Conseguences of soil crude oil pollution on some wood properties of olive trees علوم حياة |325 7102( عام 1( العدد ) 30المجلد ) مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol.03 (1) 2017 تقدير الغشاء الحيوي المتكون بتقنية االليزا للبكتيريا السالبة لصبغة كرام المعزولة من اخماج الجروح والحروق ودراسة انتاج الغشاء جزيئيا. عمر نعمه فليح حسن لنعيمياليث مصلح نجيب الحياة / كلية العلوم / جامعة االنبارعلوم قسم رنا كاظم محمد الشمري التقنيات اإلحيائية / كلية العلوم / جامعة بغدادقسم 8102/كانون االول/82,قبل في: 8102/اذار/82استلم في: الخالصة صممت هذه الدراسة للتحري عن قدرة البكتيريا السالبة لصبغة كرام والمعزولة من اخماج الجروح والحروق على ( عزالت 01إنتاج الغشاء الحيوي، تضمنت العزالت المنتخبة على العزالت األكثر مقاومة للمضادات الحيوية، وبواقع ) Escherichia( عزالت 6، )Klebsiella pneumoniae( عزالت 9، )Pseudomonas aeruginosaلبكتيريا coli( ،5 عزالت )Proteus mirabilis وعزلتين للنوعEnterobacter cloacae استعملت تقنية االليزا وربط . البنفسج البلوري الذي اعتمد على قيم الكثافة الضوئية للبنفسج والمرتبط بكتلة الغشاء الحيوي باالليزا عند طول موجي نانوميتر، بينت نتائج االختبار تباين في تكوين الغشاء الحيوي بين األنواع البكتيرية اعتمادا على قيم الكثافة الناتجة ( 671) في حين كانت أكثر العزالت إنتاجا للغشاء الحيوي هي من البكتيريا المعزولة من المرضى المصابين بقرح السكري. كارو امتال جميع العزالت نسقا بال ميدا مختلفة في الحجم والموقع وقد تم أظهرت نتائج الترحيل الكهربائي في هالم اال استعمال الحرارة كعامل محيد للبال ميدات أظهرت نتائج الترحيل فقدان البال ميدات للعزالت وفقدان واختالف في كثافة اإلنتاج بعد التحييد إشارة إلى دور بال ميدي وكرموسومي في تنظيم تلك الظاهرة. : البكتيريا السالبة كرام، الغشاء الحيوي، البال ميدات.الكلمات المفتاحية علوم حياة |326 7102( عام 1( العدد ) 30المجلد ) مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol.03 (1) 2017 المقدمة ّعرف الغشاء الحيوي على ]0[( من االحياء المجهرية ضمن تجمعات ميكروبية تعرف بالغشاء الحيوي %99يتعايش ) أنه تجمعات خلوية معقدة من االحياء المجهرية سطحية االلتصاق مطمورة في مواد بوليميرية خارج خلوية مفر ة من الكائنات نفسها ويالحظ تكون الغشاء الحيوي في بيئة المستشفيات والسيما على أسطح الجروح والحروق المعرضة للتلوث ء الرقيق الحيوي على انه خليط معقد من األحياء المجهرية المتجمعة والتي التصقت على الغشاوصف .]7[الجرثومي ولقد .]3[ذات المنشأ الميكروبي (Exopolysubstances)(EPS) السطوح الرطبة بوساطة االفرا ات المتعددة الخارجية تكوين األغشية الحيوية فأنها تميل لوحظ في حاالت اخماج الجروح والحروق خالل نموا البكتيريا على أسطح المضيف و إلى تشكيل مثل هذه التجمعات مسببة االلتهابات المستمرة وتعفن الدم وتتميز هذه التجمعات بمقاومتها للظروف القاسية داخل رام أن البكتريا السالبة لصبغة ك.وقد وجد ]4[المضيف إضافة لمقاومتها العالية للمضادات الحيوية مما يجعلها صعبة العالج والسيما المتحركة منها هي السائدة في تكوين األغشية الرقيقة الحيوية وتتميز بكتريا الزوائف الزنجارية بقابليتها العالية تمتلك البكتيريا .]5[على تكوين األغشية الرقيقة على العدد الطبية المستعملة في عالج المرضى الراقدين في المستشفيات ابلية على المقاومة للعوامل والظروف المحيطة بمعدل أعلى من البكتريا الحرة المعيشة وهي من المكونة للغشاء الحيوي الق إن معرفة التركيب الوراثي والمستوى الجزيئي للبكتيريا الممرضة .]6[األسباب المجهولة وغير الواضحة إلى حد اآلن .]2[بات المضادة لفعالية األغشية الحيويةوالمكونة للغشاء الحيوي يساعد في تشخيص الجينات و الطافرات والمرك بشكل DNAوهي عبارة عن شريط مزدوج من الـ Plasmidsتحتوي البكتيريا على عناصر وراثية تسمى البال ميدات حلقي ومغلق تساهميا ولهذه العناصر القدرة على التضاعف بثبات وبصورة مستقلة عن الكرموسوم البكتيري وهي تنتشر . تحمل هذه البال ميدات العديد من الجينات المشفرة لعدد كبير من ]8[ضمن النوع البكتيري الواحد او بين األنواع المختلفة للمضادات الحيوية وإنتاج السايدفورات والهيمواليسين وهي مختلفة في الحجم فمنها ما عوامل الضراوة منها صفة المقاومة يكون ذو حجم جزيئي كبير وأخرى احجامها الجزيئية صغيرة ويكون وجودها غير ضروري للمضيف لكن وجود هذه هنا بال ميدات قد ال يكون لها البال ميدات يعطي البكتيريا صفات تمكنها من العيش في ظروف قاسية أو استثنائية إال أن .تهدف الدراسة إلى تقدير كثافة الغشاء الحيوي ]9[أي دور على الصفات في البكتيريا لذلك تدعى بالبال ميدات الخفية المتكون عن طريق االليزا بربط البنفسج البلوري ومعرفة دور البال ميدات في إنتاج تلك الصفة من اخماج الجروح ا الهوائية والسالبة لصبغة كرام.والحروق للبكتيري المواد وطرائق العمل عزل البكتيريا والتشخيص.-0 ( عزلة من البكتيريا الممرضة السالبة لصبغة كرام والمعزولة من 071( عزلة من مجموع )37استعملت في هذه الدراسة ) بغداد للمدة بين –اخماج الجروح والحروق من مستشفى الرمادي التعليمي ومستشفى الحروق التخصصي في مدينة الطب بالبكتريا. وتو عت العزالت التي تم اختيارها بناًء على للتحري عن مدى تلوثها 0/4/7105ولغاية 71/07/7104 ، P.aeruginosa( عزالت لبكتيريا 01العزالت األكثر مقاومة للمضادات الحيوية وذات مقاومة متعددة على النحو اآلتي ) وعزلتين Proteus mirabilis( عزالت 5، )Escherichiacoli( عزالت 6، )K.pneumoniae( عزالت 9) شخصت المستعمرات مبدئيا اعتمادا على . ]01[شخصت العزالت اعتمادا على ما ورد في وقد.Enter.cloacaeللنوع الصفات المظهرية وتضمنت شكل المستعمرات ,لونها ,قوامها ,رائحتها وحجمها على وسط أكار الماكونكي واكار الدم و تعمال صبغة كرام للتعرف على شكل البكتيريا وسط أكار السيدموناس, وأخضعت العزالت إلى الفحص ألمجهري باس وترتيبها وتفاعلها مع صبغة كرام واستعملت الفحوصات الكيموحيوية المختلفة مثل فحص االوكسديز ,الكاتليز ,االندول وتم تأكيد التشخيص باستعمال عدة (0,احمر المثيل ,الفوكس بروسكار ,استهال السترات ,الحركة واليوريا جدول ) الفرنسية. تم تحضير األوساط الزرعية Biomerieuxالمجهزين من شركة 7وبجها الفايتك Api 20E Kit يص التشخ بدرجة Auto clave( وحسب تعليمات الشركة المجهزة إذ تم تعديل الرقم الهيدروجيني والتعقيم باستعمال 7الجدول ) دقيقة. 