Microsoft Word - European_Journal_of_Chemistry_1_1_2010_44_46_13


European Journal of Chemistry 1 (1) (2010) 44‐46 

 
European Journal of Chemistry 

ISSN 2153‐2249 (Print) / ISSN 2153‐2257 (Online)  2010 EURJCHEM 
DOI:10.5155/eurjchem.1.1.44‐46.13 

   

 

European Journal of Chemistry 
Journal homepage: www.eurjchem.com 

 
     

Effect of calcitonin on lipid peroxidation in ovariectomized rats 

Mehmet Berkoza, Serap Yalinb, Ulku Comelekogluc and Selda Bagisd 
a Department of Pharmaceutical Technology,  Faculty of Pharmacy, Mersin University,  Mersin,  TR­33343, Turkey 
b Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Mersin University,  Mersin,  TR­33343, Turkey 
c Department of Biophysics, Medical School, Mersin University Mersin,  TR­33343, Turkey 
d Department of Physical Medicine and Rehabilitation, Medical School, Baskent University, Adana, TR­01150, Turkey 

*Corresponding author at: Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Mersin University,  Mersin,  TR­33343, Turkey. Tel.: +90.530.6878967; fax: 
+90.324.3413022. E­mail address: syalin01@hotmail.com (S. Yalin). 

 
 
 

   

     
ARTICLE INFORMATION    ABSTRACT
Received: 1 February 2010 
Received in revised form: 2 March 2010 
Accepted: 5 March 2010 
Online: 31 March 2010 

KEYWORDS 

  Calcitonin  is one of  the active substances which  is  recently used effectively  in osteoporosis 
treatment. In literature there is no information whether calcitonin cause oxidative stress or 
not.  In  this  study,  subcutaneous  calcitonin  is  applied  to  rats  having  experimental 
postmenopausal  osteoporosis  and  the  effects  of  calcitonin  on  lipid  peroxidation  and 
antioxidant  system were  investigated.  Forty‐five  healthy  adult  female  Swiss  albino Wistar 
rats  were  used  in  this  study.  The  rats  were  divided  into  three  equal  groups  as  control, 
ovariectomized  (Ovx)  and  ovariectomized+calcitonin  (Ovx‐CAL).  The  rats  in  Ovx  and  Ovx‐
CAL  were  anaesthetized  and  underwent  a  bilateral  ovariectomy  via  ventral  incision.  Ten 
weeks after ovariectomy, salmon calcitonin (2 IU/kg body weight) was administered via s.c. 
at  a  volume of  1 mL per week  for  12 weeks  to  the Ovx‐CAL  group. At  the  end of  the drug 
treatment,  livers and kidneys of rats were removed and malondialdehyde (MDA) levels and 
catalase  (CAT)  activities  were  determined  by  biochemical  analysis  methods.  Data  were 
analyzed by one‐way ANOVA followed by the post‐hoc LSD multiple test. The liver and kidney 
MDA levels were increased whereas the activity of CAT enzyme was decreased as a result of 
ovariectomy compared to values in the control group. Similar results were observed in Ovx‐
CAL  group;  however,  the  decline  in  the  CAT  activity  in  the  kidney  was  not  significant.  In 
conclusion,  we  may  suggest  that  calcitonin  treatment  increases  the  oxidative  stress  in 
osteoporotic rats. 

Osteoporosis 
Oxidative stress 
Antioxidant 
Ovariectomy 
Calcitonin 

 
1. Introduction 
 

Osteoporosis‐means  porous  bone  in  Greek‐  is  a  disease 
that  is  characterized by structural disruption of bone and  low 
bone  mass.  Low  bone  mass  can  cause  bone  fragility  and 
fractures  [1].  Osteoporosis  can  be  a  debilitating  disease  that 
can  result  in  chronic pain,  fractures,  inability  to participate  in 
normal  daily  activities,  depression,  social  withdrawal,  loss  of 
independence,  and deformities  [1,2]. Although osteoporosis  is 
observed mostly in women, it can also affect men. Osteoporosis 
can occur at any age and in any racial or ethnic group, though it 
is  more  common  in  the  postmenopausal  women  [1‐4]. 
Pharmacologic  interventions for the prevention and treatment 
of osteoporosis  include vitamin and mineral  supplementation, 
hormone replacement therapy, bisphosphonates, and selective 
estrogen  receptor  modulators,  fluoride  supplementation  and 
salmon calcitonin [5,6]. 

