Microsoft Word - European_Journal_of_Chemistry_1_2_2010_115_123_56 European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 115‐123    European Journal of Chemistry  ISSN 2153‐2249 (Print) / ISSN 2153‐2257 (Online)  2010 EURJCHEM  DOI:10.5155/eurjchem.1.2.115‐123.56        European Journal of Chemistry  Journal homepage: www.eurjchem.com          Antimicrobial investigations on synthetic p‐tolylazo derivatives of  thienopyrimidinone based on an ortho funtionalized thiophene nucleus  Hatem M. Gabera,*, Mark C. Bagleyb and Sherif M. Sherifc  a National Organization for Drug Control and Research (NODCAR), Cairo, Egypt  b School of Chemistry, Main Building, Cardiff University, Park Place, Cardiff, CF10 3AT, U.K  c Department of Chemistry, Faculty of Science, Cairo University, Giza 12613, Egypt  *Corresponding author at: National Organization for Drug Control and Research (NODCAR), Cairo, Egypt. Tel.: +201.64703765; fax: +202.35726406.   E­mail address: hatem.gaber@yahoo.com (H. Gaber)                ARTICLE INFORMATION    ABSTRACT Received: 11 March 2010  Received in revised form: 12 April 2010  Accepted: 12 April 2010  Online: 30 June 2010  KEYWORDS    New derivatives of  thieno[2,3‐d]pyrimidin‐4‐one, 4a­c, and 6 were  respectively  synthezised based  on  thiophene  derivative,  2c,  bearing  ortho‐disposed  amino  and  ester  groups. Carbohydrazide, 7, was obtained by hydrazinolysis of 3‐ethoxycabonylmethyl derivative, 4c. Compounds  4b  and  7  were  used  to  build  up  two  series  of  novel  3‐substituted‐ methylthieno[2,3‐d]pyrimidin‐4‐ones,  7­11,  and  their  corresponding  3‐substituted‐amino analogues  12,  15a,b,  18,  which  were  of  significant  interest  for  biological  study.  The  new thieno[2,3‐d]pyrimidin‐4‐one  derivatives,  with  various  groups  in  position  3,  were  screened for  their  preliminary  antimicrobial  activity  against  a  representative  panel  of  Gram‐positive and Gram‐negative bacteria as well as fungi strains. The compounds tested displayed different levels  of  antibacterial  and  antifungal  effects,  with  the  assays  carried  out  on  six  pathogenic bacteria  and  six  pathogenic  fungi.  Of  these  compounds,  the  3‐unsubstituted‐thieno[2,3‐ d]pyrimidin‐4(3H)‐one,  4a,  showed  the  lowest  effect  on  pathogenic  bacteria,  while  the corresponding 3‐substituted analogues produced inhibitory effects against bacteria similar or superior to the reference drug Tetracycline. For those derivatives of thieno[2,3‐d]pyrimidin‐4‐ one  in  which  the  3‐position  contains  a  methylene  moiety,  it  has  been  observed  that  the antibacterial  effect  was  in  general  found  to  be  significantly  higher  than  the  corresponding analogues  with  a  substituted‐amino  moiety  in  position  3.  Despite  promising  in  vitro antibacterial  activity  of  the  new  thienopyrimidin‐4‐ones,  only  compounds  7,  10  and  11, among  the  compounds  tested,  exhibited  some  kind  of  antifungal  activity.  The  detailed synthesis and biological screening data were reported.  Thienopyrimidinone  Aminoformylation  Acetylation  Hydrazinolysis  Antimicrobial activity    1. Introduction    The  current  interest  in  the  development  of  new  antimicrobial  agents  can  be  partially  ascribed  both  to  the  increasing  emergence  of  bacterial  resistance  to  antibiotic  therapy  and  to  newly  emerging  pathogens  [1,2].  Despite  advances in antibacterial therapy, many problems remain to be  solved  for  a  new  generation  of  antimicrobial  agents.  For  example,  in  the  hospital  setting,  the  re‐emergence  of  Gram‐ negative  pathogens  is  of  major  concern.  In  fact,  the  most  important  cases  of  sepsis  were  caused  by  virulent  Gram‐ negative  bacteria  such  as  Pseudomonas  aeruginosa,  Klebsiella  pneumoniae,  Escherichia  coli  and  Enterobacter  spp.  [3,4].  Furthermore, emerging resistance among new pathogens such  as  Acinetobacter  baumannii,  and  also  the  appearance  of  multidrug  resistant  Gram‐positive  bacteria,  particularly,  methicillin‐resistant  Staphylococcus  aureus  (MRSA)  and  vancomycin‐resistant Enterococci, are causing a  serious  threat  to  public  health.  Therefore,  the  development  of  new  and  efficacious  antimicrobial  drugs  is  a  very  important  goal,  and  most  of  the  research  efforts  in  this  field  are directed  towards  the  design  of  new  agents.  A  review  of  the  recent  literature  shows  that  many  effective  antimicrobial  agents  contain  a  heterocyclic  moiety  within  their  structure  [5,6]  and,  in  particular,  that  substituted  pyrimidinone  derivatives  have  a  wide  spectrum  of  biological  properties  such  as  antibacterial,  antifungal  and  antiviral  activities  [7,8].  Furthermore,  thienopyrimidines are  in general well known for  their diverse  pharmaceutical  applications  [9‐11]  with  particular  emphasis  on  the  antimicrobial  properties  of  their  thieno[2,3‐ d]pyrimidine analogues [12‐14].  Motivated by the significant antimicrobial activity recorded  for some thienopyrimidines and as part of our ongoing studies  in  the  development  of  new  chemotherapeutic  agents  [15‐17],  we  embarked  upon  the  synthesis  of  a  variety  of  novel  thieno[2,3‐d]pyrimidin‐4‐one  derivatives  having  different  groups  in  position  3  with  the  objective  to  investigate  their  antimicrobial properties in the search for new broad spectrum  therapeutic agents.    2. Experimental  2.1. Instrumentation    Melting  points  are  uncorrected.  IR  spectra were  recorded  (KBr)  on  a  Pye  Unicam  SP‐1000  spectrophotometer.  NMR  spectra  were  obtained  on  a  Varian  Gemini  300  MHz  spectrometer  in  DMSO‐d6  as  solvent  and  TMS  as  internal  reference.  Chemical  shifts  are  expressed  in  δ  ppm.  The  biological  evaluation  of  the  products  was  carried  out  at  the  116  Gaber et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 115­123    Micro  Analytical  Center  in  Cairo  University,  Cario,  Egypt.  Compounds  1  [18]  and  2a  [19]  were  prepared  according  to  known methods.    2.2. Synthesis    2.2.1. General procedure for the synthesis of ethyl 5­arylazo­ 2­amino­4­phenylthiophene­3­carboxylates (2b, c)    A finely ground powder of the p‐substituted aniline (0.002  mol) was dissolved  in  a mixture of  concentrated hydrochloric  acid (2 mL) and water (15 mL), and stirred overnight at room  temperature. The solution was cooled  to 0‐5  oC,  a well  cooled  saturated  solution  of  sodium  nitrite  (0.0021 mol)  was  added  portionwise at 5‐10 oC, and the reaction content was stirred for  a further 1 h at the same temperature. Excess nitrous acid was  destroyed by the addition of urea, and the solution was cooled  to 0‐5 oC. The resulting clear diazonium salt solution was then  added  dropwise  over  20 min with  constant  stirring  and with  frequent  addition  of  ice  to  a  cold  (0‐5  oC)  stirred  solution  of  coupling component aminoester 1 (0.0018 mol) dissolved in 20  mL  of  ethanol  containing  sodium  acetate  (0.01  mol)  while  maintaining  temperature  at  0‐5  oC.  