IBN AL- HAITHAM J. FO R PURE & APPL. SC I VO L.22 (3) 2009 Purification of Fungul Gluco amylase and Study the Effect of Concentration And Thermal Processing on Enzymatic Activity of Starch Hydrolysis M. K. M. Jwai d Departme nt of Chemistry, College of Education, I bn Al-Haitham, Unive rsity of Baghdad Abstract Glucoamylase from black Asp ergillus niger isolate was p urified by ammonium sulfate p recipitation and sep hadex G 200 filtration. A trial for the p urification of glucoamy lase resulted in an enzy me with a sp ecific activity of 6472 unit/mg p rotein with 10 times fold. The main goal of the p resent work was to test this enzy me in hy drolyzing the raw st arch. Two substrates were used: corn st arch and p otato st arch 2% (w/v). The effect of enzy me dosage and thermal processing of substrate on kinetics and efficiency of hy drolysis were st udied. The results suggested that the glucoamy lase activity is increased as the increase of enzy me concentration and the enzy me was sufficiently effective in hy drolyzing tested raw starch, and thermal modification of substrates was not necessary . رفة والتطبیقیة المجلدمجلة ابن 2009) 3( 22الهیثم للعلوم الص تنقیة الكلوكوامیلیز الفطري ودراسة تأثیر الجرعات المختلفة من االنزیم تحلل النشا الخام فيوالمعامالت الحراریة التصنیعیة في فعالیة االنزیم مثلى كاظم محمد جواد جامعة بغداد ،كلیة التربیة ابن الهیثم ،قسم الكیمیاء الخالصة ـــ Asp.nigerُنقــيَّ الكلوكـــوامیلیز المنــتج مـــن عزلــة االســـود بوســـاطة الترســیب بكبریتـــات االمونیــوم، والترشـــیح بالـ Sephadex G 200ملغم بروتین، وبدرجة عشر مرات تنقیة/وحدة 6472فعالیة نوعیة ي، ونتج من التنقیة أنزیم ذ. اســاس يلهــذا الغـرض مـادت عملالهـدف الـرئیس للعمــل الحـالي هـو اختبــار قـدرة هـذا االنــزیم علـى تحلـل النشــا الخـام، فاسـتان ثـم درسـت تـأثیر الجرعـات المختلفــة لالنـزیم والمعـامالت الحراریـة التصـنیعیة فــي (v/w)% 2نشـا الـذرة، ونشـا البطاطــا همـا وان االنـزیم كـان كفـوءًا فـي تحلـل ،النتائج ان فعالیة االنزیم تزداد بزیادة تركیـزهودلت .تحلل النشا فياالنزیم یةحركیات وكفا .وان المعامالت الحراریة للمادة االساس لیست ضروریة ،النشا الخام المقدمة بشـكل واسـع فـي الطبیعـة، فهـو موجـود فـي االنسـجة الحیوانیـة والنباتیـة Glucoamylaseیوجـد أنـزیم الكلوكـوامیلیر ، )2(االنــزیم االســود منتجــًا جیـدًا لهــذا Aspergillus nigerفطــر دویعــ)1 (وتنتجـه اعــداد واسـعة مــن االحیــاء المجهریـة . )3(طویلة في انتاج الكحول من تخمر المواد النشویة عمل مدةاست -αهما ألفا أمیلیـز Asp-nigerمن فصل وتنقیة نوعین من أنزیمات االمیلیز المنتجة من فطر )4(تمكن الباحث amy lase والكلوكــــوامیلیز Glucoamylase ـــرة یعمــــل االخیــــر علــــى تحطــــیم ، اذ جزیئــــة النشــــا مــــن خــــالل كســــر االصـ ـــــوع ــــ ــــة نــ ــــ ـــیدیة الخارجیـــ ــــ ــــــن (α-1,6 and 