Microsoft Word - European_Journal_of_Chemistry_1_4_2010_373_376_101


European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 373‐376 

 
European Journal of Chemistry 

ISSN 2153‐2249 (Print) / ISSN 2153‐2257 (Online)  2010 EURJCHEM 
DOI:10.5155/eurjchem.1.4.373‐376.101 

   

 

European Journal of Chemistry 
Journal homepage: www.eurjchem.com 

 
     

Stabilization of 5‐aminolevulinic acid by the zinc(II) ion in an aqueous solution 

Hiroshi Sakiyamaa,*, Hidetatsu Inouea, Md.Kudrat‐E‐Zahana, Shoichi Huekib,  
Naohisa Tachiyab and Yuzo Nishidaa 

a Department of Material and Biological Chemistry, Faculty of Science, Yamagata University, Kojirakawa, Yamagata, JP­990­8560, Japan 
b Cosmo Oil Co., Ltd., Shibaura, Minatoku, Tokyo, JP­105­8528, Japan 

*Corresponding author at: Department of Material and Biological Chemistry, Faculty of Science, Yamagata University, Kojirakawa, Yamagata, JP­990­8560, Japan. 
Tel.: +81.23.6284601; fax: +81.23.6284591. E­mail address: saki@sci.kj.yamagata­u.ac.jp (H. Sakiyama). 

 
 

   

     
COMMUNICATION INFORMATION    ABSTRACT
Received: 06 May 2010 
Received in revised form: 09 June 2010 
Accepted: 22 June 2010 
Online: 31 December 2010 

KEYWORDS 

  It is known that 5‐aminolevulinic acid (5‐ALA) is not stable in an aqueous solution because of 
the auto‐condensation reaction between two 5‐ALA molecules; however, in this study, 5‐ALA 
was  stabilized  by  the  zinc(II)  ion  in  an  aqueous  solution  of  neutral  pH.  This  stabilization 
effect was ascertained by UV‐Vis Spectroscopy and 1H and 13C NMR Spectroscopy. 

5‐aminolevulinic acid 
Zinc(II) ion 
UV‐VIS absorption spectra 
NMR 
pH 

 
1. Introduction 
 

5‐Aminolevulinic acid (5‐ALA) (Scheme 1) is the precursor 
of  all  tetrapyrroles  in  biological  systems  [1];  in  the  case  of 
mammals, heme is synthesized from 5‐ALA, and, in the case of 
green  plants,  chlorophyll  is  synthesized  from  5‐ALA.  In  both 
biosynthetic processes, two 5‐ALA molecules are condensed to 
give  porphobilinogen  by  an  enzyme,  5‐aminolevulinic  acid 
dehydratase  (EC 4.2.1.24);  however, without  the  enzyme,  two 
5‐ALA molecules  are  condensed  in  a  different manner  to  give 
different  products  [2–6].  The  mechanism  of  this  auto‐
condensation of 5‐ALA was studied by Jaffe and coworkers [2] 
and  Novo  and  coworkers  [3].  They  reported  that  two  5‐ALA 
molecules  were  condensed  to  form  2,5‐bis(2‐carboxyethyl) 
dihydropyrazine(2,5‐dihydropyrazinedipropionic acid, HPDPA) 
and  then  HPDPA  was  oxidized  by  molecular  oxygen  to  form  
2,5‐bis(2‐carboxyethyl)pyrazine(2,5‐pyrazinedipropionic  acid, 
PDPA). 

 

O

O

OHH2N

 
5‐ALA 

 
Scheme 1 

 
Recently 5‐ALA has been used as a  fertilizer  for  tomatoes, 

wine grapes, strawberries, and other crops; however, the auto‐
condensation  of  5‐ALA  reduces  the  concentration  of  5‐ALA  in 
the  fertilizer  solution,  which  is  a  problem.  Therefore,  we  are 
looking for a method to stabilize 5‐ALA in an aqueous solution 
of neutral pH. In the auto‐condensation, the first condensation 

process is thought to start with a nucleophilic attack by a lone 
pair  of  the  amino  group  of  5‐ALA  to  a  γ‐carbonyl  carbon  of 
another 5‐ALA molecule. Therefore, if metal ions are added to a 
5‐ALA  solution  and  bind  to  the  amino  groups  of  5‐ALA 
molecules,  the  initial  nucleophilic  attack will  be  stopped,  and  
5‐ALA  molecules  should  be  stabilized.  In  this  study,  we 
examined the effect of a zinc(II)  ion because the zinc(II)  ion is 
colorless and diamagnetic due to its d10 electronic configuration 
and is suitable for UV‐Vis Spectroscopy and NMR Spectroscopy. 
 
2. Experimental 
 
2.1. Measurements 
 

Electronic  spectra  were  recorded  on  a  Jasco  V‐560 
spectrometer.  1H  and  13C  NMR  spectra  (400  MHz)  were 
recorded  on  a  JEOL  JNM‐α400  spectrometer  in  D2O  using 
sodium  3‐trimethylsilyl‐2,2,3,3‐tetradeuteropropionate  (TSP) 
as the internal standard. 
 
