ECJ_1_2006 Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. medicina di laboratorio 26 emergency care journal em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o II nu m er o 1 • Fe bb ra io 2 00 6 • w w w .e cj .it Lo scenario Milioni di pazienti si presentano annualmente alle strut- ture di Pronto Soccorso di tutti gli ospedali con dolore toracico o con altri sintomi suggestivi di ischemia mio- cardica1. Sebbene la disponibilità di marcatori estrema- mente sensibili e specifici di necrosi miocardica, quali le troponine, abbia reso la diagnosi relativamente più faci- le e sicura, il riscontro di valori normali di troponine non esclude a priori la possibilità di una patologia miocardi- ca di tipo ischemico2. Al contrario, un aumento dei livel- li plasmatici di troponine può portare a ricoveri inappro- priati dei pazienti in strutture altamente specializzate di trattamento. Indagini recenti su alcuni biomarcatori di eventi biologi- ci a monte della necrosi post-ischemica, quali i biomar- catori di un processo infiammatorio a carico della parete vascolare come citochine (interleuchina 6, TNF-α), pro- teine di fase acuta (proteina C reattiva), molecole di ade- sione (ICAM, VCAM), espressione e liberazione di mie- loperossidasi e/o di metalloproteinasi (MMP 9), che pos- sono a loro volta portare a destabilizzazione e rottura della placca, hanno prepotentemente suggerito l’impiego degli stessi per una migliore stratificazione del rischio e quindi una più corretta identificazione dei pazienti3. A questi biomarcatori di eventi pre-ischemici se ne aggiun- gono altri, peraltro ormai ben conosciuti, in grado di evi- denziare eventi post-ischemici quali la necrosi (troponi- ne) e il distress miocardico (peptici natriuretici di tipo B). Apparentemente non vi è la disponibilità, nella prati- ca clinica, di biomarcatori dell’evento ischemico, indi- pendentemente dal fatto che questo stesso evento possa esitare nella necrosi e/o nell’insufficienza cardiaca. La ricerca biologica di base e applicata ha portato episo- dicamente alla ribalta, in questi ultimi anni, alcuni po- tenziali marcatori di ischemia fra cui la colina4 e gli acidi Alla ricerca di un marcatore di ischemia. Il caso dell’albumina modificata dall’ischemia Marco Bagnati, Matteo Basile, Barbara Toto, Giorgio Bellomo Laboratorio di Ricerche Chimico-Cliniche, Ospedale Maggiore della Carità, Università del Piemonte Orientale, Novara SINTESI La ricerca e la disponibilità di un biomarcatore affidabile di ische- mia miocardica ha portato alla proposta di impiegare, a tale sco- po, la capacità del siero di legare cobalto. Tale proposta assume che le modificazioni ischemiche a carico dell’albumina circolante possano determinare una significativa riduzione delle sue capaci- tà di legare cobalto. Questo test, denominato IMA (Ischemia- Modified Albumin), può essere facilmente implementato sulla maggioranza delle piattaforme tecnologiche di chimica-clinica. Il test appare, di per sé, semplice e di rapida esecuzione, tale, cioè, da poter essere impiegato anche in condizioni di urgenza. Questo test è stato impiegato apparentemente con successo per la diagnosi di ischemia in diversi studi clinici e, nonostante una bassa specificità nei confronti dell’ischemia miocardica, la sua elevata sensibilità e il suo elevato valore predittivo negativo ne hanno fatto proporre l’impiego come test di prima linea nel per- corso diagnostico dei pazienti che vengono ammessi al Pronto Soccorso con dolore precordiale. La bassa specificità nei confron- ti degli eventi ischemici che coinvolgono il miocardio, anziché li- mitarne l’utilizzo, apre nuovi orizzonti per la diagnostica di la- boratorio delle sindromi ischemiche non miocardiche e per gli stati di ipossia generalizzata. Alcune limitazioni, tuttavia, pongono seri caveat. Fra di esse vanno ricordate la chiara identificazione delle proteine respon- sabili del legame del cobalto (l’albumina è solo una di esse), la normalizzazione dei risultati per la concentrazione dei siti le- ganti, la standardizzazione delle metodiche impiegate. Larghi studi controllati sono poi necessari per identificare senza ombra di dubbio le indicazioni e i limiti di questo nuovo e promettente marcatore. Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. medicina di laboratorio 27 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o II nu m er o 1 • Fe bb ra io 2 00 6 • w w w .e cj .it grassi liberi non legati all’albumina5. Il loro successo e la loro applicazione sono stati tuttavia limitati e non di grossa utilità. Un caso diverso è sicuramente rappresen- tato dall’albumina modificata dall’ischemia (IMA, Ische- mia-Modified Albumin) cui il mondo scientifico interna- zionale ha dedicato e sta dedicando una sempre più evi- dente attenzione. Il principio Bar-Or et al. osservarono, per primi, come l’albumina di pazienti in cui si era verificato un evento ischemico pos- sedesse una minore capacità di legare alcuni metalli, in particolare il cobalto6. La porzione N-terminale dell’al- bumina contiene almeno un sito di legame ad alta affini- tà per alcuni metalli di transizione, fra cui il cobalto7. Nel corso dell’evento ischemico la conformazione di tale sito verrebbe modificata, peraltro in modo transitorio, verosimilmente a seguito di un attacco radicalico prove- niente dal tessuto sede dell’evento ischemico o conse- guente alla reazione infiammatoria indotta dall’ischemia stessa. Alternativamente il sito di legame potrebbe esse- re modificato dall’acidosi conseguente all’ischemia o, an- cora, essere occupato competitivamente da metalli libe- rati dal tessuto ischemico stesso, come, ad esempio, di- mostrato per il rame. Sulla base di tali considerazioni è stato sviluppato un metodo di dosaggio il cui principio consiste nel valutare il legame del cobalto all’albumina presente nel siero del paziente in esame. Praticamente il siero viene incubato con una soluzione di cobalto cloruro; una parte di cobal- to si lega all’albumina, mentre la frazione non legata vie- ne rivelata dall’aggiunta di ditiotreitolo che forma con il cobalto libero un complesso colorato che assorbe attor- no a 500 nm. La metodica di dosaggio appare quindi estremamente semplice, di facile esecuzione e imple- mentazione sulla strumentazione di chimica-clinica. Il campione non richiede pretrattamenti e il tempo neces- sario all’esecuzione del test, comprendendo anche la fa- se di centrifugazione, non è superiore ai 25 minuti. Tutte queste condizioni ben si adattano, quindi, all’implemen- tazione di questo test nei laboratori che svolgono indagi- ni d’urgenza e all’impiego di questo stesso test per quesi- ti diagnostici che necessitano di una rapida soluzione e di una altrettanto rapida scelta dei provvedimenti tera- peutici. La riduzione della capacità di legare cobalto presente nell’ischemia modificata dall’albumina è, apparentemen- te, transitoria, sia in vivo sia ex-vivo. Quest’ultima carat- teristica appare particolarmente critica in quanto limite- rebbe le possibilità di effettuare dosaggi su campioni che sono stati prelevati da più di 120-150 minuti o su cam- pioni conservati. È stata altresì sottolineata ripetutamente la necessità di effettuare tale dosaggio esclusivamente su siero e non su plasma contenente EDTA, citrato o anche eparina per la capacità che hanno questi composti di complessare me- talli, e quindi anche cobalto, interferendo con il metodo analitico di dosaggio. Promesse La capacità dell’IMA di individuare eventi ischemici miocardici è stata testata utilizzando modelli in vivo di ischemia transitoria indotta, ad esempio mediante an- gioplastica coronaria transluminale per cutanea (PTCA). Sinha et al. hanno comparato i valori di troponina T e di IMA immediatamente prima e dopo 30 minuti e 12 ore dalla PTCA in un gruppo di 19 pazienti con interessa- mento di un singolo vaso coronario che presentavano, durante la procedura, segni clinici ed elettrocardiografi- ci di ischemia8. Mentre i valori di troponina non presen- tavano variazioni al di sopra dei limiti di riferimento, IMA presentava un significativo aumento dopo 30 minu- ti per poi ritornare normale dopo 12 ore, a indicare la possibilità di individuare l’evento ischemico indipen- dentemente dal verificarsi di una necrosi post-ischemica. Questi risultati sono stati confermati da studi successivi di Quiles et al. che hanno altresì suggerito una possibile correlazione fra l’entità dell’incremento di IMA e l’entità del tessuto interessato dall’evento ischemico, dalla dura- ta dell’ischemia e dalla presenza di un circolo collaterale efficace nel limitare l’impatto tissutale dell’ischemia stes- sa9,10. Questo stesso gruppo ha, infine, evidenziato una stretta correlazione fra l’incremento di IMA e la compar- sa di segni elettrocardiografici di ischemia in pazienti sottoposti a cardioversione elettrica per fibrillazione atriale11. Tutti questi studi, nel loro complesso, dimostrano come il verificarsi di un’ischemia miocardica sia invariabil- mente associato a una riduzione della capacità di legare cobalto da parte dell’albumina e la propongono prepo- tentemente come affidabile marcatore di ischemia. Diversi