Microsoft Word - European_Journal_of_Chemistry_1_4_2010_348_351_110


European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 348‐351 

 
European Journal of Chemistry 

ISSN 2153‐2249 (Print) / ISSN 2153‐2257 (Online)  2010 EURJCHEM 
DOI:10.5155/eurjchem.1.4.348‐351.110 

   

 

European Journal of Chemistry 
Journal homepage: www.eurjchem.com 

 
     

Derivative spectrophotometric method for simultaneous determination of 
ezetimibe and simvastatin in combined tablets 

Bahia Abbas Moussaa, Marwa Fadel Mohamedb,* and Nadia Fayek Youssefb 

a Pharmaceutical Chemistry Department, Faculty of Pharmacy, Cairo University, Kasr El­Aini Street, Cairo, EG­115562, Egypt 
b National Organization for Drug Control and Research (NODCAR), Cairo, EG­12553, Egypt 

*Corresponding author at: National Organization for Drug Control and Research (NODCAR), Cairo, EG­12553, Egypt. Tel.: +202.35850005; fax: +202.35855582. 
E­mail address: mera_pharm2003@yahoo.com (M.F. Mohamed). 

 
 

   

     
ARTICLE INFORMATION    ABSTRACT
Received: 15 May 2010 
Received in revised form: 24  August 2010 
Accepted: 20 September 2010 
Online: 31 December 2010 

KEYWORDS 

  The  introduced study portrays  the development and validation of an effortless, speedy and 
selective  first  order  derivative  zero‐crossing  spectrophotometric  method  to  estimate 
ezetimibe and simvastatin simultaneously in combined drug products over and above in the 
presence of  ezetimibe alkaline degradation products. Ezetimibe  and  its alkaline degradates 
spectra showed zero‐crossing point at 249 nm, so the amplitude at 249 nm could be used for 
calculating  the  concentration  of  simvastatin.  While  simvastatin  and  ezetimibe  alkaline 
degradates  spectra  showed  a  zero‐reading  value  at  261  nm,  so  ezetimibe  could  be 
determined  by measuring  the  amplitude  at  261  nm. Regression  plots  revealed  good  linear 
relationships  in  the  concentration  range 1‐16 µg/mL with  accuracy  checked by  conducting 
recovery studies; average recovery was 99.61 ± 1.183 and 100.47 ± 1.310 for ezetimibe and 
simvastatin,  respectively.  The  suggested  first  derivative  spectrophotometric  method  was 
successfully  applied  for  the  determination  of  the  cited  drugs  in  "Inegy  10/10,  10/20  and 
10/40 tablets". Satisfactory results were obtained for the recovery of both drugs and were in 
good  agreement with  the  labeled  amounts.   Method  validation was  estimated  according  to 
USP guidelines. 

Ezetimibe 
Simvastatin 
First derivative spectrophotometry 
Simultaneous determination 
Degradation products 
Drug products 
 

 
1. Introduction 
 

Ezetimibe (EZE); Sch‐58235 [(3R,4S)‐1‐(p‐fluorophenyl)‐3‐
[(3S)‐(p‐fluorophenyl)‐3‐hydroxypropyl]‐4‐(p‐hydoxyphenyl)‐
2‐azetidinone]  (Figure  1a)  is  an  inhibitor  of  intestinal 
cholesterol absorption by enterocytes rather than inhibition of 
intestinal  acyl  coenzyme  A:  cholesterol  actyl  transferase 
causing  selective  inhibition  of  intestinal  absorption  of  dietary 
and biliary cholesterol  leading  to a decrease  in the delivery of 
intestinal  cholesterol  to  the  liver.  Simvastatin  (SIM);  [2,2‐
dimethylbutanoic  acid  (1S,3R,7S,8S,8aR)‐1,2,3,7,8,8a‐hexa 
hydro‐3,7‐dimethyl‐8‐[2‐[2R,4R)‐tetrahydro‐4‐hydoxy‐6‐oxo‐
2H‐pyran‐2‐yl]ethyl]‐1‐napthalenylester]  (Figure  1b)  is  3‐
hydoxy‐3‐methylglutaryl  coenzyme  A  reductase  inhibitor 
which is the rate limiting step in the biosynthesis of cholesterol 
[1,2]. 