2.2. Materials 
 

Hydrochloric  salt  of  5‐ALA  (5‐ALA·HCl)  was  prepared  by 
Cosmo Oil Co., Ltd. using a  fermentation method  [7]. All other 
chemicals  were  commercial  products  and  were  used  as 
supplied. 
 
3. Results and discussion 
 
3.1. Auto­condensation reaction of 5­ALA monitored by 
electronic spectra 
 

Before examining the stabilization effect of zinc(II) ion, the 
auto‐condensation reaction of 5‐ALA was monitored by the  



374  Sakiyama et al. / European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 373­376 
 

 

 

 
Figure 1. Electronic spectral change for an aqueous 5‐ALA solution (left) and time dependencies of 
the  absorbance  for  the  solution  at  245  nm  (○)  and  275  nm  (Δ)  (right).  Conditions:  5‐ALA·HCl  (20 
μmol) and LiOH (40 μmol) in 5 mL of water under aerobic conditions at room temperature (pH=8.0). 
Measurements were conducted for 20 hours at one‐hour intervals. 

 

 
Figure 2. Electronic  spectral  change  for  an N2‐exchangerd  aqueous  5‐ALA  solution  (left)  and  time 
dependencies of the absorbance for the solution at 245 nm (○) and 275 nm (Δ) (right). Conditions:    
5‐ALA·HCl  (20  μmol),  LiOH  (40  μmol)  in  5 mL  of water  under N2  condition  at  room  temperature. 
Measured for 20 hours at one hour intervals.

 
 
electronic  spectra  as  follows.  An  aqueous  solution  of  5‐ALA 
(pH=~8)  was  prepared  by  mixing  5‐ALA·HCl  and  lithium 
hydroxide  (LiOH)  in  a  1:2  molar  ratio,  and  the  absorption 
spectra of the resulting solution were measured for 20 hours at 
one‐hour  intervals  (Figure 1). At  first,  a new absorption band 
appeared at around 245 nm, and then another band appeared 
at around 275 nm together with two shoulder bands at around 
300 nm and 330 nm. The result is consistent with the results of 
Novo  and  coworkers  [3];  the  appearance  of  the  first  band  at 
around  245  nm  corresponds  to  the  formation  of  HPDPA,  and 
the  second  band  at  around  275  nm  corresponds  to  the 
formation of PDPA. An experiment was also carried out under 
nitrogen (Figure 2), and as anticipated, the first band appeared 
at  around  245  nm  as  well  as  in  the  aerobic  experiment; 
however,  the  intensity  of  the  second  band  at  around  275  nm 
was significantly smaller than that in the aerobic experiment. 
 
3.2. Stabilization of 5­ALA by zinc(II) ion  
 

The effect of zinc(II) ion on the auto‐condensation of 5‐ALA 
was  examined  by  the method described  in  Section  3.1.  In  the 
presence  of  ZnCl2  in  the molar  ratio  of  5‐ALA:ZnCl2  (2:1),  the 
rate  of  PDPA  formation  decrease  to  about  15%  (Figure  3) 
[slope of absorbance at 275 nm: 2.5 × 10‐2 min‐1 in Figure 3 and 
1.7 × 10‐1 min‐1  in  Figure 1].    It  is  noteworthy  that  the  subtle 
precipitation  of  zinc  hydroxide  caused  an  increase  in  the 
absorbance  in  a  wide  wave‐length  range  just  after  preparing 

the  solution, but  this disappeared within  several hours. When 
ZnCl2 was added to a 5‐ALA solution  in a 1: 1 molar ratio,  the 
rate of PDPA formation became less than 5% (Figure 4) [slope 
of  absorbance  at  275  nm:  7.1  ×  10‐3  min‐1  in  Figure  4].  The 
formation  of  HPDPA  and  PDPA was  significantly  inhibited  by 
the  zinc(II)  ion,  and  we  can  conclude  that  the  zinc(II)  ion 
stabilizes 5‐ALA in solution. 

The  stabilization  effect  of  the  zinc(II)  ion  was  also 
ascertained by  1H and  13C NMR (Figure 5  and 6). Without  the 
zinc(II)  ions,  the  signals  of  5‐ALA  [1H  NMR:  δ  =  2.71  (t,  2H); 
2.90  (t,  2H);  4.13  (s,  2H)  ppm;  13C NMR:  δ  = 30.4;  37.3;  50.0; 
179.8; 207.0 ppm] disappeared, and  the signals of HPDPA [1H 
NMR: δ = 2.40 (s, 2H); 2.42 (t, 2H); 2.57 (t, 2H) ppm; 13C NMR: δ 
= 36.2; 36.2; 36.3; 175.8; 184.5 ppm] appeared; however, with 
zinc(II)  ions  (5‐ALA:ZnCl, 1:1),  the  signals of 5‐ALA remained, 
and a small amount of HPDPA was observed [1H NMR: δ = 2.51 
(t,  2H);  2.81  (t,  2H);  4.09  (s, ~1.1H)  ppm;  13C NMR:  δ  =  33.5; 
36.08 (HPDPA); 38.8; 50.2; 183.9; 208.9 ppm]. In the 1H NMR in 
the  presence  of  zinc(II)  ions  (Figure  5c),  the  integrated 
intensity  of  the  δ‐methylene  protons  was  smaller  than 
expected;  this may be explained by  the D‐H exchange through 
enolization of 5‐ALA in D2O [2]. In the presence of zinc(II) ions, 
the  1H  NMR  signals  shifted  downfield  as  compared  with  the 
solution without zinc(II) ions at pH 7 (δ = 2.45; 2.75; 4.05 ppm) 
[2];  this may suggest  the coordination of 5‐ALA to  the zinc(II) 
ion to form a zinc(II) complex. 



