico del botulismo infantile si basa su terapie di supporto; il paziente richiede il ricovero in Reparto di Terapia Intensiva a causa della frequente necessità di sup- porto respiratorio e alimentazione naso-gastrica. L’alimentazione artificiale attraverso il sondino na- so-gastrico, nonostante l’ipomotilità intestinale, ri- sulta ben tollerata e addirittura sembrerebbe mi- gliorare il decorso della malattia favorendo la nor- malizzazione della flora intestinale. I lassativi/pur- ganti non hanno invece dimostrato di abbreviare il corso della malattia e i clisteri evacuativi sono risultati poco efficaci per eliminare la tossina per- ché è stato dimostrato che il germe si sviluppa lun- go tutto il colon. La somministrazione di antibiotici non ha alcun ef- fetto sul meccanismo di tossicità della tossina bo- tulinica, mentre può essere necessaria per il tratta- mento delle eventuali complicanze secondarie, so- prattutto dell’apparato respiratorio. Alcuni anti- biotici, quali aminoglicosidi e clindamicina sono comunque controindicati per la funzione bloccan- te l’attività neuromuscolare. Secondo alcuni Auto- ri, inoltre, esisterebbe un rischio teorico di lisi del- la cellula batterica con successiva liberazione di ul- teriore tossina che potrebbe aggravare la sintoma- tologia neurologica22. Le possibili complicanze sono rappresentate so- prattutto da infezioni a livello respiratorio, infezio- ni secondarie del tratto urinario (atonia vescicale) o di natura nosocomiale. Una complicanza riscontra- ta nella casistica americana e in quella italiana è la grave colite da Clostridium difficile il quale, presen- te in maniera asintomatica nel lume intestinale dei lattanti, riesce a moltiplicarsi proprio in seguito al- la paralisi causata dalla tossina botulinica23,24. Storicamente la somministrazione di antitossina botulinica prevede l’uso di siero eterologo equino. Il potenziale effetto sensibilizzante alle proteine equine11, i parametri di farmacocinetica non favo- revoli (emivita di 5-7 giorni)25 e gli effetti collate- rali26 portano a sconsigliarne l’uso in questa forma di botulismo. Recentemente l’IBTPP ha condotto trials clinici su un siero umano per il trattamento specifico del bo- tulismo infantile contenente immunoglobuline pu- rificate e ottenute da un pool di plasma di adulti immunizzati con l’anatossina pentavalente, dai quali vengono poi selezionate le antitossine con- tro la tossina A e B22. Attualmente il farmaco de- nominato BIG-IV (Botulism Immune Globulin-In- travenous Human) è autorizzato dall’FDA27 e risul- ta disponibile negli Stati Uniti e viene inviato su richiesta in tutti i Paesi. L’uso del BIG-IV nei bam- bini malati ha ridotto i tempi di nutrizione naso- gastrica, di ospedalizzazione, di ventilazione mec- canica e, conseguentemente, le complicanze dovu- te alle infezioni secondarie. Quest’ultimo aspetto, inoltre, minimizza le conseguenze dovute all’uso di antibiotici necessari per la cura delle gravi infezio- ni concomitanti. Il trattamento con BIG-IV dovrebbe essere iniziato appena formulato il sospetto diagnostico anche in assenza della conferma di laboratorio. Il BIG-IV neu- tralizza la quota di tossina circolante e non ancora “legata” alla placca neuromuscolare e sembra man- tenere una concentrazione efficace per circa 6 mesi. Inoltre, la precoce somministrazione dell’antidoto (entro 1-3 giorni dall’esordio della sintomatologia clinica) sembra ridurre notevolmente (1 settimana circa) il periodo di ospedalizzazione rispetto ai pa- zienti trattati tra il quarto e il settimo giorno22. Il BIG-IV è costituito da una singola fiala di polve- re liofilizzata contenente approssimativamente 100 mg ± 20 mg di immunoglobuline da ricostituire con 2 ml di soluzione fisiologica. Il titolo anticor- pale nel prodotto così ricostituito è composto da almeno 15 UI/ml di antitossine contro la tossina di tipo A e da almeno 4 UI/ml di antitossine con- tro la tossina di tipo B (per convenzione e solo per le tossine di tipo A e B, 1 UI di antitossina neutra- lizza 10.000 DL50 topo di tossina somministrata per via