After  addition  of  the  diazonium salt, the mixture was stirred for an additional 3 h at  5‐10 oC. The precipitated product, in each case, separated upon  dilution with cold water (30 mL) was filtered off, washed with  hot  water  and  with  cold  water,  and  dried.  Recrystallization  from the appropriate solvents gave  the arylazo derivatives 2b  (0.40 g; 57%) and 2c (0.51 g; 77%), respectively.    2.2.1.1. Ethyl 2­amino­5­(4­chlorophenylazo)­4­phenyl  thiophene­3­carboxylate (2b)     This  compound  was  obtained  as  a  light  brown  solid  (aqueous  ethanol). M.p.:  170­171  C.  IR  (ν/cm‐1):  3442,  3330  (NH2), 3052 (arom CH), 2950 (aliph CH), 1675 (CO). 1H NMR (δ  ppm): 1.02 (t, 3H, J = 7.2 Hz, ester Me), 4.05 (q, 2H, J = 7.2 Hz,  ester  CH2),  6.01  (s,  br,  2H, NH2, D2O‐exchangeable),  7.26‐7.59  (m, 9H, PhH, ArH). Anal. Calcd. for C19H16ClN3O2S (385.867): C,  59.14;  H,  4.18;  Cl,  9.19;  N,  10.89;  S,  8.31.  Found:  C,  58.93;  H,  4.01; Cl, 8.97; N, 10.72; S, 8.16.    2.2.1.2. Ethyl 2­amino­4­phenyl­5­(p­tolylazo)thiophene­3­ carboxylate (2c)    This  compound was  obtained  as  a  yellow  solid  (ethanol),  M.p.:  155­156  C.  IR  (ν/cm‐1):  3465,  3341  (NH2),  3056  (arom  CH), 2940 (aliph CH), 1673 (CO). 1H NMR (δ ppm): 0.98 (t, 3H, J  = 7.2 Hz, ester Me), 2.30 (s, 3H, Ar‐Me), 4.12 (q, 2H, J = 7.2 Hz,  ester  CH2),  5.76  (s,  br,  2H, NH2, D2O‐exchangeable),  7.32‐7.71  (m, 9H, PhH, ArH). 13C NMR (δ ppm): 13.7 (ester Me), 21.6 (Ar‐ Me),  59.5  (ester  CH2),  107.9  (C‐3),  125.4,  127.3,  128.4,  128.9,  129.6,  130.0,  131.5,  134.9,  138.4,  153.2,  162.1  (C‐2),  165.7  (ester CO). Anal. Calcd. for C20H19N3O2S (365.449): C, 65.73; H,  5.24; N, 11.50; S, 8.77. Found: C, 65.47; H, 5.09; N, 11.31; S, 8.61.    2.2.2. Synthesis of ethyl 2­[(dimethylamino methylene  amino]­4­phenyl­5­(p­tolylazo)thiophene­3­carboxylate (3)    Compound  2c  (0.005  mol),  in  dry  xylene  (30  mL),  was  treated with  DMFDMA  (0.006 mol)  portionwise.  The  reaction  content was  stirred under  reflux  for 6 h and  then  left  to  cool.  Stirring was  continued at  room  temperature  for  an additional  12 h. The solvent was removed by evaporation under vacuo to  dryness. The residual semisolid was triturated with petroleum  ether, whereby the solid product formed was filtered off, dried  and recrystallized from 1,4‐dioxane to give the amidine 3 as a  pale yellow solid (0.84 g; 40%), M.p.: 178­179 C. IR (ν/cm‐1):  3057 (arom CH), 2930‐2865 (aliph CH), 1709 (CO). 1H NMR (δ  ppm): 1.25 (t, 3H, J = 7.2 Hz, ester Me), 2.21 (s, 3H, Ar‐Me), 2.79,  2.89 (2s, 6H, NMe2), 4.23 (q, 2H, J = 7.2 Hz, ester CH2), 7.34‐7.70  (m, 9H, PhH, ArH), 8.87  (s, 1H, amidine‐H).  13C NMR (δ ppm):  13.9  (ester  Me),  21.5  (Ar‐Me),  33.8,  38.3  (NMe2),  59.8  (ester  CH2),  118.5  (C‐3),  125.6,  127.6,  128.5,  128.9,  129.4,  129.8,  131.4,  134.8,  138.7,  152.4,  155.2  (amidine  CH),  164.9  (C‐2),  166.1  (ester  CO).  Anal.  Calcd.  for  C23H24N4O2S  (420.527):  C,  65.69;  H,  5.75;  N,  13.32;  S,  7.62.  Found:  C,  65.54;  H,  5.63;  N,  13.09; S, 7.51.     2.2.3. Synthesis of 5­phenyl­6­(p­tolylazo)thieno[2,3­d]  pyrimidin­4(3H)­one (4a)    2.2.3.1. Method A    A  stirred  suspension  of  glacial  acetic  acid  (10  mL)  and  ammonium acetate (0.015 mol), was treated with compound 3  (0.005 mol). The mixture content was refluxed for 5 h after that  it was cooled to room temperature and poured onto iced water.  The  material  which  separated  upon  cooling  was  isolated  by  filtration,  washed  with  petroleum  ether,  dried  and  recrystallized  from  dimethylformamide  to  give  the  corresponding  thienopyrimidine  derivative  4a  as  a  golden  yellow solid (0.76 g; 44%). M.p.: 221­223 C. IR (ν/cm‐1): 3152  (NH),  3074  (arom CH),  2965,  2870  (aliph  CH),  1667  (CO).  1H  NMR (δ ppm): 2.24 (s, 3H, Ar‐Me), 7.31‐7.75 (m, 9H, PhH, ArH),  8.30  (s,  1H,  pyrimidine  H‐2),  12.53  (s,  1H,  NH,  D2O‐ exchangeable). Anal. Calcd. for C19H14N4OS (346.406): C, 65.88;  H, 4.07; N, 16.17; S, 9.26. Found: C, 65.76; H, 3.90; N, 15.95; S,  9.07.    2.2.3.2. Method B    A  solution of 2c  (0.002 mol) and  formamide  (20 mL) was  refluxed  for  4  h.  The  mixture  was  cooled  and  crude  product  was  filtered  off,  washed  with  petroleum  ether,  dried  and  recrystallized from dimethylformamide to give a solid product,  in  49%  yield,  identical  in  all  aspects  (mp,  mixed  mp  and  IR  data) to that obtained above from method A.     2.2.4. Synthesis of 3­amino­5­phenyl­6­(p­tolylazo thieno  [2,3­d]pyrimidin­4(3H)­one (4b)    A mixture  of 3  (0.005 mol),  hydrazine  hydrate  (0.05 mol,  2.5 mL) and absolute ethanol (12 mL) was refluxed for 8 h. The  precipitate,  formed  after  cooling  overnight,  was  collected  by  filtration and washed with cold alcohol. Recrystallization from  methanol  gave  the N‐amino  compound 4b  as  an  orange  solid  (0.74 g; 41%). M.p.: 202‐204 C. IR (ν/cm‐1): 3316‐3204 (NH2),  3065 (CH arom), 2960, 2872 (CH aliph), 1672 (CO). 1H NMR (δ  ppm): 2.19 (s, 3H, Ar‐Me), 7.28‐7.69 (m, 9H, PhH, ArH), 5.20 (s,  2H, NH2, D2O‐exchangeable), 8.07 (s, 1H, pyrimidine H‐2). Anal.  Calcd.  for C19H15N5OS (361.420): C, 63.14; H, 4.18; N, 19.38; S,  8.87. Found: C, 62.89; H, 4.01; N, 19.18; S, 8.72.     2.2.5. Synthesis of ethyl 2­[4­oxo­5­phenyl­6­(p­tolylazo)  thieno[2,3­d]pyrimidin­3(4H)­yl]acetate (4c)     To  a  solution  of  compound  4a  (0.003  mol)  in  dimethylformamide  (20 mL),  anhydrous  potassium  carbonate  (0.006 mol)  was  added  and  the mixture was  stirred  at  room  temperature  for  15  min,  followed  by  the  addition  of  ethyl  chloroacetate  (0.0033  mol)  in  dimethylformamide  (10  mL).  Stirring  was  continued  at  room  temperature  overnight,  according  to  thin  layer  chromatographic  (TLC)  analysis.  And  then  ice/water mixture was  added  to  the  reaction mixture  to  form  a  precipitate,  which  was  collected  by  filtration,  washed  with  water,  dried  and  recrystallized  from  ethanol  to  obtain  compound 4c as colorless needles (0.78 g; 60%). M.p.: 186 C.  IR (ν/cm‐1): 3060 (arom CH), 2934 (aliph CH), 1734 (ester CO),  1680 (pyrimidine CO). 1H NMR (δ ppm): 1.30 (t, 3H, J = 7.5 Hz,  Gaber et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 115­123  117  ester Me), 2.37 (s, 3H, Ar‐Me), 4.13 (q, 2H, J = 7.5 Hz, ester CH2),  4.83 (s, 2H, NCH2CO), 7.30‐7.75 (m, 9H, PhH, ArH), 8.49 (s, 1H,  pyrimidine H‐2). 