Microsoft Word - European_Journal_of_Chemistry_1_4_2010_297_301_20


European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 297‐301 

 
European Journal of Chemistry 

ISSN 2153‐2249 (Print) / ISSN 2153‐2257 (Online)  2010 EURJCHEM 
DOI:10.5155/eurjchem.1.4.297‐301.20 

   

 

European Journal of Chemistry 
Journal homepage: www.eurjchem.com 

 
     

Synthesis and bioactivity of phosphorylated derivatives of stavudine 

Alahari Janardhan Raoa, Valasani Koteswara Raoa, Pasupuleti Visweswara Raob,  
Chamarthi Naga Rajua,* and Sunil Kumar Ghoshc 

a Department of Chemistry, Sri Venkateswara University, Tirupati, IN­517502, India  
b Department of Biotechnology, Sri Venkateswara University, Tirupati, IN­517502, India 
c Bio­organic Division, Bhabha Atomic Research Centre, Mumbai, IN­400085, India 

*Corresponding author at: Department of Chemistry, Sri Venkateswara University, Tirupati, IN­517502, India. Tel.: +91.877.2249666; fax: +91.877.2225211. 
E­mail address: rajuchamarthi10@gmail.com  (C. N. Raju). 

 
 

   

     
ARTICLE INFORMATION    ABSTRACT
Received: 28 March 2010 
Received in revised form: 13 August 2010 
Accepted: 20 September 2010 
Online: 31 December 2010 

KEYWORDS 

  Novel  phosphorylated  derivatives  of  stavudine  were  synthesized  by  the  reaction  of  bis(2‐
chloroethyl)phosphoramidic  dichloride/4‐nitrophenyl  phosphorodichloridate  with  various 
cyclic amines and amino acid esters in the presence of triethylamine in dry tetrahydrofuran 
through  the  corresponding  monochloride  intermediates  2a‐l.  Further  reaction  of  the 
intermediates  2a‐l  with  stavudine  in  tetrahydrofuran  and  pyridine  in  the  presence  of 
triethylamine  formed  the  title  compounds  4a‐l.  Their  structures were  characterized  by  IR, 
1H‐,  13C‐,  31P‐NMR  and mass  spectral  data  analyses.  They  exhibited  good  antibacterial  and 
antioxidant activities. Their bioactivity was greatly influenced by the different groups present 
at the phosphorus. 

Phosphorylated derivatives of stavudine 
Gram‐positive bacteria 
Gram‐negative bacteria 
Antibacterial activity 
Antioxidant activity 

 
1. Introduction 
 

Nucleoside  analogues  continue  to  dominate  over  other 
drugs  in  chemotherapy of cancer and antiviral diseases.  Some 
of  the  nucleoside  analogues  with  such  an  activity  are  ddC, 
FMAU,  OddC,  BCH‐189,  AZT.  Stavudine  (2',3'‐dideoxy‐2',3'‐
didehydrothymidine;  d4T)  is  licensed  for  use  in  the  human 
immunodeficiency  virus  (HIV)  infection  [1,2].  Nucleosides  to 
become bioactive are to be phosphorylated by cellular kinases 
to give successively corresponding 5'‐mono‐, ‐di, and –triphos‐
phates.  It  is  reported  that  intracellular  phosphorylation  of 
stavudine  via  monophosphate  and  diphosphate,  to  the  active 
triphosphate  anabolite  which  inhibits  HIV  reverse 
transcriptase  and  terminates  the  elongating  DNA  chain  [3‐5]. 
The  efficiency  of  this  phosphorylation  process  is  extremely 
slow.  Therefore,  many  efforts  have  been  made  to  improve 
therapeutic  properties  by  taking  at  least  the  first 
phosphorylation  step.  This  approach  has  resulted  in  the 
synthesis of potential numerous nucleotide analogues as drugs 
[6‐10]. 

These  potent  biological  activities  of  stavudine  have 
stimulated  great  interest  in  the  synthesis  of  phosphorylated 
compounds  for  extensive  studies  related  to  their  biological 
activities. In view of these, we have focused on the synthesis of 
a series of novel phosphorylated derivatives of stavudine with 
several  bioactive  groups  at  the  phosphorus  and  evaluated 
antioxidant and antibacterial properties. The oxidative stress of 
stavudine  derivatives  was  assessed  by  estimating  their 
activities  on  DPPH  using  natural  antioxidant  Vitamin  C  as 
standard. Antibacterial  activity was  investigated against Gram 
positive  bacteria:  Bacillus  subtilis,  Staphylococcus  aureus  and 
Gram  negative  bacteria:  Escherichia  coli  and  Klebsiella 
pneumoniae.  The  structures  of  all  the  newly  synthesized 

compounds 4a­l  have  been  established by  elemental  analyses 
and spectral data (IR, 1H, 13C, 31P NMR and MS). 
 