studi sono stati condotti per valutare le perfor- mance dell’IMA nella diagnostica della cardiopatia ische- mica d’urgenza. La maggioranza di tali studi sono stati condotti su piccoli gruppi, con protocolli differenti e im- piegando metodi differenti di dosaggio. I risultati di uno di questi, a conduzione multicentrica, meritano di essere citati in quanto si riferiscono a più di 200 pazienti arriva- ti al Pronto Soccorso entro tre ore dall’insorgenza del do- lore toracico e con segni clinici e strumentali di cardiopa- tia ischemica ma con valori di troponina I nella norma12. È stata valutata, in questo studio, la capacità di IMA di predire la comparsa di valori elevati di troponina I e, quindi, di necrosi 6-24 ore dopo l’insorgenza della sinto- matologia. La sensibilità e la specificità di IMA sono risul- tate essere del 70% e dell’80% rispettivamente, con un valore predittivo negativo del 96%. Risultati comparabili sono stati ottenuti da Bhagavan et al. che hanno valutato IMA in un gruppo di 75 pazienti con diagnosi di ische- mia miocardica, effettuata sulla base di dati clinici ed elet- trocardiografici, e in un gruppo di 92 pazienti senza evi- denze di ischemia13. La sensibilità e la specificità di IMA sono risultate dell’88% e del 94% rispettivamente, con un valore predittivo negativo del 91%. Sinha et al. hanno, infine comparato sensibilità e specifi- cità di IMA, elettrocardiogramma e troponina T, da soli o in combinazione, nella diagnostica delle sindromi coro- nariche acute. I risultati, riportati nella Figura 1, eviden- ziano come, rispetto ai marcatori di necrosi e all’elettro- cardiogramma, IMA sia dotata di una maggiore sensibili- tà. La combinazione dei tre approcci diagnostici permet- te di ottenere una sensibilità vicina al 95%12. Già le prime segnalazioni e alcuni dei lavori più recenti evidenziano, però, una specificità di IMA relativamente bassa. In effetti, si ritiene che le modificazioni strutturali responsabili di una riduzione della capacità di legare co- balto presente nell’albumina modificata dall’ischemia, non siano dipendenti dalla tipologia del tessuto interessa- to dal processo ischemico. Questa caratteristica, anziché rappresentare una seria limitazione, potrebbe aprire inte- ressanti scenari sull’utilizzo di IMA in condizioni cliniche diverse dall’ischemia miocardica. Di queste, sicuramente la più interessante è la sofferenza ipossica fetale nel caso di gravidanze o parti complicati, come recentemente di- mostrato da Gugliucci et al.14 Cautele In un recente ed elegante studio, van der Zee et al. hanno indagato le correlazioni esistenti fra la comparsa di IMA e i risultati derivanti dalla scintigrafia perfusoria miocardi- ca condotta durante l’esercizio fisico in un gruppo di 38 pazienti con sospetto di malattia ischemica coronaria15. Nel corso dell’indagine 15 pazienti hanno sviluppato ischemia miocardica inequivocabilmente dimostrata dai dati scintigrafici. Paradossalmente, in questi pazienti, a seguito del verificarsi dell’ischemia, IMA si riduceva tran- sitoriamente anziché aumentare. Inoltre, una regressione lineare multivariata evidenziava come la concentrazione serica di albumina risultasse il solo parametro predittivo della concentrazione di IMA. Questo riscontro pone prepotentemente alla ribalta un problema non indifferente legato all’influenza della con- centrazione di albumina sulla capacità del siero o di ciò che in esso è contenuto di legare cobalto. Il maggiore pro- duttore e distributore del test e anche una recente rasse- gna3 suggeriscono cautela nell’interpretazione dei dati di IMA in pazienti con concentrazione serica di albumina inferiore a 2,5 g/dl o superiore a 5 g/dl. È tuttavia da os- servare come i due casi estremi contemplati siano caratte- rizzati da concentrazioni di albumina l’una il doppio del- l’altra e quindi, di per sé, in grado di spiegare differenze consistenti della capacità di legare cobalto. Inoltre, in stu- di osservazionali di popolazioni diventa strettamente ne- cessario che i gruppi in esame siano, fra di loro, assoluta- mente comparabili per quanto riguarda la concentrazio- ne di albumina: tale prerequisito non è quasi mai stato ri- spettato in tutti gli studi fino ad ora condotti. Un altro aspetto degno di nota, ma sul quale non è stata mai posta una particolare attenzione, è relativo al fatto che mentre il test misura direttamente la capacità legan- te cobalto da parte di tutti i siti presenti nel campione di siero in esame, si assuma che qualsivoglia modificazione di tale capacità legante sia da imputare a modificazioni