Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. 34 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o III n um er o II • A pr ile 2 00 7 • w w w .e cj .it tossicologia e NBCR emergency care journal La microbiologia forense e il pericolo del bioterrorismo (2a parte) Maria Nasso, Francesco Saverio Romolo* Dipartimento Malattie Infettive Parassitarie e Immunomediate, Istituto Superiore di Sanità, Roma *Dipartimento di Medicina Legale, Roma SINTESI Gli attacchi bioterroristici del 2001 con le lettere contenenti an- trace hanno dimostrato che gli agenti patogeni e le tossine pos- sono essere concretamente utilizzati come armi per un attentato terroristico. Per affrontare tali situazioni è nata una nuova di- sciplina nell’ambito delle scienze forensi, definita microbial fo- rensics (microbiologia forense), che contribuisce alle indagini su un crimine eseguito utilizzando un’arma biologica. L’indagine di microbiologia forense si pone l’obiettivo di identificare l’agente patogeno responsabile, come avviene nel caso di un’indagine epi- demiologica, ma con un grado di caratterizzazione molto più ele- vato. In questo caso si procede con un’analisi genetica per cerca- re di individuare univocamente la fonte del patogeno utilizzato, seguendo un approccio comune a tutta la criminalistica, volto a classificare ed eventualmente identificare “le tracce e le cose per- tinenti al reato”. In seguito agli attacchi del 2001 si è effettuata la genotipizzazione del B. anthracis su 8 loci polimorfici VNTR (variable number tandem repeat) con la MLVA (multilocus variable tandem repeat analysis). Recentemente, alcuni grup- pi di ricerca hanno aumentato il numero dei loci a 25, mentre un altro gruppo ha individuato un altro tipo di polimorfismi (SNR, single nucleotide repeat) con un maggiore grado di mutazio- ne. Il sistema basato sui markers SNRs permette di distinguere fra isolati batterici che hanno una bassissima variabilità geneti- ca e che mostrano un identico genotipo MLVA. La nuova frontiera dei microbial forensics: un network di competenze interdisciplinari per fronteggiare il fenomeno del bioterrorismo Il bioterrorismo costituisce una problematica di grande rilievo per l’intera comunità internazionale, non esistendo ancora una definizione chiara che possa delimitare con certezza la portata del fenome- no, né una normativa idonea a fornire strategie e strumenti efficaci di contrasto. Nonostante si sia ini- ziato a parlare di bioterrorismo già in anni preceden- ti, è nell’ottobre del 2001 che va collocato il primo vero attacco bioterroristico1,2. Fu immediatamente evidente che gli strumenti giuridici internazionali (come, ad esempio, la BTWC, Biological and Toxin Weapons Convention) possedevano un loro limite in- trinseco, poiché non tenevano conto della comples- sità del fenomeno e della sua continua evoluzione3. Gli attacchi del 2001 misero in evidenza l’assoluta ne- cessità di sperimentare nuove strategie di lotta al bio- terrorismo, basate su una cooperazione massiccia fra tutti gli organi coinvolti, che consentisse un articola- to sistema di monitoraggio ed elaborazione delle in- formazioni scientifiche. Proprio con questo spirito si affrontarono le indagini che seguirono a tali eventi: si avviò subito un’indagine microbiologica4, svolta dalla Sanità Pubblica, e un’indagine di tipo forense, svolta dall’FBI, che si avvalse della collaborazione di un gruppo di lavoro costituito da scienziati di diver- se discipline, noto come Scientific Working Group on Microbial Genetics and Forensics (SWGMGF)5. Si realizzò, così, un’infrastruttura caratterizzata da tools analitici e conoscenze che ebbero come scopo l’esecuzione di un’indagine sugli eventi più rapida ed Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. tossicologia e NBCR 35 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o III n um er o II • A pr ile 2 00 7 • w w w .e cj .it efficace6,7. Denominatore comune di questo network di competenze fu una nuova disciplina, definita mi- crobial forensics, che si poneva l’obiettivo di fornire gli elementi necessari all’indagine giudiziaria per at- tribuire a uno specifico colpevole7-9 il crimine perpe- trato attraverso l’utilizzo di un agente biologico. In realtà l’FBI aveva già sfruttato questo tipo di approc- cio in seguito all’emergenza dei reati sessuali sorta a metà degli anni Novanta, istituendo un gruppo di la- voro specializzato. Lo scopo era stato quello di pro- muovere la redazione di linee guida che permettesse- ro di utilizzare l’analisi genetica del DNA umano effet- tuata in laboratorio nell’ambito di un processo pena- le10,11. Dopo il 2001 si tentò di raggiungere lo stesso contributo scientifico alle indagini, sfruttando i risul- tati già ottenuti con gli studi realizzati dalla Sanità Pub- blica nell’ambito delle malattie infettive, soprattutto da parte dei Centers for Disease Control and Prevention (CDCs), laboratori deputati al controllo e alla preven- zione di queste malattie12. Quando si cominciò, poi, a percepire il rischio di un potenziale utilizzo di agenti biologici per un attacco terroristico, i CDCs entrarono a far parte del Laboratory Response Network, una rete organizzata per realizzare una più rapida identifica- zione degli agenti utilizzati e, quindi, potenziare la ri- sposta a un possibile attacco con queste armi13,14. Il Laboratory Response Network doveva raccordare la- boratori sanitari locali con laboratori centrali alta- mente specializzati (i CDCs appunto), classificati a seconda del livello di sicurezza richiesto (Biosafety le- vel, BSL) in ordine crescente come BSL1, BSL2, BSL3 e BSL4, idonei a operare in