2. Experimental 
 
2.1. Instrumentation 
 

Sigma‐Aldrich,  Merck  and  Lancaster  chemicals  were  used 
as  such  without  further  purification.  All  solvents  used  for 
spectroscopic  and  other  physical  studies  were  reagent  grade 
and were  further purified by  literature methods  [11]. Melting 
points  were  determined  by  Guna  Digital  Melting  Point 
apparatus  using  a  calibrated  centigrade  thermometer.  IR 
spectra were  recorded  in  KBr  disks  on  a  Perkin‐Elmer Model 
281‐B spectrophotometer in wave numbers (cm‐1). 1H, 13C and 
31P NMR  spectra were  recorded  as  solutions  in DMSO‐d6  on  a 
Bruker  AVANCE  III  500  MHz  spectrometer  operating  at  500 
MHz for 1H, 125 MHz for 13C and 202.4 MHz for 31P nuclei and 
their chemical shifts were expressed in ppm with reference to 
tetramethylsilane  and  85 % H3PO4  respectively. Mass  spectra 
were  recorded  on  a  JEOL  GCMATE  II  Mass  spectrometer. 
Elemental analyses were performed by Central Drug Research 
Institute, Lucknow, India. 
 
2.2. Synthesis 
 

A  solution  of  various  cyclicamines    and  amino  acid  esters 
(0.002  mole),    in  dry  tetrahydrofuran  (THF)  (10  mL)  and 
triethylamine (TEA) (0.002 mole), was added dropwise over a 
period  of  15  minutes  to  a  stirred  solution  of  bis(2‐
chloroethyl)phosphoramidicdichloride/4‐nitro  phenylphos 
phorodichloridate  (0.002 mole)  in  20 mL  of    THF  at  ‐10‐0  oC 
(Scheme 1).  



298  Rao et al. / European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 297­301 
 

 

 

 
 

Scheme 1 
 

 
After  stirring  for  2  hours,  formation  of  intermediate 

monochlorides  2a­l  was  ascertained  by  thin  layer 
chromatography performed in 7:3 mixture of ethyl acetate and 
hexane.  To  this  stavudine  (0.002 mole)  in  10 mL  of  pyridine 
and  TEA  (0.002  mole),  was  added  dropwise  at  0  ºC.  After 
completion  of  the  addition,  the  reaction  temperature  was 
slowly  raised  to  RT  and  continued  stirring  for  an  additional    
10 h. The progress of the reaction was monitored by TLC run in 
9:1 mixture  of  ethylacetate  and hexane.  The  reaction mixture 
was  filtered  to  remove  TEA  hydrochloride  and  the  solvent  in 
the  filtrate  was  removed  in  a  rotaevaporator.  The  crude 
product was purified by  column chromatography on  silica  gel 
(60‐120  mesh)  with  chloroform:  methanol  (9:1)  as  eluent  to 
afford  pure 4a­I which  were  characterized  by  IR,  1H,  13C,  31P 
NMR and mass spectral data analyses.  
 
2.2.1. (R)­(5­(5­methyl­2,4­dioxo­3,4­dihydropyrimidin­
1(2H)­yl)­2,5­dihydrofuran­2­yl)methyl­N,N­bis(2­chloro 
ethyl)­P­(4­methylpiperazin­1­yl)phosphonamidate (4a) 
 

Yield: 55%. M.p.: 155‐158  oC.  IR  (KBr,  cm‐1): 3393 ν(‐NH), 
1683  ν(C=O),  1226  ν(P=O).  1H‐NMR  (500  MHz,  DMSO‐d6,  ): 

8.5(s, 1H, NH), 7.54 (d, 1H, J=1.5 Hz, H‐6), 6.86‐6.88 (m, 1H, H‐
1'), 6.47‐6.49  (m, 1H, H‐2'), 5.95‐5.97  (m, 1H, H‐3'), 4.13‐4.21 
(m,  3H,  H‐4',  2H‐5'),  3.95  (t,  4H,  CH2‐N),  3.65  (t,  4H,  CH2‐Cl), 
2.74 (t, 4H, CH2N‐), 2.49 (t, 4H, CH2N), 2.32 (s, 3H, N‐Me), 1.87 
(s, 3H, CH3).  13C‐NMR (125 MHz, DMSO‐d6): 164.5 (C‐4), 159.2 
(C‐2), 137 (C‐6), 135.1(C‐3'), 125.1 (C‐2'), 110.5 (C‐5), 89.2 (C‐
1'),  85.5  (C‐4'),  68.2  (C‐5'),  55.8  (pipCH2),  51.2  (C‐2''),  47.8 
(pipCH2), 45.9 (N‐CH3), 41.6 (C‐3''), 12.1 (‐CH3). 31P‐NMR (202 
MHz, DMSO‐d6):   ‐1.94, ‐1.24. GC‐MS (m/z, %): (510.25, 45%) 
[MH]+.  

 
2.2.2. (R)­(5­(5­methyl­2,4­dioxo­3,4­dihydropyrimidin­
1(2H)­yl)­2,5­dihydrofuran­2­yl)methyl­N,N­bis(2­chloro 
ethyl)­P­(piperazin­1­yl)phosphonamidate (4b) 
 

Yield:  62%.  M.p.:  161‐163  oC,  Anal.  Calcd.  for 
C18H28Cl2N5O5P: C, 43.56; H, 5.69; N, 14.11; Found C, 43.59; H, 
5.73; N, 14.05. IR (KBr, cm‐1): 3386 ν(‐NH), 1685 ν(C=O), 1230 
ν(P=O).  1H‐NMR (500 MHz, DMSO‐d6, ):   8.9  (s, 1H, NH), 7.56 
(d, 1H, J=1.5 Hz, H‐6), 6.88‐6.9 (m, 1H, H‐1'), 6.47‐6.49 (m, 1H, 
H‐2'),  5.97‐5.99  (m,  1H,  H‐3'),  4.15‐4.23  (m,  3H,  H‐4',  2H‐5'), 
4.01 (t, 4H, CH2‐N), 3.69 (t, 4H, CH2‐Cl), 2.78 (t, 4H, CH2N‐), 2.54 



Rao et al. / European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 297­301  299 
 

 
 

(t, 4H, CH2NH), 2.19 (s, 1H, NH), 1.87 (s, 3H, CH3). 31P‐NMR (202 
MHz, DMSO‐d6, ) ‐1.03. 