Salmon  calcitonin  inhibits  bone  resorption  via  blocking 
osteoclastic activity. However, the mechanisms by which these 
medications exert their protective effects on bone are not clear, 
though  it  is  generally  accepted  that  calcitonin  exerts  a  direct 
inhibitory  action on mature  osteoclasts  [7].  There  is  evidence 
that markers of bone turnover decrease and that bone mineral 
density  stabilizes  with  the  use  of  calcitonin.  Calcitonin  is 
indicated  for  the  treatment  of  postmenopausal  osteoporosis, 
Paget’s disease, and hypercalcemia [7‐9]. 

Some of the risk factors for osteoporosis are advanced age, 
beeing Caucasian or Asian, endocrine disorders,  family history 

of  osteoporosis,  high/excessive  intake  of  some  vitamins  and 
minerals,  impaired  calcium  and/or  vitamin D  absorption,  low 
calcium  and/or  vitamin  D  intake  or  other  minerals/vitamins, 
low  exposure  to  sunlight,  low  levels  of  testosterone/estrogen 
propensity for falls and smoking [10‐13]. Furthermore, reactive 
oxygen  species  (ROS)  induced  oxidative  stress  has  been 
associated with the pathogenesis of osteoporosis. Some studies 
reported  that  certain  antioxidants  can  decline  the  risk  of 
osteoporosis.    Women  with  osteoporosis  have  markedly 
decreased  plasma  antioxidants.  Increased  oxidative  stress 
biomarker is linked with reduced bone density [14‐16]. Despite 
these,  the  role  of  oxidative  stress  in  osteoporosis  was  not 
properly explained [15]  

Although  the  effects  of  oxidative  stress  on  osteoporosis 
has  been  well  documented,  the  effects  of  salmon  calcitonin 
treatment  on  oxidative  stress  in  osteoporotic  subjects  is  not 
clear  [14,15].  The  aim  of  this  study  was  to  investigate  the 
effects  of  calcitonin  treatment  on  oxidative  stress  in  post‐
menopausal  osteoporosis. We  used  ovariectomized  rat model 
for creating the post‐menopausal osteoporosis model. 
 
2. Experimental 
 
2.1. Animals 
 

Forty‐five  healthy  adult  female  Swiss  albino  Wistar  rats 
(10‐12 weeks  of  age  and  average  body weight  of  200‐250  g) 
were  used  in  this  study.  The  animals were  acclimatized  for  1 



Berkoz et al. / European Journal of Chemistry 1 (1) (2010) 44­46  45 
 

 
 

week  to  our  laboratory  conditions  prior  to  experimental 
manipulation and were exposed  to a 12‐h  light and 12‐h dark 
cycle at  room temperature of 22±1oC. They had  free access  to 
standard laboratory chow and water ad libitum. The rats were 
divided into three groups; I, control (n=15); II, ovariectomized 
(Ovx,  n=15);  and  III,  ovariectomized+calcitonin  (Ovx‐CAL, 
n=15). The rats in the control group were neither operated on 
nor treated with calcitonin. All animal procedures used were in 
strict  accordance  with  the  National  Institutes  of  Health 
Guidelines on the Care and Use of Laboratory Animals, and the 
approval  of  the  ethic  committee  of  the  School  of  Medicine, 
Mersin University was obtained prior to the study. 
 