condizioni di rischio con- trollate, avvalendosi delle più moderne tecniche di analisi15, secondo procedure operative standardizza- te e validate in costante aggiornamento16-18. Ai CDCs fu affidato il compito di realizzare corsi di formazione per gli operatori che dovevano lavorare con i patogeni “a rischio”. Nel 2000 fu realizzato il Bioterrorism Preparedness and Response Program, or- ganizzato in quattro sessioni di lavoro, dedicate allo studio di B. anthracis, Brucella Spp, Yersinia pestis e Francisella Tularensis. In queste sessioni, a cui parte- cipò anche l’FBI, furono descritti i criteri fondamen- tali per l’identificazione primaria e di conferma dei patogeni15 e furono distribuiti i protocolli contenen- ti le metodiche a cui attenersi19. Tali protocolli erano stati sviluppati dal SWGMGF e definiti come Quality Assurance Guidelines for Laboratories Performing Mi- crobial Forensic Work20. In queste linee guida erano descritti, oltre alle procedure analitiche e alla valida- zione dei metodi, anche le procedure di sicurezza e il personale idoneo a lavorare nell’ambito di un’in- dagine di microbiologia forense21. Molti punti ripor- tati nel programma di Quality Assurance stilato dal SWGMGF furono riproposti nelle linee guida più ge- nerali, formulate circa un anno dopo dall’Internatio- nal Standards Organization (ISO) a cui tutti i labora- tori con certificazione di qualità avrebbero dovuto fa- re riferimento. L’idea di affidare ai laboratori accredi- tati dei CDCs il compito di effettuare e coordinare le indagini a seguito di un attacco bioterroristico deri- vò dal fatto che le analisi svolte nei laboratori micro- biologici, principalmente a scopo di diagnosi medi- ca o di monitoraggio epidemiologico, sono per lo più le stesse analisi che sottendono ai microbial forensics22. Il sopralluogo in microbiologia forense Un’indagine di microbiologia forense segue gli stessi principi di un’indagine forense classica di tipo crimina- listico. L’attività ha sempre inizio sulla scena di un cri- mine e presuppone i due principi della criminalistica. Nel caso dell’attacco bioterroristico il criminale lascia deliberatamente il materiale pericoloso sulla scena del crimine (principio di Locard). In realtà possono essere individuate più scene del crimine: il luogo o i luoghi di preparazione e conservazione degli strumenti dell’at- tacco, quello di spedizione e/o quello di rilascio. In tut- ti questi luoghi il materiale pericoloso può essere sud- diviso in più parti grazie alla sua divisibilità: la suddivi- sione potrà essere operata volontariamente, ad esempio per realizzare più lettere contenenti spore di Bacillus an- thracis, o involontariamente, lasciando tracce che po- tranno essere utili alle indagini una volta identificate. La scena non deve essere semplicemente individuata e protetta da alterazioni e contaminazioni esterne, ma deve essere prima di tutto trattata come il luogo di un’emergenza, dove al problema dell’esercizio del- l’azione penale si aggiungono i rischi per la salute pubblica e la pubblica sicurezza. È necessario, infatti, evitare che l’agente patogeno sia disperso, rendendo più gravi le conseguenze del crimine e, qualora que- sto non sia possibile, si devono allontanare coloro che rischiano di essere contagiati. Allo stesso tempo è ne- cessario prestare soccorso alle eventuali vittime. Du- rante le attività necessarie a risolvere l’emergenza, le uniche tipicamente criminalistiche che possono esse- re svolte sono la realizzazione di riprese video e di ri- lievi descrittivi, fotografici ed eventualmente planime- trici, da posizioni che garantiscano la sicurezza degli operatori. In tutte queste operazioni, infatti, come in quelle successive di prelievo, trasporto e analisi dei campioni, è di fondamentale importanza che gli ope- ratori lavorino in condizioni di massima sicurezza23. Una volta che l’area di pericolo risulta circoscritta, è possibile individuare uno o più punti d’accesso alla sce- na del crimine, definire le procedure di entrata e uscita degli specialisti e di raccolta e trasporto dei campioni da prelevare. Gli specialisti devono quindi realizzare i rilie- Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. tossicologia e NBCR 36 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o III n um er o II • A pr ile 2 00 7 • w w w .e cj .it vi necessari a descrivere in modo esauriente la scena del crimine. Terminata la fase dei rilievi è possibile racco- gliere i reperti sui quali effettuare accertamenti di labo- ratorio. La raccolta deve essere svolta garantendo la co- sì detta “catena di custodia”, attraverso procedure che impediscano la dispersione o la sostituzione del mate- riale o almeno consentano di verificare che dispersioni e sostituzioni non si siano verificate a partire dalla sce- na del crimine. La caratteristica peculiare dell’indagine forense microbiologica è che i reperti rappresentano un rischio biologico, quindi deve essere garantita la salute degli operatori e di terzi al momento del prelievo, du- rante il trasporto, la conservazione e gli accertamenti. Le indagini di laboratorio Nella fase di laboratorio e di interpretazione dei risulta- ti emergono ancor più chiaramente le differenze fra un’i- ndagine epidemiologica e un’indagine forense condotta su un microrganismo. Secondo quanto descritto nel rap- porto conclusivo di un convegno tenutosi nel 2003 ne- gli Stati Uniti, redatto dall’American Academy of Microbi- ology, «le scienze forensi hanno pretese molto più strin- genti rispetto alla scienza epidemiologica: in primo luo- go il mantenimento di una catena di custodia per i cam- pioni che sono