Microsoft Word - European_Journal_of_Chemistry_1_2_2010_67_72_1


European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 67‐72 

 
European Journal of Chemistry 

ISSN 2153‐2249 (Print) / ISSN 2153‐2257 (Online)  2010 EURJCHEM 
DOI:10.5155/eurjchem.1.2.67‐72.1 

   

 

European Journal of Chemistry 
Journal homepage: www.eurjchem.com 

 
     

Synthesis and studying the antitumor activity of novel  
5‐(2‐methylbenzimidazol‐5‐yl)‐1,3,4‐oxadiazole‐2(3H)‐thiones 

Shadia A. Galala,*, Ahmed S. Abdelsamiea, Mireya L. Rodriguezb,  
Sean M. Kerwinb  and Hoda I. El Diwania 

a Department of Chemistry of Natural and Microbial Products, Division of Pharmaceutical and Drug Industries Research,  
National Research Centre, Dokki, 12622, Cairo, Egypt 
b Department of Chemistry and Biochemistry, Division of Medicinal Chemistry and Institute for Cellular and Molecular Biology,  
The University of Texas, Austin, TX 78712 USA 

*Corresponding author at: Department of Chemistry of Natural and Microbial Products, Division of Pharmaceutical and Drug Industries Research, National 
Research Centre, Dokki, 12311, Cairo, Egypt. Tel.: +202.33371617; fax: +202.3337093. E­mail address: sh12galal@yahoo.com (S. A. Galal). 

 
 

   

     
ARTICLE INFORMATION    ABSTRACT
Received: 23 March 2010 
Received in revised form: 29 April 2010 
Accepted: 30 April 2010 
Online: 30 June 2010 

KEYWORDS 

  The  influence of  the  incorporation of  1,3,4‐oxadiazole  ring  into 2‐methyl‐1H‐benzimidazole derivatives producing  a  series  of  substituted  5(6)‐(2‐methylbenzimidazol‐5‐yl)­1,3,4‐oxadiazoles on  the  antitumor 
activity was studied in this study. The antitumor activity of the new compounds was tested against breast 
cancer  cell  line  MCF‐7  and  lung  cancer  cell  line  A549.  S‐5‐(2‐methyl‐1H‐benzo[d]imidazol‐5‐yl)‐1,3,4‐
oxadiazol‐2‐yl 2‐nitrobenzenesulfonothioate (9) showed potent activity against both MCF‐7 and A549 cell 
lines. Whereas, compounds 7, 11‐13 and 15‐17 have moderate growth inhibitory activity on the two cell 
lines. 

Oxadiazoles 
Benzimidazoles 
Antitumor activity 
Cytotoxicity 
Breast cancer human cell (MCF‐7) 
Lung cancer human cell (A549) 

 
1. Introduction 
 

The benzimidazole nucleus is an important pharmacophore 
in drug discovery due  to being a good bioisostere of naturally 
occurring  nucleotides.  Several  promising  antitumor  active 
agents were found to contain the benzimidazole ring system [1‐
11].  Benzimidazoles  are  also  used  as  biomimetics  of  guanine 
residues  [1]  and  benzimidazole  derivatives  selectively  inhibit 
endothelial cell growth and suppress angiogenesis in vitro and 
in  vivo  [2].  They  were  found  to  exhibit  antitumor  activity 
against  several  tumor  cell  lines  like  breast  cancer  human  cell 
(MCF‐7)  and  lung  cancer  human  cell  (A549)  [10].  Potent 
antitumor  2‐methylbenzimidazole  substituted  with  6  or  5‐
membered  heterocycles  was  previously  synthesized  by  our 
laboratory  [12‐14].  Compounds  I  and  II  were  found  to  be 
potent  against  non‐small  cell  lung  cancer  and  breast  cancer 
(Figure  1)  [12].  Compounds,  2‐methyl‐5‐nitro‐1H‐benzo[d] 
imidazole  (III)  and  1‐(5‐((2‐methyl‐5‐nitro‐1H‐benzo[d] 
imidazol‐1‐yl)methyl)‐1,3,4‐thiadiazol‐2‐ylthio)propan‐2‐one 
(IV), were  found to have high cytotoxic activity against breast 
cancer (MCF7) (Figure 1) [14].  

On  the  other  hand,  five‐membered  1,3,4‐oxadiazole 
heterocycles are also useful intermediates for the development 
of  molecules  of  pharmaceutical  interest  where  several 
promising  antitumor  compounds  are  found  to  contain  the 
oxadiazole  ring  system  [15‐17].  1,3,4‐Oxadiazole  heterocycles 
are  good  bioisosteres  of  amides  and  esters,  which  can 
contribute  substantially  in  increasing pharmacological  activity 
by  participating  in  hydrogen  bonding  interactions  with  the 
receptors [18]. 

