الصرفة والتطبیقیة المجلد 200) 4 (22مجلة ابن الھیثم للعلوم 9 تریا Serratia marcescenceدراسة دور بروتینات الغشاء الخارجي لبك في المقاومة للمضادات الحیویة هناء سلیم یوسف جامعة بغداد، كلیة العلوم،قسم علوم الحیاة الخالصة عزالت من بكتریا بعد اجراء خیصیة على عشر حساسیة يجرأ Serratia marcescenceالفحوصات التشی فحص ال تا الكتام لجمیع العزالت،للمضادات الحیویة المختلفة ضادات بی ز االنزیم المحلل لم . و فحص القابلیة على افرا عزالأ عزلت بروتینات الغشاء الخارجي و یة البروتین ألربع یخذ معدل كم ت و عزلت ة للمضادا كثر مقاوم ن اقل ت األ من خالل الدراسة وجد ان بكتریا .مقاومة للمضادات تحت األختبار مقاومة عالیة لمدى واسع من وذ S.marcescence و قاومة تعود ،المضادات الحیویة ت الغشاء الخارجي عدیدةعواملل و ان هذهذ الم الشتراك مع بروتینا و مثل افراز البنسلینیز با عوامل متآزرة مع بعضها لمقاومة المضادات الححیویة و منع تأثیرها .ِتعمل هذه ال المقدمة دور في احداث االصابات المرضیة من اهمیة طبیة في العقدین األخیرین لمالهاS.marcescence اكتسبت بكتریا هابات المجاري البول، التهابات الحروق و الجروح: مثل،المختلفة رة والسیما و،یة و الت المراض الخطی رها من ا ص غی الشخا في ا یات تشف .[1]ذوي المناعة الضعیفة و الراقدین في المس ادات الحیویة S.marcescence ان االصابة الناجمة عن بكتریا اومتها لمدى واسع من المض صعبة العالج بسبب مق یویة اذ ،[2] ِ في مقاومة هذه "ا كبیر"ا دور[4] و بروتینات الغشاء الخارجي ،[3]تلعب االنزیمات المثبطة للمضادات الح لحیویة لبكتریا [5] و جماعته Palomer فقد بین الباحث .المضادات مضادات ا النفاذیة لل بسبب الغشاء S.marcescence ان ارجي یعتمد على المستضد الجسمي نبیة ) O) O-somatic antigenالخ رات (O-side chain)و السلسلة الجا و ان الطف M)التي ینقصها هذا المكون تمتاز بانخفاض قیمة التركیز المثبط االدنى IC)و ، لمضادات البیتاالكتام مقارنة بالعزالت االبویة ثبط االدنى(O)ان استرجاع المستضد و قد بین الباحث على ان النفاذیة تعتمد على المستضد . یستعید قیمة التركیز الم المقاومة للبنسلینات و منها [6] و جماعته Ito ذكر الباحث بینما. Oالجسمي Imip) ان enem) یعود الى انتاج انزیم M etallo-β-Lactamase بین الباحث chon المحمول على البالزمید في حین g و ([7]) و جماعته Nikaido [8] ان ارجي و ه الموجو(Porine)المقاومة تعود الى بروتینات . تمنع مرور المضادات"ا نفاذی"احاجزي تعمل دة في الغشاء الخ الصرفة والتطبیقیة المجلد 200) 4 (22مجلة ابن الھیثم للعلوم 9 مل المواد و طرائق الع االوساط الزرعیة ة هي Nutاالوساط الزرعی rient broth و Nut rient agarو M acChonkey agarو M uller Hinton Agarص و اقرا .ادات الحیویةالمض العزالت صادر اآلت تم ال ت من الم زال بات الحروقحصول على الع روح،یة عزلتان من التها ى الكلیة، و الج و ،و عزلتان من حص ة و ثالث عزالت من البیئة الخارجیة ).تجمعات مائیة مؤقتة(ثالث عزالت من التهابات المجاري البولی التشخیص ضاللروتینیة باالعتماق اائ تم التشخیص بالطر مجهریة ف اجریت . الى الفحوصات البایوكیمیائیةعن" د على الفحوصات ال مال نظام معتمدة وتم التأكد من التشخیص باستع ماورد في انظمة التشخیص ال مادا على EPI 20Eًاالختبارات اعت (Biomeru x). Baure-Kirby) استعملت طریقة كیربي .