Microsoft Word - European_Journal_of_Chemistry_1_2_2010_110_114_74 European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 110‐114    European Journal of Chemistry  ISSN 2153‐2249 (Print) / ISSN 2153‐2257 (Online)  2010 EURJCHEM  DOI:10.5155/eurjchem.1.2.110‐114.74        European Journal of Chemistry  Journal homepage: www.eurjchem.com          The cytotoxic activity of Linum grandiflorum leaves  Magdy Mostafa Desoky Mohammeda,b,*, Ming Chenc, Lin Zhaic and Nabaweya Ali Ibrahimb  a Danish Institute of Agricultural Sciences, Department of Food Science, Research Center Aarslev, Kirstinebjergvej 10, DK­5792 Aarslev, Denmark  b Pharmacognosy Department, National Research Center, Dokki­12311, Cairo, Egypt  c Department of Clinical Microbiology, University Hospital of Copenhagen (Rigshospitalet), Tagensvej 20, DK­2200 Copenhagen, Denmark  *Corresponding author at: Pharmacognosy Department, National Research Center, Dokki­12311, Cairo, Egypt. Tel.: +2­02­33371718; fax: +2­02­33370931.               E­mail address: melhenawy111@gmail.com (M.M.D. Mohammed).                ARTICLE INFORMATION    ABSTRACT Received: 8 March 2010  Received in revised form: 26 April 2010  Accepted: 3 May 2010  Online: 30 June 2010  KEYWORDS    The CHCl3 and MeOH fractions of the leaves of Linum grandiflorum, showed cytotoxic activity against EL4 (Murine Leukemia) cell line with IC50 = 60 and 250 g/mL respectively. Bioassay guided fractionation and isolation (BGFI) of the MeOH fraction resulted in the isolation of two new  cytotoxic  compounds  1  [luteolin  7‐O­α‐D‐(6```‐E‐feruloyl)glucopyranosyl  (1→2)‐β‐D‐ glucopyranoside]  and  6  [2‐[(3`‐isopropoxy‐O‐β‐D‐glucopyranosyl)oxy]‐2‐methylbutane nitrile] against EL4 with IC50 = 0.2 and 0.3 M/mL respectively, together with 2 [luteolin 7‐O­ β‐D‐glucopyranoside],  3  [vicenin‐1],  4  [vicenin‐2],  5  [vicenin‐3],  7  [linamarin],  8 [lotaustralin],  9  [neolinustatin],  and    10  [butan‐2‐O­β‐D‐glucopyranoside]  which  showed cytotoxicity against EL4 with IC50 = 0.2, 0.9, 0.8, 0.9, 0.4, 0.4, 0.2, 0.4 M/mL respectively. BGFI of the CHCl3 fraction revealed the isolation of three cytotoxic aryltetrahydronaphthalene‐type lignans  identified  as  11  [podophyllotoxin],  12  [deoxypodophylotoxin]  and  13  [5‐ methoxypodophyllotoxin] against EL4 with  IC50 = 0.2, 0.09 and 0.2 M/mL respectively. The isolated  compounds  were  structurally  elucidated  using  1D,  2D  NMR,  HR‐ESI‐MS,  and  HR‐ MALDI‐MS techniques.  Linum grandiflorum Desf.  Linaceae  Flavonoids glycosides  Cyanogenic glycosides  Lignans  Cytotoxicity  Murine Leukemia (EL4)    1. Introduction    It  is  well  known  that  natural  products  have  played  an  important  role  in  the  discovery  of  useful  antitumor  agents.  Especially,  clinically  relevant  anticancer  drugs  such  as  taxol,  camptothecin,  vinblastine  and  vincristine  were  discovered  from higher plants. Nonetheless, as exemplified by the frequent  morbidity and mortality associated with metastatic conditions,  there still, clearly a need for the discovery of new agents with  higher  clinical  efficacy  [1].  The Medicinal  herb  Linum  grandi­  florum  Desf.,  has  been  reported  in  the  folk  medicine  for  the  treatment  of  various  ailments  such  as  laxative &  expectorant,  treatment  of  mental  deficiencies  in  adults,  gonorrhoea  and  relieves pain. The seeds exhibited analgesic, emollient, pectoral  and  resolving,  while  the  flowers  exhibited  cardiotonic  and  nervine characterises. The crushed seed used for the treatment  of  ulceration  and  inflammations  [2],  and  its  mucilage  was  valuable  for  the  remedy  of  coughs,  cold  and  inflammation  of  urinary  organs.  