Ezetimibe  is  more  effective  when  used  in  a  combination 
therapy with statins rather than when used as a monotherapy 
where  the  dual  therapy  with  these  two  classes  of  drugs 
prevents  the enhanced cholesterol synthesis by ezetimibe and 
the increase in cholesterol absorption induced by statins so the 
combination  therapy  is  used  to  reduce  total  cholesterol,  LDL‐
cholesterol  and  apolipoprotien  B  in  the  management  of 
hyperlipidaemia  and  to  reduce  sitosterol  and  camposterol  in 
patients with homozygous familial sito‐sterolaemia [1,2]. 

Owing  to  the  curative  value  of  EZE  and  SIM,  various 
numbers of analytical procedures have been established for the 
quantitative  determination  in  drug  substances,  drug  products 
and/or  biological  fluids,  over  and  above  in  binary  mixtures. 
These  procedures  include  spectrophotometric  comprising 

simultaneous determination of EZE and atorvastatin calcium in 
pharmaceutical  dosage  form  [3],  also,  simvastatin  and 
fluvastatin  in  human  plasma  and  pharmaceutical  formulation 
[4], TLC [5‐7], LC [3,8‐26], Capillary Zone Electrophoresis (CZE) 
[27,28] and GC [29] methods. 

Derivative  spectrophotometry  is  considered  one  of  the 
most convenient analytical  techniques, because of  its  inherent 
simplicity, low cost and wide availability in most quality control 
laboratories  especially  in  developed  countries.  Also,  some 
reported  techniques  were  found  to  be  time  consuming, 
expensive  and  relatively  complicated.  For  these  reasons,  the 
present  study  describes  direct,  simple,  rapid  and  economical 
derivative  spectrophotometric  method  for  the  simultaneous 
assay of EZE and SIM  in drug substance and  in drug products 
without  inference  of  EZE  degradation  products  and  tablet 
excipients. 
 
2. Experimental 
 
2.1. Chemicals and reagents 
 

All  the  solvents  and  chemicals  used  were  of  analytical 
grade.  EZE  was  kindly  supplied  by  Marcyrl  Pharmaceutical 
Industries  (Cairo,  Egypt);  its  purity  was  found  to  be  99.23  ± 
1.074 %,  according  to Raw Material  Specification  (IN HOUSE) 
[30]  sent  by  Glenmark  Pharmaceutical,  Mumbai,  India;  by 
applying HPLC technique using C18 column; Water: Acetonitrile 
(60:40,  v:v)  as  mobile  phase  and  UV  detector  at  225  nm 
applying  isocratic  elution  mode.  SIM  was  nicely  supplied  by 
SIGMA Pharmaceutical Industries (Cairo, Egypt). Its purity was  



Moussa et al. / European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 348­351  349 
 

 
 

 

 
(a)  

 
(b) 
 

Figure 1. Structure of ezetimibe (C24H21F2NO3) (a) and simvastatin (C25H38O5) (b). 
 

found  to  be  99.40  ±  1.148  %  according  USP  pharmacopoeia 
[31]  by  performing  HPLC  technique  using  ODS  column  and 
mixture  of  acetonitrile:  0.1 %  (v:v)  phosphoric  acid  (50:50  – 
v:v)  (mobile  phase  A)  and  0.1  %  (v:v)  phosphoric  acid  in 
acetonitrile (mobile phase B) as mobile phase and UV detector 
at  238  nm  applying  gradient  elution  mode.  Inegy  tablets; 
produced by Global Napi Pharmaceuticals  (GNP,  Cairo,  Egypt) 
under license from Merck & Co. Inc., Schering‐Plough Co., USA. 
Each  tablet  was  labeled  to  contain  10/10 mg,  10/20 mg  and 
10/40  mg  of  EZE  and  SIM,  respectively.  Sodium  hydroxide 
pellets: El‐Nasr Pharmaceutical Chemicals, Co. Egypt. 
 