15( ولمدة²)بار/انج 15م وتحت ضغط º121 حرارة Detection of biofilm formationالتحري عن إنتاج الغشاء الحيوي -8 في الكشف عن قابلية العزالت على تكوين الغشاء الحيوي وكما هو موضح في أدناه:] 00 [أتبعت طريقة ْم. 73ساعة عند 42نميت العزالت قيد الدراسة على وسط االكار المغذي لمدة -1 من المرق المغذي بوساطة ناقل معقم للمقارنة مع محلول ثابت العكورة القياسي مللتر 4مستعمرات إلى 2-7تم نقل -4 خلية / مل. 10 ×8 1.1( للحصول على عدد تقريبي للخاليا يقرب من 0.5)ماكفرالند رقم مايكروليتر 111مايكروليتر من المزروع إلى أطباق المعايرة الدقيقة وبواقع ثالث حفر لكل عزلة. كما أضيف 111نقل -7 من المرق المغذي المعقم )خال من البكتريا( إلى ثالث حفر والتي عدت سيطرة. ساعة. 42م لمدة 73تم تغطية األطباق بوساطة غطاء لتوفير ظروف معقمة ومن ثم حضنت عند درجة -2 ت لتجف بهواء وبمعدل ثالث غسالت وترك Elisa Washerغسلت الحفر بالماء المقطر بوساطة جهاز االليزا الغاسل -1 دقيقة. 11الغرفة لمدة علوم حياة |327 7102( عام 1( العدد ) 30المجلد ) مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol.03 (1) 2017 دقيقة. 11( لكل حفرة وتركت لمدة %1مايكروليتر من ملون البنفسج البلوري ) 411تم إضافة -6 دقيقة. 11غسلت الحفر عدة مرات بالماء المقطر وتركت لتجف بهواء الغرفة لمدة -3 .%91مايكروليتر من االيثانول بتركيز 411أذيبت الصبغة المتبقية بإضافة -8 671االمريكية عند طول موجي Biotekمن شركة ELISA Readerقرئت النتائج بوساطة جهاز االليزا القارئ -9 نانوميتر. قسم الغشاء الحيوي إلى ثالث أقسام حسب نتائج االمتصاصية وكاالتي: قيمة االمتصاصية الغشاء الحيوي الضعيف الذي تكون قيمة االمتصاصية أكثر من قراءة السيطرة وأقل من ضعفي -ا للسيطرة. الغشاء الحيوي متوسط القوة الذي تكون قيمة االمتصاصية تساوي أو أكثر من ضعفي قيمة االمتصاصية للسيطرة وأقل -ب من أربعة أضعاف قيمة االمتصاصية للسيطرة. االمتصاصية للسيطرة.الغشاء الحيوي القوي الذي تكون فيه قيمة االمتصاصية تساوي أو أكثر من أربعة أضعاف قيمة -ج البالزميدي. DNA استخالص الـ-3 - البكتيريDNA الـ-0التي تتكون من ] 07[بطريقة الحرارة والتبريد كما ورد في البال ميدي DNAتم االســتخالص الـ وتمت عملية االستخالص وحســب الخطــوات االتيــــة: TE Bufferالمنظم محلولال 2 مئوية. 37ساعة بدرجه حرارة 24 لمدة االكار المغذي وحضنت العزالتتم تنشيط العزالت على وســط -0 نقلت عدد من المسـتعمرات المفردة النقية باستعمال الناقل الى وســط مرق نـقيع القـلب والدماغ الســائل وحضنت -8 مئوية. 37ساعة بدرجة حرارة 74لمدة مليلتر( ثم طـــرد 0.5لســائل الحــاوي على النمو البكـتيري الى انبوبة صغيرة )مليلتر من الوسـط ا 1نقـل -3 دورة/ دقيقة ولمــدة دقـيقــتين وا يل الرائق وتم االحــتفاظ بالراســب. 03.111مركــزيا بســرعة ــب الحـــاوي ومزج برفــق مع الراسـ TE Bufferمايكــرولتر من المحــلول المنظم 100أضيف للراســـب -4 على الخــاليا البكــتيرية بوساطة الماصــــة الدقـــيقــة. دقائق لتحـليل الخـاليا. 10مئوية ولمـــدة 100نقلت االنبـــــوبة الى حـــــمام مــائي بدرجــة -5 دقائق. 5ُحضن النموذج مباشرة بالثلج لمـــــدة -2 دقائق.3/ دقيقة ولمـــدة دورة13.000طـُرد النمــوذج مركــزيا وبســرعة -7 TEمايكرولتر من 100بعناية الــى انبــوبة جــديدة حـاوية على DNAنقــل بعــدها الرائــق الحــاوي على -2 Buffer .مئوية 8-4في الثالجة DNAُحــفـِظ -9 تحييد البالزميدات بأستعمال الحرارة. -4 مل من المرق 5البال ميدي باستعمال الحرارة كعامل محييد وكاالتي إذ تم تلقيح في تحييد المحتوى ] 03[تم أتباع طريقة 74المغذي بمستعمرة مفردة من أنواع البكتيريا المعزولة والمستعملة في الدراسة الحالية، حضنت المزرعة الجرثومية لمدة مل من المرق 01رعة أضيف إليها مل من المز 1.0ْم. بعد انتهاء مرحلة التحضين اخذ 32ساعة عند درجة حرارة ( ساعة ولكل عزلة على حدا، فضال عن ذلك 0-7مم ولمدة ) 32المغذي وحضن الوسط الغذائي الملقح عند درجة حرارة مل من المرق المغذي وبواقع نموذجين لكل عزلة وحضنت المزرعة عند 01مل من المزرعة وأضيف لها 1.0فقد اخذ األول الستعمالة كنموذج سيطرة لمالحظة التحييد التلقائي مع النموذج الثاني والذي تم حضنه ْم للنموذج 32درجة حرارة ( ساعة 0-7ساعة للحصول على التحييد التلقائي. تم تنمية العزالت التي تم حضنها لمدة ) 74ْم ولمدة 44عند درجة حرارة دقائق لكل درجتان حرارية مختلفة أعلى 01ة منية ( ْم ولمد66-54ْم إلى درجات حرارية عالية ومختلفة )32وبدرجة .%93للوصول إلى نسبة قتل الحساسية للمضادات الحيوية اختبار-5 وذلك بأتباع ( 3التركية كما في الجدول ) Bioanalyse( نوع من المضادات الحيوية المجهزة من شركة70استعملت ) وقسمت العزالت على فئتين هي ]04[وباالعتماد على طريقة Disc diffusion methodطريقة االنتشار باألقراص .]05[الحساسة والمقاومة واعتمادا على القياسات العالمية Agarose gel electrophoresis of DNAالكهربائي للدنا على هالم األكاروز الترحيل-6 المحاليل المستعملة في الترحيل , وتم تحضير % 1.2أجري الترحيل الكهربائي بأستعمال هالم االكارو وبتركيز وحددت ظروف الترحيل المتمثلة بالوقت والتيار وفرق الجهد لمجهز القدرة الكهربائية ]06[الكهربائي بحسب ما ورد في (power supply اعتمادا على )]وبعد االنتهاء من عملية الترحيل يرفع الهالم بحذر ويفحص بجها ]06UV- Transillumiator حزم الدنا . لمالحظة النتائج اعتمادا على نتائج التشخيص ألمجهري كانت جميع العزالت المعزولة من اخماج الجروح والحروق سالبة لصبغة كرام وبينت نتائج االختبارات الكيموحيوية تطابقا في جميع العزالت مع صفات األجناس المنتخبة وكما مبينة في الجدول وكانت نتائج جميع االختبارات متطابقة لألنواع البكتيرية المشخصة في حين تم Api 20Eتشخيص ( تم استعمال عدة ال0) علوم حياة |328 7102( عام 1( العدد ) 30المجلد ) مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol.03 (1) 2017 عائديةاألجناس المعزولة وبنسبة 7للعزالت إذ أعطت نتائج االختبار بجها الفايتك 7تأكيد