Linum  species  have  long  history  of  folkloric‐ uses as antitumor agents for the treatment of different types of  cancer such as inflamed tumours, glandular tumours.etc [3]. As  part of our screening program for new anticancer agents from  natural sources, the CHCl3 and MeOH fractions of the leaves of  L.  grandiflorum,  (Linaceae)  were  found  to  exhibit  cytotoxic  activity  against  EL4  (Murine  Leukemia)  cell  line.  Bioassay‐ guided fractionation was undertaken using a standard high‐flux  anticancer‐drug screening method which led to the isolation of  five  flavonoids,  four  cyanogenic  glycosides  and  one  alkyl  glycoside  from  the  MeOH  fraction  together  with  three  aryltetrahydronaphthalene  lignans  isolated  from  the  CHCl3  fraction, which were all exhibited cytotoxic activity against EL4  (Murine Leukemia) cell line.  2. Experimental    2.1. General     The Infra red (IR) spectra were obtained (KBr‐DISK and/or  FILM/NaCl)  on  a  Perkin‐Elmer  1720  Infrared  Fourier  Transform  Spectrometer.  Ultraviolet  (UV)  spectra  were  measured  using  SHIMADZU  MPS‐2000.  1H,  13C  NMR,  1H−1H  COSY,  1H−13C  HETCOR,  DEPT  and  DIFNOE  spectra  were  obtained  using  a  pulse  sequence  supplied  from  Varian  VXR‐ Unity 300 and 200 MHz spectrometer  (in DMSO‐d6). Chemical  shifts  were  given  in  values  (ppm)  relative  to  trimethylsilane  (TMS) as an  internal  reference. High‐Resolution ESI‐MS, using  Nano‐electrospray  tandem  (MS/MS)  mass  spectrometry  on  a  hybrid  quadrupole  time‐of‐flight  (Q‐TOF)  MS  instrument  equipped  with  Protana's  Nano‐ESI  source  for  HRESI/MS  and  Nano‐spray  needles  from  Proxeon  (Applied  Biosystems/MDS  Sciex) (QSTAR, prototype, PE‐Sciex, Canada). Tandem (MS/MS)  spectra were interpreted using the programs BioMultiView (PE  Sciex,  Canada)  and  GPMAW  (Lighthouse  Data,  Denmark).  Collision  induced  dissociation  (CID)  spectra  were  obtained  using N2 in the collision cell, collision energies between 30–40  eV  (Elab).  ESI/MS  first  conducted  in  positive  mode  to  obtain  ionized  molecular  species,  then  tandem MS/MS  spectra  were  obtained  by  CID  of  the  [M  +  H]+  ion  [4,5].  The  sequence  ion  notations have been used, e.g. Y*  ion corresponding to the loss  of  an  internal  dehydrated  sugar  residue.  Subsequent  charge‐ remote  rearrangements  take  place  resulting  in  the Y0  and Y1  ions  [6,7].  High‐Resolution MALDIMS  spectrum was  recorded  on  an  IonSpec  Fourier  Transform  Ion  Cyclotron  Resonance  Mass  Spectrometer.  Reversed  Phase‐High  Performance  Liquid  Chromatography   (RP‐HPLC)   Consists   of   L‐6200   Intelligent   Mohammed et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 110­114  111  O H OH OH OH CH2O O OH O O OH OH O H O OH OH OH O H3CO OH H H A C B 1 2 34 0 0 1 2 3 4 5 (Glu-I) (Glu-II) 1,3B0 1,3A0 Z0Y0 B3 Z1 Y1 B2 0,4X1 Z2Y2 B1 1 O O OHO OH OH CH3 N CH3 H CH CH3CH3 H 6 Figure 1. The ion nomenclature of 1 indicated by dotted arrows. NOEs are indicated by arrows (↔) and 1H−1H COSY correlations are indicated by bold bonds  (▬), for compounds 1 and 6.  Pump  (Merck‐HITACHI)  equipped  with  UV‐VIS  Detector  SPD‐ 10AV (SHIMADZU), the column used in HPLC separation is (20ϕ  x 250 mm, Develosil ODS‐HG‐5, Nomura Chemicals). Samples of  8  mL  volume  each  were  injected  into  10  mL  loop  (after  prefiltration with Nylon Filter 0,45 µm). HPLC solvents used for  all analyses were of grade M (Sigma‐Aldrich chemie, UK) with  ultra‐pure water. All solvents used were of AR grade. TLC was  carried  out  using  0.25 mm  (Silica  gel  60  F254, Merck)  and  0.5  mm (Kieselgel GF254, Merck) for the analytical and preparative  purposes, respectively.     2.2. Plant materials    The aerial parts (leaves and seeds) of L. grandiflorum, were  collected in March 2006, from El‐Orman garden – Giza – Egypt.  