13C NMR  (δ ppm):  14.3  (ester Me),  21.0  (Ar‐ Me), 45.3 (NCH2), 61.4 (ester CH2), 119.1 (C‐4a), 125.3, 127.4,  128.2,  128.7,  129.5,  129.9,  132.3,  134.5,  138.5,  150.2  (C‐2),  152.5,  157.6  (C‐6,  C‐7a),  160.1  (pyrimidine  CO),  168.6  (ester  CO); Anal. Calcd. for C23H20N4O3S (432.495): C, 63.87; H, 4.66; N,  12.95; S, 7.41. Found: C, 63.65; H, 4.49; N, 12.76; S, 7.20.    2.2.6. Synthesis of ethyl 2­acetamido­4­phenyl­5­(p­tolylazo)  thiophene­3­carboxylate (5)    A  mixture  of  ortho‐aminoester 2c  (0.005  mol)  and  acetic  anhydride (2 mL) was refluxed for 1 h with constant stirring in  acetic  acid  (5 mL).  The mixture was  cooled  and  poured  over  iced water. The resulting precipitate was collected by filtration,  washed  with  water  and  dried.  The  residue  was  purified  by  recrystallization from acetic acid to obtain the acetamido ester  5 as a canary yellow solid  (0.63 g; 31%). M.p.: 191‐192 C.  IR  (ν/cm‐1):  3264  (NH),  3056  (arom CH),  2952‐2871  (aliph  CH),  1674, 1665 (2CO). 1H NMR (δ ppm): 1.18 (t, 3H, J = 7.2 Hz, ester  Me), 2.27 (s, 3H, Me), 2.39 (s, 3H, Me), 4.20 (q, 2H,  J = 7.2 Hz,  ester CH2), 7.37‐7.76 (m, 9H, PhH, ArH), 12.42 (s, 1H, NH, D2O‐ exchangeable). 13C NMR (δ ppm): 14.0 (ester Me), 21.6 (Ar‐Me),  23.5  (amide Me),  59.4  (ester CH2),  109.0,  125.1,  127.5,  128.3,  128.7, 129.3, 130.1, 131.2, 134.7, 138.6, 149.2, 152.8 (C‐2, C‐5),  166.3 (ester CO), 168.1 (amide CO). Anal. Calcd. for C22H21N3O3S  (407.485): C, 64.85; H, 5.19; N, 10.31; S, 7.87. Found: C, 64.62;  H, 4.99; N, 10.08; S, 7.71.    2.2.7. Synthesis of 3­amino­2­methyl­5­phenyl­6­(p­tolylazo)  thieno[2,3­d]pyrimidin­4(3H)­one (6)    This compound was synthesized from N‐acetyl derivative 5  (0.002  mol)  and  hydrazine  hydrate  (0.02  mol,  1  mL)  in  a  manner similar to that described for the synthesis of 4b. It was  purified  by  recrystallization  from  a  mixture  of  ethanol  and  water (4:1) to obtain compound 6 as a dark brown solid (0.44  g; 59%). M.p.: 241‐242 C. IR (ν/cm‐1): 3321, 3200 (NH2), 3036  (CH arom), 2940‐2861 (CH aliph), 1679 (CO); 1H NMR (δ ppm):  2.26,  2.45  (2s,  6H,  2Me),  5.02  (s,  br,  2H,  NH2,  D2O‐ exchangeable),  7.41‐7.78  (m,  9H,  PhH,  ArH).  Anal.  Calcd.  for  C20H17N5OS  (375.447):  C,  63.98;  H,  4.56;  N,  18.65;  S,  8.54.  Found: C, 63.76; H, 4.40; N, 18.45; S, 8.43.    2.2.8. Synthesis of 2­[4­oxo­5­phenyl­6­(p­tolylazo thieno  [2,3­d]pyrimidin­3(4H)­yl]acetohydrazide (7)    Hydrazine hydrate (0.015 mol) was added to a solution of  compound  4c  (0.003  mol)  in  absolute  ethanol  (25  mL).  The  reaction mixture was  refluxed  for  4  h,  concentrated  in  vacuo,  cooled  and  diluted  with  water.  The  obtained  precipitate  was  collected  by  filtration,  washed  with  cold  water,  dried  and  purified by recrystallization from an ethanol and water mixture  to give yellowish white crystals of the title compound 7 (0.82 g;  65%), M.p.: 210‐212 C. IR (ν/cm‐1): 3361‐3158 (NHNH2), 3062  (arom  CH),  2920  (aliph  CH),  1681  (pyrimidine  CO),  1657  (hydrazide CO). 1H NMR (δ ppm): 2.32 (s, 3H, Ar‐Me), 4.45 (s,  2H,  NH2,  D2O‐exchangeable),  4.64  (s,  2H,  NCH2CO),  7.33‐7.71  (m, 9H, PhH, ArH), 8.43 (s, 1H, pyrimidine H‐2), 9.50 (s, 1H, NH,  D2O‐exchangeable). Anal.  Calcd.  for  C21H18N6O2S  (418.472):  C,  60.27;  H,  4.34;  N,  20.08;  S,  7.66.  Found:  C,  60.03;  H,  4.15;  N,  19.86; S, 7.52.          2.2.9. Synthesis of 2­{2­[4­oxo­5­phenyl­6­(p­tolylazo)thieno  [2,3­d]pyrimidin­3(4H)­yl]acetyl}­N­phenylhydrazine  carbothioamide (8)    A  solution  containing  carbohydrazide  7  (0.003  mol)  and  phenyl  isothiocyanate  (0.003  mol),  in  ethanol  (20  mL),  was  heated at reflux for 2 h and then cooled at room temperature.  The formed precipitate was collected by filtration, washed with  water,  dried.  Recrystallization  from  ethanol  gave  the  thiosemicarbazide 8  as  a  reddish  brown  solid  (0.85  g;  51%),  M.p.:  232‐233  C.  IR  (ν/cm‐1):  3300‐3175  (3NH),  3062  (arom  CH),  2926  (aliph  CH),  1681  (pyrimidine  CO),  1667  (thiosemicarbazide CO). 1H NMR (δ ppm): 2.31 (s, 3H, Ar‐Me),  4.71  (s,  2H, NCH2CO), 6.97‐7.62  (m, 14H, 2PhH, ArH), 8.45  (s,  1H,  pyrimidine  H‐2),  9.65,  9.80  (2s,  2H,  NHCSNH,  D2O‐ exchangeable),  10.61  (s,  1H,  CONH,  D2O‐exchangeable). Anal.  Calcd. for C28H23N7O2S2 (553.658): C, 60.74; H, 4.19; N, 17.71; S,  11.58. Found: C, 60.49; H, 3.96; N, 17.52; S, 11.42.    2.2.10. Synthesis of 5­phenyl­3­[(5­phenylamino­1,3,4­ thiadiazol­2­yl)methyl]­6­(p­tolylazo)thieno[2,3­ d]pyrimidin­4(3H)­one (9)    To 0.003 mol of thiosemicarbazide, 8, concentrated sulfuric  acid  (5 mL) was  added  dropwise.  The mixture was  stirred  at  room  temperature  for  30  min.  The  reaction  mixture  was  poured over  ice/water mixture with stirring. The precipitated  solid was filtered off, washed with sodium carbonate solution,  followed  by  water  and  recrystallized  from  ethanol  to  obtain  compound 9 as  a  yellow  solid  (0.85  g;  53%), M.p.:  265  C.  IR  (ν/cm‐1):  3240  (NH),  3076  (arom CH),  2924  (aliph  CH),  1680  (CO). 1H NMR (δ ppm): 2.28 (s, 3H, Ar‐Me), 4.99 (s, 2H, NCH2),  6.95‐7.58  (m,  14H,  2PhH,  ArH),  8.50  (s,  1H,  pyrimidine  H‐2),  10.52  (s,  1H,  NH,  D2O‐exchangeable).  13C  NMR  (δ  ppm):  20.9  (Ar‐Me), 45.7 (NCH2), 117.5, 118.9, 122.8, 125.2, 127.7, 128.1,  128.6,  129.0,  129.6,  130.1,  132.5,  134.6,  138.5,  140.2,  149.8,  152.4  (C‐2,  C‐6),  155.1  (thiadiazole  C‐2),  157.5  (C‐7a),  160.9  (pyrimidine  CO),  165.0  (thiadiazole  C‐5).  Anal.  Calcd.  for  C28H21N7OS2  (535.643):  C,  62.78;  H,  3.95;  N,  18.30;  S,  11.97.  Found: C, 62.54; H, 3.81; N, 18.08; S, 11.78.    2.2.11. Synthesis of 5­phenyl­3­[(4­phenyl­5­thioxo­4,5­ dihydro­1H­1,2,4­triazol­3­yl)methyl]­6­(p­ tolylazo)thieno[2,3­d]pyrimidin­4(3H)­one (10)    Compound  8  (0.005  mol)  was  dissolved  in  ethanolic  solution  of  sodium hydroxide  (20 mL,  4%)  and  stirred  under  reflux  for  5  h.  The  resulting  solution was  cooled  and  filtered.  The filtrate was acidified with dilute hydrochloric acid and was  kept aside for 1 h. The separated solid product was collected by  filtration,  washed  repeatedly  with  water,  dried  and  recrystallized from a mixture of dimethylformamide and water  to  obtain  brown  crystals  of  the  thione  derivative  10  (0.80  g;  30%). M.p.:  249‐250  C.  IR  (ν/cm‐1):  3192  (NH),  3072  (arom  CH), 2924 (aliph CH), 1680 (CO), 1186 (CS). 1H NMR (δ ppm):  2.28  (s,  3H,  Ar‐Me),  5.08  (s,  2H,  NCH2),  6.64‐7.56  (m,  14H,  2PhH, ArH), 8.47 (s, 1H, pyrimidine H‐2), 13.75 (s, 1H, NH, D2O‐ exchangeable).  13C  NMR  (δ  ppm):  21.2  (Ar‐Me),  48.6  (NCH2),  119.2,  125.4,  127.6,  127.9,  128.4,  128.8,  129.2,  129.7,  130.0,  132.3, 133.2, 134.0, 134.8, 138.7, 148.0 (triazoline C‐3), 150.1  (C‐2),  152.5,  157.3  (C‐6,  C‐7a),  160.5  (pyrimidine  CO),  171.6  (triazoline CS). Anal. Calcd. for C28H21N7OS2 (535.643): C, 62.78;  H, 3.95; N, 18.30; S, 11.97. Found: C, 62.61; H, 3.74; N, 18.12; S,  11.74.        