1,3-glucosidic linkage)الكالیكوســـ ــــ ـــــال عـ ــــ فضــ (α-1,4-glucosidic linkage) مـن فصـل نـواتج تحلـل النشـا بوسـاطة )6(وتمكـن الباحـث )5(یةنهائ امنتجًا الكلوكوز نتائج افلــم یجــد أثــر (HPLC) الفـائق ذي االداءكروموتــوكرافي بو (TLC)الكلوكـوامیلیز الفطــري باســتخدام كروموتـوكرافي الرقــائق والكلوكـوامیلیز مـن نـوع االنزیمـات المحبـة للحـرارة . وانمـا وجـد فقـط الكلوكـوز ،للسكریات المتعددة المتضمنة السكریات الثنائیـة Thermop)العالیة hillic) 60 -50فهو ذو ثباتیة عالیة في الدرجات الحراریة الواقعة بین º7(م(. كلوكوأمیلیز فهو یعمل على االصرة الداخلیة نوع Asp.nigerاما أنزیم االلفا أمیلیز الذي ینتجه فطر الى جانب ال (α-1,4-glucose-4-glucanohy drolase) من انزیمات التسییل نوعendo-cleavage یعمل على االصرة ، اذ(α- 1,6-glucosidic linkage) الرقم االمثل .)8(الداخل ویعمل بشكل عشوائي منتجًا الدكسترینات والمالتوز والكلوكوزمن .)9(م ْ 35بدرجة ) 5-4(وللكلوكوامیلیز ) 6.2(لثباتیته فضــال عـــنان النــزیم الكلوكــوامیلیز أهمیــة صـــناعیة كبیــرة فــي انتــاج الكلوكـــوز والكحــول النــاتج مــن تخمـــر النشــا .)11(انه یتمیز بخلوِه من السموم الفطریةالسیما )10(الصناعات الصیدالنیة عة منتجـات النشـا اجـراء عملیــة الطـبخ لغـرض جلتنتـه بعــدها یضـاف أنـزیم االلفـا أمیلیــز لقـد جـرت العـادة فـي صــنا ان المعاملة الحراریة المستخدمة في )12(النتاج الكلوكوز ثم یضاف أنزیم الكلوكوأمیلیز) خفض اللزوجة(لتسییل النشا رفة والتطبیقیة المجلد 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الص النشـا تكلــف الصـناعة مبــالغ طائلـة، لــذلك أنصـبت جهـود البــاحثین باتجـاه أنتــاج انـزیم كلوكــوامیلیز لـه القــدرة ةجلتنـ ـــل النشـــا الخــــام ـــد مـــن البــــاحثین ، اذ )1()غیـــر المجلــــتن(علـــى تحلیـ هنـــاك ثالثــــة أنـــواع مــــن أنزیمــــات ان )13(بـــین العدیـ الیمتلكـان Glaو Gluتحطیم جزیئـة النشـا الخـام واالنـزیمین االخـرین همـا له القابلیة على Glmالكلوكوامیلیز احدها یدعى .مثل تلك الصفة المحلیــة ودراســة Asp.nigerلـذا فــان مـن أهــم اهــداف هـذا البحــث هــو تنقیـة أنــزیم الكلوكـوامیلیز المنــتج مــن عزلـة راریـــة ودراســـة تــأثیر المعــامالت الح ،البطاطــاأثیر تركیــز الكلوكــوامیلیز فـــي تحلــل نــوعین مـــن النشــا همــا نشــا الـــذرة ونشــا تــ .جلتنم للنشا الم ْ 50ا الخام ودرجة م للنش ْ 45بدرجة التحللیةالتصنیعیة في فعالیته المواد وطرائق العمل تنقیة االنزیم االنــزیم بموجــب قیـة تمــت تن )7(االسـود Asp.nigerتـم الحصــول علیـه بشــكل مـزارع ســائلة للعزلـة المحلیــة : االـنزیم الخــام -:ةالتیالخطوات ا ولىالخطوة اال م، ْ 4دقیقـة وبدرجــة 15دورة مـدة 4000اجـراء عملیـة الطـرد المركـزي علـى المـزارع السـائلة المـذكورة آنفـًا وبمعـدل مللتــر مــن أنـزیم الكلوكــوأمیلیز الخــالي مــن خالیــا الفطــر ثـم أجریــت علیــه فحوصــات الفعالیــة وكمیــة 200جمــع حــوالي وتـم .