2.2. Surgical procedures 
 

The  rats  in  Ovx  and  Ovx‐CAL  were  anaesthetized  with 
ketamine  (50  mg/kg,  Ketalar,  Eczacıbaşı)  and  xilacine  (8 
mg/kg, Rompun, Parke‐Davis/Pfizer) and underwent a bilateral 
ovariectomy  via  ventral  incision.  Ovaries  were  excised  and 
oviducts  were  replaced,  with  minimum  disruption  to 
surrounding  soft  tissues,  and  the  incisions  were  closed  with 
clips. 
 
2.3. Treatment process and tissue preparation 
 

Ten weeks after ovariectomy, salmon calcitonin was diluted 
in  0.9  %  NaCl  solution  to  obtain  the  dose  of  2  IU/kg  body 
weight and administered via s.c. at a volume of 1 mL per week 
for  12  weeks  to  the  Ovx‐CAL  group.  Control  and  Ovx  groups 
didn’t take any treatment during that period and took standard 
feeding. At the end of the 12th week, the rats in all groups were 
sacrificed  by  decapitation  under  ketamine  anesthesia.  The 
livers  and  kidneys  were  quickly  excised,  rinsed  in  ice‐cold 
0.175  M  KCl/25  mM  Tris–HCl  (pH  7.4)  to  remove  the  blood, 
weighed, finely minced in the same solution, and homogenized 
by means of homogenizer with a Teflon pestle. Then,  the  liver 
and  kidney  homogenates  were  centrifuged  at  10,000g  for 
15 min at 4 °C. Supernatants were separated and kept at −20 °C 
until  enzyme  activity  and  malondialdehyde  (MDA) 
measurements were performed. 
 
2.4. Biochemical assay 
 

Lipid peroxidation: Liver and kidney MDA levels, as an index 
of  lipid  peroxidation,  were  determined  by  thiobarbituric  acid 
reaction according to the Yagi method [17]. This method relies 
on the measurement of the pink color produced by interaction 
of  thiobarbituric acid with MDA elaborated as a result of  lipid 
peroxidation.  The  colored  reaction  of  1,1,3,3‐tetraethoxyn 
propane was used as the primary standard. 

Enzyme  assay:  Catalase  (CAT)  activity  of  tissues  was 
determined  according  to  the  method  of  Aebi  et  al.  [18].  The 
enzymatic decomposition of H2O2 was followed directly by the 
decrease  in  absorbance  at  240 nm.  The  difference  in 
absorbance  per  unit  time  was  used  as  a  measure  of  CAT 
activity. Specific activity was defined as micromole of  substrate 
decomposed  per  minute  per  milligram  of  protein  as  U/mg 
protein. 

Determination  of  protein  content:  Tissue  protein  content 
was determined according to the method developed by Lowry 
et al. [19] using bovine serum albumin as standard. 
 
2.5. Statistical analysis 
 

All assays were performed  in duplicate and  the mean was 
used for statistical analysis. All analyses were performed using 
the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Windows 
version 16.0 software in a PC‐compatible computer. Results are 
expressed  as  mean  ±  SD.  Normality  of  distribution  was 

assessed by Kolmogorov‐Smirnov  test. Data were analyzed by 
one‐way  ANOVA  followed  by  the  post­hoc  LSD  multiple  test. 
p<0.05 was considered statistically significant. 
 
3. Results 
 
3.1. Liver 
 

The  liver  MDA  levels  doubled  (p<0.05),  whereas  the 
activity of antioxidant enzyme CAT decreased by 40% (p<0.05), 
as a result of ovariectomy compared to the values of the control 
group. In Ovx‐CAL group, MDA level increased 3.8 fold, whereas 
CAT  activity  decreased  by  67.3%,  compared  to  the  control 
group.  In  the  comparison of  the Ovx  and Ovx‐CAL  groups, we 
found  that  MDA  level  was  significantly  higher  ‐  about  1.85 
times  (p<0.05)  ‐  and  CAT  activity was  significantly  lower  (by 
46%; p<0.05) in the Ovx‐CAL group than those of the Ovx group 
(Table 1). 
 