118  Gaber et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 115­123    2.2.12. Synthesis of 3­{5­(N­acetyl­N­phenylamino)­1,3,4­ thiadiazol­2­yl]methyl}­5­phenyl­6­(p­tolylazo)thieno[2,3­ d]pyrimidin­4(3H)­one (11)    A  mixture  of  thiadiazole  9  (0.001  mol)  in  5  mL  acetic  anhydride was heated at reflux for 1 h. The mixture was diluted  with 30 mL of cold water, and the precipitate was  filtered off,  washed  with  water  and  dried.  The  residue  was  purified  by  recrystallization from 1,4‐dioxane to obtain N‐phenylacetamide  derivative 11 as a brown solid (0.47 g; 82%). M.p.: 227‐228 C.  IR  (ν/cm‐1):  3075  (arom  CH),  2940‐2865  (aliph  CH),  1686  (amide CO), 1679 (pyrimidine CO). 1H NMR (δ ppm): 2.25, 2.51  (2s,  6H,  2Me),  5.05  (s,  2H,  NCH2),  7.35‐7.67  (m,  14H,  2PhH,  ArH), 8.47 (s, 1H, pyrimidine H‐2). Anal. Calcd. for C30H23N7O2S2  (577.679): C, 62.37; H, 4.01; N, 16.97; S, 11.10. Found: C, 62.13;  H, 3.79; N, 16.82; S, 10.92.    2.2.13. Synthesis of 3­(benzylideneamino)­5­phenyl­6­(p­ tolylazo)thieno[2,3­d]pyrimidin­4(3H)­one (12)    2.2.13.1. Method A    To  a  solution  of  equimolar  amounts  (0.003  mol)  of  compound 4b  and benzaldehyde  in absolute ethanol  (15 mL),  two  drops  of  glacial  acetic  acid  were  added.  The  reaction  content  was  heated  at  reflux  for  4  h.  After  cooling  to  room  temperature,  the  resulting  solid  product  was  collected  by  filtration,  dried  and  recrystallized  from  a  mixture  of  ethanol  and  dimethylformamide  (2:1)  to  give  the  respective  condensation product 12 as a dark brown solid (0.61 g; 45%),  M.p.: > 300 C.  IR  (ν/cm‐1): 3048 (arom CH), 2950 (aliph CH),  1673 (CO). 1H NMR (δ ppm): 2.30 (s, 3H, Ar‐Me), 7.32‐7.76 (m,  14H,  2PhH,  ArH),  8.29  (s,  1H,  pyrimidine  H‐2),  8.75  (s,  1H,  N=CH). Anal. Calcd. for C26H19N5OS (449.527): C, 69.47; H, 4.26;  N, 15.58; S, 7.13. Found: C, 69.30; H, 4.02; N, 15.36; S, 6.95.    2.2.13.2. Method B    The  same  product  was  synthesized  from  compound  14  (0.001 mol) and DMFDMA (0.0012 mol) in a manner similar to  that described before  for  the synthesis of compound 3.  It was  recrystallized from an ethanol and dimethylformamide mixture  (2:1)  to  give  a  solid  product,  in  79%  yield,  identical  in  all  aspects  (mp,  mixed  mp  and  IR  data)  to  that  obtained  above  from method A.    2.2.14. Synthesis of 2­amino­4­phenyl­5­(p­tolylazo)  thiophene­3­carbohydrazide (13)     The same experimental procedure described before for the  synthesis of compound 7 was followed except using compound  2c  (0.003  mol)  instead  of  4c.  Recrystallization  from  ethanol  gave  the corresponding aminocarbohydrazide 13 as a  reddish  brown  crystals  (0.79  g;  75%).  M.p.:  174­175  C.  IR  (ν/cm‐1):  3410‐3182 (NH, NH2), 3035 (arom CH), 2922 (aliph CH), 1659  (CO).  1H  NMR  (δ  ppm):  2.27  (s,  3H,  Ar‐Me),  4.30  (s,  2H,  NH2  carbohydrazide,  D2O‐exchangeable),  6.92  (s,  2H,  NH2,  D2O‐ exchangeable),  7.35‐7.70  (m,  9H,  PhH,  ArH),  9.17  (s,  1H,  NH,  D2O‐exchangeable).  Anal.  Calcd.  for  C18H17N5OS  (351.425):  C,  61.52;  H,  4.88;  N,  19.93;  S,  9.12.  Found:  C,  61.27;  H,  4.74;  N,  19.69; S, 9.01.    2.2.15. Synthesis of amino­N'­benzylidene­4­phenyl­5­(p­ tolylazo)thiophene­3­carbohydrazide (14)    Synthesis  of  compound  14 was  carried  out  by  the  same  method as described before for compound 12. Recrystallization  from  acetic  acid  gave  the  corresponding  benzylidene  carbohydrazide 14  as a yellow solid  (0.83 g; 63%). M.p.: 256‐ 258  C.  IR  (ν/cm‐1):  3453‐3178  (NH,  NH2),  3044  (arom  CH),  2936 (aliph CH), 1668 (CO). 1H NMR (δ ppm): 2.27 (s, 3H, Ar‐ Me),  6.76  (s,  2H,  NH2,  D2O‐exchangeable),  7.32‐7.79  (m,  14H,  2PhH,  ArH),  8.10  (s,  1H,  N=CH),  11.06  (s,  1H,  NH,  D2O‐ exchangeable). Anal. Calcd. for C25H21N5OS (439.532): C, 68.32;  H, 4.82; N, 15.93; S, 7.30. Found: C, 68.09; H, 4.64; N, 15.73; S,  7.22.    2.2.16. Synthesis of 3­[(dimethylamino)methyleneamino]­5­ phenyl­6­(p­tolylazo)thieno[2,3­d]pyrimidin­4(3H)­one  (15a)     This  compound  was  obtained  using  compound  4b  in  a  manner  similar  to  that  described  before  for  the  synthesis  of  compound 3.  It was recrystallized from dimethylformamide to  give  the  corresponding  amidine  15a  (0.94  g,  45%).  Alternatively,  the  same  product  was  obtained,  in  49%  yield,  from  aminocarbohydrazide  13  (0.001  mol)  and  DMF‐DMA  (0.0024 mol)  following  the  same procedure  as  that  of 3.  This  compound was obtained as an orange solid, M.p.: 181­182 C.  IR (ν/cm‐1): 3040 (arom CH), 2942‐2860 (aliph CH), 1674 (CO).  1H NMR (δ ppm): 2.32 (s, 3H, Ar‐Me), 2.96, 3.03 (2s, 6H, NMe2),  7.40‐7.73  (m,  9H,  PhH, ArH),  7.94  (s,  1H,  amidine‐H),  8.27  (s,  1H, pyrimidine H‐2); Anal. Calcd.  for C22H20N6OS (416.499): C,  63.44;  H,  4.84;  N,  20.18;  S,  7.70.  Found:  C,  63.24;  H,  4.71;  N,  19.97; S, 7.61.    2.2.17. Synthesis of 3­[(Ethoxymethylene)amino]­5­phenyl­6­ (p­tolylazo)thieno[2,3­d]pyrimidin­4(3H)­one (15b)     A  mixture  of  compound  4b  (0.003  mol)  and  triethyl  orthoformate (1.5 mL, 0.009 mol), was heated at reflux in acetic  anhydride  (10  mL)  for  6  h.  The  reaction  mixture  was  evaporated under reduced pressure and the viscous mass was  treated with ether or petroleum ether (5 mL). The precipitated  solid  product  was  collected  by  filtration  and  dried.  Recrystallization from ethanol gave pale brown crystals of  the  N‐ethoxymethylene derivative 15b (0.63 g; 50%). M.p.: 150 C.  IR (ν/cm‐1): 3040 (arom CH), 2957‐2874 (aliph CH), 1675 (CO).  1H NMR (δ ppm): 1.20 (t, 3H, J = 7.3 Hz, ethoxy Me), 2.31 (s, 3H,  Ar‐Me), 4.33  (q, 2H,  J  = 7.3 Hz, OCH2), 7.37‐7.73  (m, 9H, PhH,  ArH), 8.15 (s, 1H, methylenic CH), 8.31 (s, 1H, pyrimidine H‐2).  Anal.  Calcd.  for  C22H19N5O2S  (417.484):  C,  63.29;  H,  4.59;  N,  16.78; S, 7.68. Found: C, 63.07; H, 4.40; N, 16.62; S, 7.53.     2.2.18. Synthesis of 3­(formylamino)­5­phenyl­6­(p­tolylazo)  thieno[2,3­d]pyrimidin­4(3H)­one (18)    Compound 4b  (0.002 mol) was  heated  at  reflux  in  formic  acid  (10 mL)  for  7  h.  The  reaction mixture  was  then  diluted  with cold water and allowed to stand overnight. The resulting  precipitate was filtered off, washed with ethanol (20 mL), dried  and  recrystallized  from  a  mixture  of  1,4‐dioxane  and  dimethylformamide (3:1) to give the formyl derivative 18 (0.56  g;  72%).  Alternatively,  the  same  product  was  obtained,  in  a  comparable  yield,  using  compound  13  instead  of  4b.  This  compound was obtained as a dark brown solid, M.p.: > 300 C.  IR (ν/cm‐1): 3300 (NH), 3061 (CH arom), 2953 (CH aliph), 1720  (HCO), 1680  (CO  ring).  