As  a  continuation  to  our  previous  work  in  synthesizing 
antitumor  benzimidazoles,  we  aimed  in  this  manuscript  to 
investigate  the  effect  of  substitution  of  the  benzimidazole 
moiety  at  its  5(6)  position  by  a  basic  moiety,  which  is  1,3,4‐
oxadiazole carrying different lipophilic and polar groups on the 
antitumor  activity  against  breast  cancer  (MCF‐7)  and  lung 
cancer (A549) human cell lines. 
 
2. Experimental 
 
2.1. Synthesis 
 
2.1.1. Preparation of 5­(2­methyl­1H­benzo[d]imidazol­5­
yl)­1,3,4­oxadiazole­2(3H)­thione (7) and 5­(2­methyl­6­
nitro­1H­benzo[d]imidazole­5­yl)­1,3,4­oxadiazole­2(3H)­
thione (14) 
 
General Procedure: A mixture of 6a or 6b (5 mmole), KOH (5 
mmole) and carbon disulphide (5 mL) in ethanol (50 mL) was 
refluxed  for  12  h  (Scheme  1).  The  reaction mixture was  then 
concentrated,  cooled  and  acidified  with  dilute  HCl.  The  solid 
mass  that  separated  out,  was  filtered,  washed  with  ethanol, 
dried  and  recrystallized  from  ethanol  as  a  greenish‐brown 
powder. 
 
2.1.1.1.  Compound  7:  Rf  =  0.76  (chloroform/ethylacetate/ 
methanol, 1:2:1). Yield: 90%. M.p.: >300 oC. 1H‐NMR (500 MHz, 
DMSO‐d6) δ: 2.54  (s, 3H, CH3), 7.60  (d,  J=8.6 Hz, 1H, H7), 7.65 
(d, J = 8.6 Hz,  1H,  H6),  7.92  (s, 1H, H4), 10.30, 11.63 (br., NH  
 



68  Galal et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 67­72 
 

 

 

 
I 

(Breast cancer, MCF7, GI50=1.82E‐05) 
(Breast cancer, T47D, GI50= 1.68E‐06)                      

(Non small lung cancer, HOP92, GI50=1.49 E‐05) 
 

 
II 

(Breast cancer, MCF7, GI50=2.87E‐05) 
(Breast cancer, T47D, GI50= 1.68E‐06) 

(Non small lung cancer, NCI‐H522, GI50=1.25 E‐06) 
 

 
 
 
 

  
 
 
 
III 

(Breast cancer, MCF7, IC50 = 4.2 µM) 

 
IV 

(Breast cancer, MCF7, IC50 = 8.29 µM) 
 

Figure 1. Structures of previously synthesized potent antitumor benzimidazoles. 
 
 

 

 
 

Scheme 1 
 

benzimidazole,  NH  oxadiazolethione  ring,  D2O  exchangeable). 
IR  (cm‐1):  3406  (NH  benzimidazole),  3312  (NH  oxadiazole 
ring), 1627  (C=N benzimidazole), 1604  (C=N oxadiazole  ring), 
1283.55  (C=S).  MS:  m/z  232  (M+,  100%).  Anal.  Calcd  for 
C10H8N4OS: C, 51.71; H, 3.47; N, 24.12; S, 13.81. Found: C, 51.59; 
H, 3.36; N, 24.21; S, 13.92. 
 

2.1.1.2.  Compound  14:  Rf  =  0.73  (chloroform/ethyl  acetate/ 
methanol, 1:2:1). Yield: 88%. M.p.: >300 oC. 1H‐NMR (270 MHz, 
DMSO‐d6) δ: 2.52 (s, 3H, CH3), 7.64 (s, 1H, H4), 7.92 (s, 1H, H7), 
9.46  (br.,  NH  benzimidazole,  D2O  exchangeable).  IR  (cm‐1): 
3422 (NH benzimidazole), 3312 (NH thioxadiazole), 1626 (C=N 
benzimidazole), 1588 (C=N oxadiazole), 1526 and 1365 (NO2). 
Anal. Calcd for C10H7N5O3S: C, 43.32; H, 2.54; N, 25.26; S, 11.56. 
Found: C, 43.29; H, 2.63; N, 25.16; S, 11.50. 



Galal et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 67­72  69 
 

 
 

2.1.2. Preparation of S­5­(2­methyl­1H­benzo[d]imidazol­5­
yl)­1,3,4­oxadiazole­2­ylmethanesulfonothioate (8)  and S­5­
(2­methyl­1H­benzo[d]imidazol­5­yl)­1,3,4­oxadiazol­2­yl 2­
nitrobenzenesulfonothioate (9) 
 
General Procedure:  To  a  solution of 7  (3 mmole)  in pyridine 
(10  mL)  was  added  methanesulfonyl  chloride  or  2‐nitro 
benzenesulfonyl  chloride  (4  mmole)  and  the  solution  was 
stirred at room temperature for 12 h (Scheme 2). The reaction 
mixture was poured into water and the precipitate formed was 
filtered  off  and  crystallized  from  methanol  to  give  8  and  9, 
respectively.  
 