[9]مضادات الحیویة و مقارنة النتائج بالمصدر ألختبار الحساسیة لل( صدر تاج انزیم البنسلینیز حسب الم S.marcescence نقل قطرة من معلق كثیف لبكتریا بأختصارو ، [10]اجري فحص ان سم0.1النقیة الى انبوبة تحتوي على 3 ین سم/ مكغم6.000 بتركیز G من محلول مضاد البنسل 3 غرفة رة ال و تركت بدرجة حرا (1 من محلول النشا المائي بتركیز ان ثم اضیف لها قطرت،مدة نصف ساعة من محلول ،)حجم/وزن% بعد ذلك اضیف قطرة خالل اقل من الزرق الى االبیض یر اللون ا بوبة و مزجت جیدا و لوحظ تغ دقائق و هذا دلیل على انتاج 10ًالیود الى االن .االنزیمات المحللة لمضادات البیتاالكتام ستخالص و تقدیر بروتینات الغشاء الخارجيا ماورد في المصدر على تمت الطریقة سم1 نقل اذ ،(Osborn,1980) [11] وفق 3 ائلة بعمر ساعة 18 من مزرعة س ن وسط نقیع الدماغ والقلب بحرارة . السائل الى لتر واحد م . ساعة 18 و مدة ˚ م37حضن الدورق علقت الخالیا . ˚ م4 و حرارة (g×8000) دقیقة بسرعة 30 جهاز الطرد المركزي مدة خدام باست جمعت الخالیا بعد الحضن یولوجي مركزي ،و غسلت ثالث مرات باستخراج محلول الملح الفس طرد ال الق باستخدام جهاز ال نبذ الع ة السابقةب و تم الطریق ساعة و 24 و مدة ˚ م40وضعت في الحاضنة بحرارة جففت الخالیا بوضعها في انبوبة صغیرة مغلقة بسداد قطني و. نفسها سم10 ملغم من الخالیا البكتیریة الجافة في 10استخلصت بروتینات الغشاء الخارجي بتعلیق 3 ظم من المحلول الملحي المن Tris-HCl Buffer 7.8 موالر و دالة الحموضة قیمتها تساوي 0.05 بتركیز (p H=7.8) الحاوي على EDTA 1 بتركیز ا باستخدام. ˚ م4لي موالر ألزالة المواد الالخلویة و بحرارة م (Ultrasonic) جهاز الترددات فوق الصوتیة حطمت الخالی مرات 15ثانیة لمدة / ذبذبة 24.000بتسلیط ملیة اربع حرارة مع مدة، و كررت الع اظ على ، ˚ م4 توقف لتبرید المحلول للحف رد المركزي المبرد بسرعة فصل الراشح عن الراسب باستخدام جهاز ×6000 الط g ة ساعة بحرارة ي . ˚ م4 لمد ب الراسب ف اذی امضي ظم ترس الح Tris-H)المحلول المن Cl) مقدارها 0.05 بتركیز حموضة ر و دالة مال . 8- 7 موال تم تركیز البروتین باستع .مال لحین االستع˚ م20-طریقة الفرز الغشائي و استعمال السكروز و تم الحفظ بحرارة : و باستخدام المعادلةWitakar & Granum كمیة البروتین باستعمال طریقة تس قی الصرفة والتطبیقیة المجلد 200) 4 (22مجلة ابن الھیثم للعلوم 9 سم/ملغم(تركیز البروتین 3 nm280 االمتصاصیة بطول موجي– nm235االمتصاصیة بطول موجي)= 2.51 شة النتائج و المناق ستنادا الى التشخیص مكونكي ا ط آكار ال ق ائ الى الطرشكل المظهري و المجهري و فضال عن ً العزالت المنماة على وس نتائج مطابقة لطر. APIE20الكیمیائیة و تم تأكید التشخیص باستعمال نظام ق التشخیص المعتمدة و بكتریا ائو قد جاءت ال Serratia marcescenceة تنتمي الى ع Enterobacteria ائل ceaeي مق اذ تؤدي ها بروتینات الغشاء دور ف اومت ضال مقاومة ضمن افراد العائلة عن" للمضادات الحیویة ف الى امكانیة انتقال بلزمیدات ال [13]. عزالت كانت فارزة النزیم نسلینات جدول β-Lactamase من خالل الدراسة وجدنا ان جمیع ال . )1( الذي یثبط الب مرضیة كانت فاقدة لملون و هي تحتل Prodigiosinو من خالل الجدول نفسه نالحظ ان معظم العزالت المأخوذة من حاالت زالت المرضیة% 71.4نسبة ة ،من مجموع الع من عزالت % 66 بینما كانت نسبة ،%28.5 في حین الفارزة للملون تحتل نسب ى افرا مطابقالبیئة الخارجیة و تمتلك القابلیة عل مرضیة بین ان العزالت ا، اذ[14] لما حصل علیه "از الملون و هذا ماجاء ل راسةُغالبا ماتكون فارزة للملون رجة ، ان لظروف الزرع15]، 16[ و قد اوضحت الد ضنحرارة و د و ملح الطعام و ،الح ها عوامل تؤثر ،االیونات رضفي و الضوء كل عزالت الم ب ال ت فاقدة للملون لذلك الیعدی افراز الصبغة و بما ان اغل الملون ة كان .