النتائج باستعمال جها الفايتك الحيوية إذ قاومت العزالت أكثر من مجموعتين (. أظهرت العزالت مقاومة عالية تجاه المضادات%99تصل إلى ) K. pneumonia(9 )( مضاد حيوي في حين قاومت بكتيريا 07) Ps.aeruginosaللمضادات إذ قاومت عزالت بكتيريا فقد كانت األكثر مقاومة Proteus mirabilis( مضادات اما بكتيريا 01فقد كانت مقاومة لـ ) E.coliمضادات اما بكتيريا Enterobacter( نوعا والمستعملة في االختبار اما بكتيريا70( نوعا من المضادات الحيوية من مجموع الـ)04قاومت )إذ cloacae (3( مضادات وكما في الجدول )9فقد كانت بدورها مقاومة لـ). ر مقاومة للمضادات ( نتائج اختبار الكشف عن إنتاج الغشاء الحيوي في العزالت األكث0( والصورة )4يبين الجدول ) ( أظهرت جميع 0)ومعدل قراءة االمتصاصية للعزالت الشكلالحيوية عن طريق ربط البلور البنفسجي بالبكتيريا المنتجة وقد كانت العزالت متباينة في قوة إنتاج الغشاء الحيوي إذ كانت نسبة ( %011العزالت القابلية على إنتاج الغشاء وبنسبة ) ( 0,5في العزلة رقم ) P.aeruginosa( وبواقع عزلتين للنوع البكتيري%07.5القوي بنسبة )إنتاج الغشاء الحيوي ( وبنسبة %32.5( في حين كانت نسبة إنتاج الغشاء المتوسط )3,6في العزلة رقم )K. pneumoniaوعزلتين للنوع حالية متوافقة مع الدراسة التي ( للغشاء الضعيف تو عت بين العزالت البكتيرية جميعا, كانت نتائج الدراسة ال51%) وP.mirabilisوP.aeruginosa , K.pneumoniaحيت كانت نسبة إنتاج الغشاء الحيوي لـ ]02[أجراها الباحث Enter.cloacae (011% و الدراسة التي أجراها )]بين إن نسبة إنتاج الغشاء الحيوي للعزالت ]08P. aeruginosa , K.pneumonia ,E.coliوP.mirabilis( أظهرت النتائج للنوع %90كانت بنسبة , )Ps. aeruginosa اتفاقا مع جاء إذ أشارت إن نسبة إنتاج ]71[( , وكانت النتائج متوافقة مع ماجاء للباحثة %011إذ كانت نسبة إنتاج الغشاء)] 09[في ( للزوائف الزنجارية. أما النوع %42إذ كانت نسبة اإلنتاج )]70[ولم تكن متفقة مع ما جاء في , (%95الغشاء ) Klebsiella pneumonia وEnterobacter cloacae إذ كانت نسبة ]73[و ]77[فقد كانت النتائج متفقة مع ما جاء ( فقط %71إذ كانت نسبة إنتاج الغشاء )]74[، ولكنها لم تكن متوافقة مع ما جاء في(%011إنتاج الغشاء الحيوي المنتج ) إذ كانت نسبة إنتاج ]75[فقد كانت النتائج مشابهه لما أوجده الباحث E.coli،أما النوع Enterobacter cloacaeللنوع ( نسبة اإلنتاج.%21إذ كانت )] 02[( بينما لم تتفق النتيجة مع ما جاء للباحث %011الغشاء هي ) صول على التحييد التلقائي إال إن العزالت لم تبِد أي اختالف في ْم للح 47تم تنمية العزالت الجرثومية عند درجة حرارة صفة اإلنتاج للغشاء الحيوي في حين كان للحرارة األعلى تأثيرا كبيرا على صفة اإلنتاج وكثافته وكما مبين بالجدول رقم وثات التي قد تكون مسؤولة ( إذ أظهرت نتائج الترحيل الكهربائي فقدان بعض العزالت بال ميدات قد تكون حاملة للمور5) عن صفة إنتاج الغشاء الحيوي في بعض العزالت التي فقدت القابلية على تكوين أو انخفاض تلك النسب بعد تحييدها ( لمعدل االمتصاصية للعزالت بعد التحييد.7بالحرارة كما مبين بالشكل ) المناقشة الواسعة االنتشار فهي تتواجد في مختلف البيئات ومنها التربة والمياه تعد البكتيريا السالبة لصبغة كرام من البكتريا ومنها ما يتخذ من بيئة المستشفيات مستوطنات لها إذ لها القابلية على تحمل الظروف البيئية المختلفة، ولها القدرة على هو قلة اهتمام الكادر الطبي في العيش في المطهرات والمعقمات المخففة وقد يكون أحد أسباب تلوث المعقمات والمطهرات المستشفى بالجوانب الصحية المتعلقة بالتعقيم، فضال عن عدم إتباع الطرائق الصحيحة في تخفيف المحاليل وتقدير التركيز . تزداد إصابات (Acquired infections). وهي تسبب اإلصابات المكتسبة من المستشفى ]76[المثبط للبكتريا الملوثة لكليبسيال في مرضى السكري والنقص المناعي والسيما الداخلين في المستشفيات لغرض المعالجة إذ تتميز الزوائف وا اغلب أنواعها بأنها األكثر شيوعا في بيئة المستشفى كونها انتها ية وهي تسبب اخماج مكتسبة من المستشفى أو ما يسمى ابليتها على تكوين األغشية الرقيقة الحيوية خاصة عندما , وتمتا بق (Nosocomial infections)عدوى المستشفيات .ومن خالل الدراسة الحالية فان العزالت المنتخبة لغرض التحري عن الغشاء وتكوينه كانت ]72[تملك اسواطاً عـديدة أو تحوير في موقع األكثر مقاومة للمضادات الحيوية وإن المقاومة للمضادات في البكتيريا السالبة كرام قد تأتي نتيجة تغير المخصصة الرتباط هذه المضادات ومن ثَم يصبح PBPs (Penicillin-binding proteins) الهدف للمضاد وهي -MBL(Metalo منتجة إلنزيم P. aeruginosaمن العزالت التابعة للنوع %22إن ]79 [.وجد]78[المضاد غير فعال Beta-Lactamase), كما يؤثر نظام الضخ(efflux pump) تأثيرا هاما في مقاومة البكتيريا لمضادات البيتاالكتام حتى وقد تحدث طفرات كروموسومية لمستقبالت المضاد على الرايبوسوم وحدوث الطفرة β- Lactamase غير المنتجة إلنزيم تحتوي على قنوات . كما قد يعود سبب المقاومة إلى حدوث تغير فيحاجز النفاذية للغشاء الخارجي التي ]31[بتردد عالي بروتينية تدعى البورين مما يؤدي إلى صعوبة مرور المضاد والوصول إلى موقع عمله وهذه القنوات بالبكتيريا السالبة تلجا البكتيريا إلى تكوين الغشاء الحيوي كوسيلة لمقاومة الظروف الخارجية كوسيلة دفاعية تحمي بها .]30[لصبغة كرام ون وتحصل في الغشاء الحيوي تكيفات أو تحويرات تستطيع البكتيريا فيها أن تقاوم هذه الظروف إذ المجتمع البكتيري المتك أن البكتيريا المقاومة ألكثر من ثالث مضادات حيوية فان هذه المقاومة قد تكون بسبب التحوير الذي يحصل في ] 37[أشار من ثَم منع مرور المضادات داخل الخلية البكتيرية. ومن تركيب عديد السكريد الشحمي الذي يودي إلى انخفاض النفاذية و اآلليات األخرى التي قد تلجا إليها البكتيريا هي في فقدان بروتينات الغشاء الخارجي والمسؤولة عن تكوين المسام التي في ]33[ا قد أوضحهتسمح بنقل المضادات داخل البكتيريا التي قد تعطي سبب أخر لمقاومة البكتيريا لهذه المضادات وهذا م دراسته. تعد طريقة ربط البنفسج البلوري بالبكتيريا من الطرائق التي يمكن فيها دراسة المراحل المبكرة لتكوين الغشاء علوم حياة |329 7102( عام 1( العدد ) 30المجلد ) مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol.03 (1) 2017 الحيوي