Microsoft Word - European_Journal_of_Chemistry_1_4_2010_319_321_224


European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 319‐321 

 
European Journal of Chemistry 

ISSN 2153‐2249 (Print) / ISSN 2153‐2257 (Online)  2010 EURJCHEM 
DOI:10.5155/eurjchem.1.4.319‐321.224 

   

 

European Journal of Chemistry 
Journal homepage: www.eurjchem.com 

 
     

Determination of enantiomeric excess of leucine and valine  
by X‐ray powder diffraction 

Elżbieta Tadeusiaka, Rafal Kruszynskib,*, Agata Trzesowska‐Kruszynskab,  
Tomasz Sieranskib and Bartlomiej Lewinskib 

a Department of Structural Studies, Centre of Molecular and Macromolecular Studies, Polish Academy of Sciences, Sienkiewicza 112, Łódź, PL­90­363, Poland 
b Department of X­ray Crystallography and Crystal Chemistry, Institute of General and Ecological Chemistry, Technical University of Łódź, Żeromskiego 116, Łódź, 
PL­90­924, Poland 

*Corresponding author at: Department of X­ray Crystallography and Crystal Chemistry, Institute of General and Ecological Chemistry, Technical University of Łódź, 
Żeromskiego 116, Łódź, PL­90­924, Poland. Tel.: +48.42.6313137; fax: +48.42.6313103. E­mail address: rafal.kruszynski@p.lodz.pl (R. Kruszynski). 
 

 
 

   

     
ARTICLE INFORMATION    ABSTRACT
Received: 26 June 2010 
Accepted: 06 August 2010 
Online: 31 December 2010 

KEYWORDS 

  Two amino acids, leucine and valine, were studied by X‐ray powder diffraction (XRPD). The 
linear  correlations between  intensity  of  racemate  (decrease)  or  enantiomer  (increase)  and 
enantiomeric excesses were observed in each case. 

Leucine 
Valine 
Enantiomeric excess 
X‐ray powder diffraction 

 
1. Introduction 

 
Leucine  [1,2]  and  valine  [3,4]  are  two  of  the  twenty most 

common  amino  acids  on  Earth.  Only  their  L‐enantiomers 
appear  in  mammalian  proteins.  They  are  essential  in  meta‐
bolism  and  necessary  in  the  diet,  as  the  human  body  cannot 
synthesize them from simpler metabolites.  They are branched‐
chain amino acids (BCAA). BCAA help to maintain muscle tissue 
and are also needed during times of physical stress and intense 
exercise. Young adult humans need about 31 mg of leucine and 
23 mg of valine per day per kilogram of body weight. 

Leucine,  (CH3)2CHCH2CH(NH2)COOH,  is  a  hydrophobic 
amino acid that is found as a structural element in the interior 
of  proteins  and  enzymes.  It  was  isolated  from  cheese  in  an 
impure form in 1819 and from wool  in the crystalline state  in 
1820. Leucine stimulates muscle protein synthesis and may be 
the major  fuel  involved  in anabolic (tissue‐building) reactions. 
It  helps  with  the  regulation  of  blood‐sugar  level,  growth 
hormone production, wound healing and energy  regulation.  It 
is  found  in  protein‐containing  foods,  brown  rice,  beans,  nuts 
and wheat. 

Valine,  (CH3)2CHCH(NH2)COOH, was  first  isolated  in  1888 
by Weyl  [5].  It  has  a  stimulating  effect  on muscle metabolism 
and  is  needed  for  muscle  metabolism,  repair  and  growth  of 
tissue and maintaining the nitrogen balance in the body. Good 
sources  for  this  amino  acid  are  dairy  produce,  meat,  grain, 
mushrooms, soy and peanuts. 