2.2. Apparatus 
 

Unicam  UV  300,  thermospectronic,  vision  32  software 
equipped  with  IBM  PC  computer  used  for  all  the  absorbance 
measurements and treatment of data, HP  laser  jet 1000 series 
printer  and  1  cm  path  length  quartz  cuvettes.  Thin‐layer 
chromatographic glass plates, precoated with silica gel GF‐ 50 
UV254,  20×20  cm,  0.5  mm  thickness  fluorescent  at  254  nm 
(Macherey‐ Na Gel MN, Germany). UV Lamp. short wavelength, 
254 nm. Sonamak, Ultrasonic Cleaner, Falc Instrument, Italy. 
 
2.3. Standard solutions                                                                                    
 

EZE  stock  solution  (1  mg/mL)  and  working  solution  (20 
µg/mL)  ethanol  95%.  SIM  stock  solution  (1  mg/mL)  and 
working  solution  (20  µg/mL)  in  ethanol  95  %.  EZE  alkaline 
degradation products stock solutions (0.1 mg/mL) and working 
solutions (20 µg/mL and 0.4 µg/mL) in ethanol 95 %. 
 
2.4. Preparation of EZE alkaline degradation products 
 

100 mg of ezetimibe was dissolved in 100 mL of methanolic 
1 M sodium hydroxide and refluxed for one hour. The solution 
was  neutralized  using  methanolic  1  M  hydrochloric  acid, 
filtered  and  the  filtrate  was  evaporated  to  about  10 mL.  The 
filtrate  was  spotted  on  silica  gel  TLC  glass  plates  (0.5  mm 
thickness)  in  form  of  bands,  developed  in  mobile  phase  iso‐
propanol:  ammonia  33%  (9:1;  v:v)  showing  partial  degra‐
dation. Each developed band was scratched from silica gel TLC 
plates  and  extracted  with  methanol  several  times,  filtered, 
followed by evaporation obtaining two degradation products. 
 
2.5. Preparation of combined standard solutions of EZE and 
SIM 
 

Synthetic mixtures were set up by preparing three different 
solutions  of  ezetimibe  and  simvastatin  in  ethanol  95 %.  First 
solution containing EZE (10 µg/mL) and SIM (10 µg/mL), then 
different aliquots (1‐4 mL) equivalent to (20‐80 µg/mL) of each 
EZE and SIM were transferred. Second solution containing EZE 

(10  µg/mL)  and  SIM  (20  µg/mL),  then  different  aliquots  (1‐3 
mL) equivalent  to (20‐60 µg/mL) of EZE and (40‐120 µg/mL) 
of  SIM  were  transferred.  Third  solution  containing  EZE  (10 
µg/mL)  and  SIM  (40  µg/mL),  then  different  aliquots  (0.5‐1.5 
mL) equivalent  to (10‐30 µg/mL) of EZE and (40‐120 µg/mL) 
of  SIM  were  transferred,  into  a  series  of  10  mL  volumetric 
flasks. The volume was completed with ethanol 95 %, taking in 
consideration that the final concentration ratio of EZE to SIM in 
each solution was the same as that of the dosage form (1:1, 1:2, 
1:4). 
 
2.6. Sample Preparation 
 

Ten  tablets  of  each  10/10  mg,  10/20  mg  and  10/40  mg 
were  accurately weighed  and  finely  powdered.  An  amount  of 
powder equivalent to 10 mg of EZE and 10 or 20 or 40 of SIM 
was weighed and transferred to three 25 mL volumetric flasks. 
20 mL of ethanol 95 % was added and sonicated for 30 min, the 
volume was completed with ethanol 95 %, mix well and  filter 
through a Whatman no. 1  filter paper, discarding  the  first  few 
milliliters.  The procedure was  completed  as mentioned under 
preparation of combined standard solutions of EZE and SIM. 
 