الن هذه الطريقة تستعمل ظروف ثابتة أي تكون ساكنة ومستقرة ويمكن أن تكون فعاله في تحديد العديد من العوامل غشاء الحيوي مثل االهداب والالصقات واالسواط وغيرها وان الجينات تلعب دورا مهما في إنتاج الضرورية لتكون ال أن هذه الطريقة يمكن أن تستعمل مع أنواع بكتيرية مختلفة وتلتصق ] 35[كما أشار ]34[السكريات الخارجية المتعددة المتحركة تلتصق في القعر. البكتيريا المتحركة على جدران أو قعر الحفر في حين إن الجراثيم غير أشارت العديد من الدراسات إلى امتال البكتيريا السالبة لصبغة كرام العديد من البال ميدات والتي تشفر ألغلب عوامل باحتواء البكتيريا السالبة على بال ميدات صغيرة مشفرة إلنتاج الغشاء ]36[الضراوة منها إنتاج الغشاء الحيوي إذ أشار عظم عوامل الضراوة األخرى المتمثلة بمقاومة المضادات الحيوية. أظهرت نتائج استعمال الحرارة كمعامل الحيوي وم محييد فقداناً صفة إنتاج الغشاء الحيوي في عدد من العزالت البكتيرية في حين أبدت بعض العزالت فقدان في قوة الغشاء ج الترحيل الكهربائي لبكتيريا الزوائف الزنجارية فقدان بال ميد (.بينت نتائ7دون فقدان صفة اإلنتاج كما موضح بالشكل ) إذ يتبين Ps.aeruginosa(لبكتيريا 3واحد أو أكثر من العزالت التي أظهرت اختفاء صفة اإلنتاج بعد التحييد الصورة رقم ) ( إذ فقدت 7, 0العزلة) ( وفقدان بال ميدين اصغر في4,5, 3) فقدان بال ميد واحد ذو و ن جزيئي كبير في العزلة رقم ( مسؤول عن mega plasmidإذ أشار إلى وجود بال ميد كبير ) ]32[جميع العزالت للبال ميدات وهذا ما أكده الباحث تكوين الغشاء الحيوي وهذا ما ظهر واضحا خالل الدراسة. وبالنسبة لبقية للعزالت المنتخبة األخرى إذ قد تؤدي إذ وثق امتال بكتيريا المتقلبات على بال ميد صغير مسؤول ]38[نتاج وهذا ما جاء متفق مع البال ميدات دور كبير في اإل عن إنتاج تلك الصفة إذ فقدت عزالت المتقلبات صفة اإلنتاج في جميع العزالت المنتخبة فضال عن فقدان البال ميد واحد أو الترحيل الكهربائي إذ أعطت النتائج تباين مختلف قبل أكثر من جميع العزالت عند استعمال الحرارة كعامل محيد وإجراء وبعد التحييد إذ كانت المتقلبات من أكثر البكتيريا مقاومة متعددة للمضادات الحيوية فأن هذا التباين ينعكس على قدرة المسؤولة عن البكتيريا في المقاومة تجاه مختلف المضادات أي إن العالجات أو الطرائق التي تمنع النسخ من الجينات تكوين الغشاء الحيوي قد يكون استراتيجية ناجحة في منع هذه العدوى. ان النقل األفقي للجينات هو المصدر الرئيس لتطور صفة إنتاج الغشاء الحيوي, وتؤدي البال ميدات ]39[أشار الباحث داخل مجتمع الغشاء الحيوي وتحمل أيضا االقترانية دورا مهما بين المجتمع البكتيري إذ إن االقتران البكتيري يحدث موروثات تستطيع أن تشفر لمقاومة المضادات الحيوية ومن ثَم فقدان صفة اإلنتاج للغشاء الحيوي يكون مقترناً بصفة المقاومة ومن ثَم فان الغشاء الحيوي يؤثر على انتشار المقاومة المتعددة فضال عن ارتباطها جينيا بالنقل األفقي مع عوامل .إن عدم فقدان اإلنتاج لصفة الغشاء الحيوي في بعض العزالت وحدوث ]41[ الضراوة األخرى وهذا ما أشار إليه أيضا نقصان في كثافة اإلنتاج قد تعزى إلى الحساسية للحرارة إلى بعض الميكانيكيات المحتملة مثل فقدان بعض التفاعالت رتباطات مختلفة لمستقبالت البروتينات خالل هذا المدى الحراري أو فقدان ا-Protein DNA أو Protein-Proteinمنها ومن ثَم فأنها تعمل على حدوث تغير في فعالية اإلنزيمات المسؤولة عن الذي يقود إلى تثبيط انتقال ألجين أو عدم استقراره ة للعزالت ذات , وقد يعود االختالف في النسب المئوي]40[ومن ثَم توقف أو تقلل من التضاعف DNAتضاعف الـ االختالف في كثافة اإلنتاج إلى العزالت قيد الدراسة إلنتاج الغشاء الحيوي إلى اختالف مصدر العينة إذ إن العزالت كانت من مصادر مختلفة ومن أشخاص مختلفين وبأعمار مختلفة والسيما األشخاص المصابين بداء السكري. المصادر 1. Costerton, J. W.; Stewart, P. S. and Greenberg, E. P. (1999). Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science, 284(5418), 1318-1322. 2. Kramer, A.; Schwebke, I. and Kampf, G. (2006). How long do nosocomial pathogens persist on inanimate surfaces? A systematic review. BMC infectious diseases, 6(1), 1.. 3. Derakhshan, S.; Sattari, M. and Bigdeli, M. (2010). Effect of cumin (Cuminum cyminum) seed essential oil on biofilm formation and plasmid Integrity of Klebsiella pneumoniae. Pharmacognosy magazine, 6(21), 57. 4. Mah, T. F. C. and O'Toole, G. A. (2001). Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in microbiology, 9(1), 34-39. (. دراسة النسق البال ميدي للبكتريا المعزولة من األغشية الحيوية 7119ي، حسن فاضل. )مهدي، داليا صالح وناج .5 آيار. 78-72للعدد الطبية. عدد خاص بمؤتمر كلية العلوم. جامعة بابل. 6. Dadawala, A. I.; Chauhan, H. C.; Chandel, B. S.; Ranaware, P.; Patel Sandip, S.; Khushboo, S. and Kher, H. N. (2010). Assessment of Escherichia coli isolates for in vitro biofilm production. Vet World, 3, 364-366. 7. Benoit, M. R.; Conant, C. G.; Ionescu-Zanetti, C.; Schwartz, M., and Matin, A. (2010). New device for high-throughput viability screening of flow biofilms.Applied and environmental microbiology, 76(13), 4136-4142. علوم حياة |330 7102( عام 1( العدد ) 30المجلد ) مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol.03 (1) 2017 8. Gerdes, K.; Rasmussen, P. B. and Molin, S. (1986). Uniguetype of maintenance functionpostegregational killing of plasmid free cells. Proe. Natl. Acad. Sci. USA., 38: 3116-3120. 9. Martineau, F.; Picard, F. J.; Ménard, C.; Roy , P. H.; Ouellette, M. and Bergeron, M. G. (2000). Development of a Rapid PCR Assay Specific for Staphylococcus saprophyticus and Application to Direct Detection from Urine Samples. Journal of clinical microbiology, 38(9), 3280-3284. 10. Holt, J. G.; Krieg, N.R.; Sneath, P.H.A.; Staley, J.A. and Williams, S.T. (1994). Bergy, s Manual Of Derminative Bacteriology. (9th) ed. Williams and Wilkins. 