sottoposti ad analisi e, in secondo luo- go, la necessità, per le scienze forensi, di identificare il microbo con un grado di dettaglio molto più alto»24,25. Nella criminalistica è necessario partire da una classi- ficazione delle tracce pertinenti il reato per giungere, ove possibile, all’identificazione della fonte di tale traccia e alla ricostruzione della sequenza di even- ti26. Dal punto di vista metodologico, l’investigazione microbiologica forense si pone, dunque, l’obiettivo di individuare l’esatta variante genomica, piuttosto che la più semplice caratterizzazione fenotipica. L’individua- zione della natura del microrganismo responsabile del contagio, che risulta sufficiente per un’analisi epidemio- logica, non lo è per assicurare il responsabile di una condotta criminale alla giustizia. Solo con l’analisi gene- tica (DNA fingerprinting) si può risalire alla fonte del- l’agente biologico e, quindi, a coloro che, verosimil- mente, avrebbero potuto avere accesso a quella fonte, procurandosi l’agente patogeno da utilizzare, successi- vamente, per un attacco bioterroristico24. Una tipica in- dagine di microbial forensics, quindi, accanto all’impiego delle più classiche procedure di analisi microbiologica, si avvale dello studio dei polimorfismi, analogamente a quanto avviene per l’analisi forense del DNA umano. I polimorfismi sono variazioni nel genoma che consi- stono di mutazioni spontanee puntiformi a carico di un singolo nucleotide (single nucleotide polymorphism, SNP), oppure di mutazioni che comportano variazioni nella lunghezza di un determinato locus genico, poi- ché caratterizzate da un diverso numero di ripetizioni di determinate sequenze di DNA all’interno di un fram- mento specifico (copy number polymorphism, CNP). Nell’ambito delle CNP si distinguono i microsatelliti (short tandem repeats, STR) e i minisatelliti (variable number tandem repeats, VNTR) che consistono di se- quenze ripetute in tandem contenenti 10-20 nucleoti- di, particolarmente abbondanti nei microrganismi27,28. Da quando sono iniziati i primi studi sui polimorfismi, sono stati messi a punto diversi approcci e lo sviluppo di tecniche sempre più rapide e affidabili ha subito, nel tempo, un notevole progresso sia in termini di qualità sia di quantità di analisi effettuabili: se si considera che il genoma umano arriva a contenere miliardi di nucleo- tidi, è evidente come il fattore limitante in questo tipo di indagine sia rappresentato proprio dalla dimensio- ne del genoma e, quindi, dalle tecniche usate per ana- lizzarlo. Oggi gli approcci che forniscono i risultati più rapidi e attendibili sono tutti basati sull’amplificazio- ne dei frammenti di DNA attraverso la ben nota tecni- ca della polymerase chain reaction (PCR)29. È importante notare che lo studio dei polimorfismi, applicato alle scienze forensi, non è cosa recente ma già da molto tempo era stato messo a punto per l’ana- lisi del DNA umano, consentendo di individuare, ad esempio, le tracce di DNA rinvenibili sulla vittima e provenienti da un determinato soggetto, sospettato come autore del reato, oppure per effettuare un’iden- tificazione di familiarità fra due individui. Quando si pensò di applicare questo tipo di approccio a una caratterizzazione genotipica di un isolato batte- rico o di un virus, ci si scontrò con una serie di proble- mi: nel caso dei microbi era necessario preliminar- mente identificare con certezza quale fosse il patogeno coinvolto, inoltre bisognava considerare che i virus e la maggior parte dei batteri sono aploidi e, quindi, si riproducono per via asessuata, per ricombinazione o duplicazione genica. Per questo motivo le metodolo- gie analitiche e statistiche, oltre che l’interpretazione dei risultati, si dovevano avvalere di tools differenti ri- spetto a quelli utilizzati correntemente per analizzare il profilo diploide del DNA umano30. Infine, al con- trario del genoma umano, fortemente ridondante, gli organismi inferiori hanno un genoma molto meno complesso e, quindi, con un numero di polimorfismi molto più ridotto31. Il Bacillus anthracis, in particola- re, rappresenta uno dei batteri geneticamente più mo- nomorfi, poiché rimane per lungo tempo nello stato dormiente di spora a elevata sopravvivenza. Secondo recenti studi, la probabilità che all’interno del genoma del B. anthracis subentri una mutazione SNP è pari a un valore di 10-10 mutazioni per nucleo- tide per generazione, quindi estremamente bassa, mentre per un polimorfismo VNTR è stato stimato un valore molto più alto, compreso fra 10-5 e 10-4 muta- Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. tossicologia e NBCR 37 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o III n um er o II • A pr ile 2 00 7 • w w w .e cj .it zioni per generazione, contro quello di 10-3 per gli altri batteri32. È per questo motivo che la genotipiz- zazione del B. anthracis viene effettuata proprio ana- lizzando i polimorfismi VNTR, nonostante siano sta- ti sviluppati metodi di analisi sui polimorfismi SNP33. Alla luce di quanto sinora considerato, risulta eviden- te, quindi, che per un’analisi genetica svolta a scopo forense (microbial forensics) è necessario proporsi due obiettivi fondamentali: individuare un appropriato ti- po di polimorfismo da analizzare34 e raggiungere il più elevato grado di certezza possibile o, più corret- tamente, consentire l’apprezzamento del rapporto tra la probabilità dell’ipotesi dell’accusa e quella della di- fesa, dato un elemento di prova35,36. Le indagini che seguirono l’attacco bioterroristico del 2001 furono svolte scegliendo quelle metodiche che nel tempo avevano fornito le migliori