1H NMR  (δ ppm):  2.21  (s,  3H, Ar‐Me),  7.29‐7.68 (m, 9H, PhH, ArH), 8.07 (s, 1H, pyrimidine H‐2), 8.46  (s, 1H, CHO), 10.95 (s, 1H, NH, D2O‐exchangeable). Anal. Calcd.  for C20H15N5O2S (389.430): C, 61.68; H, 3.88; N, 17.98; S, 8.23.  Found: C, 61.49; H, 3.67; N, 17.84; S, 8.06.    2.2.19. Reaction of 15a,b with hydrazine hydrate    To a solution of either 15a or 15b (0.001 mol), in methanol  (20 mL),  hydrazine  hydrate  (0.0025 mol) was  added  and  the  reaction  content was  then  stirred  under  reflux  for  2‐4  h.  The  reaction  mixture  was  cooled  and  diluted  with  a  three‐fold  amount of water and the precipitate was filtered off, dried and  Gaber et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 115­123  119  recrystallized  from  methanol  to  give,  in  each  case,  a  solid  product  in  69‐77%  yield,  identical  in  all  respects  (mp, mixed  mp and IR data) to the N‐amino compound 4a.     2.3. Antimicrobial Assay    The preliminary antimicrobial activity was investigated on  a  dozen  of  newly  synthesized  thienopyrimidin‐4‐one  derivatives  having  different  groups  in  position  3  in  order  to  increase  the  selectivity  of  these  derivatives  towards  test  microorganisms.  The  antimicrobial  profile  was  tested  against  three  Gram‐positive  bacteria  species  (Bacillus  subtilis,  Staphylococcus  aureus,  Streptococcus  faecalis),  three  Gram‐ negative  bacteria  species  (Escherichia  coli,  Neisseria  gonorrhoeae,  Pseudomonas  aeruginosa),  two  moulds  (Aspergillus  flavus, Aspergillus niger)  and  four yeasts  (Candida  albicans,  Candida  parapsilosis,  Candida  tropicalis,  Saccharomyces  cerevisiae)  using  a  modified  Kirby‐Bauer  disc  diffusion method [20]. Briefly, 100 µl of the test bacteria/fungi  were grown in 10 mL of fresh media until they reached a count  of approximately 108 cells/mL for bacteria or 105 cells/mL for  fungi [21]. One hundred µl of microbial suspension was spread  onto agar plates corresponding to the broth in which they were  maintained.  Isolated colonies of each organism that might be playing a  pathogenic  role  should  be  selected  from  primary  agar  plates  and  tested  for  susceptibility  by disc  diffusion method  [22]. Of  the  many  media  available,  National  Committee  for  Clinical  Laboratory  Standards  (NCCLS)  recommends  Mueller‐Hinton  agar  as  it  results  in  good  batch‐to‐batch  reproducibility.  Disc  diffusion  method  for  filamentous  fungi  was  tested  by  using  approved  standard method  (M38‐A)  developed  by  the NCCLS  [23]  for  evaluating  the  susceptibilities  of  filamentous  fungi  to  antifungal  agents.  Disc  diffusion  method  for  yeasts  was  developed  by  using  approved  standard  method  (M44‐P)  according to reference [24]. The plates were incubated at 25 oC  for 48 h for fungi such as Aspergillus flavus and at 35‐37 oC for  24‐48  h  for  bacteria  such  as  Staphylococcus  aureus,  Bacillus  subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeuroginosa, whereas for  yeast such as Candida albicans they were incubated at 30 oC for  24‐48  h.  The  resulting  inhibition  zone  diameters  (IZDs) were  measured  in  millimeters  and  used  as  criterion  for  the  antimicrobial  activity  [20].  The  size  of  the  clear  zone  is  proportional  to  the  inhibitory  action  of  the  compound  under  investigation.  Standard  discs  of  the  bactericide  Tetracycline  and  the  fungicide  Amphotericin  B  served  as  positive  controls  for  antimicrobial activity but filter discs impregnated with 10 µl of  solvent  (distilled  water,  chloroform,  DMSO)  were  used  as  a  negative  control. The agar used  is Meuller‐Hinton agar  that  is  rigorously tested for composition and pH. Further the depth of  the  agar  in  the  plate  is  a  factor  to  be  considered  in  the  disc  diffusion  method.  This  method  is  well  documented  and  standard  zones  of  inhibition  have  been  determined  for  susceptible and resistant values. Blank paper disks (Schleicher  & Schuell, Spain) with a diameter of 8.0 mm were impregnated  with  10µl  of  the  tested  concentration  of  the  stock  solutions.  When a filter paper disc impregnated with a tested chemical is  placed on agar the chemical will diffuse  from the disc  into the  agar.  This  diffusion  will  place  the  chemical  in  the  agar  only  around the disc. The solubility of the chemical and its molecular  size will determine the size of the area of chemical  infiltration  around the disc. If an organism is placed on the agar it will not  grow  in  the  area  around  the  disc  if  it  is  susceptible  to  the  chemical. This area of no growth around the disc is known as a  "Zone of  inhibition" or "Clear zone". For the disc diffusion, the  zone  diameters  were  measured  with  slipping  calipers  of  the  National  Committee  for  Clinical  Laboratory  Standards  [22].  Agar‐based  methods  such  as  Etest  and  disk  diffusion  can  be  good  alternatives  because  they  are  simpler  and  faster  than  broth‐based methods [25].  Solvent controls (DMF) were included in every experiment  as  negative  controls.  DMF  was  used  for  dissolving  the  crude  extracts and showed no inhibition zones, confirming that it has  no influence on growth of the tested microoganisms.    3. Results and Discussion  3.1. Chemistry    The  starting material  ethyl  2‐amino‐4‐phenylthiophene‐3‐ carboxylate (1) was obtained according to the Gewald method  [18]. Coupling reaction of compound 1 with diazotized aniline,  p‐chloroaniline  and  p‐toluidine,  respectively,  led  to  the  corresponding  arylazo  derivatives, 2a­c.  Aminoformylation  of  p‐tolylazo derivative, 2c, with DMF dimethylacetal (DMF‐DMA)  provided  the  desired  N,N‐dimethylformamidine,  3,  whose  structure was confirmed from its 1H NMR spectrum. Thus,  the  spectrum  of  3  displayed  the  anticipated  signals  from  sp3  carbons of  the ethyl ester group at δH 1.25 and 4.23 ppm, and  signals from dimethylamino group at δH 2.79 and 2.89 ppm. In  the downfield region of the spectrum, the resonance at δH 8.87  ppm was due to a formamidinic proton. The 13C NMR spectrum  of  the  reaction  product  provided  further  evidence  for  the  proposed  structure,  where  sp3  carbons  of  the  ester  group  resonated  at  δC  13.9  and  59.8  ppm  as  well  as  signals  for  amidine  and  ester  carbonyl  carbons,  detected  at  δC 155.2  and  166.1  ppm,  respectively.  The  remaining  carbons  were  also  observed  at  the  expected  regions.  Compound  3  was  readily  cyclized  to  the  corresponding  thieno[2,3‐d]pyrimidin‐4‐one  derivative, 4a, on reflux in a mixture of ammonium acetate and  glacial  acetic  acid.  