 
2.2.3. (R)­(5­(5­methyl­2,4­dioxo­3,4­dihydropyrimidin­
1(2H)­yl)­2,5­dihydrofuran­2­yl)methyl­N,N­bis(2­chloro 
ethyl)­P­(piperidin ­1­yl) phosphonamidate (4c) 
 

Yield:  61%.  M.p.:  174‐176  oC,  Anal.  Calcd.  for 
C19H29Cl2N4O5P: C, 46.07; H, 5.90; N, 11.31; Found C, 46.12.; H, 
5.95; N, 11.25. IR (KBr, cm‐1): 3378 ν(‐NH), 1686 ν(C=O), 1234 
ν(P=O). 1H‐NMR (500 MHz, DMSO‐d6, ): 8.8 (s, 1H, NH), 7.5 (d, 
1H, J=1.5 Hz, H‐6), 6.84‐6.88 (m, 1H, H‐1'), 6.46‐6.48 (m, 1H, H‐
2'), 5.93‐5.95 (m, 1H, H‐3'), 4.15‐4.28 (m, 3H, H‐4', 2H‐5'), 3.94 
(t,  4H,  CH2N),  3.63  (t,  4H,  ‐CH2Cl),  2.75(t,  4H,  CH2N‐),  1.87  (s, 
3H, CH3),1.46‐1.56(m, 6H, (CH2)3).  31P‐NMR (202 MHz, DMSO‐
d6, ): 2.85. 

 
 2.2.4. (R)­(5­(5­methyl­2,4­dioxo­3,4­dihydropyrimidin­
1(2H)­yl)­2,5­dihydrofuran­2­yl)methyl­N,N­bis(2­chloro 
ethyl)­P­morpholinophosphonamidate (4d) 
 

Yield: 55%. M.p.: 167‐169  0C,  IR  (KBr,  cm‐1): 3394 ν(‐NH), 
1685 ν(C=O), 1225 ν(P=O). 1H‐NMR (500 MHz, DMSO‐d6, ): 8.6 
(s, 1H, NH), 7.7 (d, 1H, J=1.5 Hz, H‐6), 6.95 ‐6.97 (m, 1H, H‐1'), 
6.45‐6.47  (m,  1H,  H‐2'),  5.9‐5.92  (m,  1H,  H‐3'),  4.15‐4.23  (m, 
3H, H‐4', 2H‐5'), 3.66  (t, 4H, CH2‐O), 3.6  (t, 4H, CH2N), 3.06  (t, 
4H, CH2‐Cl), 2.64 (t, 4H, CH2N‐), 1.0 (s, 3H, CH3). 13C‐NMR (125 
MHz, DMSO‐d6): 163.9 (C‐4), 158.4 (C‐2), 136.5 (C‐6), 134.5(C‐
3'), 125.8 (C‐2'), 111.2 (C‐5), 91.2 (C‐1'), 86.5 (C‐4'), 69.2 (C‐5'), 
62.8 (morCH2), 52.5 (C‐2''), 45.8 (morCH2), 42.6 (C‐3''), 12.1 (‐
CH3). 31P‐NMR (202 MHz, DMSO‐d6, ): ‐2.15, ‐1.51. GCMS (m/z; 
%): (497.25, 30%) [MH]+.  
 
2.2.5. Ethyl2­((S)­((5­(5­methyl­2,4­dioxo­3,4­dihydro 
pyrimidin­1(2H)­yl)­2,5­dihydrofuran­2­yl)methoxy) (4­
nitrophenoxy) phosphorylamino)­2­phenylacetate (4e) 
 

Yield: 59%. M.p.: 149‐152  oC,  IR  (KBr,  cm‐1): 3389 ν(‐NH), 
1681, 1729 ν(C=O), 1236 ν(P=O). 1H‐NMR (500 MHz, DMSO‐d6, 
): 11.2 (s, 1H, NH), 8.16 (d, 2H, J=9 Hz, Ar‐H), 8.1 (d, 2H, J=9.5 
Hz, Ar‐H), 7.57 (d, 1H, J=1 Hz, H‐6), 7.23‐7.4 (m, 5H, Ar‐H), 6.8‐
6.81 (m, 1H, H‐1'), 6.31‐6.33 (m, 1H, H‐2'), 5.89‐5.90 (m, 1H, H‐
3'),  6.54  (brs,  1H,  Gly‐NH),  3.57‐3.63  (m,  4H,  2H‐5', H‐4',  Gly‐
NH‐CH), 3.04 (q, 2H, ‐OCH2), 1.73 (s, 3H, CH3), 1.2 (t, 3H, O‐CH2‐
CH3). 13C‐NMR (125 MHz, DMSO‐d6): 171 (Gly CO), 164.3 (C‐4), 
161.2  (C‐1''),  151.2  (C‐2),  142  (C‐4''),  137.1  (C‐6),  134.6 
(GlyArC1), 129.2 (C‐3'), 128.7 (GlyArC‐2 & C‐6), 128.1 (GlyArC‐
3 & C‐5), 127.5 (GlyArC‐4), 126.7 (C‐3'' & C‐5''), 125.5 (C‐2'' & 
C‐6''), 110 (C‐5), 89.1 (C‐1'), 85.8 (C‐4'), 66.2 (C‐5'), 58.14 (O‐
CH2‐CH3), 45.7 (Gly‐CH), 12.2 (O‐CH2‐CH3), 11.3 (CH3). 31P‐NMR 
(202  MHz,  DMSO‐d6,  ):  5.78.  GCMS  (m/z;  %):  (586.2,  35%) 
[MH]+.  