2.7. Analytical performance 
 

Aliquots  (0.5‐8  mL)  of  EZE  working  solution  (20  µg/mL) 
equivalent  to  10‐160  µg  EZE  and  aliquots  (0.5‐8  mL)  of  SIM 
working solution (20 µg/mL) equivalent to 10‐160 µg SIM were 
separately  transferred  into  two  series  of  10  mL  volumetric 
flasks and  the volume was completed with ethanol 95 %. The 
first derivative spectrum of each solution was recorded against 
ethanol 95 % as blank at a range of 200‐400 nm; band width: 
1.5  nm;  scan  speed:  intelliscan;  data  interval:  normal; 
smoothing:  high.  The  amplitude  of  different  concentrations  at 
261 nm for EZE and 249 nm for SIM were measured, then two 
calibration  curves  were  constructed  and  the  regression 
equations were calculated.  
 
3. Results and discussion 
 
3.1. Methods development 
 

Derivative  spectrophotometry  is  a  useful  technique  for 
identifying  and  quantitating  combination  of  drugs  with 
overlapping  spectra  and  for  eliminating  interference  from 
formulation  matrix  by  using  the  zero‐crossing  point  (ZCP) 
technique  [32‐37].  The  zero‐order  absorption  spectra  of  EZE, 
its  alkaline  degradation  products  and  SIM  in  ethanol  95% 
showed an extensive overlap of spectral bands, Figure 2. 

Accordingly,  a  derivative  spectrophotometric method was 
developed  for  the  evaluation  of  EZE  and  SIM  in  their  binary 
mixture and in presence of EZE alkaline degradation products.  



350  Moussa et al. / European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 348­351 
 

 

Table 1. Analytical and validation parameters for determination of ezetimibe & simvastatin using first derivative spectrophotometric method. 

Parameters 
First Derivative Spectrophotometric Method 

Ezetimibe  Simvastatin 
Wavelength (nm)  261  249
Linearity range  1‐16 µg/mL 1‐ 6 µg/mL
Specificity (mean ± R.S.D. %)a  100.14 ± 1.141 100.14 ± 1.219 
Slope (b)  0.1146 0.2845
Intercept (a)  0.0177 0.0155
Regression coefficient (r2)  0.9999 0.9997
LOD  0.132 µg/mL 0.123 µg/mL
LOQ  0.439 µg/mL 0.410 µg/mL

Precision (± R.S.D. %)  Precision (± R.S.D. %) 
Intradayb  ± 0.832 ± 1.114
Interdayb  ± 1.109 ± 1.315
Synthetic mixture (Mean ± R.S.D. %)  99.48 ± 1.150 100.24 ± 1.196 

100.38 ± 1.269 99.74 ± 1.142 
99.15 ± 1.221 99.93 ± 1.286 
Accuracy (Mean ± R.S.D. %)  Accuracy (Mean ± R.S.D. %) 

Drug substances  99.61 ± 1.183 100.47 ± 1.310 
Drug products  102.43 ± 1.097 102.64 ± 1.299 

102.66 ± 1.244 104.23 ± 1.193 
103.08 ± 1.272 103.38 ± 1.174 

Standard added  100.09 ± 1.291 100.34 ± 1.343 
99.42 ± 1.573 99.57 ± 1.530 
100.54 ± 1.344 100.02 ± 1.259 

a Average of 6 experiments. 
b Average of 9 experiments. 
 

Figure 2. The zero‐order absorption spectra of: (A) ‐ Ezetimibe Intact (10 
µg/mL); (B) and (C) ‐ Ezetimibe Alkaline Degradation Products (10 µg/mL); 
(D) ‐ Simvastatin Intact (10 µg/mL). 
 

The  first  derivative  technique  was  able  to  enhance  the 
resolution  of  overlapping  absorption  bands  through  the 
application of zero‐ crossing technique. 