It  is  worth  mentioning  that  compound  4a  could  be  also  obtained  directly  by  reacting  ortho‐aminoester,  2c, with formamide. Compound 4a prepared by the latter route  was  found  to  be  identical  to  that  obtained  by  the  former  method as evidenced by TLC analysis, m.p., mixed m.p. and IR  data. Treating amidine, 3, with hydrazine hydrate led to closure  of  the pyrimidine ring and accordingly  led  to  the  formation of  anothor bicyclic thieno[2,3‐d]pyrimidine, 4b (Scheme 1).  Typical  for  the  established  alkylation  of  3‐unsubstituted‐ thienopyrimidin‐4‐ones [26‐28], compound 4a reacted readily  with ethyl  chloroacetate  in DMF  in  the presence of potassium  carbonate  to  afford  the  target  N‐alkylated  product,  4c.  All  spectroscopic data fitted perfectly with the proposed structure  4  (see Experimental  section). Acylation of  the amino group  in  compound  2c  with  acetic  anhydride  yielded  the  acetamidoester,  5.  Heterocyclization  to  the  thienopyrimidine  ring  system  was  carried  out  by  heating  5  at  reflux  in  an  alcoholic  solution  of  hydrazine  hydrate  to  afford  the  2‐ methylpyrimidin‐4‐one derivative 6 (Scheme 1).  Treatment of compound 4c with excess hydrazine hydrate  resulted in the formation of the acetohydrazide, 7 (Scheme 2).  When  compound 7 was  treated with phenyl  isothiocyanate,  it  produced  the  acetyl‐N‐phenylhydrazinecarbothioamide  derivative,  8.  Cyclodehydration  of  the  3‐side  chain  of  compound  8  with  concentrated  sulfuric  acid  led  to  a  single  product with the molecular formula of C28H21N7OS2, which may  be formulated as thiadiazole, 9, or triazoline, 10. The CO band,  present  in  the  IR  spectrum  of  8,  was  not  detectable  for  the  isolated  product,  demonstrating  the  disappearance  of  this  group  on  ring  closure.  Both  elemental  analysis  and molecular  ion  peak  data  are  not  supportive  for  discrimination  between  the two isomeric structures 9 and 10. However, the structure of  the isolated product was considered to be thiadiazole structure,  9,  rather  than  the  other  possible  isomeric  structure  10  as  evidenced  by  spectroscopic  investigations,  beside  a  chemical  proof.  In  the  1H  NMR  spectrum  of  the  reaction  product,  the  signal associated with the NH proton appeared at a higher field,   120  Gaber et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 115­123      Scheme 1    typically at δH 10.52 ppm as a singlet which disappeared upon  addition of deuterium oxide. Such an upfield NH resonance is in  complete  agreement  with  the  thiadiazole  structure  9  rather  than with  the  triazoline structure 10,  for which the  thioamide  NH  proton  would  be  expected  to  be  deshielded  due  to  the  adjacent thione group. As a result, the isomeric structure 10, if  isolated, would be expected to display a downfield shift for the  thioamide  NH  proton,  typically  in  the  range  of  δH  ca.  13.00‐ 14.00 ppm as reported by different authors in similar protocols  [29‐36]. The lack of signals arising from the thione function in  the downfield region at δC value above 169 ppm [36‐39], in the  13C  NMR  spectrum  of  the  product  isolated  from  the  studied  reaction,  is  also  evidence  in  favor  of  the  structure  9.  On  the  basis of  such data,  it  is not unreasonable  to  conclude  that  the  studied reaction is completely regioselective and the structure  of  the  isolated  product  is  thiadiazole  9;  the  alternative  cyclization  direction  to  the  corresponding  triazoline  10  is  therefore  discarded.  The  preferred  formation  of  thiadiazole  ring under such acidic conditions could be explained by the loss  of  nucleophilicity  of  N‐4  of  the  carbothioamide  moiety  as  a  result of its protonation or by the higher nucleophilicity of the  sulfur atom in this N‐phenylthiourea‐type group and proceeds  by  nucleophilic  attack  by  the  sulfur  atom  on  the  acyclic  carbonyl  carbon,  followed  by  elimination  of  water  [40].  Therefore, 5‐phenylaminothiadiazole 9 was isolated as the sole  product (Scheme 2).  In  support of  this hypothesis,  the  alternative  structure 10  could  be  successfully  obtained  from  the  cyclodehydration  of  acetylhydrazinecarbothioamide, 8,  in boiling ethanolic  sodium  hydroxide solution at reflux. The configuration of the resulting  triazoline  derivative,  10,  is  worth  a  special  mention.  Both  IR  and NMR spectra were informative in establishing structure 10.  Its IR spectrum have important absorption bands at ν 3192 and  1186  cm‐1  belonging  to  stretching  vibrations  of  NH  and  CS  groups,  respectively.  The  absorption  bands  associated  with  other  functional  groups  appeared  in  the  expected  regions.  In  the  1H NMR  spectrum of 10,  a  signal  for  the  triazoline CS‐NH  proton  was  observed  to  be  shifted  downfield  to  13.75  ppm.  This  downfield  shift  of  NH  proton  in  this  reaction  product  as  compared to the corresponding NH proton in compound 9 can  be  rationalized  on  the  basis  of  the  deshielding  effect  of  the  adjacent  CS  group,  thus  establishing  the  thione  structure, 10,  [29‐35]. Conclusive evidence for the proposed structure 10 was  provided  by  13C  NMR  spectrum  of  the  isolated  product,  in  which an important signal at δC 171.6 ppm was detected. Such a  lowfield signal can be assigned only to the thioamide CS carbon  atom, which was reported to appear around that chemical shift  value  [37‐39].  It  is worthwhile  to  report  here  that  compound  10 was  observed  to  exist mainly  in  the  thione  form  as  its  IR  spectrum revealed no absorption band at around ν 2600‐2550  cm‐1, which  is  indicative of  thiol  form [32‐34, 41].  In addition,  the absence of the signal due to the SH proton that resonates in  the  range  of  1.6‐4.0  ppm,  in  the  1H  NMR  spectrum  of  10,  provided confirmatory evidence  for  thione  formation [32, 36].  This alternative mode of cyclization into a triazoline ring under  such  alkaline  conditions  may  be  due  to  the  enhanced  nucleophilicity  of  N‐4  of  the  carbothioamide  moiety  towards  the attack on the carbonyl carbon and subsequent dehydration  to give thione derivative 10 as the sole isolated product [40].  Compound  9  was  well  illustrated  as  it  afforded  the  acetylated  thiadiazole  derivative,  11,  by  a  nucleophilic  acetylation reaction of 5‐aminophenyl derivative, 9, with acetic  anhydride. This chemical transformation gives added proof for  the  proposed  structure,  besides  the  spectroscopic  evidence.  Notably, the latter products, 9­11, presented in Scheme 2 seem  to  be  of  significant  interest  for  antimicrobial  investigations,  since  the antimicrobial profile of 1,2,4‐triazoline‐3‐thione [31‐ 35,41‐43]  and  1,3,4‐thiadiazole  [32,43‐47]  derivatives  is  well  explored in the literature.  