It  was  kindly  identified  by  Miss.  Tressa  Labib  the  Head  of  Specialists  of  Plant  Taxonomy  at  the  garden.  A  voucher  specimen  (No.  38)  of  the  whole  plant  was  deposited  at  the  Herbarium of National Research Center (HNRC).    2.3. Extraction and isolation     The  air‐dried  aerial  parts  [leaves  (2.4  Kg)  and  seeds  (184.46  g)]  of  L.  grandiflorum,  were  extracted  by Maceration  process (5L x 5) followed by defatting with petroleum ether (1L  x 3)  and  the  residue dissolved  in dist. H2O and  refractionated  with  CHCl3  (2L  x  3)  to  give  (10.5  g)  the  residue  which  were  concentrated till dryness and finally extracted with MeOH (3L x  3) to give (91.7 g). The MeOH fraction (15.5 g) was dissolved in  MeOH−H2O  (100  mL,  1:1),  filtered  and  subjected  to  fractionation using preparative ODS‐HPLC at room temp, using  solvent  A  =  1%  HCOOH  and  Solvent  B  =  100%  MeOH,  with  elution  profile  90%  A,  50%  A,  and  finally  with  100%  B,  monitoring at 340 nm, with  flow rate 3 mL/min, accumulated  three main fractions (I, II, and III), and subjected to TLC and UV  examinations which revealed that fraction II (50% A) contains  the  main  phenolics.  Fraction  II  refractionated  with  prep.  RP‐ HPLC at room temp, isocraticaly eluted with 60% A, monitoring  at 280 nm, with 0.8 mL/min flow rate, resulted in the isolation  of 1 (5 mg), 2  (12 mg), 3  (8 mg), 4  (15 mg), 5  (10 mg), 6  (10  mg), 7 (8 mg), 8 (12 mg), 9 (6 mg), and 10 (11 mg). The CHCl3  fraction (10.5 g) was concentrated  till dryness,  then dissolved  in CH3CN−H2O (100 mL, 1:1) and left over‐night at r.t., then the  supernatant  was  separated  and  examined  with  TLC  for  the  presence  of  lignans,  concentrated  and  refractionated  using  prep. RP‐HPLC at  room  temp.,  isocraticaly  eluted with MeOH‐ H2O (20:80), monitoring at 280 nm, with 1.0 mL/min flow rate,  resulted in the isolation of 11 (35 mg), 12 (44 mg) and 13 (13  mg).    2.3.1. Luteolin 7­O­α­D­(6```­E­feruloyl)glucopyranosyl  (1→2)­β­D­glucopyranoside (1)     Pale  yellow  amorphous  solid,  with  a  molecular  formula  C37H38O19 as determined by HR‐ESI‐MS (Positive mode) m/z =  809.1917  [M+Na]+  (calcd.  for C37H38O19Na: 809.1905). UV λmax  (MeOH):  252,  269,  300(sh),  337;  (NaOMe):  268,  390;  (AlCl3):  275, 300(sh), 325, 360(sh), 423; (AlCl3/HCl): 277, 298(sh), 325,  385;  (NaOAc):  265(sh),  269(sh),  335,  408;  (NaOAc/H3BO3):  258,  296(sh),  335,  376.  1H‐NMR  (DMSO‐d6,  300  MHz)  δ  5.24  (1H, d,  J = 7.32 Hz, H‐1`` of Glc I), 3.58   (1H, brd,  J = 8.0 Hz, H‐ 2``), 3.78‐3.90 (2H, m, H‐6``), 5.18 (1H, d,  J = 3.66 Hz, H‐1``` of  Glc  II),  3.26  (1H,  brd,  J  =  9.0 Hz,  H‐2```),  4.15‐4.27  (2H, m,  H‐ 6```), 3.00‐3.55 (6H, overlapped, H‐3``, 4``, 5``, 3```, 4``` and 5```)  6.67 (1H, s, H‐3), 6.46 (1H, d, J = 2.1 Hz, H‐6), 6.74 (1H, d, J = 2.1  Hz, H‐8), 7.41 (2H, brd, J = 8.5 Hz, H‐2`, 6`), 6.95 (1H, d, J = 8.4  Hz, H‐5`), 3.73 (3H, s,  feruloyl‐OMe), 7.12 (1H, d, J = 1.5 Hz, H‐ 2````), 6.70 (1H, d, J = 8.1 Hz, H‐5````), 6.89 (1H, brd, J = 8.1 Hz, H‐ 6````), 6.37 (1H, d, J = 15.80 Hz, H‐α), 7.45 (1H, d, J = 15.8 Hz, H‐ β);  DIFNOE  and  COSY  spectra:  (see  Figure  1);  HRESIMS  (Positive mode) m/z 809.1917 [M+Na]+ (calcd for C37H38O19Na,  809.1905)  (see  Figure  1  for  the  fragmentations).  Acid  hydrolysis  of  1  by  conc.  H2SO4  released  α‐,  β‐glucose  and  luteolin,  which  were  identified  by  PC  and  TLC  as  compared  with the authentic samples. Alkaline hydrolysis of 1 gave ferulic  acid which was identified by comparing with authentic sample  [8].    2.3.2. 