The  first  derivative  spectrum  of  EZE  displays  a  peak 
amplitude  at  261  nm  (1D261),  while  its  degradation  products 
and SIM have a zero‐crossing point at 261 nm, so EZE could be 
determined by measuring the amplitude at 261 nm in presence 
of simvastatin and  its degradation products without any prior 
separation procedures. On  the  other hand,  the  first derivative 
spectrum of SIM shows that SIM exhibits peak amplitude at 249 
nm  (1D249)  where  EZE  and  its  degradation  products  spectra 
show a zero‐ reading value, so the amplitude at 249 nm could 
be used for calculating the concentration of SIM, in presence of 
EZE and its degradation products, Figure 3. 
 
3.2. Methods validation 
 
3.2.1. Linearity 
 

The  linearity  of  the  proposed method was  constructed by 
triplicate  analysis  of  six  standard  solutions  with  different 
concentrations  ranging  1‐16  µg/mL  of  EZE  and  SIM.  Linear 
regression analysis of EZE and SIM was driven (Table 1), with 
acceptable  intercepts and good correlation coefficients, Figure 
4 and 5. The LOD and LOQ were calculated from the slope (s) of 
the  calibration  plots  and  the  standard  deviation  (SD)  of  the 
response. The values are given in Table 1. 

  
Figure 3. The First Derivative absorption spectra of:  (A)  ‐ Ezetimibe  Intact 
(10  µg/mL);  (B)  and  (C)  –  Ezetimibe  Alkaline  Degradation  Products  (10 
µg/mL); (D) ‐ Simvastatin Intact (10 µg/mL). 
 

Figure 4. Linearity of peak amplitudes of first derivative absorption 
spectra at 261 nm to concentrations of EZE (1‐16 µg/mL). 
 

Figure 5. Linearity of peak amplitudes of first derivative absorption 
spectra at 247 nm to concentrations of SIM (1‐16 µg/mL). 
 
 



Moussa et al. / European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 348­351  351 
 

 
 

Table 2. Statistical comparison between the results of ezetimibe & simvastatin  in drug substances applying first derivative spectrophotometric, reported and 
official methods.              

First Derivative Spectrophotometric Method 
Statistical Item  Ezetimibe  Reported Method [30]  Simvastatin  Official Method [31] 
Ma ± RSD %  99.61 ± 1.183  99.23 ± 1.074 100.47 ± 1.310  99.40 ± 1.148
SD  1.191  1.065 1.317 1.141
SE  0.533  0.477 0.589 0.510
Variance  1.418  1.135 1.733 1.302
t (2.31)b  0.538  ‐ 1.369 ‐
F (6.39)b  1.244  ‐ 1.331 ‐
a Average of 5 experiments. 
b Tabulated values of t‐ test and F‐ratio. 
 

3.2.2. Accuracy 
 

The  validity  of  the proposed methods  could be proved by 
analyzing authentic samples of the drug substances. The results 
obtained were  in a good agreement with those obtained using 
reported and official methods [30,31]. Using student’s t test and 
variance  ratio  F  test  statistically  revealed  no  significant 
difference  between  the  results  of  proposed,  reported  and 
official methods, (Table 2). 

The recovery method was studied by analyzing samples of 
tablet  formulations  without  the  interference  of  tablet 
excipients (Butylated hydroxyanisole, Citric acid monohydrate, 
Croscarmellose  sodium,  Hypromellose,  Lactose  monohydrate, 
Magnesium stearate, Microcrystalline cellulose, Propyl gallate) 
[38];  also  the  standard  addition  technique  was  applied  by 
adding a known amount of standard drugs to the drug products 
and the results were expressed as mean± R.S.D. %, (Table 1). 
 
3.2.3. Precision 

 
The precision of the suggested method was assessed by the 

repeatability  and  reproducibility  of  the  first  derivative 
spectrophotometric method. The intra‐ and inter‐day variation 
expressed  by mean  ±  R.S.D. %  (Table  1),  was  determined  by 
measuring  triplicate  analysis of  three different  concentrations 
(1.6, 8, 14.4 µg/mL) over a period of three days, (Table 1). 
   