بروتینال الخطوة الثانیة )14(طة كبریتـات االمونیــوماترسـیب االنـزیم بوســ وذلـك بأضــافة مـادة كبریتـات االمونیــوم الـى االنــزیم علـى اربعــة دقیقـة 15دورة مـدة 5000وفي كل مـرة تجـرى عملیـة الطـرد المركـزي بمعـدل %100و % 80، %60، %40هي مراحل فـي كـل مرحلـة مـع تعیـین فعالیـة 4.2منظم الفوسـفات ذو الـرقم الهیـدروجیني  0.2مع اذابة البروتین المترسب في محلول .االنزیم وكمیة البروتین الخطوة الثالثة النضج الغشائي یؤخـذ الراسـب المـذاب فـي ، اذ المـنظم ثـم فـي بلـورات سـكر المائـدةماء المقطـر والمحلـول اجراء عملیة الدیلزة مقابل ال المستحصل علیه من الخطـوة الثانیـة ویوضـع فـي انابیـب الـدیلزة مـع 4.2منظم الفوسفات ذو الرقم الهیدروجیني 0.2محلول فـي مـنظم الفوسـفات المـذكور آنفـًا ثــم تنقـل الـى المـاء المقطـر للمـدة نفســها، ســاعات 3غلـق االنابیـب بأحكـام ووضـعها مـدة م الجـراء عملیـة التنقیـة الالحقـة بعــد ْ 5سـاعات اخـرى ثـم تحفـظ بالثالجـة بدرجــة 3بعـدها توضـع فـي بلـورات السـكروز مــدة .قیاس الفعالیة وكمیة البروتین الخطوة الرابعة Ultra filtration of crude enzy(15) الترشـیح الفـائق me باسـتخدام مرشـحاتDiafloultra fitera مـن PMنـوع الجزیئیــة االوزان يوع مــن المرشــحات یســمح للجزیئــات ذواســتنادًا الــى تعلیمــات الشــركة المنتجــة فــان هــذا النــ 10 تـم .م ْ 4بـار وبدرجـة 2-1.5االوزان االعلى وباستخدام ضـغط ير من خاللها والیسمح للجزیئات ذاو أقل بالمرو 10.000 .مرات بعدها قیس الحجم وفعالیة االنزیم وكمیة البروتین 3تركیز االنزیم بمقدار الخطوة الخامسة بمـادة معبـا ) 2.6× 7.0(العمـود ه، اذ اسـتخدم تـم تحضـیر ، Gel filtrationالترشـیح الهالمـي اسـتخدمت طریقـة (Sephadex G200) واضیفت المادة 4.2الرقم الهیدروجیني يذ المحلول منظم الفوسفات و استعمل ، رفة والتطبیقیة المجلد 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الص Sodium azide مـل مــن عینـة االنــزیم 1لمنــع نمـو الفطریـات داخــل حشـوة العمــود وأضـیف )% 0.02(بتركیـز سـاعة /مـل 40ر بسـرعة فـالجـل وبموجـب جریـان الب التي حصلنا علیها من الخطوة الرابعة بعنایة الـى قمـة العمـود فـوق سـطح روتین وتمـت قـراءة االمتصـاص الضــوئي وتـم تعیـین فعالیـة االجـزاء وكمیـة البـ. مـل لكـل جـزء 5جـزء بواقـع 50جمـع خاللهـا مـن نـوع االنـزیم الفطـري ثبـتزیم الكلوكـوأمیلیز القیاسـي للتوكـررت العملیـة مـع انـ ،نـانومیتر 280 لكل جزء على طول موجي .قید البحث عملالمست التحلیالت الكیمیائیة )17: (تقدیر البروتین )18(: یة االنزیمقیاس فعالو ) 19: (تقدیر كمیة الكلوكوزو )19(: تعیین كمیة الدكستروز المكافيءو Spالفعالیة النوعیة تقدیرو ecific activity :وتحسب بموجب المعادلة ملغم بروتین/ وحدة= = الفعالیة النوعیة تعیین تركیز حامض االوكزالیك مـن وجـود حــامض االوكزالیـك الـذي قـد ینـتج مــن ثبـتوهـي طریقــة كیمیائیـة للت )16(ي اتبعـت الطریقـة المـذكورة فـ .بعض الفطریات فحص السمیة فـي االنـزیم الخـام وأهمهـا سـموم فربة السـموم الفطریـة التـي قـد تتـوالقیـاس نسـ) 11(استخدمت الطریقة المـذكورة فـي ، B1وتـم تحضـیر محالیـل قیاسـیة مـن سـموم االفالتوكسـین وهـي (HPLC) السمیة بوسـاطة جهـاز اذ قسیت ،االفالتوكسین B2 ،G1 ،G2 من شركة(Sigma, st .louis- M o, U.S.A) علـى مـل/غراممـایكرو 10، 0.1، 0.01، 0.001بتركیـز ثـم حقنـت المحالیـل القیاسـیة فـي الجهــاز 1: 9بنسـبة Acetonitrileنتریـل الخلیــك و فـي محلـول مكـون مـن البنـزین التـوالي .