2.1.2.1. Compound 8:  Brown solid. Rf = 0.43 (petroleum ether: 
ethyl acetate: methanol, 1:2:1/2). Yield: 70%. M.p.: 125‐127 oC. 
1H‐NMR  (270  MHz,  DMSO‐d6)  δ:  2.44  (s,  3H,  CH3  benz 
imidazole), 2.82  (s, 3H, CH3,  SO2CH3), 7.48  (d,  J = 8.58 Hz, 1H, 
H7), 7.86 (d, J = 8.58 Hz, 1H, H6), 8.40 (s, 1H, H4), 12.5 (br., NH 
and OH, D2O  exchangeable).  IR  (cm‐1):  3410  (NH),  1628  (C=N 
benzimidazole), 1604 (C=N oxadiazole ring), 1194 (SO2). Anal. 
Calcd.  for  C11H10N4O3S2:  C,  42.57;  H,  3.25;  N,  18.05;  S,  20.66. 
Found: C, 42.60; H, 3.21; N, 18.29; S, 20.40.  
 
2.1.2.2. Compound 9: Brown solid. Rf = 0.45 (petroleum ether: 
ethyl acetate: methanol, 1:2:1/2). Yield: 69%. M.p.: 213‐215 oC. 
1H‐NMR  (270  MHz,  DMSO‐d6)  δ:  2.59  (s,  3H,  CH3  benz 
imidazole),  7.46  (d,  J  =  8.58  Hz,1H,  H7),  7.64  (m,  1H,  H4`  
nitrobenzenesulfonothioate), 7.91 (d, J = 8.58 Hz,1H, H6), 8.25  
(m,  2H, H5`  and H6`    nitrobenzenesulfonothioate),  8.44  (s,1H, 
H4),  8.72  (m,  1H,  H3`  nitrobenzenesulfonothioate),  12.8  (br., 
NH  and  OH,    D2O  exchangeable).  IR  (cm‐1):  3406  (NH),  1627 
(C=N benzimidazole), 1595 (C=N oxadiazole ring), 1398 (SO2), 
1453 and 1368 (NO2). Anal. Calcd for C16H11N5O5S2: C, 46.04; H, 
2.66; N,  16.78;  S,  15.36.  Found:  C,  46.15; H,  2.70; N,  16.70;  S, 
15.25. 
 
2.1.3. Preparation of 2­(5­(2­methyl­1H­benzo[d]imidazol­5­
yl)­1,3,4­oxadiazol­2­ylthio)acetonitrile (10) and 2­((1H­
benzo[d]imidazol­2­yl)methylthio)­5­(2­methyl­1H­
benzo[d]imidazol­5­yl)­1,3,4­oxadiazole(11) 
 
General  Procedure:  A  mixture  of  7  (5  mmole), 
chloroacetonitrile  or  2‐chloromethylbenzimidazole  (5 mmole) 
and  anhydrous  potassium  carbonate  (6  mmole)  in  absolute 
ethanol  (30  mL)  was  stirred  at  room  temperature  for  6‐8  h 
(Scheme  3).  The  mixture  was  filtered  and  the  filtrate  was 
evaporated  until  dryness,  the  residue  obtained  was  washed 
with water and recrystallized  from ethanol  to give 10  and 11 
respectively. 
 
2.1.3.1. Compound 10: Buff  solid. Rf  = 0.68  (petroleum ether: 
ethyl acetate: methanol, 1:2:1/2). Yield: 84%. M.p.: 228‐230 oC. 
1H‐NMR (270 MHz, DMSO‐d6) δ: 2.49 (s, 3H, CH3), 4.52 (s, 2H, 
CH2), 7.63 (d, J = 8.41 Hz, 1H, H7), 7.77 (d, J = 8.41 Hz, 1H, H6), 
8.06  (s,  1H,  H4),  12.65  (br.,  D2O  exchangeable,  NH 
benzimidazole).  IR (cm‐1): 3365 (NH), 2249 (C≡N), 1627 (C=N 
benzimidazole), 1576 (C=N oxadiazole ring). MS: m/z 271 (M+, 
50%). Anal. Calcd for C12H9N5OS: C, 53.13; H, 3.34; N, 25.81; S, 
11.82. Found: C, 53.41; H, 3.20; N, 25.90; S, 11.92.  
 