garanzie37. Il B. anthracis possiede un DNA cromosomico e due pla- smidi, pOX138 e pOX239, sui quali si trovano i geni codificanti per i fattori di virulenza: la capsula40 nel primo e la tossina dell’antrace41 nel secondo, la qua- le è costituita da 3 subunità, letal factor (LF), edema factor (EF) e protective antigen (PA), ognuna codifica- ta da un gene diverso42. Proprio sul B. anthracis furo- no sviluppati numerosi studi con lo scopo di indivi- duarne i polimorfismi fino a quando, tra il 1996 e il 1997, due gruppi di scienziati arrivarono all’identifi- cazione di 8 loci genici contenenti sequenze VNTR, che mostrarono un elevato grado di variabilità fra i di- versi ceppi analizzati43,44. Per l’identificazione di que- sti loci furono sequenziati diversi frammenti di DNA attraverso la tecnica amplified fragment length polymor- phism (AFLP)45, utilizzata anche per la determinazio- ne delle relazioni filogenetiche del bacillo dell’antra- ce con gli altri bacilli della stessa famiglia (B. cereus e B. thuringiensis)43,44,46. In particolare, 6 degli 8 loci po- limorfici furono individuati sul DNA cromosomiale (CG3, vrrA, vrrB1, vrrB2, vrrC1, vrrC2) e altri due (pXO2-at e pXO1-aat) sui due plasmidi43,44. Nel 1999 altri studi si focalizzarono sull’analisi del tratto di DNA del plasmide pOX2, contenente il ge- ne pagA, codificante per il fattore di protezione anti- genico (PA), a cui è associato lo sviluppo dell’immu- nità verso il carbonchio47. La tipizzazione di questo locus portò alla caratterizzazione di 6 genotipi diffe- renti e ha rappresentato una scoperta molto impor- tante, perché può fornire informazioni utili circa la possibilità che il batterio usato per l’attacco bioterro- ristico sia stato ingegnerizzato, ad esempio, per au- mentarne la patogenicità48. Nel 2000 gli stessi grup- pi di scienziati che individuarono le sequenze VNTR per il B. anthracis misero a punto una nuova tecnica di analisi dei polimorfismi, sfruttando gli stessi loci polimorfici individuati in precedenza, e nota come multiple locus variable number of tandem repeat analy- sis (MLVA), impiegata oggi di routine per la determi- nazione genomica del B. anthracis e utilizzata con successo anche per lo studio dei polimorfismi di al- tri patogeni molto conservati, come Yersinia pestis49-51 e Francisella tularensis52,53, anch’essi considerati agen- ti patogeni utilizzabili a scopo bioterroristico. Lo studio con la MLVA fu condotto sui 419 ceppi di B. anthracis isolati in tutto il mondo e consentì di deter- minare 89 differenti genotipi, i quali filogeneticamente discendono tutti da sei grandi gruppi genetici ancestra- li del B. anthracis54. Rispetto alla AFLP, con questa tec- nica è possibile analizzare un numero di sequenze di DNA elevatissimo in un tempo molto più breve. Nella Tabella 1 sono riportati gli isolati batterici, classi- ficati per regione, su cui l’analisi venne effettuata e a cui furono attribuiti i diversi genotipi, mentre in Figura 1 è riportato l’albero filogenetico costruito proprio grazie al- la tipizzazione genetica. Nella Tabella 2, invece, sono riportati i genotipi associati non solo alle regioni ma an- che ai centri che ufficialmente li possiedono. Grazie a questi studi condotti nel 2000 è possibile individuare specificamente la fonte ufficiale di ogni ceppo di B. an- thracis isolato. Fu presto evidente, però, che la MLVA messa a punto sugli 8 loci descritti (MLVA8) non forni- va un elevato grado di discriminazione fra i diversi ge- notipi, per cui risultava molto limitante sia per un’in- dagine epidemiologica sia per un’indagine forense. Poco tempo dopo furono individuati ulteriori loci polimorfici, fino a quando, un anno dopo, il grup- po di Le Flèche pubblicò i propri risultati, propo- nendo 14 sequenze VNTR aggiuntive55. L’ultimo ri- sultato raggiunto in questo senso, però, si è ottenu- to con il lavoro di Lista e collaboratori, pubblicato recentemente su BMC Microbiology, in cui viene ri- portato un sistema di genotipizzazione molto rapido, accurato e riproducibile. In particolare, sono state individuate altre 4 sequenze polimorfiche identifica- tive che, aggiunte al pannello elaborato da Le Flè- che nel 2001, hanno permesso di aumentare il nu- mero di loci VNTR da 21 a 25 (MLVA25), sfruttando un sistema di analisi MLVA basato su un metodo au- tomatizzato di elettroforesi capillare. I dati ottenuti con l’elettroforesi capillare hanno confermato quan- to era già stato dimostrato nei lavori precedenti, ma hanno permesso di risolvere nuovi alleli che con le tecniche di separazione su gel d’agarosio non era sta- to possibile separare. Il metodo di genotipizzazione messo a punto da Lista e collaboratori, a oggi, è quel- lo che fornisce il massimo grado di discriminazione genotipica del B. anthracis, effettuabile con un costo contenuto e in un tempo sufficientemente breve56. Di recente, un altro gruppo di ricerca ha messo a pun- to un nuovo metodo di genotipizzazione, avvalendosi di Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. tossicologia e NBCR 38 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o III n um er o II • A pr ile 2 00 7 • w w w .e cj .it un approccio in silico, basato sull’analisi delle SNRs (sin- gle nucleotide repeat)57, variazioni ripetute di mononu- cleotidi, appartenenti al genere di polimorfismi VNTR, ma con un grado di mutazione ancora più elevato34. Le sequenze SNRs sono state identificate in un discreto nu- mero di batteri e già erano state oggetto di studio per la tipizzazione genotipica di alcuni di essi58-60. Attraverso lo studio di questi polimorfismi sul B. anthracis è stato possibile discriminare isolati