2­[(3`­isopropoxy­O­β­D­glucopyranosyl)oxy]­2­ methylbutanenitrile (6)     Yellow amorphous;  IR υmax 3499, 2859, 2928, 2252, 1094,  1011 cm‐1; UV λmax (MeOH): 274, 320 (sh); 1H NMR (DMSO‐d6,  300 MHz) δ 0.86 (3H, t, J = 7.61 Hz, CH3‐4), 1.14 (6H, d, J = 6.23  Hz, −CH=(2CH3)), 1.27 (3H, s, CH3), 1.46 (2H, q, J = 7.61 Hz, CH2‐ 3), 3.06 (1H, dd, J = 7.69 Hz, H‐2`), 3.24 (1H, brd, J = 8.05 Hz, H‐ 4`), 3.48 (1H, m, H‐5`), 3.64 (2H, m, H‐6`), 3.67 (1H, sep, J = 6.23  Hz, −CH=(2Me)), 4.29 (1H, d, J = 7.69 Hz, H‐1`), 4.74 (1H, t, J =  9.16 Hz, H‐3`);  13C‐NMR  (DMSO‐d6,  125 MHz) δC  121.5  (C N),  74.5  (C‐2), 32.9 (C‐3), 8.6  (C‐4), 104.5 (C‐1`), 74.6  (C‐2`), 81.9  (C‐3`),  71.9  (C‐4`),  78.1  (C‐5`),  62.6  (C‐6`),  24.6  (CH3‐2),  73.8  (−CH=(2CH3)), 22.4  (−CH=(2CH3)); DIFNOE and COSY  spectra:  (see  Figure  1);  HRMALDIMS  (Positive  mode)  m/z  326.1579  [M+Na]+,  (calcd  for  C14H25NO9Na,  326.1575) m/z  303  [M+H]+,  m/z 284 [M+Na − (:C(CH3)2)]+, m/z 611 [2M+Na − H2O]+.    2.4. Assay for cytotoxicity     The cell line EL4 (Murine Lymphoma) was purchased from  National  Cancer  Institute  (NCI).  A  standard  high‐flux  anticancer‐drug   screening   method   using   Sulforhodamine  B   112  Mohammed et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 110­114    O O OH OHOH CH3 N CH3 7- Linamarin O O OH OH OHOH CH3 N CH3 8- Lotaustraline O O OH OH OH O CH3 N CH3 O OH OH OH OH 9- Neolinostatin O O OH OH OHOH CH3 H CH3 10- Butan 2-O-glucopyranoside     O OH O R4 R2 OH R1 R3 2- Glucoluteolin R1=H, R2=glucosyl, R3=H, R4=OH 3- Vicenin-1 R1=xylosyl, R2=H, R3=glucosyl, R4=H 4- Vicenin-2 R1=glucosyl, R2=H, R3=glucosyl, R4=H 5- Vicenin-3 R1=glucosyl, R2=H, R3=xylosyl, R4=H O O O O R2 O OO CH3 CH3 CH3 H H R1 11- Podophyllotoxin R1 = H R2 = OH 12- Deoxypodophyllotoxin R1 = H R2 = H 13- 5-methoxypodophyllotoxin R1 = OCH3 R2 = OH     Figure 2. Structures of the isolated known compounds from Linum grandiflorum.     (SRB) assay, which permitted a simpler, faster, inexpensive and  more  sensitive  than  the  MTT  assay,  provided  better  linearity  with  cell  number,  permitted  the  use  of  saturating  dye  concentrations,  was  less  sensitive  to  environmental  fluctuations,  independent  of  intermediary  metabolism,  and  provided a fixed end point that did not require a time‐sensitive  measurement of  initial  reaction velocity  [9,10]. The method  is  suitable  for  ordinary  laboratory  purposes  and  for  very  large‐ scale  applications,  briefly;  cancer  cells  were  plated  in  96‐ multiwell plate (104 cells/well) for 24 h before treatment with  the  samples  to  allow  attachment  of  the  cell  to  the wall  of  the  plate. Different concentrations of  the samples under test (0, 1,  5,  10, 25, 50, 100, 250, 500,  and 1000 μg/mL) were added  to  the  cell  monolayer,  triplicate  wells  were  prepared  for  each  individual dose. The monolayer  cells were  incubated with  the  test samples at 37 oC for 48h in atmosphere of 5% CO2. Cultures  were  fixed  with  trichloroacetic  acid,  then  stained  with  sulforhodamine  B  and  the  colour  intensity  was  measured  at  490  nm  by  ELISA  reader.  All  experiments were  performed  at  least  two  times  in  triplicates.  Thapsigargin  (T‐9033,  >96%,  Sigma) was used as positive potent cytotoxin with IC50 1.9 ± 0.5  M/mL. Data  are  given  as  IC50  (M/mL) mean  ±  SEM  from 4  different experiments [11].    