Today,  many  athletes  use  leucine  and  valine  in  the  L‐
enantiomeric form as supplemental nutrients, so easy and fast 
determination of enantiomeric excess (ee) of these amino acids 
is  very  important.  It  is  known  that  two  enantiomers  give 
different  pharmacological  responses,  so  pharmaceutical 
companies tend to produce chiral drugs in single enantiomeric 

form  and  any  new  method  able  to  control  the  enantiomeric 
purity is strongly desired. The X‐ray powder diffraction method 
(XRPD)  is  successfully  used  for  determination  of  ee  of 
pharmaceuticals  such  as  Ibuprofen  (anti‐inflammatory, 
analgesic  and  antipyretic  agent  [6,7])  [8]  and  cyclophosph 
amide  (anticancer  agent  [9‐11])  [12].  Now  extension  of  the 
XRPD technique to the determination of enantiomeric excess in 
the mixtures of leucine or valine is presented. 
 
2. Experimental 
 

The  samples  of  racemeric  (DL)  and  enantiomeric  (L) 
leucine were mixed in different proportions to prepare physical 
mixtures. The ee values were 5%, 10%, 25%, 40%, 50%, 60%, 
75%, 90%. Analogous samples were prepared  for valine.   The 
physical  mixtures  and  recrystallized  physical  mixtures 
(MeOH:H2O,  1:1)  of  these  amino  acids  were  prepared. 
Recrystallized  physical  mixtures  were  prepared  in  different 
ways:  slow  evaporation  techniques  and  fast  evaporation  in  a 
rotary evaporator  (Pressure 100 mm Hg, Temperature: 19  °C; 
Pressure:  500  mmHg,  Temperature:  40  °C).  In  all  cases  the 
same  mixtures  recrystallized  by  different  methods  gave 
identical  diffraction  patterns,  i.e.  the  peaks  have  the  same 
positions  and  intensities.  To  avoid  errors  associated  with 
change of ee during the recrystallization the ee was monitored 
also by 13C CP/MAS and ODESSA NMR experiments. 
 
2.1. Instrumentation 
 

The substances and mixtures discussed above were milled 
in the planetary ball corundum mill for 5 minutes and the X‐ray 
diffractograms  were  then  recorded  using  a  D‐5000 
diffractometer  and  CuKα  (Ni‐filtered)  radiation  with  Bragg‐



320  Tadeusiak et al. / European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 319­321 
 

 

Brentano focusing geometry. The measurements were made in 
the 2θ = 2‐80° range with 2 seconds per 0.01° step. The area of 
peak  was  computed  by  EVA  version  3.09  from  diffrac  at 
program  PACKAGE  with  ω‐2θ  scan  mode  after  appropriate 
background determination [13]. 
 
3. Results and discussion 
 

The structures of L‐leucine  [14‐16] / L‐valine  [17‐19] and 
their  racemates  (DL‐leucine  [20,21]  /  DL‐valine  [22‐25])  are 
different  (for  details  see  supplementary  materials),  which 
result  in  different  powder  patterns.  This  allows  both  phase 
identification  and  quantitative  analysis.  Recorded 
diffractograms  of  the  pure  amino  acids,  leucine  and  valine  in 
racemic and enantiomeric  forms, are depicted  in Figure 1 and 
2.  The  sample  X‐ray  powder  diffraction  patterns  of  prepared 
mixtures are depicted on Figure 3 and 4. 

 

 (a) 

(b) 
 

Figure 1. Diffractogram of (a) leucine (racemate), (b) leucine (L‐enantiomer). 
 

(a) 

(b) 
 

Figure 2. Diffractogram of (a) valine: racemate, (b) valine: L‐enantiomer.

 

(a) 

(b) 
 
Figure  3.  Diffractogram  of  leucine  (ee  =  75%)  (a)  physical  mixture.  (b) 
recrystallized mixture. 

 

(a) 

(b) 
 
Figure  4.  Diffractogram  of  valine  (ee  =  25%)  (a)  physical  mixture,  (b) 
recrystallized mixture. 