As  expected,  condensation  of  the  N‐amino  compound  4b  with  benzaldehyde  furnished  the  corresponding  benzylideneamino  derivative,  12  (Scheme  3).  Another  synthesis of 12 was achieved via an alternative synthetic route  involving  the  reaction  of  aminoester,  2c,  with  hydrazine  hydrate  to  give  the  aminocarbohydrazide  13,  which  on  subsequent  treatment  with  benzaldehyde  yielded  the  acyclic  condensation product 14. A  further  reaction of 14 with DMF‐ DMA  led  to  a  product  (79%  yield)  that  was  identified  as  12  according  to TLC analysis, m.p., mixed m.p.  and  IR data of  the  isolated  material.  Also,  amidation  reaction  of  compound  4b  with  DMF‐DMA  gave  the  corresponding  amidine  15a  while  with  triethyl  orthoformate,  the N‐ethoxymethylene derivative,  15b, was  formed.  Alternatively,  compound 15a  could  be  also  obtained by reacting aminocarbohydrazide, 13, with an excess  of DMF‐DMA. Elucidation of  structures  for  the  latter  products  was  established  on  the  basis  of  elemental  and  spectroscopic  analyses in each case (see Experimental section).  Unexpectedly,  the  attempted  cyclization  of  15a,b  with  hydrazine  hydrate  did  not  give  the  target  tetrazine,  17,  but  instead  the N‐amino  compound, 4b, was  isolated  as  indicated  from TLC analysis, m.p., mixed m.p. and IR data of the reaction  product.  This  result  could  be  explained  by  assuming  the  formation of adduct 16 as a  first step. Subsequent elimination  of  ethyl  formohydrazonate  or  N,N‐dimethylformohydrazon  amide  gives  back  the  original  amino  derivative,  4b.  This  observation  is  supported  by  previous  reports  in  the  recent   Gaber et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 115­123  121    Scheme 2       Scheme 3      literature  concerning  similar  transamination  of  the  amidine  [48,49]  and  imino  ether  [50‐52]  moieties.  Reaction  of  compound 4b with formic acid provided a reaction product for  which the 3‐formylamino structure 18 was established on the  basis of  its  analytical and spectroscopic data. The structure of  the  product  18  was  further  established  by  an  independent  synthesis  of  the  same  product  via  heating  aminocarbo‐  hydrazide, 13, with formic acid (Scheme 3).      3.2. Antimicrobial Evaluation    The results of testing for antibacterial and antifungal effects  are summarized  in Tables 1 and 2. As shown by these results,  the new thienopyrimidinones tested displayed variable in vitro  antibacterial  and  antifungal  actions.  In  general,  the  chemical  structure of  the whole molecule,  comprising  the nature of  the  heterocyclic  system  as  well  as  the  type  of  the  substituted  function  present  in  the  heterocyclic  ring  structure,  has  a  pronounced effect on antimicrobial activity. In particular, it has   122  Gaber et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 115­123    Table 1. In vitro antibacterial activity of test compounds.a  IZDb (mm)  Compound   Gram­negative Gram­positive  P. aeruginosaN. gonorrhoeae E. coliS. faecalis S. aureus B. subtilis  12 130.0159 134a  34 25332433 364b  34 29362433 334c 38 30362848 377  40 28433245 418  36 31363051 389  40 30382839 4010  30 26382539 3411  36 30382935 3712 37 25342433 3615a  34 28342931 3915b  36 32383138 3618  33 34323327 32Standardc  a DMF has no antibacterial activity at the concentration used to dissolve the test compounds.  b IZD: inhibition zone diameter.   c Standard for bacteria: Tetracycline.      Table 2. In vitro antifungal activity of test compounds.a  IZDb (mm)  Compound  S. cerevisiaeC. tropicalis C. parapsilosisC. albicans A. niger A. flavus  0.0 0.0 0.00.00.0 0.04a  0.0 0.0 0.00.00.0 0.04b  0.0 0.0 0.00.00.0 0.04c  9.0 0.0 9.00.010.0 0.07  0.0 0.0 0.00.00.0 0.08  0.0 0.0 0.00.00.0 0.09  9.0 13.0 0.010.00.0 0.010  14.0 0.0 0.015.00.0 0.011 0.0 0.0 0.00.00.0 0.012 0.0 0.0 0.00.00.0 0.015a  0.0 0.0 0.00.00.0 0.015b  0.0 0.0 0.00.00.0 0.018  10.0 12.0 13.018.012.0 16.0Standardc  a DMF has no antifungal activity at the concentration used to dissolve the test compounds.  b IZD: inhibition zone diameter.  c Standard for fungi: Amphotericin B.    been found that antimicrobial activity was relatively dependent  on the type of substituent in the 3‐position of pyrimidine ring.  It  was  observed  that  the  synthesized  compounds  substituted  with  a methylene moiety  in  the  3‐position  of  the  heterocyclic  nucleus favored the antibacterial activity especially against the  Gram‐positive strains. Replacement of the methylene moiety by  a  substituted  amino  moiety  diminished  the  antibacterial  activity slightly. On the contrary, there was no essential in vitro  antifungal  profile  of  the  test  compounds  against  moulds  and  yeasts.  Only  a  few  thienopyrimidin‐4‐ones  with  a  methylene  moiety  (compounds  7,  10  and  11)  revealed  poor  activity  against  the  test  fungi  isolates.  Based  on  the  biological  evaluation,  compounds 8 and 9 may be considered promising  for the development of new antibacterial agents.      4. Conclusion    In  summary,  we  have  demonstrated  in  the  present  study  that reactions of 3‐acetylhydrazine, 7, and N‐amino compound  4b  provide  an  easy  and  versatile  access  to  functionalized  thienopyrimidin‐4‐ones  of  significant  interest  for  biological  study.  The  biological  potential  of  the  new  thienopyrimidin‐4‐ one  derivatives  was  further  investigated  by  screening  their  antimicrobial  activity  against  six  pathogenic  bacteria  and  six  pathogenic  fungi.  Biological  study  of  the  compounds  under  investigation indicated that the most prominent and consistent  antimicrobial activity was obtained with compound 9 carrying  a methylene attached to thiadiazole moiety in the 3‐position of  the heterocycle. Its IZD value (51 mm) toward S. aureus is very  significant.  Compound  8  showed  an  appreciable  broad  spectrum  of  action  against  both  Gram‐positive  and  Gram‐ negative bacteria. In light of the results presented in this work  and  taking  into  account  that  this  preliminary  study  does  not  produce  conclusive  evidence  regarding  a  structure‐ antimicrobial  activity  relationship,  we  have  focused  our  attention  on  the  most  promising  compounds  8  and  9  as  an  interesting starting point for the development of a new class of  antibacterial  agents.  Further  optimization  and  structure‐ activity  relationships  (SAR)  of  these  type  of  heterocycles  are  well  underway.  We  believe  that  research  in  this  direction  should be encouraged  in order  to broaden  the applicability of  these  new  heterocyclic  frameworks  to  serve  as  leads  for  designing novel chemotherapeutic agents.     