 
2.2.6. Methyl3­(4­hydroxyphenyl)­2­((S)­((5­(5­methyl­2,4­
dioxo­3,4­dihydropyrimidin­1(2H)­yl)­2,5­dihydrofuran­2­
yl) methoxy)(4­nitrophenoxy)phosphorylamino) propanoate 
(4f) 
 

Yield:  62%. M.p.:  154‐156  oC  IR  (KBr,  cm‐1):  3378  ν(‐NH), 
1678, 1723 ν(C=O), 1218 ν(P=O). 1H‐NMR (500 MHz, DMSO‐d6, 
): 8.5 (s, 1H, NH), 7.92 (d, 2H, J=9.5 Hz, Ar‐H), 7.49 (d, 1H, J=1.5 
Hz, H‐6), 7.38 (d, 2H, J=9 Hz, Ar‐H), 7.15 (d, 2H, J=8.5 Hz, Ar‐H), 
6.89 (d, 2H, J=9 Hz, Ar‐H), 6.78‐6.79 (m, 1H, H‐1'), 6.3‐6.32 (m, 
1H, H‐2'), 5.87‐5.89 (m, 1H, H‐3'), 5.47 (s, 1H, Tyr‐OH), 4.7 (brs, 
1H, Tyr‐NH),  3.91‐3.97  (m,  4H,  2H‐5', H‐4',  Tyr‐NH‐CH),  3.51‐
3.53 (m, 2H, Tyr‐CH2), 3.32 (s, 3H, ‐OCH3), 4.71 (s, 3H, CH3), 31P‐
NMR (202 MHz, DMSO‐d6, ): 5.91, 6.54. 

 

2.2.7. Ethyl2­(4­hydroxyphenyl)­2­((S)­((5­(5­methyl­2,4­
dioxo­3,4­dihydropyrimidin­1(2H)­yl)­2,5­dihydrofuran­2­
yl) methoxy) (4­nitrophenoxy)phosphorylamino)acetate 
(4g) 
 

Yield: 57%. M.p.: 167‐169 oC, Anal. Calcd. for C26H27N4O11P: 
C,  51.83; H,  4.52; N,  9.30;  Found C,  51.79; H,  4.47; N, 9.35.  IR 
(KBr, cm‐1): 3385 ν(‐NH), 1683, 1725 ν(C=O), 1230 ν(P=O). 1H‐
NMR (500 MHz, DMSO‐d6, ): 11.1 (s, 1H, NH), 8.18 (d, 2H, J=9 
Hz, Ar‐H), 8.11 (d, 2H, J=9.5 Hz, Ar‐H), 7.51 (d, 1H, J=1.5 Hz, H‐
6), 7.25‐7.43  (m, 5H, Ar‐H), 6.79‐6.81  (m, 1H, H‐1'), 6.29‐6.31 
(m, 1H, H‐2'), 5.87‐5.89 (m, 1H, H‐3'), 5.54 (s, 1H, Gly‐OH), 4.4 
(brs,  1H,  GLY‐NH),  3.55‐3.61  (m,  4H,  2H‐5',  H‐4',  Gly‐NH‐CH), 
3.11 (q, 2H,  ‐OCH2), 1.71  (s, 3H, CH3), 1.21  (t, 3H, O‐CH2‐CH3). 
31P‐NMR (202 MHz, DMSO‐d6, ): 4.24. 

 
2.2.8. (2S)­Methyl­3­methyl­2­((S)­((5­(5­methyl­2,4­dioxo­
3,4­dihydropyrimidin­1(2H)­yl)­2,5­dihydrofuran­2­yl) met­
hoxy) (4­nitrophenoxy)phosphorylamino)butanoate (4h) 
 