 
For  each  pattern  one  non‐overlapping  independent 

diffraction peak for  the L‐amino acid and the racemate can be 
selected (for the leucine L‐enantiomer at 2θ = 24.3° and for the 
leucine racemate at 2θ = 25.3°; and for valine at 29.5° and 32.4° 
for  the  L‐enantiomer  and  racemate,  respectively).  Thus  the 
classic  approach  based  on  the  intensity  of  one  peak  can  be 
applied  instead  of  the  Rieteveld  method.  Fitting  the  whole 
diffraction pattern  to  the calculated  intensities  for  the various 
phases that are present can give more precise results, but in the 
case  discussed  here  the  classic  approach  gives  a  linear 
correlation between the intensity (the area of the peak) and the 
ee in each cases (Figure 5 and Figure 6) with R2 values greater 
than 0.99. 
 



Tadeusiak et al. / European Journal of Chemistry 1 (4) (2010) 319­321  321 
 

 
 

 (a) 

   (b) 
 

Figure  5.  Linear  correlation  between  intensity  and  ee  in  samples  of  leucine 
(physical mixture) –  reflection: 2θ = 24.3˚  (enantiomer);  reflection: 2θ = 25.3˚ 
(racemate) (a) physical mixture, (b) recrystallized mixture. 
 

(a) 

 (b) 
 
Figure 6. Linear  correlation  between  intensity  and  ee  in  samples  of  valine 
(physical mixture) – reflection: 2θ = 32.4˚(enantiomer); reflection: 2θ = 29.5˚ 
(racemate) (a) physical mixture (b) recrystallized mixture. 

 
As  it  is  shown  in  Figure  5  and  Figure  6  the  regression 

coefficients  differ  for  physical  mixtures  and  recrystallised 
samples. It is caused by differences in the degree of crystallinity 
of determined compounds. Thus all standard samples must be 
recrystallised to obtain reliable results. 

Prepared physical mixtures diffractograms did not show a 
dependence  on method  of  preparation  ‐  slow  evaporation  or 
fast evaporation in a rotary evaporator (Pressure: 100 mm Hg, 
Temperature:  19  °C;  Pressure:  500  mmHg,  Temperature:         
40  °C).  In  all  cases  of  recrystallization  for  the  same  physical 
mixture  recorded  diffraction  patterns  are  identical  i.e.  the 
peaks  have  the  same  positions  and  intensities.  Thus  the 
recrystallization  process  can  be  fast  and  using  the  same 
crystallization  medium  (MeOH:H2O,  1:1)  gives  repeatable 
results. 
 
4. Conclusion 
 

The  X‐ray  powder  diffraction  is  a  powerful  and  fast 
technique for the identification of polycrystalline samples [26‐

28].   However, quantitative analysis  is not a common practice. 
It  is  mostly  involved  with  problems  occurring  during 
determination of the amount of phase in a multiphase sample. 
The  quantity  of  a  specific  compound  or  compounds  in  a 
multicomponent sample can be determined from the intensities 
of  the  peaks  in  a  powder  diffraction  pattern  [13].  The  main 
problem is the accurate determination of peak intensities. The 
absolute  intensity  measurement  practically  almost  cannot  be 
made, but measurement of relative intensity is sufficient if the 
comparative  analytical method  is  used  [29].  Thus  one  of  two 
methods  can  be  considered:  the  calibration  curve  and  the 
internal  standard  method.  As  shown  in  the  amino  acids 
samples  considered  here,  the  relative  intensity  is  linearly 
correlated  with  the  ee,  and,  as  expected,  it  changes  with  the 
degree  of  crystallinity.  Thus  choosing  the  calibration  curve 
method  after  fast  recrystallization  from  the  same  medium  is 
quicker  and  more  reasonable  than  the  internal  standard 
method,  because  in  the  second  case  the  problem  of  the 
crystallinity of the standard exists. Though this problem can be 
overridden  by  a  one  additional  recrystallization,  the  internal 
standard method will be still more laborious, as depicted in the 
work of Phandnis and Suryanarayanan [7]. 
 
Acknowledgement 
 

This  work  was  supported  by  funds  allocated  by  the 
Ministry  of  Science  and  Higher  Education  to  the  Institute  of 
General and Ecological Chemistry, Technical University of Lodz. 
 