Table1. Liver MDA concentration and CAT activity in control, Ovx and Ovx‐
CAL groups. 
Variables  Control (n=15)  Ovx (n=15)  Ovx­CAL (n=15) 
MDA
(nmol/mg protein)  0.51±0.10  1.05±0.14a  1.94±0.51a,b 

CAT
(U/mg protein)  190.15±10.61  114.21±12.34a  62.21±15.49a,b 

a Significantly different from control at  p<0.05. 
b Significantly different from Ovx group at  p<0.05. 
 
3.2. Kidney 

 
As shown in Table 2, ovariectomy resulted in an increase in 

the  MDA  level  (approximately  1.8  fold,  p<0.05)  compared  to 
the  control,  but  there  was  no  significant  difference  in  the 
activity  of  CAT  in  the  kidneys  of  control  and  Ovx  groups 
(p>0.05). In the comparison of the Ovx and Ovx‐CAL groups, we 
found that MDA level was significantly higher ‐ about 1.4 times 
(p<0.05)  ‐  but  no  significant  variation  in  CAT  activity  was 
observed between the Ovx and Ovx‐CAL groups (Table 2). 

 
Table 2. Kidney MDA concentration and CAT activity in control, Ovx and 
Ovx‐CAL groups. 
Variables  Control (n=15)  Ovx (n=15)  Ovx­CAL (n=15) 
MDA 
(nmol/mg protein)  0.85±0.20  1.55±0.17a  2.19±0.43a,b 

CAT 
(U/mg protein)  210.21±18.71  190.11±10.38  182.33±16.59 

a Significantly different from control at  p<0.05. 
b Significantly different from Ovx group at  p<0.05. 
 
4. Discussion 

 
In our study we investigated the effect of post‐menopausal 

calcitonin treatment on oxidative stress in rat liver and kidney 
tissues.  We  measured  the  MDA  level  and  CAT  activity  to 
evaluate  the  oxidative  stress.  We  found  that  MDA  levels 
increased  in  liver  and  kidney  tissues  and  CAT  activity 
decreased in liver but not in the kidney of ovariectomized rats 
compared  to  control  group.  Reports  about  the  effect  of 
ovariectomy on antioxidant enzymes and lipid peroxidation are 
conflicting.  Kume‐Kick  et  al.  indicated  that  gonadectomy was 
caused to oxidative stress in brain of female rat and suggested 
that  ovarian  sex  hormones  have  protective  role  in  the 
prevention of oxidative stress [20,21]. Borras et al. founded an 
increase  in  lipid  peroxidation  and  a  decrease  in  glutathione 
levels in liver and brain mitochondria of ovariectomized rats. In 
addition,  they  reported  that  antioxidant  gene  expression was 
increased  and  oxidative  damage  was  decreased  in 
mitochondria  of  females  than males  [20,22]. Muthusami et al. 
showed  that  ovariectomy  in  rats  reduced  femur  antioxidant 
enzymes  and  they  elucidated  this  result  by  heightened  lipid 
peroxidation  after  ovariectomy  [20,23].  Yalın  et  al.  indicated 



46  Berkoz et al. / European Journal of Chemistry 1 (1) (2010) 44­46 
 
that ovariectomy reduced CAT and SOD activities and increased 
MDA  levels  both  in  liver  and  kidney  tissues  [20]. 
Sreelathakumari  et  al.  showed  increased  MDA  level  and 
decreased CAT and SOD activity in liver of ovariectomized rats 
[24]. 