2.1.3.2. Compound 11: Brown solid. Rf = 0.36 (petroleum ether: 
ethyl acetate: methanol, 1:2:1/2). Yield: 88%. M.p.: 250‐251 oC. 
1H‐NMR  (270 MHz,  DMSO‐d6)  δ:  2.5  (s,  3H,  CH3),  4.69  (s,  2H, 
CH2), 7.26 (m, 3H, H5` + H6` + H7`), 7.51 (m, 1H, H4`), 7.73 (d, J 
= 8.35 Hz, 1H, H7), 7.82 (d, J = 8.35 Hz, 1H, H6), 8.26 (s, 1H, H4), 
11.92  (s,  1H,  NH,  D2O  exchangeable),  12.19  (s,  1H,  NH,  D2O 
exchangeable).  IR  (cm‐1):  3437  (NH),  1626  (C=N).  Anal.  Calcd 
for  C18H14N6OS:  C,  59.65;  H,  3.89;  N,  23.19;  S,  8.85.  Found:  C, 
59.72; H, 3.71; N, 23.15; S, 8.95. 

2.1.4. Preparation of 1,2­Bis(5­(2­methyl­1H­
benzo[d]imidazol­5­yl)­1,3,4­oxadiazol­2­ylthio)ethane (12) 
and Bis(5­(2­methyl­1H­benzo[d]imidazol­5­yl)­1,3,4­
oxadiazol­2­ylthio)methane (13) 
  
General procedure: A mixture of 7 (5 mmole), dibromoethane 
or  diiodomethane  (2.5  mmole)  and  anhydrous  potassium 
carbonate  (6  mmole)  in  dimethylformamide  (30  mL)  was 
stirred at room temperature for 4 h. The reaction mixture was 
filtered  off  and  crystallized  from  ethanol  to  give  12  and  13, 
respectively (Scheme 3).  
 
2.1.4.1. Compound 12: Brown solid. Rf = 0.76 (petroleum ether: 
ethyl acetate: methanol, 2:2:1/2). Yield: 76%. M.p.: 275‐277 oC. 
1H‐NMR (270 MHz, DMSO‐d6) δ: 2.50 (s, 6H, 2CH3), 2.77 (s, 4H, 
2CH2), 7.52 (d, J = 8.1 Hz, 2H, H7 and H7`), 7.67 (d, J = 8.1 Hz, 
2H,  H6  and  H6`),  7.94  (s,  2H,  H4  and  H4`),  11.75  (br.,  NH 
benzimidazole, D2O exchangeable). IR (cm‐1): 3359 (NH), 1625 
(C=N). MS: m/z 490 (M+, 3%). Anal. Calcd  for C22H18N8O2S2: C, 
53.86; H,  3.70; N,  22.84;  S,  13.07.  Found:  C,  53.70; H,  3.65; N, 
22.98; S, 13.16. 
 
2.1.4.2. Compound 13: Brown solid. Rf = 0.75 (petroleum ether: 
ethyl acetate: methanol, 2:2:1/2). Yield: 72%. M.p.: 245‐247 oC. 
1H‐NMR (500 MHz, DMSO‐d6) δ: 2.45 (s, 6H, 2CH3), 3.31 (s, 2H, 
CH2), 7.38 (d, J = 8.05 Hz, 2H, H7 and H7`), 7.59 (d, J = 8.05 Hz, 
2H, H6 and H6`), 7.91 (s, 2H, H4 and H4`). IR (cm‐1): 3406 (NH), 
1629  (C=N).  MS:  m/z  478  (M++2,  3%).  Anal.  Calcd  for 
C21H16N8O2S2:  C,  52.93;  H,  3.38;  N,  23.51;  S,  13.46.  Found:  C, 
53.90; H, 3.50; N, 23.60; S, 13.49. 
 
2.1.5. Preparation of 2­(5­(2­methyl­6­nitro­1H­
benzimidazole­5­yl)­1,3,4­oxadiazole­2­ylthio)acetonitrile 
(15) 
 
A mixture  of 14  (5 mmole),  chloroacetonitrile  (5 mmole)  and 
anhydrous potassium carbonate (6 mmole) in absolute ethanol 
(30 mL) was stirred at room temperature for 6 h. The reaction 
mixture  was  filtered  and  the  filtrate  was  evaporated  until 
dryness. The residue was washed with water and recrystallized 
from  ethanol  as  a  brown  powder  (Scheme  4).  Rf  =  0.66 
(petroleum ether/ethyl acetate/methanol, 1:2:1/4). Yield: 80%. 
M.p.: 100‐101oC. IR (cm‐1): 3364 (NH), 2250 (CN), 1627 (C=N), 
1577  and 1462  (NO2), MS: m/z 316  (M+,  5%).  Anal.  Calcd  for 
C12H8N6O3S:  C,  45.57;  H,  2.55;  N,  26.57;  S,  10.14.  Found:  C, 
45.72; H, 2.61; N, 26.40; S, 10.03. 
 