References 
 
[1]. Fischer, E. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1904, 37, 2486‐2511.  
[2]. Patel, M. S.; Worsley. M. Can. J. Chem. 1970, 48, 1881‐1884. 
[3]. Marvel, C. S. Org. Synth. 1940, 20, 106‐108. 
[4]. Shono,  T.;  Matsumura,  Y.;  Tsubata,  K.  Tetrahedron  Lett.  1981,  22, 

2411‐2412. 
[5]. Jakubke,  H‐D.;  Jeschkeit,  H.  Aminosäuren,  Peptide,  Proteine, 

Akademie‐Verlag, Berlin 1982. 
[6]. Adams, S. S.; McCullough, K. F.; Nicholson, J. S. Arch. Int. Pharmacodyn. 

Ther. 1969, 178, 115‐129. 
[7]. Adams,  S.  S.;  Bough,  R.  G.;  Cliffe,  E.  E.;  Lessel,  B.; Mills,  R.  F. Toxicol. 

Appl. Pharmacol. 1969, 15, 310 330. 
[8]. Phandnis,  N.  V.;  Suryanarayanan,  R.    Pharmaceutical  Res.  1997,  9, 

1176‐1180. 
[9]. Sullivan, M. P. Cancer Chemother. Rep. 1967, 51, 393. 
[10]. Hill, D. L. A Review of Cyclophosphamide, Ch. C. Thomas, Springfield 

III 1975. 
[11]. Brock, N. Cancer. Res. 1989, 41, 1‐7. 
[12]. Tadeusiak, E. J.; Kruszynski, R.; Misiura, K. Pol. J. Chem. 2004, 78, 431‐

435. 
[13]. Klug,  H.P.;  Alexander,  L.E.  X‐ray  Diffraction  Procedures  for 

Polycrystalline and Amorphous Materials, Wiley, New York 1974. 
[14]. Harding, M. M.; Howieson, R. M. Acta Cryst. 1976, B32, 633‐634.  
[15]. Coll, M.;  Solans,  X.;  Font‐Altaba, M.;  Subirana,  J.  A. Acta Cryst. 1986, 

C42, 599‐601. 
[16]. Gorbitz, C. H.; Dalhus, B.  Acta Cryst. 1996, C52, 1754‐1756. 
[17]. Torii, K.; Iitaka, Y. Acta Cryst. 1970, B26, 1317‐1326. 
[18]. Dalhus, B.; Gorbitz, C. H. Acta Chem. Scand. 1996, 50, 544‐548. 
[19]. Wang, W. Q.; Gong, Y.; Liang, Z.; Sun, F. L.; Shi, D. X.; Gao, H. J.; Lin X.; 

Jiang, P; Wang, Z. M.  Surf. Sci. 2002, 512, 379‐384. 
[20]. Blasio, B.;  Pedone, C.;  Sirigu, A. Acta Cryst. 1975, B31,  601; Erratum 

Acta Cryst. 1975, B31, 601‐602. 
[21]. Moller, A. Acta Chem. Scand. 1949, 3, 1326‐1330. 
[22]. Mallikarjunan, M.; Rao. S. T. Acta Cryst. 1969, B25, 296‐303. 
[23]. Dawson, B.; Mc Mathieson, A. L. Acta Cryst. 1951, 4, 475‐477. 
[24]. Dalhus, B.; Gorbitz, C. H. Acta Cryst. 1996, C52, 1759‐1761. 
[25]. Flaig,  R.;  Koritsanszky,  T.;  Dittrich,  B.;  Wagner,  A.;  Luger,  P.    J.  Am. 

Chem. Soc. 2002, 124, 3407‐3417. 
[26]. Jenkins, R.; Snyder, R. L. Introduction to X‐Ray Powder Diffractometry, 

John Wiley & Sons, Inc., New York 1996. 
[27]. Masciochi, N. The Rigaku J. 1997, 14, 9‐16. 
[28]. Harris,  K.  D.  M.;  Tremayne,  M.;  Kariuki,  B.  M. Angew.  Chem.  Int.  Ed. 

2001, 40, 1626‐1651. 
[29]. Zevin, L. S. J. Appl. Cryst. 1977, 10, 147­150.