[14] عامل فیاعة للبكتریا ة عن بكتریا السالبة ا اعتمد في الدراسة على المضادات المتو ة المتسبب ت المرضی الج الحاال تعملة لع ق و المس فرة في االسوا .رامگلملون المقاومة ناجمة عن سوء ِ و ان هذه، الحیویةنجد ان هناك مقاومة متعددة لغلب المضادات) 2( عند مالحظة جدول بطة للمضادات كماانها استعمال المضادات الحیویة التي تسبب في انتقاء العزالت المقاومة و التحفیز على افراز االنزیمات المث ا یبه الكیمی ر في ترك ب تغی بسب ي سماحئيتؤدي الى تغییر في نفاذیة الغشاء الخارج ى عدم ال ي یؤدي ال ضاد بالنفاذ او و الذ للم رابع فعالة ضد بكتریا ] 7،8 [تثبیط المضاد بحیث الیعمل على البكتریا S.marcescence و ان سیفالوسبورینات الجیل ال یز .]18، 17[بسبب قلة االلفة بینها و بین انزیم البنسلین ها السلسلة الجانبیة Palomar كما اوضح ت التي ینقص لذلك اشار الى دور MICsقلل قیمة تO و جماعته ان الطفرا .[5] في نفاذیة المضادات عبر الغشاء الخارجيOالسلسلة ِلمضاد الجنتامایسین و تعزى هذه % 100مضادات االمینوكالیكوسایدات فیالحظ ان هنالك مقاومة الى اما بالنسبة ر هعن" فضالالمقاومة ات تعمل على تحوی اذیة الى وجود انزیم ى حاجز النف مولة عل ضادات و هذه االنزیمات مح ِذه الم ِ ل [3] البالزمید و یمكن انتقائها بین افراد العائلة ر على مضادات االمینوكالیكوساید مث و ان االنزیمات المثبطة التي تؤث جمه .20Kb-10ُالجنتامایسین و االمیكاسین تكون محمولة على بالزمید یتراوح ح الصرفة والتطبیقیة المجلدمجلة ابن الھیثم للعلو 200) 4 (22م 9 عددة المقاومة هو Amikacinل ان مضاد ا) 2( من الجدول نالحظ نالحظ اقل مقاومة .االنسب لعالج حاالت البكتریا المت و Cepكانت للجیل الرابع من السیفالوسبورینات و ه hot axim و Cep ht riexone و ال یقتصر استعمالها ضد هذه البكتریا ِ .]17[فقط و انما یستعمل لجمیع افراد عائلة البكتریا المعویة صعبة العالج نا ان اكثر العزالت مقاومة و هي )3( جدول قیاس كمیة بروتین الغشاء الخارجيالى بالنسبة ، S1 ، S4 ، S5 وجد S10توا 2.56 و معدل كمیة البروتین لها كانت 2.51 ، 2.07 ، 2.97 ، 2.71لي كمیة البروتین لها كانت على ال سم/مكغم 3 تائج موافقة ت هذه الن ة للمضادا یة المقاوم ز الملون و هي عال ة على افرا یمة القابلی میعها عد ِ و هذه العزالت كانت ج ِ .]14 [للنتائج التي حصل علیها عزالت االقل مقاومة نسبیا ضادات الحیویة و هي ًفي حین ان ال غشاء S9 و S2للم فارزة للملون و كمیة بروتینات ال ارجي كان على التوالي معدل كمیة البروتین 1.65 ، 1.78الخ تریا 1.71 و ارجي للبك و هي اقل من كمیة بروتینات الغشاء الخ .الفاقدة للملون الصابة لالشخاص ذوي المناعة الضعیفة و هي بكتریا انتهازیة لها القابلی S.marcescence ان بكتریا ة على احداث ا كتریا المعویة ة من افراد عائلة الب ت المقاوم ن طریق انتقال جینا ضادات الحیویة ع لها القابلیة على اكتساب المقاومة ألغلب الم بح قلیلة النفاذیة غشاء الخارجي لتص نات ال تحویر بروتی .]19 [االخرى كما تمتلك القابلیة على Multidrug eff كما ان بروتینات نظام lu x p ump s س مختلفة و ان نتاجیة و فعالیة هذه مواد اسا ِ تعمل على ر عدیدةعواملبالبروتینات تتأثر ن انتاجها یكون كبی م یعتمد على الطاقة و قد وجد و ان هذا النظا، في السالالت الممرضة"ا و ا لسالالت الممرضة "انه یؤدي دورا یعتمد على الطاقة و قد وجد انه ،في ا في مقاومة "یا اساس"ادوریؤدي و ان هذا النظام Pseudomonas aeroginosaعائلة المعویة . و بقیة افراد ال ثل مضاد من مجموعة ِ لعالج االصابات الناجمة عن هذه البكتریا متعددة المقاومة یستعمل خلیط من مضادین او اكثر م ضاد البیتاالكتام بمنع اعادة النمو ،یدات فاالمینو كالیكوسایدات تحفز القتل السریع و اختزال الطعماالمینوكالیكوسا نما یقوم م بی ]20[. المصادر 1. Korner,R.J.; Nicol, A. and Reeves, D.S.