2.1.6. Preparation of 3­(2­hydroxyphenyl)­2­(5­(2­methyl­6­
nitro­1H­benzo[d]imidazol­5­yl)­1,3,4­oxadiazol­2­
ylthio)acrylonitrile (16) and 2­Imino­3­(5­(2­methyl­6­nitro­
1H­benzo[d]imidazol­5­yl)­1,3,4­oxadiazol­2­ylthio)­2H­
chromen­7­ol (17) 
 
General Procedure: To a solution of 15 (3 mmole) in pyridine 
(10 mL) was added an equivalent amount of salicylaldehyde or 
2,4‐dihydroxybenzaldehyde.  The  solution was  stirred  at  room 
temperature  for  12  h.  The  reaction  mixture  was  poured  into 
water  and  the  precipitate  formed  was  filtered  off  and 
recrystallised  from  butanol  to  give  16  and  17,  respectively 
(Scheme 4).  
 
2.1.6.1.  Compound  16:  Yellowish‐green  solid.  Rf  =  0.75 
(petroleum  ether:  ethyl  acetate,  1:1).  Yield:  76%.  M.p.:  173‐
175oC.  1H‐NMR (270 MHz, DMSO‐d6) δ: 2.52 (s, 3H, CH3), 6.60 
(s,  1H,  CH=),  6.84‐6.88  (m,  4H,  Phenyl  protons),  7.64  (s,  1H, 
H4),  
 



70  Galal et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 67­72 
 

 

 
Scheme 2

 

7
10

11

12

13

N

N

CH3

NN

O
S

H

H

N

N

CH3

NN

O
S

N

N

HH

N

N

CH3

NN

O
S

NC

H

ClCH2CN

Cl

N

N

H

N

N

CH3

NN

O
SS

NN

O
N

N

CH3

H
H

N

N

CH3

NN

O
SS

NN

O

H

CH2I2

(CH2)2Br2

N

N

CH3

H

Scheme 3
 
8.05  (s,  1H,  H7),  9.46  (br.,  NH  benzimidazole,  D2O 
exchangeable), 11.05 (s, 1H, phenolic OH). IR (cm‐1): 3430 (NH 
benzimidazole), 3000 (br., intermolecular H‐bonded OH,), 2188 
(C N),  1633  (C=N),  1591  (C=N  oxadiazole),  1527  and  1336 
(NO2). Anal. Calcd for C19H12N6O4S: C, 54.28; H, 2.88; N, 19.99; S, 
7.63. Found: C, 54.40; H, 2.68; N, 19.77; S, 7.41. 
 
2.1.6.2.  Compound  17:  White‐greenish  solid.  Rf  =  0.16 
(petroleum ether: ethyl acetate, 1:2). Yield: 80%. M.p.: 130‐132 
oC. 1H‐NMR (270 MHz, DMSO‐d6) δ: 2.57 (s, 3H, CH3), 6.28 (s,1H, 
H4`), 6.35 (d, J = 8.25 Hz,1H, H5`), 7.10 (br., 1H, NH imine, D2O 
exchangeable)), 7.49  (d,  J = 8.25 Hz, 1H, H6`), 8.02  (s,1H, H4), 

8.18  (s,1H, H8\),  8.40  (s,1H, H7),  8.90  (br., NH benzimidazole, 
D2O  exchangeable),  9.87  (s,  1H,  phenolic  OH,  D2O  exchange 
able).  IR  (cm‐1):  3433  (NH  benzimidazole),  3354  (NH  imino), 
3000  (br.,  intermolecular  H‐bonded  OH,),  1629  (C=N),  1529 
and 1343 (NO2). Anal. Calcd for C19H12N6O5S: C, 52.29; H, 2.77; 
N, 19.26; S, 7.35. Found: C, 52.13; H, 2.81; N, 19.18; S, 7.34. 
 
2.2. Cytotoxicity Assays 
 

Cell  culture  cytotoxicity  assays  were  carried  out  as 
described  previously  [10].  Briefly,  aliquots  of  100  µl  cell 
suspension (1‐3 x 103  cells) were  placed  in microtiter plates in  



Galal et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 67­72  71 
 

 
 

 

 
Scheme 4 

 
an atmosphere of 5% CO2 at 37 °C. After 24 h, 100 µL of culture 
media and 2 µL of the compound in DMSO were added to each 
well  in duplicate, and  the plates were  incubated an additional 
72  h  at  37  °C.  There  was  no  effect  on  the  growth  of  cells 
compared to  that of  cells  in culture media alone at  this DMSO 
concentration.  Compounds,  along  with  mitomycin‐C  as  a 
positive control were evaluated at final concentrations ranging 
from 0.001 to 50 µM. 