o strain batterici che han- no una diversità genetica estremamente bassa. In parti- colare, si sono potuti differenziare isolati di B. anthracis che, analizzati con la MLVA, avevano presentato un identico genotipo57. Questo tipo di approccio non è indicato per individua- re le relazioni filogenetiche, per le quali risulta più appro- priata l’analisi MLVA. Piuttosto, risulta particolarmente efficace per gli studi epidemiologici o per un’indagine in ambito forense in cui è richiesto il più elevato grado di discriminazione genetica fra gli isolati batterici. Le attività svolte in seguito agli attacchi bioterroristici del 2001 Le indagini che si svolsero dopo gli attentati bioterro- ristici del 2001 con B. anthracis partirono dai risultati che si erano ottenuti, nel 2000, con il lavoro svolto dal TAB. 1 Isolati di B. anthracis sui quali fu effettuata l’analisi tramite la multiple locus variable number of tandem repeats analysis (MLVA) (Keim54). Continente Regione (sigla) Numero di isolati Numero di genotipi Africa Mozambico (MOZ) 5 4 Namibia (NAM) 23 7 Sud Africa (SAF) 127 9 Tanzania (TANZ) 5 1 Zambia (ZAM) 17 2 Zimbawe (ZIM) 4 2 Subtotale 181 18 Asia Cina 7 5 India 3 2 Indonesia (INDO) 5 4 Pakistan (PAK) 4 4 Corea del Sud (KOR) 4 2 Turchia (TURK) 41 12 Subtotale 64 31 Australia 30 3 Europa Croazia (CRO) 1 1 Francia (FRA) 8 3 Germania (GER) 9 5 Ungheria (HUN) 3 2 Irlanda (IRE) 1 1 Italia 3 2 Norvegia (NOR) 5 5 Polonia (POL) 1 1 Slovacchia (SLO) 3 2 Spagna (SPA) 2 1 Svizzera (SWI) 2 2 Gran Bretagna (UK) 19 10 Subtotale 57 32 Nord America Canada (CAN) 51 7 Haiti 1 1 Stati Uniti (USA) 32 16 Subtotale 84 22 Sud America Argentina (ARG) 2 2 Brasile (BRA) 1 1 Subtotale 3 3 TOTALE 419 89 Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. tossicologia e NBCR 39 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o III n um er o II • A pr ile 2 00 7 • w w w .e cj .it Fig. 1 - Albero filogenetico ricostruito in base ai diversi genotipi determinati tramite la multiple locus variable number of tandem repeat analysis (MLVA). L’albero mette in relazione i genotipi (G), classificati numericamente da 1 a 89, le regioni geografiche di provenienza degli isolati batterici, come classificati nella Tabella 1 (Geo. Region), a cui è stato associato un determinato genotipo, le regioni polimorfiche variable number tandem repeat (VNTR) attraverso le quali sono stati ricostruiti i rapporti filogenetici fra i diversi isolati (cluster). Lo strain di appartenenza dell’isolato di B. anthracis utiliz- zato per l’attacco bioterroristico del 2001 è l’Ames corrispondente al genotipo 6254. Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. tossicologia e NBCR 40 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o III n um er o II • A pr ile 2 00 7 • w w w .e cj .it TAB. 2 Associazione dei genotipi determinati con la multiple locus variable number of tandem repeat analysis (MLVA) con gli isolati di B. anthracis e con i centri in cui ognuno di essi ufficialmente si trova54. Genotipo Regione Fonte* Genotipo Regione Fonte* 1 Italia IZS 46 Argentina GELAB 2 Canada ADRI 47 Gran Bretagna CAMR 3 Canada ADRI 48 Gran Bretagna CAMR 4 Iowa USAMRIID 49 Gran Bretagna CAMR 5 Canada ADRI 50 Scozia CAMR 6 Texas TVMDL 51 Maryland USAMRIID 7 Canada USAMRIID 52 India CMCH 8 Canada ADRI 53 India CMCH 9 Canada ADRI 54 Namibia DRM 10 S. Dakota ADRDL 55 Australia CAMR 11 Turchia EM 56 Namibia DRM 12 Turchia EM 57 Cina CAMR 13 Cina CAMR 58 Canada ADRI 14 Cina CAMR 59 Cina IEM 15 Polonia VMRI 60 Germania IUTSTT 16 Ungheria VMRI 61 Germania IUTSTT 17 Norvegia CVL 62 Gran Bretagna USAMRIID 18 Slovacchia IUTSTT 63 Indonesia RIVS 19 Ungheria VMRI 64 Indonesia RIVS 20 Italia IZS 65 Germania IUTSTT 21 Inghilterra CAMR 66 Australia EMAI 22 Inghilterra CAMR 67 Sud Africa KNP 23 Turchia EM 68 Ohio USAMRIID 24 Inghilterra CAMR 69 Pakistan USAMRIID 25 Florida ATCC 70 Norvegia CVL 26 Zambia CAMR 71 Irlanda USAMRIID 27 Norvegia CVL 72 Germania IUTSTT 28 Turchia EM 73 Cina CAMR 29 Pakistan VRI 74 Pakistan IUTSTT 30 Zambia CVLL 75 Svizzera IUTSTT 31 Indonesia RIVS 76 Pakistan USAMRIID 32 Corea del Sud DMNIH 77 Gran Bretagna CAMR 33 Turchia EM 78 Norvegia CVL 34 Corea del Sud DMNIH 79 Francia IP 35 Namibia DRM 80 Francia IP 36 Turchia EM 81 Sud Africa USAMRIID 37 Turchia EM 82 Sud Africa USAMRIID 38 Germania IUTSTT 83 Mozambico INV 39 Namibia DRM 84 Gran Bretagna CAMR 40 Namibia CAMR 85 Mozambico INV 41 Turchia EM 86 Norvegia CVL 42 Turchia EM 87 Sud Africa KNP 43 Turchia EM 88 Sud Africa USAMRIID 44 Namibia USAMRIID 89 North. Carolina USAMRIID 45 Argentina GELAB * ADRDL: Animal Disease Research and Diagnostic Laboratory, South Dakota State University; ADRI: Animal Diseases Research Institute, Alberta, Canada; ATCC: American Type Culture Collection, Manassas, Va.; CAMR: Center for Applied Microbiology and Research, Porton Down, United Kingdom; CMCH: Christian Medical College and Hospital, Tamil Nadu, India; CVL: Central Veterinary Laboratory, Oslo, Norway; CVLL: Central Veterinary Laboratory, Lusa- ka, Zambia; DMNIH: Department of Microbiology, National Institute of Health, Seoul, South Korea; DRM: Directorate of Resource Management, Windhoek, Namibia; EM: Enstutusu Muduriugu, Ankara, Turkey; EMAI: Elizabeth MacArthur Agricultural Institute, New South Wales, Australia; GELAB: Department Bacteriologia General, Buenos Aires, Argentina; IEM: Institute of Epidemiology and Microbiology, Changping, China; INV: Instituto Nacional de Veterinaria, Maputo, Mozambique; IP: Institut Pasteur, Paris, France; IUTSTT: Institut für Unwelt und Tierhygiene Sowie Tiermedizin mit Tierklinik, Stuttgart, Germa- ny; IZS: Istituto Zooprofilattico Sperimentale, Foggia, Italy; KNP: Kruger National Park, South Africa; RIVS: Research Institute for Veterinary Science, Bogor, Indonesia; TVMDL: Texas Veterinary Medical Diagnostic Laboratory, College Station, Texas; USAMRIID: United States Army Medical Research Institute for Infectious Diseases, Maryland; VMRI: Veterinary Medical Research Institute, Budapest, Hungary; VRI: Veterinary Research Institute, Lahore, Pakistan. Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. tossicologia e NBCR 41 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o III n um er o II • A pr ile 2 00 7 • w w w .e cj .it gruppo di Keim, sfruttando, per la prima volta, un complesso network di competenze5,20. L’indagine del- la Sanità Pubblica, infatti, si arrestò nel momento in cui fu individuato il patogeno responsabile del contagio. L’indagine forense, invece, necessitava della determi- nazione dell’esatto sottotipo del ceppo batterico in mo- do da circoscriverne l’origine24. Generalmente, nella diagnostica microbiologica, l’iden- tificazione definitiva dell’isolato batterico avviene tra- mite l’esecuzione di test di caratterizzazione biochimi- ca o antigenica che richiedono la manipolazione e la crescita in coltura del microrganismo. L’indagine si concentra sulla determinazione delle differenze fenoti- piche tra il bacillo dell’antrace e gli altri componenti della famiglia, analizzando la perdita della motilità, del- la capacità di indurre emolisi, la suscettibilità alla pe- nicillina e la morfologia della colonia. Accanto a questo tipo di approccio identificativo, in questi ultimi anni sono state messe a punto tecniche di biologia moleco- lare che garantiscono una maggiore sicurezza all’opera- tore, offrono la possibilità di analizzare campioni inat- tivati o direttamente il DNA estratto, oltre che fornire un’identificazione certa del microrganismo responsabi- le61. L’indagine forense in seguito agli attacchi bioterro- ristici con B. anthracis, invece, procedette con l’identi- ficazione dei polimorfismi, allo scopo di individuare quale fosse la variante genomica del ceppo batterico. L’analisi fu condotta sugli stessi campioni che erano stati collezionati per l’indagine diagnostica, e in parti- colare su diversi liquidi e tessuti biologici delle vittime (sangue, liquido cerebrospinale, linfonodi ecc.) oltre che sulle polveri contenute nelle lettere (ai laboratori dei CDCs arrivarono più di 125.000 campioni)24. Lo studio fu effettuato sia con la MLVA per gli 8 loci po- limorfici noti, sia sul gene pagA per determinare un’e- ventuale manipolazione genetica del batterio. I risultati dimostrarono che in tutti i campioni era presente lo stes- so ceppo di batterio, corrispondente al sottotipo Ames, un ceppo presente in molti laboratori di ricerca, isolato negli anni Ottanta, sul quale si basarono molti studi sul- l’antrace, mentre il sequenziamento del pagA dimostrò che il batterio non era stato ingegnerizzato37. Dall’esperienza appena riportata emerse inequivocabil- mente come la migliore delle strategie alle quali affida- re il contrasto del fenomeno emergente del bioterrori- smo non poteva che essere improntata ai fondamenta- li criteri dell’interdisciplinarietà e della condivisione delle informazioni scientifiche, nella prospettiva di una rielaborazione di queste ultime in un’ottica prevalente- mente investigativa. Il consolidarsi di questo tipo di ap- proccio portò, alla fine del 2005, alla determinazione di uno dei più grandi database oggi disponibili, denomi- nato Microbial Rosetta Stone Database, che raccoglie tut- ti i microrganismi esistenti e gli agenti patogeni emer- genti, potenzialmente utilizzabili per un attacco bio- terroristico, associati alla loro classificazione tassonomi- ca, alle varianti genomiche conosciute, alle malattie connesse, ai protocolli terapeutici e alle metodiche dia- gnostiche62. Il database fornisce, inoltre, un sistema di collegamento rapido e completo con tutte le banche da- ti mondiali e rappresenta il risultato vincente di un ap- proccio multidisciplinare per la lotta al bioterrorismo, che ha fatto della specificità tecnica e della dinamicità scientifica la propria forza63. L’emergenza bioterrorismo, però, non ha contraddistin- to solo gli Stati Uniti, ma in tutti i Paesi occidentali, com- presa l’Italia, il rischio di episodi di terrorismo con armi non convenzionali è divenuto più plausibile. Tutti i Pae- si, infatti, immediatamente dopo il 2001 hanno conve- nuto sul fatto che risposte rapide a questo tipo di emer- genze non potevano essere assicurate se non esisteva un’attività di preparazione continua a monte dell’even- to. Ma, soprattutto, anche se la risposta a eventuali emergenze non era solo di competenza del settore sani- tario, era ovvia la necessità di preparare e, quando neces- sario, mobilitare il Servizio Sanitario alla cooperazione con le forze di soccorso, di difesa e di sicurezza interna. Poco dopo gli attentati terroristici negli USA venne pubblicata dal Ministero della Salute la relazione sullo stato sanitario dell’Italia per l’anno 2001-2002, dove fu- rono descritte le iniziative assunte nel nostro Paese per fronteggiare le conseguenze di un’eventuale emergen- za in seguito a un attacco bioterroristico64. Le iniziati- ve intraprese dagli Enti istituzionalmente coinvolti si sono articolate in tre fasi: gestione dell’emergenza, rico- gnizione delle risorse ed elaborazione e divulgazione del Piano Nazionale di Difesa per il Settore Sanitario. Nell’ambito della fase di gestione dell’emergenza è sta- ta costituita, presso il Ministero della Salute, “l’Unità di crisi”, un gruppo di