In  the  Ovx‐CAL  group,  MDA  level  increased  in  liver  and 
kidney  tissues. Conversely, CAT activity decreased  in  liver but 
not in kidney compared to control groups. In the comparison of 
the Ovx and Ovx‐CAL groups, we found that liver MDA level was 
significantly higher and CAT activity was significantly lower in 
the Ovx‐CAL  group  than  those  of  the Ovx  group.  Kidney MDA 
level was significantly higher but no significant variation in CAT 
activity was observed between Ovx and Ovx‐CAL groups. These 
results  showed  us  that  calcitonin  treatment  didn’t  decrease 
lipid  peroxidation  besides  this,  increased  oxidative  stress  in 
post‐menopausal osteoporosis model. 

Pharmaceuticals  used  in  post‐menopausal  osteoporosis 
treatment  could  change  the  level  of  lipid  peroxidation  and 
antioxidant  activity.  Dombrecht  et al.  demonstrated  that  lipid 
peroxidation  was  reduced  after  treatment  of  risedronate 
together with some other bisphosphonates [25‐27]. Ozgonul et 
al.  indicated  that  brain  lipid  peroxidation  level  in 
ovariectomized  rats  decreased  to  normal  value  by  raloxifene 
administration  [27,28].  But  there  is  no  data  on  the  effect  of 
post‐menopausal  calcitonin  treatment  on  oxidative  stress 
[7,8,29,30]. 

As  a  result,  ovariectomy  plays  a  vital  role  on  oxidative 
stress  on  tissues  and  current  state  induces  postmenopausal 
bone  loss  and  triggers  the  osteoporosis  formation, 
dramatically. As an opinion, anti‐osteoporotic drugs may have 
an effect on decreasing the oxidative stress [27]. But calcitonin 
treatment couldn’t prevent the oxidative stress on osteoporotic 
subjects and besides this increase it upwardly. 

Further  research  requires  displaying  the  oxidative  stress 
mechanisms  in  more  tissues  and  with  more  parameters.  In 
addition to lipid peroxidation level, antioxidant activity can be 
used  for  following  the  prognosis  of  post‐menopausal 
osteoporosis and osteoporosis treatment [27]. According to our 
data  it  is  possible  to  say  that  contrary  to  expectations, 
calcitonin  couldn’t  reduce  the  oxidative  stress  in  post‐
menopusal osteoporosis,  in  fact  it  increased dramatically. And 
finally we can suggest that other post‐menopausal osteoporosis 
preventing  agents  (such  as  vitamin  and  mineral 
supplementations,  hormone  replacement  therapy, 
bisphosphonates,  and  selective  estrogen  receptor modulators, 
fluoride  supplementation)  may  be  preferred  for  osteoporosis 
treatment  or  if  calcitonin  must  be  used  for  several  medical 
excuses, oxidative stress parameters should be followed during 
the therapy. 
 
References 
 
[1]. Song, Y.; Liebschner, M. A.; Gunaratne, G. H. Biophys. J. 2004, 87, 3642‐

3647. 
[2]. Grynpas, M. D.; Huckell, B.; Pritzker, K. P.; Hancock, R. G.; Kessler, M. J. 

P. R. Health Sci. J. 1989, 8, 197‐204. 
[3]. Recker, R. R. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1989, 191, 272‐274. 
[4]. Khosla, S. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2010, 95, 3‐10. 
[5]. Davidson, M. R. J. Midwifery Wom. Heal. 2003, 48, 39‐52. 
[6]. Theodorou, D. J.; Theodorou, S. J.; Sartoris, D. J. Compr. Ther. 2002, 28, 

109‐122. 
[7]. Pazzaglia, U. E.; Zatti, G.; Di Nucci, A.; Coci, A. Calcif. Tissue Int. 1993, 

52, 125‐129. 
[8]. Plosker, G. L.; McTavish, D. Drugs Aging. 1996, 8, 378‐400. 
[9]. Mehta,  N. M.; Malootian,  A.;  Gilligan,  J.  P. Curr. Pharm. Des. 2003, 9, 