After  the 72 h  incubation,  the culture media was removed 
from each well, and 200 µL of fresh media and 20 µL of Alamar 
Blue  reagent  were  added,  followed  by  additional  6  h 
incubation. Cell viability was detected by  fluorescent  intensity 
using a Beckman Coulter DTX880 plate reader with excitation 
at  530  nm  and  emission  at  590  nm.  The  fluorescence  data 
obtained from the cytotoxicity studies was used to calculate the 
percent growth according to the following equation (1): 
 
% Growth = 100*(Ftest – Ftime0)/ (Fctrl – Ftime0)                              (1) 
 
Where  Mean  Ftime0  =  the  averaged  measured  fluorescent 
intensities  of  Alamar  Blue  reagent  at  the  time  just  before  the 
exposure  of  the  cells  to  the  test  substance;  Mean  Ftest  =  the 
averaged  measured  fluorescent  intensities  of  Alamar  Blue 
reagent after 72 h exposure of the cells to the test substance at 
a particular concentration; Mean Fcrtl = the averaged measured 
fluorescent  intensities  of  Alamar  Blue  reagent  after  72  h 
exposure of the cells to the vehicle without the test substance. 

The IC50, the compound concentration for which the growth 
of  treated  cells  from  time0  was  only  50%  as  much  as  the 
vehicle‐control was determined by non‐linear regression fitting 
the data to equation (2):  

 
y = Min + (Max‐Min)/(1+10^((x‐logIC50)*n))                       (2) 
 
Where  Min=  the  minimum  response  plateau  (0%Growth); 
Max=  the  maximum  response  plateau  (100%  Growth);  y=  % 
Growth  at  each  test  compound  concentration;  n  is  a  fitted 
parameter (the Hill slope coefficient).  

2.2. Instrumentation 
 

Melting  points  were  taken  on  a  capillary  melting  point 
apparatus  and are uncorrected.  1H and  13C NMR spectra were 
recorded using Jeol EX‐200 MHZ, 270 MHz and 500 MHz NMR 
spectrometers  with  Me4Si  as  an  internal  standard.  Chemical 
shifts  are  reported  in  parts  per  million  (ppm)  from  the 
tetramethylsilane resonance  in the  indicated solvent. Coupling 
constants are reported in Hertz (Hz), spectral splitting partners 
are  designed  as  follow:  singlet  (s);  doublet  (d);  triplet  (t); 
multiplet  (m). Mass  spectra  were  obtained with  a  Schimadzu 
GCS‐QP  1000  EX  spectrometer  at  70  ev.  The  IR  spectra were 
recorded  with  a  Philips  Infracord  Spectro‐photometer  Model 
PU9712 in KBr discs. Elemental analyses were performed at the 
Microanalytical Laboratory of the National Research Centre. 
 
3. Results and Discussion 
 
3.1. Chemistry 
 

2‐Methyl‐1H‐benzimidazole‐5‐carboxylic  acid,  1,  was 
prepared  from  3,4‐diaminobenzoic  acid  with  acetic  acid  in 
hydrochloric  acid  according  to  Philips'  method  [19,20]. 
Treatment  of  compound  1  with  ethanol  and  sulfuric  acid 
afforded the ester 2  [21] which was nitrated to yield the 6(5)‐
nitro  derivative 3  [22]  in which  the  nitro  group was  reduced 
using  ferrous  sulfate  and  hydrochloric  acid  to  yield  the  6(5)‐
amino  hydrochloride  derivative  4.  The  ortho  position  of  the 
nitro or  amino group vis‐à‐vis  the  ester  group was proved by 
1H‐NMR as it did not show any meta coupling when the singlets 
corresponding to H4 and H7 were expanded. 

Hydrolysis  of  the  ester  group  of  3  was  accomplished  by 
refluxing  in  10%  sodium  hydroxide  to  afford  5(6)‐carboxylic 
acid derivative (5). The acid hydrazides 6(a, b) were formed by 
the  reaction  of  the  esters  2  or  3  with  hydrazine  hydrate. 
(Scheme 1).  

The  formation of  a dihydrooxadiazole‐2‐thione  ring at  the 
5(6)  position  of  2‐methylbenzimidazole  was  achieved  by  the 



72  Galal et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 67­72 
 

 

reaction of the hydrazides 6a [23] or 6b with carbon disulfide 
in  potassium  hydroxide  to  produce  compounds  7  and  14 
respectively.  Sulfonylation  took  place  when  compound  7 
reacted  with  methanesulfonyl  chloride  or  2‐nitrobenzene 
esulfonyl  chloride  to  obtain  the  thiosulfonothioate derivatives 
8 and 9 respectively (Scheme 2).  Reaction of chloroacetonitrile 
or  2‐chloromethylbenzimidazole  in  pyridine  to  produce  the 
1,3,4‐oxadiazole‐2‐thio  derivatives  10  and  11,  respectively. 
Stirring compound 7 with dibromoethane or diiodomethane in 
a  molar  ratio  of  2:1  with  anhydrous  potassium  carbonate  in 
DMF  yielded  the  bis  compounds  12  and  13,  respectively, 
(Scheme 3). 