lavoro formato da specialisti nel campo delle malattie infettive, dell’ematologia, della si- curezza, della prevenzione e della sanità militare. Ele- mento cardine della fase iniziale è stata l’istituzione di un numero verde (800.571.661), che avrebbero potu- to contattare cittadini e operatori sanitari per registra- re le segnalazioni, valutarne la qualità, smistarle verso le strutture competenti e ritrasmetterle alle istituzioni. È stato, inoltre, stilato un protocollo per la gestione dei materiali sospetti per possibile contaminazione da spo- re di Bacillus anthracis, in cui è stabilito quale materiale fosse da considerare sospetto, le procedure per l’aller- ta, le modalità di prelievo e trasporto e il trattamento per l’inattivazione del probabile contaminante64. Co- me centro di riferimento nazionale per l’antrace è stato designato, dal Ministero della Salute, l’Istituto Zoopro- filattico di Puglia e Basilicata (CeRNA), con sede a Fog- gia, che già era deputato all’allestimento dei due vacci- ni contro il carbonchio ematico, Carbosap e Pasteur1, e Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. tossicologia e NBCR 42 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o III n um er o II • A pr ile 2 00 7 • w w w .e cj .it ti bersaglio, sugli aggressivi presumibilmente utilizzabi- li e sulle modalità patogenetiche di detti aggressivi. Nel maggio del 2003, in linea con il Piano di Difesa, è stato approvato il nuovo Piano Sanitario per il biennio 2003-2005 in cui, nel paragrafo 4.8, si descrive la «Pia- nificazione e risposta sanitaria in caso di eventi terrori- stici ed emergenze di altra natura»67. In questo docu- mento sono stati riconfermati tutti i punti riportati nel Piano Sanitario dell’anno precedente, come descritti nella relazione del Ministero della Salute sopra citata. Infine, il 26 maggio 2004 è stata emanata la Legge n. 138/2004 che ha convertito il DL 29 marzo 2004, n. 81, recante Interventi urgenti per fronteggiare situazioni di pericolo per la salute pubblica [...] al fine di contrastare le emergenze legate prevalentemente alle malattie infettive e diffusive e al bioterrorismo. In linea con il modello ame- ricano dei CDCs, è stato istituito e reso operativo il Cen- tro nazionale per la prevenzione e il controllo delle ma- lattie infettive (CCM), con il compito di effettuare ana- lisi e gestione di rischi, coordinamento con le Regioni e con altre realtà istituzionali e con analoghe realtà in- ternazionali, promuovendo l’aggiornamento, la forma- zione e la diffusione delle informazioni nell’ambito dei diversi campi di interesse della salute pubblica, ivi com- preso il bioterrorismo. La legge ha predisposto, inoltre, la riorganizzazione dei finanziamenti destinati alla Sani- tà Pubblica per fornire strumenti più idonei ad affron- tare un eventuale attacco con armi biologiche68. Conclusioni Nel presente lavoro è stato illustrato come si possa va- lutare il contributo della scienza nel fronteggiare il pro- blema delle armi biologiche e del bioterrorismo a par- tire dal supporto necessario alla redazione della BTWC. Qui, il contributo delle scienze è molto gene- rico, limitandosi a rappresentare la risposta a un sog- getto che vuole conoscere un fenomeno da regolamen- tare, e pertanto non sembrerebbe giustificare di per sé l’esistenza di una disciplina autonoma. In tale contesto, infatti, il contributo scientifico è meramente descritti- vo: la microbiologia è utile nella descrizione delle pro- blematiche da affrontare ed eventualmente nella predi- sposizione di strumenti di controllo nella BTWC, così come la chimica ha contribuito alla redazione della CWC. In entrambi i casi si potrà porre un problema di linguaggio utilizzato nel descrivere un fenomeno a non specialisti, ma non di nuove questioni scientifiche, che richiedano un nuovo approccio metodologico. Ben diverso è il contributo della scienza alle indagini nel caso di un crimine. In questo caso l’apporto della scien- za richiede un approccio metodologico nuovo. La spe- dizione di una serie di lettere contenenti spore del Ba- cillus anthracis nel 2001, pochi giorni dopo gli attenta- ti alle Torri Gemelle di New York, ha costituito il pri- alla sperimentazione del nuovo vaccino Sterne. Il cen- tro ha il compito di effettuare il test di rilevamento del- le spore di antrace in campioni sospetti (con eccezione dei sospetti clinici umani) nell’ambito dell’emergenza bioterrorismo65, che consiste nell’amplificazione, trami- te PCR, di sequenze nucleotidiche specifiche per il cro- mosoma, il fattore letale, il fattore edemigeno, l’antige- ne protettivo e la capsula di Bacillus anthracis. Con riferimento alle modalità operative, invece, il Mi- nistero della Salute ha disposto che i campioni sospet- ti (buste, lettere o altro materiale contenente polveri), individuati a livello locale, vengano prelevati dal corpo dei Vigili del Fuoco, trasportati al presidio ospedaliero più vicino munito di autoclave e immediatamente ste- rilizzati a 121 °C per 45 minuti, prima di essere inviati al centro. Questa misura riduce al minimo la possibili- tà di diffusione di materiale patogeno nell’ambiente e garantisce la sicurezza degli operatori in tutte le fasi, dal trasporto alla lavorazione65. Al centro, inoltre, è stato anche affidato il compito di aggiornare costantemente la mappa dei genotipi italiani di B. anthracis66. In parti- colare, dopo una serie di studi che si sono susseguiti ne- gli anni, sono stati identificati, nel nostro Paese, 64 cep- pi di B. anthracis, isolati da focolai carbonchiosi in Pu- glia, Campania, Basilicata, Calabria, Toscana, Sicilia, Sardegna, Lazio e