strutturali della porzione N-terminale dell’albumina. Ad esempio, altre proteine diverse dall’albumina, come tra- sferrina16 e apoproteine AI e B10017, sono in grado di le- gare metalli come il rame e il cobalto. Studi condotti presso il nostro laboratorio hanno, ad esempio, dimo- strato che l’albumina rende ragione di non più del 60% del legame del cobalto alle varie componenti seriche. È evidente che, alla luce di queste riflessioni, anche tali va- riabili debbano essere tenute in considerazione nell’in- terpretazione dei risultati ottenuti nei vari studi clinici. Non bisogna dimenticare, inoltre, che una riduzione del- la capacità legante il cobalto da parte delle varie compo- nenti seriche possa essere imputabile alla competizione da parte di altri metalli liberati nel corso dell’evento ischemico. Studi condotti nel nostro laboratorio hanno infatti dimostrato che il rame (Cu++) è in grado di inibire in modo significativo il legame del cobalto sia all’albumi- na umana purificata sia al siero in toto (Figura 2). Tale os- servazione assume una rilevanza notevole alla luce della dimostrazione che, a seguito di un evento ischemico mio- cardico, la concentrazione di Cu++ nel seno coronario au- menta di circa 50 volte rispetto ai valori basali18. Un’ultima osservazione riguarda la mancanza di standar- dizzazione della metodica per il dosaggio di IMA, l’im- piego di unità di misura le più variegate e l’utilizzo di va- Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. medicina di laboratorio 28 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o II nu m er o 1 • Fe bb ra io 2 00 6 • w w w .e cj .it Fig. 1 - Sensibilità di IMA, elettrocardiogramma (ECG) e troponina T (cTnT) da soli o in combinazione, nell’identificazione dell’ischemia miocardica. Da Sinha et al.12, modificato. Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. medicina di laboratorio 29 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o II nu m er o 1 • Fe bb ra io 2 00 6 • w w w .e cj .it ischemia and risk stratification in acute coronary syndromes. Clin Chem 2005; 51: 810-824. 4. Danne O, Mockel M, Lueders C et al. Prognostic implications of elevated whole blood choline levels in acute coronary syndromes. Am J Cardiol 2003; 91: 1060-67. 5. Apple FS, Kleinfeld AM, Adams J III. Unbound free fatty acid con- centrations are increased in cardiac ischemia. Clin Proteomics 2004; 1: 169-172. 6. Bar-Or D, Lau E, Winkler JV. Novel assay for cobalt-albumin bind- ing and its potential as a marker for myocardial ischemia. A prelim- inary report. J Emerg Med 2000; 19: 311-315. 7. Bar-Or D, Curtis G, Rao N et al. Characterization of the Co2 and Ni2 binding amino-acid residues of the N-terminus of human albumin. 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This test (IMA, Ischemia-Modified Albumin) can be easi- ly implemented on most of the technological platforms employed for clinical chemistry assays. It is simple and rapid and suitable for most of the diagnostic purposes of emergency medicine. This assay has been successfully employed to detect myocardial is- chemia in various clinical studies and, despite a low specificity for myocardial ischemia, its high sensitivity and negative predictive value have pointed out its possible role as a first-line assay in clin- ical setting of patients with chest pain admitted to the Emergency Department. The low specificity toward ischemic events occurring to myocardium is challenging its use in clinical conditions associ- ated with tissue ischemia or whole body hypoxia. Few caveat, however, must be taken into account. They include the clear identification of the proteins responsible for cobalt binding, the normalization of the results for the serum concen- tration of the binding sites, the standardizations of the assays employed. Large randomized trials are also absolutely needed to undoubtedly identify the potential and the limit of this new and promising biomarker. lori di cut-off differenti. Alla luce dell’enorme rilevanza potenziale di un biomarcatore di ischemia, che verrebbe a colmare un notevole vuoto diagnostico, è indispensa- bile un momento di riflessione e di ricerca programmata volta a validare in modo inequivocabile il test e le sue li- mitazioni. Studi controllati e correttamente pianificati e condotti su ampi numeri potranno finalmente chiarire se tale vuoto possa essere colmato. Bibliografia 1. Van de Werf F, Ardissino D, Betriu A et al. Management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment eleva- tion. 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