Similarly  compound 14  reacted with  chloroacetonitrile  to 
produce  the  thioacetonitrile  derivative,  15,  which  led  to  the 
aldol  condensation  products  16  upon  it's  reaction  with 
salicylaldehyde.  The  iminopyran  17  resulted  from  the 
condensation  of  15  with  2,4‐dihydroxybenzaldehyde  with 
subsequent addition of the OH on cyano group  (Scheme 4). 

Dehydrochlorination reaction of compounds 7 and 14 took 
place  selectively  on  the  thiol  group  of  oxadiazole  moiety  by 
using equimolar reagents which was proved from the presence 
of NH of benzimidazole moiety as revealed from the IR and the 
1H‐NMR spectra of the products. 
 
3.2. The cytotoxicity  
 

The cytotoxicity of synthesized compounds and Mitomycin C 
was tested using the AlamarBlue assay [10]  in breast cancer cell 
line MCF‐7 and lung cancer cell line A549 (Table 1). Compound 1 
did  not  show  cytotoxity  at  the  highest  concentration  examined 
(100 µM) against both cell lines, whereas its ethyl ester derivative 
(2) was cytotoxic against MCF‐7 (IC50 = 62 µM). Compounds 3, 5, 
6 (a, b) did not exhibit cytotoxity. Most of the compounds bearing 
the  5‐thio‐1,3,4‐oxadiazol‐2‐yl  group  at  the  5th  position  of  the 
benzimidazole  ring  have  moderate  growth  inhibitory  effects  as 
compounds 7 (IC50 = 21 µM  and 24 µM), 11 (IC50 = 26 µM  and 21 
µM), 12 (IC50 = 19 µM  and 22 µM),  13  (IC50 = 37 µM  and 64 µM), 
compounds 15 and 17 (IC50 = 48 µM  and 24 µM)  and 16 (IC50 = 
20  µM  and  24  µM)  against  both  MCF‐7  and  A549  cell  lines 
respectively. Interestingly compound 9 exhibited potent cytotoxic 
effect  against  the  two  cell  lines  (IC50  =  1.2  µM  and  1.9  µM). 
However some exceptions (e.g. inactive compounds 8, 10 and 14) 
were noted. 

 
Table  1.    Cytotoxicity  of  the  synthesized  compounds  against  MCF‐7  and 
A549 cell lines using the AlamarBlue assay [10]. 
Compound  IC50 for MCF­7 Cells (µM)  IC50  for A549 cells (µM) 

1  > 100  > 100
2  62±18  >100
3  > 100  > 100
4  Nda  Nda
5  > 100  > 100
6a  > 100  > 100
6b  > 100  > 100
7  21±3  24±5
8  >100  >100
9  1.2±0.1  1.9±0.1
10  > 100  > 100
11  26±5  21±3
12  19±3  22±2
13  37±8  64±16
14  >100  >100
15  48±28  24±3
16  20±0.1  24±7
17  48±2.8  24±3

Mitomycin‐C  0.2 ± 0.07  0.4 ± 0.1
a Not determined due to limited solubility in DMSO or aqueous solutions.
IC50:The  compound  concentration  for  which  the  growth  of  treated  cells 
from time0 was only 50%. 
 

On the basis of above screening, esterification of 2‐methyl‐
1H‐benzimidazole‐5‐carboxylic  acid,  1,  gave  compound  2  of 
moderate cytotoxic effect, whereas nitration of compound 2 to 
form  3  reduced  the  cytotoxicity.  Formation  of  the  5‐(5‐thio‐

1,3,4‐oxadiazol‐2‐yl)  group  led  to  an  increase  in  the  growth 
inhibitory  effects  on  these  two  cell  lines,  where  compound 9 
showed potent activity. Whereas, compounds 7, 11­13, and 15­
17 showed moderate activity. The activity of these compounds 
is relatively insensitive to the nature of the 1,3,4‐oxadiazole‐2‐
thio  substituent;  however,  some  exceptions  (e.g.,  inactive 
compounds 8, 10, 14) were found.  

In  conclusion,  nitration  of  ethyl  2‐methyl‐1H­
benzimidazole‐5‐carboxylate took place selectively at position‐
6.  Oxadiazole‐2‐thione  ring  at  the  5(6)  position  of  2‐
methylbenzimidazole  was  performed  by  the  reaction  of  the 
hydrazides (6a, b) with carbon disulfide. Dehydrochlorination 
and sulphonation reactions of compounds 7 and 14 took place 
selectively  on  the  thiol  group  of  oxadiazole  moiety.  The 
incorporation  of  1,3,4‐oxadiazole  ring  carrying  2‐nitrophenyl 
group  in  its  side  chain  to 2‐methyl‐1H‐benzimidazole  into  the 
5(6)‐position was successful  to increase the cytotoxic effect of 
the starting material. The reason of this may be the lipophilicity 
of  the  phenyl  group  together  with  the  influence  of  the  nitro 
group as a hydrogen bond acceptor.   
 
Acknowledgements 
 

We thank the US‐Egypt Joint Science and Technology Board 
Fund, Administered through the USDA (BIO9‐002‐015).   
 