Yield:  59%. M.p.:  145‐147  oC  IR  (KBr,  cm‐1):  3386  ν(‐NH), 
1678, 1731 ν(C=O), 1220 ν(P=O). 1H‐NMR (500 MHz, DMSO‐d6, 
): 8.1(s, 1H, NH), 8.0 (d, 2H, J=9 Hz, Ar‐H), 7.51 (d, 1H, J=1 Hz, 
H‐6),  7.32  (d,  2H,  J=9 Hz,  Ar‐H),  6.8‐6.81  (m,  1H,  H‐1'),  6.32‐
6.34  (m,  1H,  H‐2'),  5.89‐5.90  (m,  1H,  H‐3'),  4.8  (brs,  1H,  Val‐
NH),  3.94‐4.00  (m,  4H,  2H‐5',  H‐4',  Val‐NH‐CH),  3.01  (s,  3H,  ‐
OCH3), 2.51‐2.52 (m, 1H, (CH3)2CH), 1.71 (s, 3H, CH3), 1.15‐1.18 
(d, 6H,  (CH3)2C‐).  13C‐NMR (125 MHz, DMSO‐d6, ): 172.5 (Val‐
C=O), 164.39 (C‐4), 159.8 (C‐2),151.2 (C‐1''), 142.3 (C‐4''), 137 
(C‐6), 134.5 (C‐3'), 126.7 (C‐3'', C‐5''), 125.4 (C‐2'), 120.7 (C‐2'', 
C‐6''), 110.9 (C‐5), 89.2 (C‐1'), 85.7 (C‐4'), 66.4 (C‐5'), 46 (Val‐
CH),  43.1(‐OCH3),  33.2  (CH3)2C‐),  18.9  (CH3)2C‐),  12.2  (‐CH3). 
31P‐NMR (202 MHz, DMSO‐d6, ): 2.85. GCMS (m/z; %): (539.25, 
27%) [MH]+.  

 
2.2.9. (2S)­Methyl 4­methyl­2­((S)­((5­(5­methyl­2, 4­dioxo­
3,4­dihydropyrimidin­1(2H)­yl)­2,5­dihydrofuran­2­yl)meth 
oxy)(4­nitrophenoxy)phosphorylamino)pentanoate (4i) 
 

Yield: 63%. M.p.: 151‐153 oC  . IR (KBr, cm‐1): 3387 ν(‐NH), 
1675, 1728 ν(C=O), 1232 ν(P=O). 1H‐NMR (500 MHz, DMSO‐d6, 
): 8.7 (s, 1H, NH), 8.21 (d, 2H, J=7 Hz, Ar‐H), 7.6 (d, 1H, J=1 Hz, 
H‐6), 7.48 (d, 2H,  J=7.5 Hz, Ar‐H), 6.94‐6.95 (m, 1H, H‐1'), 6.3‐
6.33  (m, 1H, H‐2'), 5.89‐5.92  (m, 1H, H‐3'), 5.2  (brs, 1H, Leu  ‐
NH),  3.32‐3.36  (m,  4H,  2H‐5', H‐4',  Leu‐NH‐CH),  3.21  (s,  3H,  ‐
OCH3), 1.9‐1.93 (m, 2H, Leu‐CH2), 1.51‐1.52 (m, 1H, (CH3)2CH), 
1.71 (s, 3H, CH3), 1.17‐1.2 (d, 6H, (CH3)2C‐). 31P‐NMR (202 MHz, 
DMSO‐d6, ): 3.40, 4.11. GCMS (m/z; %): (553.35, 35%) [MH]+.  

 
2.2.10. (2R)­Ethyl 2­amino­3­((R)­((5­(5­methyl­2,4­dioxo­
3,4­dihydropyrimidin­1(2H)­yl)­2,5­dihydrofuran­2­yl) 
methoxy)(4­nitrophenoxy)phosphorylthio)propanoate (4j) 
 

Yield:  59%.  M.p.:  138‐141  oC,  Anal.  Calcd.  for 
C21H25N4O10PS:  C,  45.32;  H,  4.53;  N,  10.07;Found  C,  45.27;  H, 
4.49; N, 10.11. IR (KBr, cm‐1): 3375 ν(‐NH), 1677, 1727 ν(C=O), 
1228 ν(P=O).  1H‐NMR (500 MHz, DMSO‐d6, ): 9.4  (s, 1H, NH), 
8.21 (d, 2H, J=9.5 Hz, Ar‐H), 8.11(d, 2H, J=9 Hz, Ar‐H), 7.43 (d, 
1H,  J=1 Hz, H‐6), 6.95‐6.97 (m, 1H, H‐1'), 6.29‐6.31 (m, 1H, H‐
2'), 5.91‐5.93 (m, 1H, H‐3'), 5.54 (bs, 2H, ‐NH2, ), 3.92‐3.98 (m, 
4H, 2H‐5', H‐4', Cys‐CH‐ NH2), 3.65  (q, 2H,  ‐O‐CH2‐CH3), 2.97  ‐
3.05  (m,  2H,  Cys  ‐CH2),  1.73  (s,  3H,  CH3).  13C‐NMR  (125 MHz, 
DMSO‐d6,  ):  172.6  (Cys‐C=O),  159.1  (C‐4),  158.1  (C‐2),  143.2 
(C‐1''), 142.6 (C‐4''), 137.5 (C‐6), 135.1 (C‐3'), 125 (C‐3'', C‐5''), 
124 (C‐2'), 120.5 (C‐2'', C‐6''), 111.1 (C‐5), 89.8 (C‐1'), 86.1 (C‐
4'),  67.4  (C‐5'),  61.1  (O‐CH2),  53.7  (Cys‐CH),  22.1  (Cys‐CH2), 
13.8 (‐O‐CH2‐CH3), 12.1 (‐CH3). 31P‐NMR (202 MHz, DMSO‐d6, ): 
7.85. 

 
 



300  Rao et al. / European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 297­301 
 

 

Table 1. Antibacterial  activity of 4a­l. 