11. Schwartz, T.; Kohnen, W.; Jansen, B. and Obst, U. (2003). Detection of antibiotic- resistant bacteria and their resistance genes in wastewater, surface water, and drinking water biofilms. FEMS microbiology ecology, 43(3), 325-335. 12. Singh, H.; Rathore, R. S.; Singh, S. and Cheema, P. S. (2011). Comparative analysis of cultural isolation and PCR based assay for detection of Campylobacter jejune in food and faecal samples. Brazilian Journal of Microbiology, 42(1), 181-186. 13. Trevors, J. T. (1986). Plasmid curing in bacteria. FEMS microbiology reviews,32(3), 149-157. 14. Bauer, A.W.; Kirby, W. M. M.; Sherris, J. C and Truck M.(1966). Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. of Clin.Pathol.45:493- 496. 15. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). (2013). Performance standards for disc susceptibility tests, 8th ed. Approved standard M2-A8. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa. 16. Dillon, JA ; Nasim A and Nestmann, E (1985) Recombinant DNA Methodology. John Wiley and Sons Inc., Mississauga, Ontario, Canada. 17. Al-Ani, Narjis Fowzi Ismail. Microbiological Aspects in Biofilm Produced by Some Uropathogens Isolated from Patients with Indwelling Bladder Catheters. Diss. Anbar University, 2008. 07 :3 :485-495- 18. Buniya, H. K. (2013). Transformation of some genetic traits carried on Staphylococcus aureus plasmids to E. coli BL21 (DE3) strain Al-Anbar Journal of Veterinary Sciences : V: 6 I: (1) P,(173-179). 19. Moteeb, S. H. (2008). Quantitative and qualitative assay of bacterial biofilm produced by Pseudomonas aeroginosa and klebsiella Spp. J AlAnbar university for pure science, (3). 20. Naji, E. N.; Ali ,A. A. and Hamzah, B. F.(2015)"The Bactericidal Effect of CO2 Laser on Pseudomonas aeruginosa Isolated from Wound and Burn Infections, In-Vitro".Baghdad Science Journal ISSN: P: 20788665 E: 24117986. 21. Al-Enzi, R. M. and Al-Charrakh, A. (2013)" H. Heavy Metals Resistance of Pseudomonas aeruginosa Isolated from Clinical and Environmental Sources in Hilla City".Medical Journal of Babylon ISSN: 1812156X 23126760:: 10: 1: 110-119 22. Oleiwi, S. R. and Abid, H. K.(2014)" Role of Extracted Genomic DNA on Biofilm Formation by Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella pneumoniae in vitro". Ibn Al- Haitham J. for Pure and Appl. Sci. 27 (3). 23. Mathur, T.; Singhal, S.; Khan, S.; Upadhyay, D. J.; Fatma, T. and Rattan, A. (2006). Detection of biofilm formation among the clinical isolates of staphylococci: an evaluation of three different screening methods. Indian journal of medical microbiology, 24(1), 25. 24. Nktel, f. Al-saad ; Mohammed, S. AL-Saeed and Ilham A. Bnyan. (2012)" Biofilm Formation by Bacterial Isolates from Burn Infected Patients". Medical Journal of Babylon- 9-3. 25. Ebraheem, A. A. and Alwendawi, S. A.(2015)" Screening for in Vitro Biofilm Formation Ability of Locally Isolated Uropathogenic Escherichia coli (UPEC)". Iraqi Journal of Science. 56, (2B): (1310-1314). http://www.iasj.net/iasj?func=issues&jId=146&uiLanguage=en http://www.iasj.net/iasj?func=issues&jId=146&uiLanguage=en http://www.iasj.net/iasj?func=issues&jId=161&uiLanguage=ar http://www.iasj.net/iasj?func=issues&jId=161&uiLanguage=ar http://www.iasj.net/iasj?func=issues&jId=161&uiLanguage=ar علوم حياة |331 7102( عام 1( العدد ) 30المجلد ) مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol.03 (1) 2017 26. Agnihotri, N.; Gupta, V. and Joshi, R. M. (2004). Aerobic bacterial isolates from burn wound infections and their antibiograms—a five-year study. Burns, 30(3), 241-243. 27. Nathwani, D. and Barlow, G. (2005). Is antibiotic resistance a problem, Apractical guide for hospital clinicians. Post. Med. J., 81: 680-692. 28. Nelson, D. E.; Ghosh, A. S.; Paulson, A. L.; and Young, K. D. (2002). Contribution of membrane-binding and enzymatic domains of penicillin binding protein 5 to maintenance of uniform cellular morphology of Escherichia coli.Journal of bacteriology, 184(13), 3630- 3639. 29. Zavascki, A. P.; Gaspareto, P. B.; Martins, A. F.; Gonçalves, A. L. and Barth, A. L. (2005). Outbreak of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa producing SPM-1 metallo-β-lactamase in a teaching hospital in southern Brazil.Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 56(6), 1148-1151. 30. Brooks, G. F.; Butel, J. S. and Morse, S. A. (1998). Medical Mirobiology 21st ed. Appleton and Lange. Stamford United States el America. P. 145 – 176, 231 – 233. 31. Spanu, T.; Luzzaro, F.; Perilli, M.; Amicosante, G.; Toniolo, A.; Fadda, G. and Italian ESBL Study Group. (2002). Occurrence of extended-spectrum β-lactamases in members of the family Enterobacteriaceae in Italy: implications for resistance to β-lactams and other antimicrobial drugs. Antimicrobial agents and chemotherapy, 46(1), 196-202. 32. Hoyle, B. D.; Alcantara, J. and Costerton, J. W. (1992)"Pseudomonas aeruginosa biofilm as a diffusion barrier to piperacillin." Antimicrobial agents and chemotherapy 36.9: 2054-2056 33. Jazani, Nima Hosseini, Afshin Zahedi, and NaserGarebagi. "Phenotypic detection of metallo-β-lactamase producing Pseudomonas aeruginosa isolated from Urmia hospitals." African Journal of Microbiology Research [Internet] 6.7 (2012): 1387-92. 