References 
 
[1]. Boiani, M.; Gonzalez, M. Mini­Rev. Med. Chem. 2005, 5, 409. 
[2]. Hori, A.; Imaeda, Y.; Kubo, K.; Kusaka, M. Cancer Lett. 2002, 183, 53. 
[3]. Abdel‐Mohsen H. T.; Ragab F. A.  F.; Ramla M. M.; Diwani H.  I. Eur.  J. 

Med. Chem, 2010, 45, 2336‐2344. 
[4]. Velaparthi  U.;  Liu  P.;  Balasubramanian  B.;  Carboni  J.;  Attar  R.; 

Gottardis  M.;  Li  A.;  Greer  A.;  Zoeckler  M.;  Wittman  M.  D.;  Vyas  D. 
Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007, 17, 3072‐3076. 

[5]. Pagano M. A.;  Andrzejewska M.; Ruzzene M.; Sarno S.; Cesaro L.; Bain 
J.; Elliott M.; Meggio F.; Kazimierczuk Z.; Pinna L.A. J. Med. Chem. 2004, 
47, 6239‐6247. 

[6]. Pagano M. A.; Meggio F.; Ruzzene M.; Andrzejewska M.; Kazimierczuk 
Z.; Pinna L. A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 321, 1040‐1044. 

[7]. Neff D. K.; Lee‐Dutra A.; Blevitt J. M.; Axe F. U.; Hack M. D.; Buma J. C.; 
Rynberg R;  Brunmark A.;  Karlsson  L.; Breitenbucher G. Bioorg. Med. 
Chem. Lett. 2007, 17, 6467‐6471. 

[8]. Arienti K. L.; Brunmark A.; Axe F. U.; McClure K.; Lee A.; Blevitt J.; Neff 
D. K.; Huang L.; Crawford S.; Pandit C. R.; Karlsson L.; Breitenbucher J. 
G. J. Med. Chem. 2005, 48, 1873‐1885. 

[9]. Hajduk J. P.; Boyd S.; Nettesheim D.; Nienaber V.; Severin J.; Smith R.; 
Davidson D.;  Rockway  T.;  Fesik  S. W.  J. Med. Chem. 2000, 43,  3862‐
3866. 

[10]. Kumar D.; Jacob M. R.; Reynolds M. B.; Kerwin S. M. Bioorg. Med. Chem. 
2002, 10 , 3997–4004 

[11]. Aboraia  A.  S.;  Abdel‐Rahman H. M.; Mahfouz  N. M.;  EL‐Gendy M.  A., 
Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 1236‐1246. 

[12]. El  Naem  Sh.  I.;  El‐Nzhawy  A.  O.;  El‐Diwani  H  .I.;  Abdel  Hamid  A.  O.  
Arch Pharm. Pharm. Med. Chem. 2003, 1, 7‐17. 

[13]. Ramla M. M.; Omar M. A.; Tokuda H.; El‐Diwani H. I. Bioorg. Med. Chem. 
2007, 15, 6489‐6496. 

[14]. Ramla M. M.; Omar M. A.; EL‐Khamry A. M. M.; El‐Diwani H. I. Bioorg. 
Med. Chem. 2006, 14, 7324‐7332. 

[15]. Rostom S. A.  F.;  Shalaby M. A.;  El‐Demellawy M. A. Eur.  J. Med. Chem. 
2003, 38, 959‐974. 

[16]. Loetchutinat C.; Chau F.; Mankhetkorn S. Chem. Pharm. Bull. 2003, 51, 
728‐730. 

[17]. Kumar D.; Sundaree S.; Johnson E. O.; Shah K. Bioorg. Med. Chem. Lett. 
2009, 19, 4492–4494 

[18]. Guimaraes  C.  R  .W.;  Boger    D.  L.;  Jorgensen W  .L.  J. Am.  Chem.  Soc. 
2005, 127, 17377 –17384. 

[19]. Phillips A. M. J. Chem. Soc. 1928, 2393‐2399.  
[20]. Yamasaki N.; Imoto T.; Murai Y.; Hiramura T.; Oku T.; Sawada K. PCT 

Int. Appl. WO 9724334: Chem. Abst. 127 (1997) 135799. 
[21]. Blackburn W.; Danzig M.; Hubinger H.; Soisson D.; Schultz H. P., J. Org. 

Chem. 1961, 26 (8), 2805‐2809. 
[22]. Galal S. A.; Hegab K. H.; Kassab A. S.; Rodriguez M. L.; Kerwin S. M.; El‐

Khamry A. A.; El Diwani H. I. Eur. J. Med. Chem. 2009, 44,1500‐1508. 
[23]. Labouta  I. M.; Hassan A. M. M.; Aboulwafa O. M.; Kader O.; Monatsh. 

Chem. 1989, 120 (6‐7), 571‐574.