Compounds 
Zone of Inhibition in mm (100 µg/mL) 

B. subtilis  S. aureus E. coli K. pneumoniae
4a  12  1 0 11 10
4b  12  12 10 11
4c  10  10 11 13
4d  11  13 14 12
4e  ‐  ‐ 9 8 
4f  12  11 16 9 
4g  10  8 12 10
4h  11  9 12 11
4i  13  12 13 13
4j  13  11 13 14
4k  10  15 12 11
4l  11  12 17 9 
Ampicillin  11  9 13 10
 

 
2.2.11. Benzyl1­((S)­((5­(5­methyl­2,4­dioxo­3,4­dihydro 
pyrimidin­1(2H)­yl)­2,5­dihydrofuran­2­yl)methoxy) (4­
nitro­phenoxy) phosphoryl)pyrrolidine­2­carboxylate (4k) 
 

Yield: 62 %. M.p.: 171‐173 oC. Anal. Calcd. for C28H29N4O10P: 
C, 54.90; H, 4.77; N, 9.15; Found C, 54.95; H, 4.79; N, 9.11. IR 
(KBr, cm‐1): 3379 ν(‐NH), 1680, 1728 ν(C=O), 1234 ν(P=O). 1H‐
NMR (500 MHz, DMSO‐d6, ): 9.1 (s, 1H, NH),  8.14 (d, 2H, J=9.5 
Hz, Ar‐H), 7.49 (d, 1H, J=1.5 Hz, H‐6), 7.39 (d, 2H, J=9 Hz, Ar‐H), 
7.20‐7.32 (m, 5H, Ar‐H), 6.79‐6.80 (m, 1H, H‐1'), 6.33‐6.35 (m, 
1H, H‐2'), 5.90‐5.91 (m, 1H, H‐3'), 5.38 (s, 2H, Ph‐CH2), 3.91‐
3.98 (m, 4H, 2H‐5', H‐4', Prol‐CH), 2.83‐2.87 (m, 2H, N‐CH2), 
1.92‐1.97 (m, 4H, (CH2)2), 1.71 (s, 3H, CH3), 31P‐NMR (202 MHz, 
DMSO‐d6, ): 2.12. 

 
2.2.12. Methyl3­(1H­imidazol­4­yl)­2­((((2S,5R)­5­(5­methyl­
2,4­dioxo­3,4dihydropyrimidin­1(2H)­yl)­2,5­dihydrofuran­
2­yl) methoxy) (4­nitrophenoxy)phosphorylamino) 
propanoate (4l) 
 

Yield: 65 %. M.p.: 164‐167 oC, Anal. Calcd. for C23H25N6O10P: 
C, 47.92; H, 4.37; N, 14.58; Found C, 47.87; H, 4.34; N, 14.65. IR 
(KBr, cm‐1): 3385 ν(‐NH), 1680, 1731 ν(C=O), 1226 ν(P=O). 1H‐
NMR (500 MHz, DMSO‐d6, ): 11.2 (br s, 1H, NH), 9.2 (s, 1H, NH), 
8.65‐8.67 (m, 1H, N=CH), 8.21 (d, 2H,  J=9.5 Hz, Ar‐H), 7.51 (d, 
1H, J=1 Hz, H‐6), 7.38‐7.44 (m, 3H, NH‐CH, 2Ar‐H), 6.8‐6.81 (m, 
1H, H‐1'), 6.32‐6.34  (m, 1H, H‐2'), 5.89‐5.90  (m, 1H, H‐3'), 5.2 
(brs, 1H, ‐NH), 3.96‐4.04 (m, 4H, 2H‐5', H‐4', His‐CH), 3.34‐3.38 
(m,2H, His‐CH2), 3.21 (s, 3H, ‐OCH3). 31P‐NMR (202 MHz, DMSO‐
d6, ): 3.31. 
 
2.3. Biological Activity 
 
2.3.1. Antibacterial activity 
 

Compounds  4a­l  were  screened  for  their  antibacterial 
activity  against Gram positive bacteria, Staphylococcus aureus, 
Bacillus  subtilis  and  Gram  negative  bacteria,  Escherichia  coli, 
Klebsiella pneumoniae by the cup plate method [12] in nutrient 
agar  medium  at  the  concentration  of  100  µg/mL  in  DMSO. 
Nutrient  agar  plates  were  prepared  by  pouring  20  mL  of 
nutrient  agar  in  sterile  Petri  dishes  for  antibacterial  assay. 
Concentration  of  these  organisms  was  prepared  to  contain 
approximately 1×106  cfu/mL. The  tubes were  then  inoculated 
with 0.1 mL of the appropriate culture suspension of bacterium 
mixed  gently  and  poured  onto  previously  solidified  nutrient 
agar. After setting, a cup borer (6 mm diameter) was properly 
sterilized  by  flaming  and  used  to  make  four  uniform  cups  in 
each  Petri  dish.  The  cups  were  then  filled  with  the  test 
compounds  and  allowed  to  diffuse  for  45 minutes.  Ampicillin 
(100  μg/disc)  was  used  as  standard  for  bacteria.  The  plates 
were incubated at 37 oC for 24 hours. At the end of the period, 
inhibition zones formed on the medium were evaluated in mm 
using  a  scale.  The  experiment  was  carried  out  in  triplicates.  

The results (Table 1) were compared with that of the standard 
antibiotic Ampicillin (100 µg/mL). 
 