34. Pehl, M. J.; Jamieson, W. D.; Kong, K.; Forbester, J. L.; Fredendall, R. J.; Gregory, G. A. and Orwin, P. M. (2012). Genes that influence swarming motility and biofilm formation in Variovorax paradoxus EPS. PloS one, 7(2), e31832. 35. O'Toole, G. A. (2011). Microtiter dish biofilm formation assay. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (47), e2437-e2437. 36. Chmielewski, R. A. N. and Frank, J. F. (2003). Biofilm formation and control in food processing facilities. Comprehensive reviews in food science and food safety, 2(1), 22-32. 37. Dougherty, K.; Smith, B. A.; Moore, A. F.; Maitland, S.; Fanger, C.; Murillo, R. and Baltrus, D. A. (2014). Multiple phenotypic changes associated with large-scale horizontal gene transfer. PloS one, 9(7), e102170. 38. Khan, A. U. and Musharraf, A. (2004). Plasmid-mediated multiple antibiotic resistance in Proteus mirabilis isolated from patients with urinary tract infection. Medical science monitor: international medical journal of experimental and clinical research, 10(11), CR598-602. 39. Ghigo, J. M. (2001). Natural conjugative plasmids induce bacterial biofilm development. Nature, 412(6845), 442-445. 40. Branda, S. S.; Vik, Å.; Friedman, L. and Kolter, R. (2005). Biofilms: the matrix revisited. Trends in microbiology, 13(1), 20-26. 41. Sherburne, C. K.; Lawley, T.D.; Gilmour, M.W.; Blattner, F.R.; Burland, V.; Grotbeck, E.; Rose, D. J. and Taylor, D. F. (2000). The complete DNA sequence and analysis of R27, a large IncHI plasmid from Salmonella typhithat is temperature sensitive for transfer. Nucleic Acid Research, 28.2177–2186. علوم حياة |332 7102( عام 1( العدد ) 30المجلد ) مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol.03 (1) 2017 ( يوضح االختبارات الكيموحيوية والمجهرية لغرض التميز والتشخيص األولي0) جدول اسم العزلة G r a m s ta in M o ti li ty In d o le M - R e d V -P C it r a te C a ta la se O x id a se U r e a se S 2 H G lu c o se L a c to se C o 2 P. aeruginosa - + - + - + + + - - + - + Kl. pneumoniae - - -+/ - + + + - /+- - + + + Escherichia coli - + + + - - + - - - + + + P. mirabilis - + - + -+/ -+/ + - + + + - - Entero. cloacae - + - - + + + - /+- - + + - ( االوساط الزرعية واستعماالتها والشركة المصنعة لها8جدول ) الشركة المصنعة االستعمال اسم الوسط ت 0. وسط اكار ماكونكي MacConkeyśagar medium عزل العصيات السالبة لصبغة كرام والتفريق بين الالكتو عن غير المخمرةالعزالت المخمرة لسكر Himedia (India) 7. Bloodوسط الدم االساس agar base وسط غذائي الستنبات وتمييز البكتريا المحللة للدم Haemolytic bacteria Himedia (India) 3. وسط االكار المغذي Nutrient agar media لحفظ العزالت البكتيرية النقية على السطح المائل Slant Oxoid (England) 4. Nutrientالمرق المغذي broth لتنمية العزالت البكتيرية وتنشيطها الجراء االختبارات الكيموحيوية Himedia (India) 5. هنتون-اكار مولر Muller-hinton agar الختبار حساسية العزالت البكتيرية للمضادات الحيوية Oxoid (England 6. وسط عزل السيدوموناس Pseudomonas isolation agar لعزل الزوائف الزنجارية وتشخيصها Himedia (India) 2. وسط اكار سترات سيمون Simmon citrate agar هذا الوسط الختبار قابلية البكتريا على استهال السترات كمصدر للكاربون. Oxoid (England) 8. Kligler'sوسط اكار كلكلر Iron agar medium لتشخيص قدرة البكتريا على تخمير السكريات ، وإنتاج الغا من تخمير السكريات وانتاج كبريتيد S2Hالهيدروجين Himedia (India) 9. Peptonوسط ماء الببتون water medium للتحري عن قابلية البكتريا على تحليل الحامض ( وانتاج االندولTryptophanاالميني ) Himedia (India) 01. Ureaاكار اليوريا االساس agar base للتحري عن قابلية البكتريا على انتاج انزيم اليوريز وتحليل اليوريا Himedia (India) 00. الدماغ -مرق نقيع القلب Brain-heart infusion broth لفترات طويلة دون لحفظ العزالت البكتيرية النقية احتمال تعرضها لفقدان بعض مواصفاتها الوراثية Oxoid (England) 07. الفوكس -المثيل األحمر MR-VPبروسكاور التحري والكشف عن المثيل األحمر التي تسهم في 4.6(إلى اقل من PHخفض الدالة الحامضية ) Oxoid (England) علوم حياة |333 7102( عام 1( العدد ) 30المجلد ) مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol.03 (1) 2017 ومقاومتها للمضادات الحيوية البكتيرية ( حساسية العزالت3جدول ) Antimicrobial class المضادات الحيوية ونسبة الحساسية P. aeruginosa K. pneumoniae E.coli P. Mirabilis E. cloacae المعدل N=(54) N=(34) N(14) N=(11) N=(7) 071 Penicillins Ampicillin R% 011 011 011 011 011 011 S% 1 1 1 1 1 1 Oxacillin R% 011 011 011 011 011 011 S% 1 1 1 1 1 1 Ticarcillin R% 011 011 011 011 011 011 S% 1 1 1 1 1 1 β-lactam/β- lactamaseinhibitor Amoxicillin- clavulanic acid R% 011 011 011 011 011 011 S% 1 1 1 1 1 1 Cephems (parenteral ) Cephlothine R% 011 011 011 011 011 011 S% 1 1 1 1 1 1 Cefotaxime R% 011 37(94%) 011 011 7(79%) 85% S% 1 7(6%) 1 1 5(20%) 05% Ceftriaxone R% 51(93%) 79(85%) 2(51%) 0(9%) 6(86%) 65% S% 4(2%) 5(05%) 2(51%) 01(90%) 0(04%) 35% Monobactams Aztreonam R% 011 011 011 011 011 011 S% 1 1 1 1 1 1 Penems Imipenem R% 7(3%) 0(3%) 1 1 1 0% S% 57(92%) 33(92%) ِِ 011(011%) 00(011%) 2(011%) 99% Aminoglycoside Amikacin R% 71(32%) 74(20%) 0(2%) 8(23%) 1 38% S% 34(63%) 01(79%) 03(93%) 3(72%) 2(011%) 67% Gentamycin R% 76(48%) 74(21%) 5(36%) 7(08%) 0(04%) 32% S% 78(57%) 01(31%) 9 (64%) 9(87%) 6(86%) 63% Tobramycin R% 30(52%) 78(83%) 3(70%) 8(23%) 0(04%) 51% S% 73(43%) 6(02%) 00(29%) 