Sakiyama et al. / European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 373­376  375 
 

 
 

 

 
Figure 3. Electronic  spectral  change  for  an  aqueous  5‐ALA  solution  in  the  presence  of  zinc(II)  ion 
(left) and time dependencies of the absorbance for the solution at 245 nm (○) and 275 nm (Δ) (right). 
Conditions:  5‐ALA·HCl  (20  μmol),  ZnCl2  (10  μmol),  and  LiOH  (40  μmol)  in  5  mL  of  water  under 
aerobic conditions at  room temperature  (pH = 7.2). Measurements were conducted  for 20 hours at 
one‐hour intervals. 

 

 
Figure 4. Electronic  spectral  change  for  an  aqueous  5‐ALA  solution  in  the  presence  of  zinc(II)  ion 
(left) and time dependencies of the absorbance for the solution at 245 nm (○) and 275 nm (Δ) (right). 
Conditions:  5‐ALA·HCl  (20  μmol),  ZnCl2  (20  μmol),  and  LiOH  (40  μmol)  in  5  mL  of  water  under 
aerobic conditions at  room temperature  (pH = 6.7). Measurements were conducted  for 20 hours at 
one‐hour intervals. 

 

 
Figure 5.  1H NMR  spectra  of  5‐ALA  in  D2O:  (a)  5‐ALA·HCl,  (b)  neutralized 
with LiOH, and (c) neutralized with LiOH in the presence of ZnCl2 (pH = 7).  
 

 
Figure 6.  13C NMR spectra  of  5‐ALA  in D2O:  (a)  5‐ALA·HCl,  (b) neutralized 
with LiOH, and (c) neutralized with LiOH in the presence of ZnCl2 (pH = 7).
 



376  Sakiyama et al. / European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 373­376 
 

 

3.3. Stabilization mechanism of 5­ALA by zinc(II) ion  
 

As  reported  in  the  introduction,  the  auto‐condensation  of  
5‐ALA  starts  with  a  nucleophilic  attack  by  a  lone  pair  of  the 
amino group of 5‐ALA to a γ‐carbonyl carbon of another 5‐ALA 
molecule.  Judging  from  the  downfield  shift  in  1H NMR,  5‐ALA 
seems  to  coordinate  to  the  zinc(II)  ion  to  form  a  zinc(II) 
complex. Since the lone pair  is used for the coordination bond 
in the complex, the initial nucleophilic attack cannot occur, and 
5‐ALA molecules  are  stabilized. Although  the  zinc(II)  complex 
has not been isolated, attempts to do so is underway. 
 
4. Conclusion 
 

A  method  of  stabilizing  5‐ALA  at  neutral  pH  was  being 
required in order to use 5‐ALA for some application purposes. 
It  is known that 5‐ALA  is not stable  in an aqueous solution at 
neutral pH. In this study, the zinc(II) ion was found to stabilize 
5‐ALA  in  an  aqueous  solution  of  neutral  pH  by  forming  a 
zinc(II) complex. 
 
References 
 
[1]. Shemin, D.; Russell, C. S. J. Am. Chem. Soc. 1953, 75, 4873–4874. 
[2]. Jaffe, E. K.; Rajagopalan, J. S. Bioinorg. Chem. 1990, 18, 381–394.  
[3]. Novo, M.;  Hüttmann,  G.;  Diddens,  H.  J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 

1996, 34, 143–148.  
[4]. Elfsson, B.; Wallin, I.; Eksborg, S.; Rudaeus, K.; Ros, A. M.; Ehrsson, H. 

Eur. J. Pharm. Sci. 1998, 7, 87–91. 
[5]. Bunke, A.; Zerbe, O.; Schmid, H.; Burmeister, G.; Merkle, H. P.; Gander, 

B. J. Pharm. Sci. 2000, 89, 1335–1341. 
[6]. Gadmar,  Ø.  B.; Moan,  J.;  Scheie,  E.; Ma,  L. W.;  Peng,  Q.  J. Photochem. 

Photobiol. B: Biol. 2002, 67, 187–193. 
[7]. Nishikawa,  S.;  Watanabe,  K.;  Tanaka,  T.;  Miyachi,  N.;  Hotta,  Y.; 

Murooka, Y. J. Biosci. Bioeng. 1999, 87, 798–804.