intraperitoneale); il titolo anticorpale ri- guardante le tossine di tipo C, D ed E non è stato determinato. La posologia consigliata è di una singola dose pari a 1 ml/kg (50 mg/kg) somministrata per via endo- venosa. La velocità di infusione iniziale (per i pri- mi 15 minuti) deve essere di 0,5 ml/kg/ora (25 mg/kg/ora) e successivamente non va superata la dose di 1 ml/kg/ora (50 mg/kg/ora). La somministrazione deve essere iniziata dopo 30 minuti dalla ricostituzione (per consentire una ot- timale solubilizzazione del preparato che non de- ve essere agitato a causa della formazione di schiu- ma) e comunque entro le 2 ore dalla ricostituzione; la somministrazione deve essere ultimata entro le 4 ore dalla ricostituzione. Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. tossicologia NBCR 38 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o IV n um er o V I • D ic em br e 20 08 • w w w .e cj .it Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. tossicologia NBCR em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o IV n um er o V I • D ic em br e 20 08 • w w w .e cj .it 39 Durante la somministrazione devono essere moni- torati strettamente i parametri vitali e l’infusione può essere rallentata in caso di comparsa di effetti avversi minori (ad es., flushing) e interrotta alla comparsa di reazioni avverse gravi. La reazione av- versa più frequentemente riportata sia nel gruppo di pazienti trattati con BIG-IV (14%) sia in quello trattato con immunoglobuline-placebo (8%) è stata rash eritematoso transitorio al viso e al tronco22, anche se un effetto simile è stato osservato in pa- zienti affetti da botulismo infantile non trattati con immunoglobuline20. Risulta pertanto difficile indi- viduare con precisione la causa di tale rash cutaneo; nei due gruppi non sono state registrate anche rea- zioni di broncospasmo e anafilattiche. L’antidoto andrebbe utilizzato con cautela nei pa- zienti con preesistente insufficienza renale o nei pa- zienti giudicati a rischio di sviluppare insufficienza renale acuta o con nota/pregressa/sospetta reazione avversa a prodotti contenenti immunoglobuline. Nel caso di botulismo infantile la dose consigliata permette di contrastare e neutralizzare la totalità della tossina circolante28. L’emivita del farmaco sembra essere, similmente agli altri preparati con- tenenti immunoglobuline, approssimativamente di 28 giorni29. La durata della malattia varia da pochi giorni a me- si e la guarigione dipende dal tempo necessario a formare nuove giunzioni neuromuscolari a livello della placca motrice. Sono riportati rari casi di ricadute in lattanti appa- rentemente completamente guariti. Il significato di questo andamento bifasico è controverso e la cau- sa principale potrebbe risiedere in erronee valuta- zioni di guarigione e dimissioni troppo precoci18. Diagnosi clinica Casi di botulismo infantile sono stati diagnosticati in tutti i continenti a eccezione dell’Africa, anche se con incidenze molto diverse. Benché la malattia sia stata identificata da circa 30 anni, in considerazio- ne della sua rarità è ancora sicuramente sottosti- mata e confusa con altre patologie. Infatti, la dia- gnosi clinica del botulismo infantile si basa su un accurato esame dei sintomi neurologici. La presen- za di paralisi multipla coinvolgente i nervi cranici è il segno tipico del quadro clinico del botulismo infantile. Questa sintomatologia può essere accom- pagnata da pianto flebile, suzione debole, xerosto- mia, riflesso faringeo o della deglutizione abolito, ipotonia assiale con difficoltà a controllare il capo. La ptosi può non essere evidente fino a quando il bimbo non assume la posizione eretta e/o non vie- ne sostenuto il capo, mentre le alterazioni dello sguardo e del riflesso pupillare possono essere rile- vate solo dopo valutazione neurologica attenta e prolungata. Gli esami strumentali, pur non evidenziando alte- razioni patognomoniche, risultano molto utili nel- la fase di diagnostica differenziale con le altre pa- tologie neurologiche. L’elettromiografia può iden- tificare un pattern caratteristico, ma