2659‐2676. 
[10]. El‐Hajj Fuleihan, G. J. Med. Liban. 1998, 46, 23‐28. 
[11]. Rizer, M. K. Prim. Care. 2006, 33, 943‐951. 
[12]. Hawker, G. A. J. Rheumatol. Suppl. 1996, 45, 2‐5. 
[13]. Kulak, C. A.; Bilezikian, J. P. Int. J. Fertil. Womens Med. 1998, 43, 56‐64. 
[14]. Rao, L. G. Endocrinology Rounds. 2005, 5, 7‐12. 
[15]. Rao, L. G.; Guns, E.; Rao, A. V. Agro. Food Ind. Hi Tec. 2003, 14, 25‐30, 
[16]. Yalin,  S.; Bagis,  S.; Polat, G.; Dogruer, N.; Cenk, Aksit,  S.; Hatungil, R.; 

Erdogan, C. Clin. Exp. Rheumatol. 2005, 23, 689‐692. 

[17]. Yagi, K. Methods Mol. Biol. 1998, 108, 101‐106. 
[18]. Aebi, H. Methods Enzymol. 1984, 105, 121‐126. 
[19]. Lowry, O. H.; Rosebrough, N.  J.; Farr, A. L.; Randall, R.  J.  J. Biol. Chem. 

1951, 193, 265‐275. 
[20]. Yalin, S.; Comelekoglu, U.; Bagis, S.; Sahin, N. O.; Ogenler, O.; Hatungil, 

R. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2006, 65, 140‐144. 
[21]. Kume‐Kick,  J.;  Ferris,  D.  C.;  Russo‐Menna,  I.;  Rice,  M.  E.  Brain  Res. 

1996, 738, 8‐14. 
[22]. Borrás, C.; Sastre,  J.; García‐Sala, D.; Lloret, A.; Pallardó, F. V.; Viña,  J. 

Free Radic. Biol. Med. 2003, 34, 546‐552. 
[23]. Muthusami,  S.;  Ramachandran,  I.;  Muthusami,  B.;  Vasudevan,  G.; 

Prabhu,  V.;  Subramaniam,  V.;  Jagadeesan,  A.;  Narasimhan,  S.  Clin. 
Chim. Acta. 2005, 360, 81‐86. 

[24]. Sreelathakumari, K. T., Menon, V. P.; Leelamma, S.  Indian  J. Med. Res. 
1993, 98, 305‐308. 

[25]. Dombrecht,  E.  J.;  Cos,  P.;  Vanden,  Berghe,  D.;  Van  Offel,  J.  F.; 
Schuerwegh, A. J.; Bridts, C. H.; Stevens, W. J.; De Clerck, L.S. Biochem. 
Biophys. Res. Commun. 2004, 314, 675‐680. 

[26]. Dombrecht, E. J.; De Tollenaere, C. B.; Aerts, K.; Cos, P.; Schuerwegh, A. 
J.; Bridts, C. H.; Van Offel, J. F.; Ebo, D. G.; Stevens, W. J.; De Clerck, L. S. 
Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006, 348, 459‐464. 

[27]. Ozgocmen, S.; Kaya, H.; Fadillioglu, E.; Yilmaz, Z. Arch. Med. Res. 2007, 
38, 196‐205. 

[28]. Ozgonul, M.; Oge, A.; Sezer, E. D.; Bayraktar, F.; Sozmen, E. Y. Endocr. 
Res. 2003, 29, 183‐189. 

[29]. Karsdal,  M.  A.;  Henriksen,  K.;  Arnold,  M.;  Christiansen,  C.  BioDrugs. 
2008, 22, 137‐144. 

[30]. Chesnut,  C.  H.;  Azria,  M.;  Silverman,  S.;  Engelhardt,  M.;  Olson,  M.; 
Mindeholm, L. Osteoporos. Int. 2008, 19, 479‐491.