Acknowledgements    H. M. Gaber would  like  to  express his  sincere gratitude  to  the  School  of  Chemistry,  Cardiff  University,  U.K.,  for  a  Post‐ Doctoral  Research  Fellowship  grant  and  for  all  facilities  provided  to  this  fellowship.  Financial  support  from  Cardiff  University,  the  Engineering  and  Physical  Sciences  Research  Council (EPSRC) and the Biotechnology and Biological Sciences  Research Council (BBSRC), in collaboration with the University  of Wales College of Medicine, UK, is gratefully acknowledged.    References    [1]. Cohen, M. L. Nature 2000, 406, 762‐767.  [2]. Barrett, C. T.; Barrett, J. F. Curr. Opin. Biotechnol. 2003, 14, 621‐626.  [3]. Andrade,  S.  S.;  Jones,  R.  N.;  Gales,  A.  C.;  Sader,  H.  S.  J.  Antimicrob.  Chemother. 2003, 52, 140‐141.  [4]. Finch, R. Clin. Microbiol. Infect. 2002, 8 (3), 21‐32.  [5]. Daidone, G.; Maggio, B.; Schillaci, D. Pharmazie 1990, 45, 441‐442.  [6]. Franchini, C.; Muraglia, M.; Corbo, F.; Florio, M. A.; Mola, A. D.; Rosato,  A.; Matucci,  R.; Nesi, M.;  Bambeke,  F.  V.;  Vitali,  C. Arch. Pharm. Chem.  Life Sci. 2009, 342, 605‐613.  [7]. Balalaie,  S.;  Bararjanian, M.;  Rominger,  F.  J. Heterocyclic  Chem. 2006,  43, 821‐826.  [8]. Ram, V. J.; Vanden Berghe, D. A.; Vlietinck, A. J. Liebigs Ann. Chem. 1987,  797‐801.  Gaber et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 115­123  123  [9]. Wang,  Y.  D.;  Johnson,  S.;  Powell,  D.;  McGinnis,  J.  P.;  Miranda,  M.;  Rabindran, S. K. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 3763‐3766.  [10]. Duval, E.; Case, A.; Stein, R. L.; Cuny, G. D. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005,  15, 1885‐1889.  [11]. Dai, Y.; Guo, Y.; Frey, R. R.; Ji, Z.; Curtin, M. L.; Ahmed, A. A.; Albert, D. H.;  Arnold,  L.;  Arries,  S.  S.;  Barlozzari,  T.;  Bauch,  J.  L.;  Bouska,  J.  J.;  Bousquet, P. F.; Cunha, G. A.; Glaser, K. B.; Guo, J.; Li, J.; Marcotte, P. A.;  Marsh,  K.  C.;  Moskey,  M.  D.;  Pease,  L.  J.;  Stewart,  K.  D.;  Stoll,  V.  S.;  Tapang, P.; Wishart, N.; Davidsen, S. K.; Michaelides, M. R. J. Med. Chem.  2005, 48, 6066‐6083.  [12]. Azab, M. E. Phosphorus, Sulfur, and Silicon 2008, 183, 1766‐1782.  [13]. Chambhare, R. V.; Khadse, B. G.; Bobde, A. S.; Bahekar, R. H. Eur. J. Med.  Chem. 2003, 38, 89‐100.  [14]. El‐Sherbeny, M. A.; El‐Ashmawy, M. B.; El‐Subbagh, H.  I.;  El‐Emam, A.  A.; Badria, F. A. Eur. J. Med. Chem. 1995, 30, 445‐449.  [15]. Gaber, H. M.; Bagley, M. C. ChemMedChem 2009, 4, 1043‐1050.  [16]. Filichev,  V.  V.;  Gaber,  H.;  Olsen,  T.  R.;  Jørgensen,  P.  T.;  Jessen,  C.  H.;  Pedersen, E. B. Eur. J. Org. Chem. 2006, 17, 3960‐3968.  [17]. Gaber, H. M.; Elgemeie, G. E. H.; Ouf, S. A.; Sherif, S. M. Heteroat. Chem.  2005, 16, 298‐307.  [18]. Tormyshev, V. M.; Trukhin, D. V.; Rogozhnikova, O. Y.; Mikhalina, T. V.;  Troitskaya, T. I.; Flinn, A. Synlett. 2006, 16, 2559‐2564.  [19]. Gewald, K.; Gruner, M.; Hain, U.; Sueptitz, G. Monatsh. Chem. 1988, 119,  985‐992.  [20]. Bauer, A. W.; Kirby, W. W. M.; Sherris, J. C.; Turck, M. Am. J. Clin. Pathol.  1966, 45, 493‐496.  [21]. Pfaller, M. A.; Burmeister, L.; BartlettGhorab, M. A.; Rinaldi, M. G. J. Clin.  Microbiol. 1988, 26, 1437‐1441.  [22]. National  Committee  for  Clinical  Laboratory  Standards,  Antimicrobial  Susceptibility of Flavobacteria; Performance Vol 41, 1997.  [23]. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Reference Method  for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Conidium­Forming  Filamentous Fungi; Proposed Standard, NCCLS Document M38‐A; Wayne,  PA, USA, 2002.  [24]. National  Committee  for  Clinical  Laboratory  Standards,  Method  for  Antifungal  Disk  Diffusion  Susceptibility  Testing  of  Yeast;  Proposed  Guideline, NCCLS Document M44‐P; Wayne, PA, USA, 2003.  [25]. Matar, M. J.; Ostrosky‐Zeichner, L.; Paetznick, V. L.; Rodriguez, J. R.; Chen,  E.; Rex, J. H. Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 47, 1647‐1651.  [26]. Crespo, M.  I.;  Pagès,  L.;  Vega,  A.;  Segarra,  V.;  López,  M.;  Doménech,  T.;  Miralpeix, M.; Beleta, J.; Ryder, H.; Palacios, J. M. J. Med. Chem. 1998, 41,  4021‐4035.  [27]. Ahmed, E. Kh.; Sensfuss, U.; Habicher, W. D. J. Heterocyclic Chem. 1999,  36, 1119‐1122.  [28]. Abdel  Hafez,  A.  A.;  Kamal  El‐Dean,  A.;  Hassan,  A.  A.;  El‐Kashef,  H.  S.;  Rault, S.; Robba, M. J. Heterocyclic Chem. 1996, 33, 431‐438.  [29]. Küçükgüzel, İ.; Küçükgüzel, Ş. G.; Rollas, S.; Ötük‐Saniş, G.; Özdemir, O.;  Bayrak, I.; Altuğ, T.; Stables, J. P. IL Farmaco 2004, 59, 893‐901.  [30]. Oruç,  E.  E.;  Koçyigit‐Kaymakçioglu,  B.;  Oral,  B.;  Altunbas‐Toklu,  H.  Z.;  Kabasakal, L.; Rollas, S. Arch. Pharm. Chem. Life Sci. 2006, 339, 267‐272.  [31]. Wujec, M.; Kosikowska, U.; Paneth, P.; Malm, A. Heterocycles 2007, 71,  2617‐2626.  [32]. Gürsoy, A.; Demirayak, Ş.; Cesur, Z.; Reisch, J.; Ötük, G. Pharmazie 1990,  45, 246‐250.  [33]. Rollas,  S.;  Kalyoncuoğlu,  N.;  Sur‐Altiner,  D.;  Yeğenoğlu,  Y.  Pharmazie  1993, 48, 308‐309.  [34]. Ergenc, N.; Ilhan, E.; Ötük, G. Pharmazie 1992, 47, 59‐60.  [35]. Küçükgüzel,  S.  G.;  Rollas,  S.;  Erdeniz,  H.;  Kiraz,  M.  Eur.  J. Med.  Chem.  1999, 34, 153‐160.  [36]. Cho, N. S.; Kim, G. N.; Parkanyi, C. J. Heterocyclic Chem. 1993, 30, 397‐ 401.  [37]. Elmoghayar, M. R. H.; Ghali, E. A.; Ramiz, M. M. M.; Elnagdi, M. H. Liebigs  Ann. Chem. 1985, 1962‐1968.  [38]. Bartels‐Keith,  J. R.; Burgess, M. T.; Stevenson,  J. M.  J. Org. Chem. 1977,  42, 3725‐3731.  [39]. Pappalardo, S.; Bottino, F.; Tringali, C. J. Org. Chem. 1987, 52, 405‐412.  [40]. El‐Essawy, F. A.; Khattab, A. F.; Abdel‐Rahman, A. A.‐H. Monatsh. Chem.  2007, 138, 777‐785.  [41]. Shaker, R. M.; Mahmoud, A. F.; Abdel‐Latif, F. F. Phosphorus, Sulfur, and  Silicon 2005, 180, 397‐406.  [42]. Abdel‐Rahman, H. M.; Hussein, M. A. Arch. Pharm. Chem. Life Sci. 2006,  339, 378‐387.  [43]. Zou, X.; Jin, G. J. Heterocyclic Chem. 2001, 38, 993‐996.  [44]. Dogan,  H.  N.;  Duran,  A.;  Rollas,  S.;  Sener,  G.;  Uysal,  M.  K.;  Gülen,  D.  Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 2893‐2898.  [45]. Oruç,  E.  E.; Rollas,  S.; Kandemirli,  F.;  Shvets, N.; Dimoglo, A.  S.  J. Med.  Chem. 2004, 47, 6760‐6767.  [46]. Karakuş, S.; Rollas, S. IL Farmaco 2002, 57, 577‐581.  [47]. El‐Hawash, S. A. M.; Wahab, A. E. A. Arch. Pharm. Chem. Life Sci. 2006,  339, 437‐447.  [48]. Makarov, V. A.; Ryabova, O. B.; Alekseeva, L. M.; Shashkov, A. S.; Granik,  V. G. Chem. Heterocyclic Compds. 2003, 39, 238‐243.  [49]. Gad‐Elkareem, M.  A. M.;  Abdel‐Fattah,  A. M.;  Elneairy, M.  A.  A. Can.  J.  Chem. 2007, 85, 592‐599.  [50]. Abdel‐Rahman,  A.  E.;  Bakhite,  E.  A.;  Al‐Taifi,  E.  A.  J. Chem. Res. 2005,  461‐468.  [51]. Hassan, S. M.; Emam, H. A.; Abdelall, M. M. J. Chem. Res. (S), 2000, 544‐ 545; (M), 2000, 1301‐1315.  [52]. El‐Gaby, M. S. A.; Abdel‐Gawad, S. M.; Ghorab, M. M.; Heiba, H. I.; Aly, H.  M. Phosphorus, Sulfur, and Silicon 2006, 181, 279‐297.