مایكرولیتر مع كاشف فلورسیني 40بكمیة ).خام(غیر المعاملة حراریًا (v/w)% 2 میلیز في تحلل نشا الذرة والبطاطادراسة تأثیر تركیز الكلوكوا A- 2 وسط نشا الذرة بتركیز %(v/w) م ْ 40وبدرجـة حـرارة 4.2 يهیـدروجینالالـرقم المذاب في منظم الفوسفات ذي 90وحضــنت مـــدة ) مــل/ملغــم بـــروتین 0.120و 0.0600، 0.0300، 0.0150، 0.0075(اضــیفت التراكیــز .دقائق 10الكلوكوامیلیز كل یةالمتحررة وكفا تقاس كمیة الكلوكوز )19(م ْ 40 دقیقة في حمام مائي بدرجة B- 2وسـط نشـا البطاطـا بتركیـز %(v/w) م ْ 40وبدرجــة 4.2الـرقم الهیـدروجیني المـذاب فــي مـنظم الفوسـفات ذي اس دقیقـة تقـ 90م مـدة ْ 40من االنزیم وحضنت في حمـام مـائي بدرجـة Aفي نفسها اضیفت المقادیر المذكورة .دقائق 10ل االنزیم ك یةكمیة الكلوكوز المتحررة وكفا مل/فعالیة االنزیم وحدة مل/كمیة البروتین ملغم رفة والتطبیقیة المجلد 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الص TLCتشخیص الكلوكوامیلیز بوساطة زیمــي فصــلت نــواتج التفاعــل االن اذ )20(ســتخدمت الطریقــة المــذكورة فــي ا (TLC)فصـل نــواتج التفاعــل بطریقــة .وتمت المقارنة مع الكلوكوامیلیز القیاسي (TLC) قبطریقة كروموتوكرافي الرقائ الفعل التحللي لالنزیم فيتأثیر المعاملة الحراریة التصنیعیة A- 2مـل الــى وسـط نشــا الـذرة /ملغـم بــروتین 0.0600اضـیف الكلوكـوامیلیز بتركیــز %(v/w) ووســط نشـا البطاطــا 2 %(v/w) اس كمیـة الكلوكــوز تقـ. دقیقـة قبـل الوصـول الـى حالــة الجلتنـة 90م مــدة ْ 45بعـد رفـع حرارتهـا الـى .دقائق 10االنزیم كل یةالمتحررة وكفا B- م ْ 50مــل وهـي بدرجــة /ملغـم بـروتین 0.006یضـاف الكلوكـوامیلیز الــى وسـطي نشـا الــذرة ونشـا البطاطـا بتركیــز یــةاس كمیـة الكلوكــوز المتحـررة وكفاتقـ. دقیقــة 90م مـدة ْ 50حــرارة وبحالـة جلتنـة وتتــرك فـي حمــام مـائي علـى .دقائق 10االنزیم كل النتائج والمناقشة تنقیة االنزیم الخام )7(المحلیــة بشــكل مــزارع ســائلة للفطـــر االســود Asp.nigelأنــزیم الكلوكــوامیلیز الخــام المنــتج مــن عزلـــة عملاســت Jabor et al, (2004). اجریت عملیة الترشیح للحصول على االنـزیم الخـام الخـالي مـن خالیـا الفطـر ثـم رسـب بكبریتـات االمونیـوم واجریـت .Sephadex G 200بعدها عملیة الدیلزة وتنقیة االنزیم بوساطة الترشیح الهالمي باستخدام ارتفعـت الفعالیـة النوعیـة اذ ،بعد كـل خطـوة تنقیـة على ان الفعالیة النوعیة لالنزیم تزداد) 1(النتیجة المبینة بالجدول رقم دلت .