3.2.4. Specificity 
 

The specificity of the proposed method was determined by 
preparing  laboratory mixtures  of  EZE  and  SIM  in  presence  of 
up  to  100 %  of  EZE  alkaline  degradation  products,  (Table  1). 
The  assay  results  were  unaffected  by  the  presence  of 
degradates. 
 
3.2.5. Robustness 
 

Two sets of experiments were performed for the two drugs 
on  UNICAM  UV  300  with  1  cm  matched  quartz  cells  by  two 
different  analysts  in  different  days  with  respect  to  the 
derivative  amplitude  as  a  response  factor  and  no  significant 
difference was obtained between the results in this study. 
 
4. Conclusion 
 

The  present  study  described  a  validated  derivative 
spectrophotometric  method  which  can  be  used  as  a 
simultaneous  assay  of  EZE  and  SIM  in  the  presence  of  EZE 
degradation  products  and  in  drug  products  without 
interference from tablet excipients. The proposed methods are 
of great worth in quality control analysis of EZE and SIM owing 
to  their  improved  simplicity,  low‐cost,  their  independence  on 
expensive  instruments,  or  critical  analytical  reagents,  the 
reproducibility  and  the  lack  of  complicated  pretreatments 
before analysis. 
 
References 
 
[1]. Sweetman,  S.  C.  Martindale,  The  Complete  Drug  Reference,  36th 

Edition, The Pharmaceutical Press, London, 2009. 

[2]. Brunton,  L.  L.;  Lazo,  J.  S.;  Parker,  K.  L.  Goodman  and  Gilman's,  The 
Pharmacological  Basis  of  Therapeutics.  McGraw‐Hill  Book  Co.,  New 
York, NY, 2006.    

[3]. Sonawane, S. S.; Shirkhedkar, A. A.; Fursule, R.A.; Surana, S. J. Eurasian 
J. Anal. Chem. 2006, 1, 31‐41. 

[4]. Erk, N. Pharmazie 2002, 57, 817‐819.  
[5]. Dhaneshwar,  S.  S.;  Dhaneshwar,  S.  R.;  Deshpande,  P.;  Patil,  M.  Acta 

Chromatogr. 2007, 19, 141‐148.  
[6]. Dixit, R. P.; Barhate, C. R.; Nagarsenker, M. S. Chromatographia 2008, 

67, 101‐107. 
[7]. Komsta, L.; Skibinski, R.; Hopkala, H.; Winiarcyzk‐Serwacka, M. Chem. 

Anal. (Warsaw, Pol.) 2007, 52, 771‐779. 
[8]. Sistla, R.; Tata, V. S. S. K.; Kashyap, Y. V.; Chandrasekar, D.; Diwan, P.V. 

J. Pharm. Biomed. Anal. 2005, 39, 517‐522. 
[9]. Li, S.  J.; Liu, G.Y.;  Jia,  J.Y.; Li, X.C.; Yu, C. J. Pharm. Biomed. Anal. 2006, 

40, 987‐992.  
[10]. Oliveria, P. R.; Brum, L. Jr.; Fronza, M.; Bernard, L. S.; Masiero, S. M. K.; 

Dalmora, S. L. Chromatographia 2006, 63, 315‐320. 
[11]. Singh,  S.;  Singh,  B.;  Bahuguna,  R.;  Wadhwa,  L.;  Saxena,  R.  J.  Pharm. 

Biomed. Anal. 2006, 41, 1037‐1040. 
[12]. Oswald,  S.;  Scheuch,  E.;  Cascorbi,  I.;  Siegmund, W.  J.  Chromatogr. B: 

Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2006, 830,143‐150. 
[13]. Ashfaq M.; Ullahkhan I.; Qutab S. S.; Naeemrazzaq S. J. Chil. Chem. Soc. 

2007, 52, 1220‐1223. 
[14]. Basha, S. J. S.; Naveed, S. A.; Tiwari, N. K.; Shashikumar, D.; Muzeeb, S.; 

Kumar,  T.  R.;  Kumar,  N.V.;  Rao,  N.  P.;  Srinivas,  N.;  Mullangi,  R.; 
Srinivas, N. R.  J. Chromatogr. B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2007, 
853, 88‐96. 