non sempre diagnostico, denominato BSAPs (brief-duration, small amplitude, overly abundant motor-unit action potential)30. Tuttavia la mancanza di alterazioni compatibili con pattern BSAPs non esclude la ma- lattia18,31. Diagnosi di laboratorio La conferma di laboratorio prevede la presenza di tossina botulinica nel siero e/o nelle feci del pa- ziente o la presenza delle spore di C. botulinum o altri clostridi neurotossigeni nelle feci. Il Centro Nazionale di Riferimento per il Botulismo effettua, tra l’altro, la diagnosi di laboratorio dei ca- si sospetti. In particolare, nel 1984, dopo l’identifi- cazione dei primi casi di botulismo infantile, è sta- to varato un programma ad hoc per la sorveglianza attiva e lo studio della malattia. I primi casi italia- ni, infatti, presentavano delle peculiarità in relazio- ne a un nuovo agente eziologico identificato in un ceppo di C. butyricum produttore di tossina botuli- nica tipo E. Questo lavoro di sorveglianza attiva ha permesso di raccogliere numerosi dati sia clinici sia microbiologici sulla malattia, riportati in articoli scientifici e case reports, e di fornire un supporto ai clinici coinvolti nella gestione dei casi, facendo da punto di raccordo con le strutture specializzate, quali i Centri Antiveleni, spesso in collaborazione con l’IBTPP. Le indagini di laboratorio prevedono analisi di cam- pioni biologici, alimentari e ambientali. I metodi per la ricerca delle tossine e dell’agente eziologico sono quelli del CDC32 con limitate modifiche. Que- sti sono fondamentalmente basati su test biotossi- cologici che prevedono l‘uso di animali da labora- torio (Mouse Test). Al fine di ridurre l’uso degli ani- mali, recentemente è stato messo a punto un me- todo di quadruplex PCR per la ricerca delle spore produttrici di tossine botuliniche di tipo A, B, E ed F. Tale metodo attualmente è utilizzato parallela- mente al Mouse Test per la diagnosi della malattia e la tipizzazione delle tossine. Quando i campioni lo consentono, viene quantificata la tossina nel siero e nelle feci mediante calcolo della MLD/g e vengo- no numerate le spore tossigene. Al fine di permettere il follow up della malattia, vie- ne studiata la persistenza nel tempo delle spore tos- sigene nelle feci dei pazienti anche dopo guarigio- ne clinica e dimissione ospedaliera. Per consentire, inoltre, l’individuazione del veicolo delle spore ven- gono analizzati campioni di alimento (miele, baby foods) nonché campioni di polvere ambientale. Il Centro Nazionale di Riferimento per il Botulismo è attivo 24 ore su 24 presso l’Istituto Superiore di Sa- nità ed è contattabile ai numeri: 06 4990 2254 o, in orari notturni e nei giorni festivi, 06 4990 2440-2441. I campioni da inviare sono: • un campione di feci o, in caso di stipsi, 4-5 tam- poni rettali per la ricerca delle spore neurotossi- gene; • feci o, in caso di stipsi, circa 30 ml di liquido di la- vaggio rettale (enema) per la ricerca delle tossine botuliniche. I campioni devono essere inviati al seguente indi- rizzo: Centro Nazionale di Riferimento per il Botu- lismo – Reparto Adempimenti Comunitari – DSPVSA. Istituto Superiore di Sanità – viale Regi- na Elena 299 – 00161 Roma. Diagnosi differenziale La negatività o normalità delle indagini effettuate per la diagnostica differenziale possono essere utili a for- mulare (per esclusione) la diagnosi di botulismo in- fantile, che rimane comunque difficile. Tuttavia l’a- spetto negativo di tale approccio consiste nel fatto che molte procedure (ad es., rachicentesi) invasive e rischiose potrebbero essere evitate (Tabella 1). Altre patologie che possono mimare la clinica del botulismo infantile sono l’atrofia midollare spinale di tipo I e specifici disturbi metabolici, quali, ad esempio, l’aciduria glutarica di tipo I, la malattia con urine a sciroppo d’acero, la sindrome di Leigh e il deficit della succinico semialdeide deidrogenasi. I pazienti affetti da atrofia midollare spinale di tipo I non hanno un esordio acuto della sintomatologia, caratteristica invece dei pazienti affetti da botulismo infantile, che