(1994). Cip rofloxacin resistant Serratia marcescence endocard itis as a comp licat ion of non-Hodgkin 's lymp homa. J.infect. 29:73- 76. 2. Sleigh,J.D.(1983).Antibiotic resistance in Serr atia marcescenc e. BM J.287:1651-1653. 3. Garcia,D.C.; Wo loj,G.M .; Pileiro,S. and Sord elli,O.(1995). An 8-y ears study of resistant to amikacin in gr am-ne gative bacilli isol ated from p atient with nosocomial inf ections at one hosp ital in Argentina.J.M cd.Microbiol.42:283-390. 4. Nikaido,H.(1994).Prevention of dru g access to bacterial targets : Perm eability barriers.S cien ce.15:382-388. 5. Palomars,J.: Puig,M.; M ont illa, R. and Loren JG .(1995). Lipop oly saccharide recovery rest ores s uscep tibility levels towards β-lactamase in S. marcescence. M icrobios.82:21-26. الصرفة والتطبیقیة المجلد 200) 4 (22مجلة ابن الھیثم للعلوم 9 6. Ito, H. ; Arakawa,Y.; Ohsuka,S. and W acharot ay ankum,R. (1995).Plasmid- mediated dissemination of the metallo-β- lactamase gen e blatmp among clinically isolated strains of Serratia marcescence. Ant imicrobial Agents Chemoth.39:824-829. 7. Chong, Y.; Lee,K.; and Kwon O.H.(1993).Invitro activities of cefepime against Enterobact er cloacae, S. marcescenc e, Pseudom onas aeruginosa and other aerob ic Gram- negative bacilli.I.Antimicrob.Chemot h.32 Sup p l.B:21-29. 8. Nikaido,H.; Liu,W.; and Rosenber g,E. Y.(1990).Out er membran e p ermeability and β- lactamase st ability of dip olar ionic cephalosp orins containing methalo xy immo substituent s.Ant imicrob A gents.Chemoth.34:337-342. 9. National Comm ittee for Cl inical Labor atory Standars (NCCLs).(1989).Peromance st andars for antibacterial suscep tibility testing. 10. Roseblatt ,J.E. and Neumann.(1978).A rapid test for p encillinase. Am.J. Clin.Pathology .89:351-354. 11. Osborn, M . J. and Wu ,H.C.(1980).Proteins of the outer membrane of gr am ne gative bacteria Ann.Rev.M icrobiol. 34:369-422. 12. Witakar,R.J. and Grannum,P.E.(1980).An absolut e m ethand for p rotein determination based on deferen ce in absorbance 235 , 280.Ana l.Bioch emisery .109:156-159. 13. Grimont , PAD , Grimont,F.(1984). Serratia in Krieg, N.R. Holt, J.G.(eds) Ber gey 's M annual of systematic bacteriology Vol.I. B altemore, Williams and Wilkins.477- 484. 14. Philip s,I. and King A.(1977). Serr atia marcescence in hosp ital practice.Lancet 1, 538. 15. Williams, R.P.; Gott C.L.; and Qadri, S.M .H.(1971).Influence of temper true of incubation and type of growth medium on pigmentation in Serr atia marcescence . J.Bacteriol.106:438-443. 