3(72%) 6(86%) 51% Ansamycins Rifampin R% 011 011 011 011 011 011 S% 1 1 1 1 1 1 Folatepathway inhibitor Trimethoprim R% 011 30(90%) 01(20%) 011 7(79%) 28% S% 1 3(9%) 4(79%) 1 5(20%) 77% sulfaTri- R% 011 30(90%) 00(28%) 011 1 24% S% 1 3(9%) 3(77%) 1 2(011%) 76% Glycopeptide Vancomycin R% 011 011 011 011 011 011 S% 1 1 1 1 1 1 Lincosamide Clindamycin R% 011 011 011 011 011 011 S% 1 1 1 1 1 1 Phenicols Chloramphenicol R% 01(09%) 6(08%) 07(86%) 011 3(43%) 53% S% 44(87%) 78(87%) 7(04%) 1 4(52%) 42% Quinolones Nalidxic acid R% 50(95%) 8(74%) 03(93%) 011 7(79%) 68% S% 3(5%) 76(26%) 0(2%) 1 5(20%) 37% Ciprofloxacin R% 51(93%) 4(07%) 00(28%) 1 0(04%) 39% S% 4(2%) 31(88%) 3(77%) 00(011%) 6(86%) 60% Tetracycline Tetracycline R% 44(80%) 79(86%) 4(79%) 9(87%) 6(86%) 23% S% 01(09%) 5(04%) 01(20%) 7(08%) 0(04%) 72% = Sensitive(S*) Resistant( =R*) علوم حياة |334 7102( عام 1( العدد ) 30المجلد ) مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol.03 (1) 2017 ( قيم الكثافة الضوئية للغشاء الحيوي بعد ربط البنفسج البلوري بالعزالت المنتخبة والقراءة عند طول موجي 4الجدول ) (nm281قبل التحييد ) Sample at ac 2ac 4ac week mid strong at1 at2 at3 En.cloacae 1 0.124 0.061 0.122 0.244 False True False 0.132 0.128 0.113 En.cloacae 2 0.098 0.061 0.122 0.244 True False False 0.067 0.159 0.07 P. mirabilis 1 0.146 0.061 0.122 0.244 False True False 0.146 0.149 0.145 P. mirabilis 2 0.139 0.061 0.122 0.244 False True False 0.138 0.139 0.142 P. mirabilis 3 0.113 0.061 0.122 0.244 True False False 0.121 0.085 0.135 P. mirabilis 4 0.091 0.061 0.122 0.244 True False False 0.072 0.126 0.075 P. mirabilis 5 0.129 0.061 0.122 0.244 False True False 0.129 0.135 0.125 E. coli 1 0.072 0.061 0.122 0.244 True False False 0.061 0.093 0.063 E. coli 2 0.079 0.061 0.122 0.244 True False False 0.087 0.053 0.097 E. coli 3 0.084 0.061 0.122 0.244 True False False 0.068 0.104 0.082 E.coli 4 0.082 0.061 0.122 0.244 True False False 0.09 0.061 0.097 E. coli 5 0.082 0.061 0.122 0.244 True False False 0.088 0.083 0.076 E. coli 6 0.127 0.061 0.122 0.244 False True False 0.119 0.135 0.127 Kl.Pneumoniae1 0.168 0.061 0.122 0.244 False True False 0.157 0.187 0.161 Kl.Pneumoniae2 0.089 0.061 0.122 0.244 True False False 0.1 0.089 0.079 Kl.Pneumoniae3 0.253 0.061 0.122 0.244 False False True 0.265 0.244 0.25 Kl.Pneumoniae4 0.080 0.061 0.122 0.244 True False False 0.09 0.073 0.077 Kl.Pneumoniae5 0.110 0.061 0.122 0.244 True False False 0.112 0.11 0.109 Kl.Pneumoniae6 0.252 0.061 0.122 0.244 False False True 0.248 0.251 0.258 Kl.Pneumoniae7 0.141 0.061 0.122 0.244 False True False 0.144 0.15 0.129 Kl.Pneumoniae8 0.128 0.061 0.122 0.244 False True False 0.126 0.124 0.134 Kl.Pneumoniae9 0.133 0.061 0.122 0.244 False True False 0.143 0.125 0.131 P. aeruginosa 1 0.249 0.061 0.122 0.244 False False True 0.252 0.243 0.253 P. aeruginosa 2 0.078 0.061 0.122 0.244 True False False 0.067 0.105 0.062 P. aeruginosa 3 0.118 0.061 0.122 0.244 True False False 0.132 0.1 0.123 P. aeruginosa 4 0.092 0.061 0.122 0.244 True False False 0.082 0.108 0.086 P. aeruginosa 5 0.245 0.061 0.122 0.244 False False True 0.264 0.228 0.243 P. aeruginosa 6 0.0896 0.061 0.122 0.244 True False False 0.078 0.113 0.078 P. aeruginosa 7 0.1273 0.061 0.122 0.244 False True False 0.128 0.121 0.133 P. aeruginosa 8 0.1106 0.061 0.122 0.244 True False False 0.164 0.103 0.065 P. aeruginosa 9 0.1373 0.061 0.122 0.244 False True False 0.145 0.136 0.131 P.aeruginosa 10 0.128 0.061 0.122 0.244 False True False 0.155 0.065 0.164 علوم حياة |335 7102( عام 1( العدد ) 30المجلد ) مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol.03 (1) 2017 ( nm281( قيم الكثافة الضوئية للغشاء الحيوي بعد ربط البنفسج البلوري بالعزالت المنتخبة والقراءة عند طول موجي )5الجدول ) بعد التحييد  at معدل قراءة االمتصاصية للعزالت عند الطول الموجي =nm281 =𝒂𝒕𝟏 + 𝒂𝒕𝟐 + 𝒂𝒕𝟑 / 𝟑  ac .معدل قراءة االمتصاصية لعزلة الكونترول =  2ac .ضعف معدل قراءة االمتصاصية لعزلة الكونترول =  4ac .أربعة اضعاف معدل قراءة االمتصاصية لعزلة الكونترول =  at1 القراءة للمكرر االول =  at2 القراءة الثانية للمكرر =  at3 القراءة الثالثة للمكرر =  weekغشاء ضعيف =  mid غشاء متوسط =  strong غشاء قوي = Sample at ac 2ac 4ac week mid strong at1 at2 at3 En.cloacae 1 0.056 0.057 0.114 0.228 False False False 0.054 0.054 0.061 En.cloacae 2 0.062 0.057 0.114 0.228 True False False 0.063 0.066 0.059 P. mirabilis 1 0.056 0.057 0.114 0.228 False False False 0.056 0.056 0.058 P. mirabilis 2 0.057 0.057 0.114 0.228 False False False 0.056 0.058 0.057 P. mirabilis 3 0.057 0.057 0.114 0.228 False False False 0.06 0.055 0.056 P. mirabilis 4 0.056 0.057 0.114 0.228 False False False 0.056 0.058 0.056 P. mirabilis 5 0.055 0.057 0.114 0.228 False False False 0.053 0.055 0.057 E. coli 1 0.057 0.057 0.114 0.228 False False False 0.055 0.058 0.058 E. coli 2 0.055 0.057 0.114 0.228 False False False 0.056 0.056 0.053 E. coli 3 0.054 0.057 0.114 0.228 False False False 0.06 0.054 0.048 E.coli 4 0.060 0.057 0.114 0.228 True False False 0.06 0.064 0.057 E. coli 5 0.055 0.057 0.114 0.228 False False False 0.051 0.054 0.061 E. coli 6 0.052 0.057 0.114 0.228 False False False 0.05 0.06 0.046 Kl.Pneumoniae 1 0.056 0.057 0.114 0.228 False False False 0.06 0.053 0.055 