presentano tipicamente oftalmoplegia e diminuzione del tono dello sfintere anale, altera- zioni assenti nei pazienti affetti da SMA di tipo I. Secondo i dati americani, accanto a una buona di- mostrazione della capacità di saper formulare il so- spetto diagnostico della sindrome da parte dei cli- nici, in alcuni casi (fino al 28%) la diagnosi di cer- tezza di botulismo infantile può non essere effettua- ta a causa dell’impossibilità di ottenere dei campio- ni di feci per eseguire le indagini di laboratorio33. A causa della difficoltà diagnostica e della contempo- ranea necessità di trattare i pazienti con sospetto bo- tulismo infantile (anche in assenza della conferma di laboratorio), alcuni pazienti sono stati sottoposti a trattamento specifico anche se, a posteriori, non sono risultati affetti dalla malattia. Infatti, negli stu- di condotti dal CDPH22 circa il 5% dei pazienti ar- ruolati dal 1992 al 2005 (trattati con BIG-IV o con placebo) non sono risultati affetti da botulismo in- fantile. La diagnostica differenziale ha permesso successivamente di formulare le seguenti diagnosi: probabile botulismo infantile (9 pazienti), disordi- ni metabolici (8 pazienti), atrofia muscolare spina- le di tipo I (5 pazienti), patologie infettive (3 pa- zienti) e miscellanea (7 pazienti)34. Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. tossicologia NBCR 40 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o IV n um er o V I • D ic em br e 20 08 • w w w .e cj .it TAB. 1 Principali patologie in diagnosi differenziale con il botulismo infantile3. Principali caratteristiche che differenziano il botulismo infantile dalle altre patologie Sepsi Normotermia, normalità dei parametri di flogosi, assenza di segni di shock Meningo-encefalite Normalità di rachicentesi ed elettroencefalogramma Malattie metaboliche congenite Normalità di emogasanalisi, elettroliti sierici e urinari, transaminasi, ammoniemia e acido lattico Sindrome di Guillain Barré ROT normoevocabili, assenza di dissociazione albumino-citologica liquorale (variante Miller Fisher) Intossicazione da insetticidi Normalità delle colinesterasi plasmatiche, negatività delle indagini organofosforici, benzodiazepine tossicologiche, assenza di risposta a flumazenil Miastenia congenita EMG: assenza di esaurimento dopo stimolazione ad alta frequenza Malattia di Werdning-Hoffmann Esordio acuto/subacuto della malattia, reperto EMG non compatibile, ROT normoevocabili Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o IV n um er o V I • D ic em br e 20 08 • w w w .e cj .it 41 tossicologia NBCR Caratterizzazione dell’agente eziologico L’agente eziologico del botulismo umano è classi- camente il C. botulinum produttore di tossine di ti- po A, B, E ed F. Dati epidemiologici indicano che la maggior parte dei casi di botulismo infantile nel mondo sono causati da C. botulinum di tipo A e B. Dal 1979, però, sono state isolate altre specie di clo- stridi in grado di sintetizzare tossine botuliniche, in particolare il C. baratii di produttore di tossina ti- po F, isolato in 10 casi di botulismo intestinale (3 lattanti e 6 adulti negli USA, 1 lattante in Ungheria e 1 possibile caso di botulismo alimentare in Cali- fornia), e il C. butyricum produttore di tossina tipo E, isolato in 6 casi di botulismo intestinale (4 neo- nati, 2 ragazzi) in Italia3 e in un caso di botulismo infantile in Giappone. Fattori di rischio L’età è l’unico fattore predisponente per il botulismo infantile; infatti, la maggior parte dei casi interessa bambini di età inferiore a 6 mesi (il più piccolo ave- va 58 ore) e, comunque, tutti di età inferiore a un anno. Adulti sani e ragazzi ingeriscono, abitual- mente, spore di C. botulinum senza sviluppare la malattia. Ciò è correlato alla maturazione della mi- croflora intestinale che è quantitativamente e qua- litativamente più semplice nei neonati e può non essere in grado, come dimostrato da prove effettua- te su modelli animali, di prevenire la colonizzazio- ne dell’intestino da parte di spore di clostridi neu- rotossigeni35. Lo studio dei fattori che possono