16. Silv erman, M.P. and M unoz,E.F.(1973).Effect of iron and salt on p rodigiosin synt hesis in Serratia marcescence .J.Bacteriol.114,999-1006. 17. Bellido,F .; Pechere,J.C. and Hanco ck,R.E.W.(1991).Novel method for m easurement of out er membran e permeability to new β-lactamase in intact Enterobacter cloa cae cells Ant imicrob. Agents,Chemother.35,68-72. 18. De Champ s,C.; Henqw ell,C. and Guelon,D.(1993).Clinical and bacteriological st udy of nosocomial infection due to Enterobacter aerogenes resist ant to impenem.Clinic M icrob.13:123-127. 19. Nikaido,H.(1989).Outer membrane barri er as a mechanism of antimicrobial resistance.33(11):1831-1836. 20. Carbon,C.(1991).Imp act of the ant ibiotic dosage schedule of efficacy in exp erimental endocarditis. J.Infect.Dis.supp .74:164-172. الصرفة والتطبیقیة المجلد 200) 4 (22مجلة ابن الھیثم للعلوم 9 β-La و انزیمات Prodigiosin على افراز ملون S.marcescence قابلیة عزالت :)1(جدول ctamas e القابلیة على افراز ملون مصدر العزلة رقم العزلة Prodigiosin ت القابلیة على افراز انزیما β-Lactamase + - التهاب الحروق 1 + + التهاب الجروح 2 كلیة 3 + - حصى ال + - حصى لكلیة 4 + - التهاب المجاري البولیة 5 + + التهاب المجاري البولیة 6 + - التهاب المجاري البولیة 7 + + بیئة خرجیة 8 + + بیئة خارجیة 9 + - بیئة خارجیة 10 )9(ًللمضادات الحیویة المختلفة استنادا للمصدر S.marcescenceیة بكتریا حساس:)2(جدول تركیز المضاد المضاد الحیوي قرص/مكغم ت الحساسة العزال (%)العدد ة ت متوسط عزال (%)الحساسیة العدد اومة ت المق العزال (%)العدد Amp icillin 10 (0.0)0 (0.0)0 (100)10 Amoxy cillin 25 (30)3 (10)1 (60)6 Amikacin 30 (40)4 (40)4 (20)2 Gent amicin 10 (0.0)0 (0.0)0 (100)10 Nalidi xic acid 30 (30)3 (30)3 (40)4 Cep halexin 30 (30)3 (20)2 (50)5 Cephotaxime 30 (40)4 (40)4 (20)2 Cepht ricxone 30 (70)7 (20)2 (10)1 الصرفة والتطب 200) 4 (22یقیة المجلدمجلة ابن الھیثم للعلوم 9 سم/ مقاسة بالمكغم S.marcescence كمیة البروتین في الغشاء الخارجي لبكتریا :)3(جدول 3 ة البروتین العزلة كمی S1* 2.71 S2 1.78 S3* 2.35 S4* 2.27 S5* 2.07 S6 3.07 S7* 2.44 S8 1.05 S9 1.65 S10* 2.51 IBN AL- H AITHAM J. FO R PURE & APPL. S CI. VO L.22 (4) 2009 Study of the Role of the Outer Membrane Proteins of Serratia marcescence in Resistant to Antibiotics H. S. Yossef De partment of Biology , Colle ge of Science , Unive rsity of Baghdad Abstrac t Aft er diagnostic test s on ten isolates of S. marcescence, were made an examination of sensitivity to various antibiotics and checkin g the ability to p roduce β-lactamase of all isolates. The outer membrane prot ein quant ity was determined in μg/cm 3 for all isolates. The results showed that S. marcescence have antibiotic multiresistant and all isolates had the ability to p roduce β-lactamase and its resistance may arise from more than two mechanisms like overp roduction of antibiotic inactivation enzy mes and the decrease of p ermeability by outer membran e prot ein.