[15]. Ozaltin, N.; Ucakturk, E. Chromatographia 2007, 66, S87‐S91. 
[16]. Doshi, A.  S.; Kachhadia, P. K.;  Joshi, H. S. Chromatographia 2008, 67, 

137‐142. 
[17]. Seshachalam,  U.;  Kothapally,  C.  B.  J.  Liq.  Chromatogr. Relat. Technol. 

2008, 31, 714‐721.  
[18]. Iwabuchi,  H.;  Kitazawa,  E.;  Kobayashi,  N.;  Watanabe,  H.;  Kanai,  M.; 

Nakamura, K. Biol. Mass Spectrom. 1994, 23, 540‐546. 
[19]. Ochiai, H.; Uchiyama, N.; Imagaki, K.; Hata, S.; Kamei, T. J. chromatogr. 

B: Biomed.  Appl. 1997, 694, 211‐217. 
[20]. Jemal, M.; Ouyang, Z.; Powell, M. L.  J. Pharm. Biomed. Anal. 2000, 23, 

323‐340.  
[21]. Zhao,  J.  J.;  Xie,  I.  H.;  Yang,  A.  Y.;  Roadcap,  B.  A.;  Rogers,  J.  D.  J. Mass 

Spectrom. 2000, 35, 1133‐1143. 
[22]. Zhang, N. Y.; Yang, A.; Rogers,  J. D.; Zhao,  J.  J.  J. Pharm. Biomed. Anal. 

2004, 34, 175‐287. 
[23]. Yang,  A.  Y.;  Sun,  L.; Musson,  D.  G.;  Zhao,  J.  J.  J. Pharm. Biomed. Anal. 

2005, 38, 521‐527. 
[24]. Barrett,  B.;  Huclova,  J.;  Borek‐Dohalsky,  V.;  Nemec,  B.;  Jelinek,  I.  J. 

Pharm. Biomed. Anal. 2006, 41, 517‐526.  
[25]. Malenovic, A.; Medenica, M.;  Ivanovic, D.;  Jancic, B. Chromatographia 

2006, 63, S95‐S100. 
[26]. Senthamil S. P.; Pal, T. K. J. Pharm. Biomed. Anal. 2009, 49, 780‐785. 
[27]. Dalmora, S. L.; Oliveria, P. R.; Barth, T.; Todeschini, V. J. Anal. Sci. 2008, 

24, 499‐503. 
[28]. Srinivasu, M. K.; Raju, A. N.; Reddy, G. O. J. Pharm. Biomed. Anal. 2002, 

29, 715‐721. 
[29]. Morris, M. J.; Gilbert, J. D.; Hsieh, J. Y.‐K.; Matuszewski, B. K.; Ramjit, H. 

G.; Bayne, W. F. Biol. Mass Spectrom. 1993, 22, 1‐8. 
[30]. Raw  Material  In  House  Specifications;  Glenmark  Pharmaceuticals, 

Mumbai, India, 2003. 
[31]. The United  States  Pharmacopoeia  (USP 32)  and National  Formulary 

(NF 27); Asian Ed., 2009. 
[32]. Morelli, B. J. Pharm. Sci. 1988, 77, 615‐621. 
[33]. Morelli, B. J. Pharm. Sci. 1988, 77, 1042‐1045. 
[34]. Morelli, B. J. Pharm. Sci. 1995, 84, 34‐37. 
[35]. Talsky, G.; Marying, L.; Kreuzer, H. Angew. Chem.  Int. Ed. Engl. 1978, 

17, 785‐799. 
[36]. OHaver, T.C. Anal. Chem. 1979, 51, 91A‐100A. 
[37]. Rojas, F.S.; Ojeda, C.B.; Pavon, J. M.C. Talanta 1988, 35, 753‐761. 
[38].  http://www.medicines.org.uk/emc/medicine/15657.