3. Results and Discussion    For the screening of novel anti‐leukemic agents with potent  cytostatic  activity  and  low  cytotoxicity,  this  research  was  directed  to  the  exploration  of L. grandiflorum,  which was  not  investigated before  for  its biological  activity. A standard high‐ flux  anticancer‐drug  screening  method  was  used  to  evaluate  the  cytotoxicity  of  the  MeOH  and  CHCl3  fractions  (Table  1),  which  revealed  that  both  fractions  have  cytotoxic  activity  against  EL4  (Murine  Leukemia)  cell  line with  IC50  60  and 250  g/mL  respectively,  this  prompts  us  to  follow  up  the  fractionation procedure in parallel with the bioassay activity of  the  isolated  compounds;  this  resulted  in  the  isolation  of  two  novel compounds 1 and 6 (Figure 1), with IC50 0.2, 0.3 M/mL  respectively, together with eight known compounds (Figure 2)  structurally  elucidated  according  to  their  spectral  data  in  comparison  with  those  in  the  literature  and  identified  as  2  luteolin  7‐O‐β‐D‐glucoside  [12],  3−5  vicenin‐1,  vicenin‐2  and  vicenin‐3  [13],  7−9  linamarin,  lotaustralin  and  neolinustatin  [14] and 10 butan‐2‐O‐β‐D‐glucoside [15] (Figure 1) with  IC50  0.2,  0.9,  0.8,  0.9,  0.4,  0.4,  0.2,  0.4  M/mL  respectively.  Furthermore,  three  aryltetrahydronaphthalene‐type  lignans  11−13  (Figure  2)  were  isolated  from  the  CHCl3  fraction  and  identified  as  podophyllotoxin,  deoxypodophylotoxin  and  5‐ methoxypodophyllotoxin  [16,17]  with  IC50  0.2,  0.09  and  0.2  M/Ml, respectively.  Compound  1  was  isolated  as  a  pale  yellow  amorphous  solid, with a molecular formula C37H38O19 as determined by HR‐ ESI‐MS  (Positive  mode) m/z  =  809.1917  [M+Na]+  (calcd.  for  C37H38O19Na:  809.1905).  Its  UV  spectrum  was  the  same  as  compound 2, with  shift  reagents  suggested  an  occupied  7‐OH  group. 1H‐NMR spectrum showed a singlet signal at δH 6.67 (1H,  s, H‐3)  characteristic  for  the  flavone‐type,  a  hydrogen‐bonded  hydroxyl  proton  at  δH  12.95  (1H,  brs,  5‐OH),  two  anomeric  protons of two hexose moieties at δH 5.24 (1H, d, J = 7.3 Hz, H‐ 1``  of  Glc  I)  and  δH  5.18  (1H,  d,  J  =  3.7  Hz,  H‐1```  of  Glc  II)  characteristic  for  the  β‐  and  α‐glucopyranoside  as  confirmed  from  the  3JH‐1,H‐2  coupling  constant  [18].  The  interglycosidic     Mohammed et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 110­114  113  Table 1. The cytotoxic activities of the isolated compounds.  Compounds  *  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  EL4  IC50  (M/mL)  1.9  ±  0.5  0.2  ±  7.5  0.2  ±  8.0  0.9  ±  8.9  0.8  ±  9.0  0.9  ±  7.6  0.3  ±  8.6  0.4  ±  5.6  0.4  ±  8.3  0.2  ±  5.8  0.4  ±  6.7  0.2  ±  6.5  0.09  ±  6.8  0.2  ±  5.3  * Thapsigargin.    linkage  as  well  as  its  attachment  to  the  aglycone  was  established  as  shown  in  (Figure  1)  according  to  the  DIFNOE  spectroscopy [19]. By the irradiation at δH 5.24 (Glc I) caused a  strong  negative  NOEs  at  δH  5.18,  δH  6.47  and  δH  6.74  corresponding  to  H‐1```  (Glc  II),  H‐6  and  H‐8  respectively;  confirmed the attachment of (Glc  I) at 7‐OH of  luteolin, by the  irradiation at δH 5.18 (Glc II) caused a strong negative NOE at δH  5.24 H‐1`` (Glc I),  indicating that, the interglycosidic linkage to  be  α‐D‐glucopyranosyl  (1→2)‐β‐D‐glucopyranoside.  2D  COSY  spectra showed a cross‐peak of two doublets at δH 6.37 (1H, d, J  =  15.8  Hz,  H‐α)  and  δH  7.45  (1H,  d,  J  =  15.8  Hz,  H‐β)  corresponding  to  AM  system  in  the  trans‐configuration  as  indicated  from  the  3JH‐α,H‐β  coupling  constant  [18],  the  down‐ field  shift  of  the methylene  proton  of  (Glc  II)  at  δH  4.15‐4.27  (2H,  m,  6‐CH2)  assigned  from  1H−1H  COSY  suggesting  the  attachment position of the E‐feruloyl group at 6‐CH2OH of (Glc  II),  which  was  confirmed  by  the  irradiation  at  δH  6.37  (H‐α)  resulted  in  a  weak  negative  NOE  at  δH  4.15‐4.27.  From  the  above data Compound 1 suggested as  luteolin 7‐O‐α‐D‐(6```‐E‐ feruloyl)glucopyranosyl  (1→2)‐β‐D‐glucopyranoside.  