Kl.Pneumoniae 2 0.056 0.057 0.114 0.228 False False False 0.056 0.064 0.049 Kl.Pneumoniae 3 0.062 0.057 0.114 0.228 True False False 0.054 0.062 0.071 Kl.Pneumoniae 4 0.057 0.057 0.114 0.228 False False False 0.056 0.057 0.058 Kl.Pneumoniae 5 0.065 0.057 0.114 0.228 True False False 0.064 0.066 0.067 Kl.Pneumoniae 6 0.070 0.057 0.114 0.228 True False False 0.071 0.072 0.068 Kl.Pneumoniae 7 0.055 0.057 0.114 0.228 False False False 0.052 0.06 0.053 Kl.Pneumoniae 8 0.072 0.057 0.114 0.228 True False False 0.062 0.077 0.077 Kl.Pneumoniae 9 0.075 0.057 0.114 0.228 True False False 0.075 0.076 0.075 P. aeruginosa 1 0.058 0.057 0.114 0.228 True False False 0.059 0.058 0.057 P. aeruginosa 2 0.07 0.057 0.114 0.228 True False False 0.074 0.071 0.065 P. aeruginosa 3 0.055 0.057 0.114 0.228 False False False 0.054 0.057 0.055 P. aeruginosa 4 0.066 0.057 0.114 0.228 True False False 0.063 0.064 0.073 P. aeruginosa 5 0.056 0.057 0.114 0.228 False False False 0.054 0.06 0.055 P. aeruginosa 6 0.056 0.057 0.114 0.228 False False False 0.059 0.057 0.054 P. aeruginosa 7 0.067 0.057 0.114 0.228 True False False 0.061 0.067 0.073 P. aeruginosa 8 0.064 0.057 0.114 0.228 True False False 0.063 0.069 0.061 P. aeruginosa 9 0.056 0.057 0.114 0.228 False False False 0.054 0.052 0.062 P.aeruginosa 10 0.068 0.057 0.114 0.228 True False False 0.072 0.065 0.068 علوم حياة |336 7102( عام 1( العدد ) 30المجلد ) مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol.03 (1) 2017 قيم الكثافة الضوئية للغشاء الحيوي قبل التحييد (0شكل ) ( قيم الكثافة الضوئية للغشاء الحيوي بعد التحييد8شكل ) conterol P.areuginsa K.pnumoni a E.coli P.miriballis Ent.ecalase Isolution 1 0.244 0.249 0.168 0.072 0.146 0.124 Isolution 2 0.122 0.078 0.089 0.079 0.139 0.098 Isolution 3 0.061 0.118 0.253 0.084 0.113 Isolution 4 0.092 0.08 0.082 0.091 Isolution 5 0.245 0.11 0.082 0.129 Isolution 6 0.089 0.252 0.127 Isolution 7 0.127 0.141 Isolution 8 0.11 0.128 Isolution 9 0.137 0.133 Isolution 10 0.128 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2 0.22 0.24 ة م قي O .D ي ج و م ال ل و ط ال د عن n m 2 8 1 غشاء حيوي قوي غشاء حيوي متوسط غشاء حيوي ضعيف Conterol Pareuginsa K.pnumnia E.coli P.miriballis Ent.ecalase Isolution 1 0.228 0.058 0.056 0.057 0.056 0.056 Isolution2 0.114 0.07 0.056 0.055 0.057 0.062 Isolution 3 0.057 0.055 0.062 0.054 0.057 Isolution 4 0.056 0.066 0.057 0.06 0.056 Isolution 5 0.056 0.065 0.055 0.055 Isolution 6 0.056 0.07 0.052 Isolution 7 0.067 0.055 Isolution 8 0.064 0.072 Isolution 9 0.056 0.075 Isolution 10 0.068 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2 0.22 0.24 ة يم ق O .D ي ج و لم ا ل و ط ال د عن n m 6 7 1 غشاء حيوي قوي غشاء حيوي متوسط غشاء حيوي ضعيف عديمة الغشاء الحيوي مجموعة السيطرة علوم حياة |337 7102( عام 1( العدد ) 30المجلد ) مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol.03 (1) 2017 ( البنفسج البلوري المرتبط بإنتاج الغشاء الحيوي للعزالت المنتخبة0لصورة )ا ساعة 1.5فولت / سم 5وفولتية %1.2البالزميدي على هالم االكاروز بتركيز DNAالترحيل الكهربائي للـ (2صورة ) العزلة األولى والثانية والثالثة 1PsA,2PsA,3PsA,4PsA,5PsAإذ يمثل المسار Ps.aregenousaلبكتيريا الـ العزلة األولى والثانية والثالثة والرابعة 1PsM,2PsM,3PsM,4PsM,5PsMوالرابعة والخامسة قبل التحييد وتمثل التحييد. والخامسة بعد PLASM ID العينات 1PsA 2PsA 3PsA 4PsA 5PsA 1PsM 2PsM 3PsM 4PsM 5PsM مجموعة السيطرة العينة األولى علوم حياة |338 7102( عام 1( العدد ) 30المجلد ) مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol.03 (1) 2017 Determine the Biofilm Formed by Using ELISA Technology for Gram-Negative Bacteria Isolated from Wounds and Burns Infections, and the Study of the Production of the Biofilm Molecularly. Omar Nama Flaih Laith Musleh Najeb Dept. Of Biology / College Of Science/ University Of Al-Anbar Rana Kadhim Mohammad Dept. Of Biotechnology / College Of Science/ University Of Baghdad Received in :22/ March /2016 , Accepted in : 28 /December/ 2016 Abstract This study was designed to investigate the capability of gram-negative bacteria that isolated form wound and burn infection to production of Biofilm which included (32) isolates, which have multi – drug resistant to antibiotics. The isolates included (10) Pseudomonas aeruginosa, (9) Klebsiella pneumoniae, (6) Escherichia coli, (5) Proteus mirabilis and (2) Enterobacter cloacae. The method used method links the crystal violet with biofilm and reading by ELISA which was adopted on the values of optical density of violets that linked to the mass of biofilm at the wavelength of (620) nm, the test results showed variation of biofilm composition for all bacterial species depending on the optical density value while the most production of biofilm was product form bacterial isolated from diabetes patients wound. Agarose gal electrophoreses results show that all isolate have a different plasmid profile according to the (size and position), it was also that temperature used as a curing factor causes a high frequency loss the plasmid from all isolates and according to this reason the yield was different after the curing that maybe refers to the role of both plasmid and chromosome in regulating this phenomena. Keywords: Gram Negative Bacteria, Biofilm, Crystal Violate, Plasmid