Veneto. Tra essi sono stati individua- ti 10 genotipi differenti (denominati con le lettere del- l’alfabeto dalla A alla J), tutti appartenenti al cluster A1.a, a eccezione di un singolo isolato (J), associato al cluster A3.b66. Con il lavoro di Lista e collaboratori si è riusciti a discriminare ulteriormente i 64 isolati batteri- ci in 34 genotipi56, piuttosto che nei 10 individuati dal- l’Istituto Zooprofilattico. Nella seconda fase delle iniziative intraprese all’indo- mani del 2001, è proseguita la ricognizione dei presidi utili e di provata efficacia in caso di emergenza, della di- sponibilità di posti letto nei reparti per malattie infetti- ve oltre che delle scorte di farmaci e vaccini. La ricogni- zione è stata effettuata anche a livello locale, presso le Regioni, in relazione alla disponibilità, sui territori di ri- spettiva competenza, non solo di presidi farmacologi- ci, ma anche di laboratori di livello BSL3 e BSL4 per la gestione di agenti infettivi a fini diagnostici. In ultimo, il Ministero della Salute ha fornito agli orga- ni regionali il Piano di Difesa per il Settore Sanitario, redatto dalla Direzione Generale della Prevenzione con il supporto dell’ISS e dell’ISPESL e approvato dall’Uni- tà di crisi. Una parte del Piano, contenente informazio- ni utili circa le procedure di intervento più idonee da sviluppare in sede locale, è stata resa accessibile soltan- to agli operatori provvisti di nulla osta di segretezza. Nella parte pubblica, invece, sono state fornite informa- zioni generali sui criteri essenziali per l’identificazione di eventi dannosi a seguito di un atto terroristico, sui si- Materiale protetto da copyright. Non fotocopiare o distribuire elettronicamente senza l’autorizzazione scritta dell’editore. tossicologia e NBCR 43 em er ge nc y ca re jo ur na l - o rg an iz za zi on e, cli ni ca ,r ice rc a • A nn o III n um er o II • A pr ile 2 00 7 • w w w .e cj .it mo attacco bioterroristico vero e proprio. L’attività mi- crobiologica tradizionale ha consentito di individuare il patogeno responsabile del contagio in risposta all’emer- genza sanitaria. A questo punto si è posto un nuovo problema, tipico per la criminalistica ma non per la mi- crobiologia: cercare di risalire alla fonte del materiale utilizzato per commettere il crimine, determinando l’esatto sottotipo del ceppo batterico. Tale fase, detta dell’“identificazione”, è parte del processo di formazio- ne comune a tutte le prove scientifiche e si realizza at- traverso il confronto fra una traccia di origine incerta e una di origine certa, nel tentativo di determinare se i due elementi del confronto abbiano la stessa origine. In questi termini, la microbiologia forense affronta un nuovo problema scientifico, applicando i principi fondamentali e l’approccio operativo della criminali- stica. I principi sono quello di Locard e quello della divisibilità della materia. L’approccio operativo è quello per fasi successive a partire dall’esame di una scena del crimine classificando e, in seguito, identifi- cando elementi di prova, per tentare di associare un sospetto a un crimine e di ricostruirne la condotta. Nell’esempio illustrato non è stato ancora possibile identificare i responsabili dell’attacco bioterroristico e ricostruirne la condotta. Possiamo però già parlare di prima indagine di una disciplina nuova, denominata microbiologia forense. Non ci si è infatti limitati alla semplice caratterizzazione fenotipica del microrgani- smo responsabile del contagio ma è stata determina- ta l’esatta variante genomica, al fine di identificare le possibili fonti dell’agente biologico, nel tentativo di ri- salire ai gruppi terroristici che, verosimilmente, a- vrebbero potuto avere accesso a quelle fonti. Ringraziamenti Gli Autori sono profondamente grati al prof. Fabio Al- tieri, del Dipartimento di Scienze Biochimiche Rossi- Fanelli, Università degli studi di Roma “La Sapienza”, e al prof. Raffaele D’Amelio, dell’UOC Immunologia Clinica – Allergologia – Reumatologia dell’Azienda Ospedaliera Sant’Andrea, Università degli Studi di Ro- ma “La Sapienza”, per i preziosi suggerimenti e chiari- menti che hanno permesso di completare lo studio. Bibliografia 1. Jernigan DB, Raghunathan PL, Bell BP et al. Investigation of bio- terrorism-related anthrax, United States, 2001: epidemiologic findings. Emerg Infect Dis 2002; 8: 1019-28. 2. 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A new subfield of forensic science, called “microbial foren- sics”, has been developed. It is a new scientific discipline dedi- cated to collect and analyze microbiological evidence from a scene of crime. In addition to collecting and analyzing tradition- al forensic evidences, the microbial forensic investigation will at- tempt to determine the identity of the causal agent, as so as epi- demiologic investigation, but with higher-resolution characteri- zation. The tools for a successful attribution include genetically based-assays to determine the exact strain of isolate, aiming the individualization of the source of the pathogen used in a bi- ological weapon. Following the 2001 anthrax attacks, genotyp- ing of B. anthracis was done on 8 variable number tandem re- peats loci (VNTR polymorphisms), with multilocus variable number tandem repeats (MLVA) method. In recent years some research groups have increased the VNTR markers number to 25 loci, while other groups have identified single nucleotide re- peat (SNR) polymorphisms, which display very high mutation rates. SNR marker system allows the distinguishing of isolates with extremely low levels of genetic diversity within the same MLVA genotype.