This  proposed  structure was  confirmed by  the  analysis with nano‐ ESI‐CID‐MS/MS,  it  has  been  investigated  that  the  interglycosidic linkage‐type (1→2) or (1→6) can be concluded  from  the  relative  abundances  of  the Y0  and Y1  ions  obtained  from  the  protonated  molecule  and  the  relative  abundance  of  the Y*  ion  provide  information  on  the  nature  of  the  aglycone  and on  the  linkage position of  the disaccharide  [7,20‐22]. The  interglycosidic  linkage  and  the  aglycone part  of  compounds 1  can be characterized by CID of  the molecular  ion peak [M+H]+  at m/z 787, it was found a protonated aglycone Y0+  ion at m/z  287,  the  fragments  at  m/z  177  and  339  corresponding  to  feruloyl+  and  feruloylhexose+  respectively  [23],  the  weak  abundance of the Y* ion at m/z 625 confirmed the flavone type,  where the high relative abundance of Y0 at m/z 287 compared  with  Y1  at  m/z  449  (Y0  >  Y1)  confirmed  the  interglycosidic  linkage  to  be  (1→2)  agreed  with  DIFNOE  spectra,  it  was  suggested  from the  (DIFNOE)  that  the exact  location of  the E‐ feruloyl to be at the 6```‐OH (Glc II), which was confirmed from  the presence of the molecular ion 0,4X1 at m/z 321, this proved  the attachment of E‐feruloyl at the 6```‐OH (Glc II) [24]. Hence;  Compound  1  was  confirmed  to  be  luteolin  7‐O‐α‐D‐(6```‐E‐ feruloyl)glucopyranosyl (1→2)‐β‐D‐glucopyranoside [25].   Compound 6  was  isolated  as  yellow  amorphous  solid;  its  molecular  formula  was  determined  to  be  C14H25NO6  by  HR‐ MALDI‐MS (Positive mode) m/z = 326.1579 [M+Na]+, (calcd. for  C14H25NO9Na: 326.1575). The 1H‐ and 13C‐NMR spectra was the  same as that of compound 8, with extra three signals classified  into; a doublet signal at δH 1.14 (6H, d,  J = 6.2 Hz, 2CH3 of  the  isopropoxy group) and CH3 of the isopropoxy group at δC 22.43,  a  multiplet  signal  at  δH  3.67  (1H,  sep,  J  =  6.2  Hz,  CH  of  the  isopropoxy group) and CH of the  isopropoxy at δC 73.80, and a  triplet  signal  at  δH  4.74  (1H,  t,  J  =  9.2 Hz,  H‐3`)  and  C‐3`at δC  81.98. Analysis of  1H‐NMR and  1H−1H COSY  spectra  showed a  cross‐peak correlated the triplet methyl signal at δH 0.86 (3H, t,  J  =  7.6  Hz,  CH3‐4) with  a  quartet methylene  signal  at  δH  1.46  (2H,  q,  J  =  7.6  Hz,  CH2‐3),  and  a  cross‐peak  correlated  the  doublet  signal  at δH 1.14  (6H, −CH=(2CH3)) with  the methene  group at δH 3.67 (1H, −CH=(2CH3)) corresponding to isopropyl  group,  the  downfield  shift  of  the  methene  group  at  δH  3.67  confirmed the form of isopropoxy group, which suggested to be  attached to the 3`‐OH of the glucose moiety as indicated by the  downfield shift of H‐3` at δH 4.74, and C‐3` at δC 81.98, this was  confirmed by  the  irradiation  of  the methene  proton  (δH 3.67)  caused  a  strong  NOEs  enhancement  at  δH  4.74  and  δH  1.14  corresponding to H‐3` of glucose moiety and the doublet signal  of  the  two  methyls  of  the  isopropoxy  group,  respectively.  Hence;  compound 6 was confirmed  to be 2‐[(3`‐isopropoxy‐O‐ β‐D‐glucopyranosyl)oxy]‐2‐methylbutanenitrile [25].   Several  investigations  showed  that  flavonoids  inhibit  tumour  cell  growth  via  the  cessation  of  aerobic  glycolysis  by  blocking  membrane  Na+,  K+‐ATPase  of  tumour  cells  [26],  flavonoids appeared to be compounds of low toxicity and some  of  them  apparently  have  antiproliferative  activity  against  human  tumour  cells  [27].  The  chemopreventive  activity  of  flavonoids may result  from  their ability  to  inhibit phase  I  and  induce phase  II  carcinogen metabolizing enzymes  that  initiate  carcinogenesis.  