in- fluenzare la composizione della microflora ha na- turalmente individuato il ruolo centrale della die- ta. La microflora dei lattanti è costituita da un mi- nor numero di specie batteriche e la prevalenza dei vari microrganismi dipende in parte dal tipo di al- lattamento del lattante: solo materno, solo artifi- ciale o misto. Inoltre, la composizione della flora si modifica nel tempo soprattutto quando alimenti so- lidi, come i cereali, sono aggiunti alla dieta del bam- bino36. La maggior incidenza dei casi, infatti, è con- centrata proprio all’inizio dello svezzamento, quan- do appunto si verificano i cambiamenti maggiori. La normale microflora del lattante contiene alcune specie di batteri, principalmente Bifidobacterium e Bacteroides, che in vitro possono inibire la moltipli- cazione del C. botulinum37. Tuttavia, studi epide- miologici non hanno potuto dimostrare una chiara relazione causa-effetto tra il tipo di dieta e l’insor- genza della malattia; infatti, benché la maggior par- te dei pazienti fossero allattati al seno, la malattia si riscontrava più precocemente nei lattanti allatta- ti con latte di formula (7,6 settimane contro 13,7 settimane)38. Questo probabilmente si verifica a causa della presenza (nel latte in polvere) di nicchie ecologiche favorenti e a causa della mancanza di fattori immunitari (come Ig A secretorie e lattofer- rina), invece presenti nel latte materno; a ciò con- segue uno stato immunitario più fragile o una mi- croflora intestinale più debole o non bilanciata38,39. Studi comparativi dello stato immunitario dei bam- bini rilevano una relazione tra ambiente e nutrizio- ne18. Un altro fattore predisponente l’infezione bo- tulinica nei bimbi, indipendente dal tipo allatta- mento, è la ridotta motilità intestinale che può fa- vorire la colonizzazione di spore di clostridi. Un ulteriore fattore predisponente è stato sospetta- to in una concomitante infezione virale intestina- le. Tale evenienza, studiata in un bambino che ha presentato una coinfezione da C. botulinum di tipo A e da enterovirus, potrebbe essere spiegata con una maggiore suscettibilità alla colonizzazione del C. botulinum in seguito all’alterazione della muco- sa intestinale indotta dagli enterovirus40,41. Ringraziamenti Studio realizzato nell’ambito del progetto di ricerca dell’Istituto Superiore di Sanità “Programma Italia- USA Malattie Rare – Infant Botulism” (n. 7MR1/1). Bibliografia 1. Circolare n. 9 Ministero della Sanità – Dipartimento prevenzio- ne e farmaci. 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Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. 42 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o IV n um er o V I • D ic em br e 20 08 • w w w .e cj .it tossicologia NBCR Il network italiano per la diagnosi e il trattamento del botulismo infantile L’incidenza mondiale del botulismo infantile (BI) è strettamente legata alla conoscenza della malattia da parte dei clinici e alla conseguente formulazione di un “sospetto diagnostico” che porta all’indivi- duazione dei casi. Presso il California Department of Public Health (CDPH) è attivo già dalla fine degli anni ‘70 l’Infant Botulism Treatment and Prevention Program (IBTPP) per lo studio, la prevenzione e la diffusione delle informazioni sulla malattia. È proprio grazie a tale programma che negli USA si regi- stra la maggiore incidenza al mondo del fenomeno. In Italia, benché nel 1984 sia stato varato presso il Centro Nazionale di Riferimento per il Botulismo (CNRB) dell’Istituto Superiore di Sanità (ISS) un programma ad hoc per la sorveglianza attiva della malattia, il botulismo infantile risulta ancora una malattia poco conosciuta dalla classe medica e dai ge- nitori. Al fine di promuovere il riconoscimento, la diagnosi e, in generale, le conoscenze sulla malat- tia, è stato recentemente elaborato un progetto di ricerca denominato Infant Botulism nell’ambito del programma di collaborazione Italia-USA, sezione malattie rare. A tale progetto partecipano Unità Ope- rative dell’Istituto Superiore di Sanità (ISS) e del Centro Antiveleni (CAV) della Fondazione Maugeri di Pavia, con la collaborazione scientifica dell’IBTPP. Il CNRB dell’ISS, oltre all’attività di sorveglianza e di ricerca sui vari aspetti del botulismo infantile mediante la diagnosi di laboratorio dei casi sospetti, la raccolta di dati clinici, epidemiologici e micro- biologici, allestirà un web-site informativo con una sezione tecnica destinata agli operatori del setto- re. Inoltre, si occuperà dello sviluppo e della standardizzazione di una metodica di PCR Real-Time per la determinazione rapida e specifica dei clostridi neurotossigeni. Il CAV della Fondazione Salvatore Maugeri di Pavia si occuperà di migliorare la diffusione della cono- scenza della malattia (sia attraverso una programma di prevenzione indirizzato prevalentemente ai genitori, sia attraverso un programma di formazione indirizzato ai medici coinvolti nelle fasi di dia- gnosi precoce e trattamento) e di fornire un supporto specialistico da parte di medici tossicologi (H24) per la diagnosi precoce e il trattamento specifico. Servizi che costituiscono il network per il miglioramento della diagnosi e cura del botulismo infantile. Diagnosi clinica e trattamento specifico Servizio di Tossicologia, Centro Antiveleni di Pavia e Centro Nazionale di Informazione Tossicologica IRCCS Fondazione Maugeri via Maugeri 10 27100 Pavia tel 0382 24444 (Centro Antiveleni H24) tel 0382 26261 (Segreteria) fax 0382 24605 email: progetto.iss@fsm.it www.cavpavia.it Sorveglianza attiva, registro dei casi e conferma di laboratorio Centro Nazionale di Riferimento per il Botulismo Istituto Superiore di Sanità viale Regina Elena, 299 00161 Roma tel 06 49902254 (49902441 notturno e festivi) fax 06 49902045 email: lucia.fenicia@iss.it www.iss.it Supporto scientifico Infant Botulism Treatment and Prevention Program (IBTPP) California Department of Public Health (CDPH) www.infantbotulism.org Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. tossicologia NBCR 43 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o IV n um er o V I • D ic em br e 20 08 • w w w .e cj .it 12. Nakano H, Sakaguchi G. An unusual heavy contamination of honey products by Clostridium botulinum type F and Bacillus al- vei. FEMS Microbiological Letters 1991; 63: 171-177. 13. Aureli P, Ferrini AM, Negri S. Ricerca di spore di C. botulinum nel miele. Riv Soc It Sci Alim 1983; 6: 457-460. 14. Nevas M, Hielm S, Lindstrom M et al. High prevalence of Clo- stridium botulinum types A and B in honey samples detected by polymerase chain reaction. Int J Food Microbiol 2002; 72: 45- 52. 15. Dodds KL. Worldwide incidence and ecology of infant botulism. In: Hauschild AHW, Dodds KL eds. Clostridium botulinum, Ecology and Control in Foods. Marcel Dekker Inc, New York, 1993, pp. 105-120. 16. Austin J. Botulism in Canada – Summary for 1995. 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Moreover, failu- re to recognise the disease is probably related to the low in- dex of suspicion: in fact, the experience of clinicians is fun- damental in recognising infant botulism. A specific project has been promote to improve knowled- ge of the disease by training physicians (pediatricians, neurologists, clinical toxicologists) to look out for the pos- sible presence of Infant Botulism cases and improving pu- blic awareness through a prevention program. Standardi- zation of therapeutic protocol also by treatment with spe- cific therapeutic measures will be disseminated. A staff of physicians specialized in Clinical Toxicology will be available, 24 hours a day and seven days/week in the Pavia Poison Centre – National Toxicology Information Center. According to the project, this Centre acts as Refe- rence Center for the clinical diagnosis and the treatment of infant botulism for the correct recognition of typical syndrome, the early diagnosis and the possible therapy with particular attention to antidotic treatment. The Na- tional Reference Centre for Botulism at the Istituto Supe- riore di Sanità will offer a 24-hours diagnostic laboratory service to support diagnose in suspected cases of botulism.