2.3.2. Antioxidant activity 
 

The  antiradical  activity  of 4a­l was measured  in  triplicate 
using a modified Burits  and Bucar method  [13]. A methanolic 
solution  of  DPPH  (4 mL,  40  ppm) was  added  to  1 mL  of  the 
antioxidant  solutions  in  0.1 M Tris–HCl  buffer  (pH=7.1)  at  25 
°C,  giving  final  concentrations  of  10,  25,  50  and  100  μM.  The 
absorbance read at 517 nm was measured after 60 min of  the 
reaction in the dark and compared with the control prepared in 
a  similar  way  without  the  addition  of  the  antioxidants  (this 
value was assigned arbitrarily to 100%). A 100 μM solution of 
ascorbic acid (a strong and natural antioxidant agent) was also 
tested as a control for the reaction. In this case, the violet color 
of DPPH disappeared immediately. It is confirmed that the test 
compounds showed better antioxidant activity when compared 
to  the  parent  drug  stavudine  and  moderate  activity  when 
compared with that of Vitamin C (Table 2). 
 
Antioxidant activity (%) = [(A517control ‐ A517sample) /A517control] x 100  (1) 
 
Table 2. DPPH radical scavenging activity of (4a­l). 
Compounds  IC50 / DPPHvalues(μg/mL) 
4a  150.66 ± 6.95 
4b  187.56 ± 9.31 
4c  149.33 ± 4.43 
4d  122.79 ± 2.51 
4e  110.39 ± 7.55 
4f  119.06± 0.84 
4g  162.33 ± 5.45 
4h  127.49 ± 6.47 
4i  112.94 ± 4.73 
4j  132.67 ± 7.76 
4k  157.56 ± 5.28 
4l  162.71 ± 3.37 
Stavudine  244.82 ± 6.21 
Vitamin C  71.30 ± 1.66 
 
3. Results and discussion  
 

The  synthesis  of  the  phosphorylated  derivatives  of 
stavudine  4a­l  is  depicted  in  Scheme  1.  Cyclic  amines  and 
amino  acid  esters  were  reacted  with  bis(2‐chloroethyl) 
phosphoramidic  dichloride  and  4‐nitro  phenyl  phosphoro 
dichloridate  at  ‐10  °C  (Scheme  1),  in  the  presence  of  TEA  in 
THF. The progress of the reaction was monitored by TLC. After 
completion of  the  reaction  in 2 h,  a  solution of  stavudine  and 
TEA in pyridine was added to the reaction mixture at 10 °C and 
the  mixture  was  stirred  for  10  h  at  RT.  The  reaction  was 
completed as indicated by TLC, (ethylacetate:hexane, 9:1), TEA 
hydrochloride was removed by filtration and the solvent  from 
the  filtrate was  removed  in  vacuum.  The  residue was  column 
chromatographed  on  silica  and  eluted  with  1%  methanol  in 
chloroform.  All  the  compounds  4a­l  exhibited  characteristic 
infrared absorption bands for P=O, C=O and NH in the regions 
1218‐1236, 1683‐1731 and 3394‐3375 cm‐1, respectively [14]. 



Rao et al. / European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 297­301  301 
 

 
 

The  chemical  shifts  of  the  NH  protons  in  thymine  ring  were 
observed as a singlet in the region d 8.1‐11.2. [15‐16]. The H‐6' 
proton signal appeared as a doublet in the region 7.43‐7.7 ppm 
[17].  In  13C NMR the chemical shifts of  the carbonyl carbon of 
thymine  ring  resonated  at        164.5‐150.2  [17].  The  31P NMR 
chemical shifts appeared  in the region ‐1.24 to 7.85 ppm [18]. 
The compounds 4a, 4d, 4e, 4h and 4i exhibited molecular  ion 
peaks with moderate intensity in their GC mass spectra. 

The  compound  4j  showed  high  activity  against  Gram 
negative  bacteria  (K.  pneumoniae).  The  compounds 4f  and 4l 
exhibited  higher  activity  against  Escherichia  coli  when 
compared to that of the standard. The compound 4k exhibited 
high  activity,  against  Gram  positive  bacterium  Staphylococcus 
aureus when compared to that of the ampicillin. Majority of the 
compounds  exhibited  significant  antibacterial  activity  (Table 
1). 

Majority of the compounds showed significant activities for 
DPPH  radical  scavenging  when  compared  to  stavudine  and 
Vitamin  C  (Table  2).  The  potency  of  these  radical  scavenging 
activities was mainly  influenced  by  the  fragments  attached  to 
the  phosphorylated  stavudine.  The  fragments  4‐nitrophenyl 
phosphoryl moiety  and  various  cyclic  amines  and  amino  acid 
esters  linked  to  phosphorus  led  to  increase  in  DPPH  radical 
scavenging  activity  (i.e. 4e  and 4i).  4‐Nitrophenyl  phosphoryl 
and  phenyl  glycine  ethyl  ester moieties were  found  to  be  the 
most  potent  fragments  for  increasing  radical  scavenging 
activity. 
 