They  also  inhibit  the  promotion  stage  of  carcinogenesis  by  inhibiting  oxygen  radical‐forming  enzymes  or  enzymes  that  contribute  to  DNA  synthesis  or  act  as  ATP  mimics  and  inhibit  protein  kinases  that  contribute  to  proliferative signal transduction. Also, they may prevent tumor  development  by  inducing  tumor  cell  apoptosis  by  inhibiting  DNA topoisomerase  II and p53 down regulation or by causing  mitochondrial toxicity, which initiates mitochondrial apoptosis  [28]. Thus, some of the past studies support the antitumor cell  effects of  flavonoids being  caused via DNA damage  to  tumour  cells  [26].  The  limited  understanding  about  a  possible  structure‐activity  relationship  of  flavonoids  as  anticancer  agents  could  possibly  because  of  the  few or  not  appropriated  flavonoids used  in  the previous  studies.  It was  found  that  the  presence  of  sugar moiety  reduce  the  cytotoxic  activity  of  the  aglycone on tumor cell lines and this may be due to the fact that  the  hydrophilic  nature  of  sugars  or  the  increased  volume  of  glycosides  could  interfere with  the  drug  entering  through  the  cellular membrane  [29],  this  appeared  clearly  in  our  study  as  the IC50 against EL4 of the mono‐glucoside, if compared with the  diglucosides  1  with  IC50  against  EL4  is  0.2  M/mL,  which  in  turn  more  potent  than  the  Di‐  C‐glycoside  flavonoids  3−5.  It  can be concluded that the presence of the −H at C‐3 as well as  the C‐4 oxo group is required for maximal biological activity of  flavonoids. Both of the aromatic substituents and the keto‐enol  functionality  can  serve  as  targets  for  future  structure  activity  relationship (SAR) studies of flavonoids [30]. Furthermore, the  cyanogenic  glycosides were  used  for  the  treatment  of  human  neoplastic disease,  its activity as anticancer may be due to the  fact  that  these  types  of  compounds  liberate  hydrocyanic  acid  (HCN)  by  hydrolysis,  resulted  in  their  potential  danger  as  poisons to livestock as well as human [31].   Aryltetrahydronaphthalene‐type  lignans  as  podophyl  lotoxin  and  its  derivatives  are  important  natural  products  in  the  armamentarium  of  antineoplastic  agents.  The  biological  assessment of podophyllotoxin was followed by discovery of its  mode  of  action  and  culminated  in  the  synthesis  of  the  anticancer  drugs  etoposide  and  teniposide.  The  long  journey  from  podophyllotoxin  to  etoposide  and  teniposide  illustrates  the  fascinating  development  of  clinically  useful  anticancer  drugs  from  natural  product  prototypes  through  chemical  modification.  It  is  particularly  distinctive  that  structural  variation  of  podophyllotoxin  caused  a  radical  change  in  the  mechanism  of  action.  Today,  several  new  podophyllotoxin  analogs  have  emerged  as  potential  anticancer  drugs.  Some  recent  literature  contributions  have  provided  comprehensive  updates  on  various  aspects  of  this  compound  class  primary  molecular mechanisms underlying  the antineoplastic activities  of podophyllotoxin analogs include preventing the assembly of  tubulin  into microtubules or  inhibiting  the catalytic activity of  114  Mohammed et al. / European Journal of Chemistry 1 (2) (2010) 110­114    DNA topoisomerase II, although other known and in some cases  ambiguous  mechanisms  are  also  involved  [32,33].  Thus,  podophyllotoxin  derivatives,  etoposide  and  teniposide  were  reported to break DNA strands, which results in a cessation of  the tumour cell proliferation at the G2 cell cycle [34].    References    [1]. Sang, K. L.; Kyung, A. N.; Yoen, H. H. Planta Med. 2003, 69, 21−25.  [2]. Bown  D.  Encyclopedia  of  Herbs  and  their  Uses. Dorling  Kindersley,  London, 1995.  [3]. Hartwell  J.  L.  Plants  Used  Against  Cancer.  A  Survey.  Quarterman  Publication Inc., USA, 1982. p. 350.  [4]. Nielsen, S. E.; Freese, R.; Cornett, C.; Dragsted, L. O. Anal. Chem. 2000,  72, 1503−1509.   [5]. Hakkinen, S.; Auriola, S. J. Chromatog. A 1998, 829, 91−100.   [6]. Es‐Safi, N. E.; Krhoas, L.; Einhorn, J.; Ducrot, P. H. Int. J. Mass Spectrom.  2005, 247, 93−100.   [7]. Ma,  Y.  L.;  Vedernikova,  I.;  Van  Den Heuvel,  H.;  Claeys, M.  J. Am.  Soc.  Mass Spectom. 2000, 11, 136−144.   [8]. Mabry  T.  J.;  Markham  K.  R.;  Thomas  M.  B.  The  Systematic  Identification of Flavonoids. Springer, Berlin, 1970.  [9]. Vistica, D.T.; Skehan, P.; Scudiero, D.; Monks, A.; Pittman, A.; Boyd, M.R.  Cancer Res. 1991, 51, 2515−2520.   [10]. Rubinstein, L.V.; Paull, K.D.; Shoemaker, R.H.; Simon, R. M.; Tosini, S.;  Skehan, P.; Scudiero, D.A.; Monks, A.; Boyd, M.R. Cancer Res. 1989, 30,  607−613.   [11]. Skehan,  P.;  Storeng, R.;  Scudiero, D.; Monks, A.; Mcmahon,  J.; Vistica,  D.; Warren, J.T.; Bokesch, H.; Kenney, S.; Boyd, M.R. J. Natl. Cancer Inst.  1990, 82, 1107–1112.  [12]. Seikel,  M.  K.;  Chow,  J.  H.  S.;  Feldman,  L.  Phytochemistry  1966,  5,  439−455.  [13]. Harborne  J.  B.  The  Flavonoids  in  Advances  in  Research  since  1986.  Chapman & Hall, New York, 1994.   [14]. Cecil, R. S.  Jr.; David, W.; Roger, W.; Miller,  I. S. P.; Oscar, E. O.  J. Org.  Chem. 1980, 45, 507−510.  [15]. Cable, J.; Nocke, H. Australian J. Chem. 1975, 28, 2737−2739.   [16]. Mohammed M. M. D. Phytochemical and Biological Studies on Linum  grandiflorum  (Linaceae)  and  Ixora undulata  (Rubiaceae)  Growing  in  Egypt. Doctoral Thesis, Menoufia University, Egypt, 2008.   [17]. Ayres,  D.  C.;  Loike,  J.  D.  Chemistry  and  Pharmacology  of  Natural  Products.  Lignans:  Chemistry,  Biological,  and  Clinical  Properties.  Cambridge University Press, Cambridge, 1990. p. 138.    [18]. Day, P. M.; Harborne, J. B. Plant Phenolics. (Vol. 1). In Methods in Plant  Biochemistry. Academic Press, London, 1989.  [19]. David, N.; Michael, P. W. The Nuclear Overhauser Effect  in Structural  and Conformational  Analysis. Wiley‐VCH Publishers  INC., New York,  1989 & 2000.  [20]. Es‐Safi, N. E.; Krhoas, L.; Einhorn, J.; Ducrot, P‐H. Int. J. Mass Spectrom.  2005, 247, 93−100.  [21]. Cuyckens,  F.;  Rozenberg,  R.;  Hoffmann,  E‐D,  Claeys,  M.  J.  Mass  Spectrom. 2001, 36, 1203−1210.   [22]. Ma, Y. L.; Cuyckens, F.; Van Den Heuvel, H.; Claeys, M. Phytochem. Anal.  2001, 12, 159−165.  [23]. Cuyckens, F.;  Shahat, A. A.; Van den Heuvel, H.; Abdel‐Shafeek, K. A.;  El‐Messiry, M. M.; Seif El‐Nasr, M. M.; Pieters, L.; Vlietinck, A. J.; Claeys,  M. Eur. J. Mass Spectrom. 2003, 9, 409−420.  [24]. Bylka,  W.;  Franski,  R.;  Stobiecki,  M.  J.  Mass  Spectrom.  2002,  37,  648−650.   [25]. Mohammed, M. M. D.;  Christensen,  L. P.;  Ibrahim, N. A.; Awad, N.  E.;  Zeid, I. F.; Pedersen, E. B. Nat. Prod. Res. 2009, 23(5), 489−497.  [26]. Suolina,  E.  M.;  Buchsbaum,  R.  N.;  Racker,  E.  Cancer  Res.  1975,  35,  1865−1872.  [27]. Hirano, T.; Gotoh, M.; Oka, K. Life Sci. 1994, 55, 1061−1069.  [28]. Giuseppe, G.; Peter, J. O. Free Radical Biol. & Med. 2004, 37, 287–303.   [29]. Lopez‐Lazaro, M.; Martin‐Cordero, C.; Cortes, F.; Pinero, J.; Ayuso, M. J.  Z. Naturforch. (Section C) 2000, 55, 40−43.  [30]. Wu, J. H.; Wang, X. H.; Yi, Y. H.; Lee, K. H. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003,  13, 1813−1815.   [31]. Norman R. F. J. Pharmaceut. Sci. 1966, 55, 225−276.   [32]. Raphael  I.  Selected  Topics  in  the  Chemistry  of  Scientific  Research.  World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd., Singapore, 2008. p. 471.   [33]. Gordon,  M.  C.;  David,  G.  I.  K.;  David,  J.  N.  Anticancer  Agents  from  Natural Products. CRC Press Taylor & Francis Group, Boca Raton FL.,  2005.  [34]. Kalwinskyl, D. K.; Look, A. T.; Ducore, J.; Fridland, A. Cancer Res. 1983,  43, 1592−1597.