4. Conclusion 
 

In conclusion, a series of novel phosphorylated derivatives 
of  stavudine  were  synthesized  and  evaluated  for  their 
antimicrobial  and  antioxidant  properties.  Structure  activity 
studies showed that the antioxidant and antimicrobial potency 
was mainly  influenced  by  the  functional  groups  at  the  end  of 
the  aliphatic  chain,  as  well  as  the  nature  of  atom  attached 
directly  to  phosphorus  atom  and  the  two different  types  of  R 
fragments  attached  to  phosphorus  atom,  which  provided 
additional  sites  of  interactions  between  the  inhibitor  and  the 
enzyme, which constitutes a key element for enhanced affinity. 
The results suggest  that  the compounds 4e, 4f and 4i  showed 
promising antioxidant activities.  
 
Acknowledgement 
 

We  thank  BRNS  (DAE),  BARC,  Mumbai  for  the  financial 
support (Project No.: (2007/37/46/BRNS/2916), dated 31‐03‐
2008. 
 
References 
 
[1]. Browne, M. J.; Mayer, K. H.; Chafee, S. B. D.; Dudley, M. N.; Posner, M. 

R.; Steinberg, S. M.; Graham, K. K.; Geletko, S. M.; Zinner, S. H.; Denamn, 
S. L.; Dunkle, L. M.; Kaul, S.;  McLaren, C.; Skowron, G.;  Kouttab, N. M.; 
Kennedy, T. A.; Weitberg, A. B.; Curt, G. A. J. Infect. Dis. 1993, 167, 21–
29. 

[2]. Murray, H. W.; Squires, K. E.; Weiss, W.; Sledz, S.; Sacks, H. S.;  Hassett, 
J.; Cross, A.; Anderson, R. E.; Dunkle, L. M.  J. Infect. Dis. 1995, 171(2), 
123–130.  

[3]. Balzarini, J.; Herdewijn, P.; Clercq, E. D. J. Biol. Chem. 1989, 264, 6127–
6133. 

[4]. Ho, H.‐T.; Hitchcock, M. J. M. Antimicrob. Agents Chemother. 1989, 33, 
844–849.  

[5]. Mansuri,  M.  M.;  Starrett,  J.  E.;  Ghazzouli,  I.;  Hitchcock,  M.  J.  M.; 
Sterzycki, R. Z.; Brankovan, V.; Lin, T.‐S.; August, E. M.; Prussoff, W. H.; 
Sommadossi, J.‐P.; Martin, J. C. J. Med. Chem. 1989, 32, 461–466. 

[6]. Siddiqui, A. Q.; McGuigan, C.; Ballatore, C.; Zuccotto, F.; Gilbert, I. H.; De 
Clercq, E.; Balzarini, J. J. Med. Chem. 1999, 42, 4122‐4128. 

[7]. Wagner, C.R.; Iyer, V. V.; McIntee, E. J. Med. Res. Rev 2000, 20, 417‐451. 
[8]. Mavromoustakos,  T.;  Calogeropoulou,  T.;  Koufaki, M.;  Kolocouris,  A.; 

Daliani,  I.;  Demetzos,  C.;  Meng,  Z.;  Makriyannis,  A.;  Balzarini,  J.;  De 
Clercq, E. J. Med. Chem. 2001, 44, 1702‐1709. 

[9]. Balzarini, J.; Aquaro, S.; Knispel, T.; Rampazzo, C.; Bianchi, V.; Perno, C. 
F.; De Clercq, E.; Meier, C. Mol. Pharmacol. 2000, 58, 928‐35. 

[10]. Cardona, V. M.; Ayi, A. I.; Aubertin, A. M.; Guedj, R. Antiviral Res. 1999, 
42,189‐196. 

[11]. Armarego, W. L. F.; Perrin, D. D. Purification of Laboratory Chemicals, 
4th ed., Butterworth, Heinemann, Oxford, OX2 8DP 1997. 

[12]. Murray, P. R.; Baron, E.    J.; Pfaller, M. A.; Tenover, F. C.; Yolken, H. R. 
Manual  of Clinical microbiology, 6th Ed. ASM Press, Washington DC, 
pp. 15‐18 , 1995. 

[13]. Burits, M.; Bucar, F. Phytother. Res. 2000, 14, 323–328. 
[14]. Kishore,    K.  R,;  Anil,  K.  M.;  Narayana,  R.  M.  V.;  Devendranath,    R.C.; 

Suresh, R. C. Tetrahedron Lett. 2008, 49, 6337‐6340.  
[15]. Shirokova, E. A.;  Jasko, M. V.;   Khandazhinskaya, A. L.;    Ivanov, A. V.;  

Yanvarev,    D.  V.;  Skoblov,  Y.  S.;    Mitkevich,  V.  A.;  Bocharov,  E.  V.; 
Pronyaeva, T. R.;   Fedyuk, N. V.; Kukhanova, M. K.; Pokrovsky, A. G. J. 
Med. Chem. 2004, 47, 3606–3614. 

[16]. Kim,  J.;  Chou,  T.  F.;  Griesgraber,  G.  W.;  Wagner,  C.  R.  Mol. 
Pharmaceutics 2004, 1, 102‐111.  

[17]. McGuigan, C.; Cahard, D.; Sheeka, H.M.; Clercq, E.D.; Balzarini, J.  J. Med. 
Chem. 1996, 39, 1748‐1753. 

[18]. Koteswara Rao, V.; Janardhan Rao, A.; Subba Reddy, S.; Naga Raju, C.; 
Visweswara Rao, P.; Ghosh.  S. K.   Eur.  J.   Med. Chem. 2010, 45,  203–
209.