مرة اكثر من الخطوة التي تسبقها 5.7ملغم بروتین بمعدل تنقیة /وحدة 3670.5بعد الترسیب بكبریتات االمونیوم الى لغــم م/وحـدة 4023.6وعنـد اجـراء عملیــة الـدیلزة لالنـزیم مقابــل بلـورات السـكروز ادت الــى رفـع الفعالیـة النوعیــة الـى الى زیادة الفعالیـة النوعیـة Sephadex G 200مرة تنقیة كما ادت خطوة الترشیح الهالمي بوساطة 6.2بروتین بما یعادل مرات تنقیـة عـن الخطـوة االولـى لقـد دلـت هـذه النتـائج علـى ان الزیـادة 10بما یعادل ملغم بروتین /وحدة 6471.6لالنزیم الى ،منهـا عدیـدة وسـائل التنقیـة علـى عوامـل ، تعتمـد)15، 6(النوعیـة تـهفعالیة في تركیـزه ورفـع في تنقیة االنزیم تؤدي الى زیاد ومیـل االنـزیم ،ثباتیتهوالرقم الهیدروجیني االمثل ل ،ونقطة التعادل الكهربائي ،وصافي شحنة البروتین ،حجم جزیئات البروتین Lactobacillusالـــى تنقیـــة انــزیم االلفـــا امیلیـــز المنـــتج مــن بكتریـــا )21(لالرتبــاط بـــبعض المـــواد فقـــد توصــل الباحـــث fermentum مــرة اكثــر مــن الخطــوة االولــى عنــدما اســتخدم طریقــة الترســیب بــالكالیكوجین واســتخدم 28الـى تنقیــة تعــادل .بادل االیونيكروماتوكرافي الت ن بــروتین ظهــر مـع االجــزاء الخارجــة مــن وجــود اكثــر مـ (a) 1دلـت نتیجــة الترشــیح الهالمـي المبینــة فــي الشـكل . 24-18العمود وعند قیاس فعالیة الكلوكوامیلیز وجد انها واقعة بین االنابیب نمــوذج القیاســـي للكلوكــوامیلیز بعــد امـــراره علــى الهـــالم الــذي یمثـــل اال (b) 1بالشـــكل رقــم (a) 1الشـــكل رقــم وعنــد مقارنــة Sephadex G 200 وهــذا دلیــل علــى ان عزلـــة ،عنــد ضــبط وقـــت االضــافة نفســها وجــد ان االنــزیم یقــع فـــي االنابیــب Asp.niger لــون اذ اللكلوكـوامیلیز، وان جـزء البـروتین االخـر المنفصـل اختبـر باضـافة الیـود فكـون معقـد المحلیـة هـي منتجـة لالمیلـوبكتین منتجـًا سالســل االمیلـوز القصـیرة التــي ازرق داللـة علـى ان االنـزیم یعمــل علـى االواصـر الكالیكوســیدیة الفرعیـة المحلیــة تنــتج انــزیم االیزوامیلیــز الــى جانـــب االســود Asp.nigerأي ان عزلــة ، ) 22،15(اللــون االزرق مــع الیــود تعطــي .الكلوكوامیلیز رفة والتطبیقیة المجلد 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الص TLCفصل نواتج تفاعل االنزیم بوساطة دلـت النتـائج المبینـة فـي ). TLC )20مـن تشـخیص االنـزیم فصـلت نـواتج التفاعـل االنزیمـي بطریقـة ثبتلزیادة الت تكـون سـكر الكلوكــوز وتحركـه مـع محلـول الكلوكــوز القیاسـي وهـذا دلیـل علــى وجـود انـزیم الكلوكـوامیلیز الــذي ) 2(الشـكل رقـم ونالحـظ بقـاء بعـض السـكریات علـى خـط البدایـة وهــذا )22، 20، 15( بشـكل كامـل الـى كلوكـوز كنـاتج نهــائيیحطـم النشـا .یعود الى ارتفاع الوزن الجزئي لهذه السكریات مما سبب عدم تحركها مع محلول الفصل قیاس السمیة HPLCتـم التحــري عــن سـموم االفالتوكســین وحــامض االوكزالیـك فــي المســتخلص االنزیمـي قیــد الدراســة بطریقــة .السموم الفطریة وحامض االوكزالیك أظهرت النتائج خلوه من اذبالمقارنة مع السموم القیاسیة، Bونشا البطاطا Aشا الذرة تحلل النشا في وسطین مختلفین للنشا هما ن فيتأثیر تركیز الكلوكوامیلیز النقي :مختلفة هي عدیدة تخافیفبأضیف الكلوكوامیلیز النقي Bونشا البطاطا Aفي وسطین للنشا هما نشا الذرة ) مل/ملغم بروتین 0.120، 0.0600، 0.0300، 0.0150، 0.0075( تقـاس كمیـة الكلوكـوز .دقیقـة 90م مـدة ْ 40وحضنت االوساط فـي حمـام مـائي بدرجـة ،لكال الوسطین (v/w)% 2بتركیز بـأن سـرعة تحلـل النشـا (b) 3والشـكل رقـم (a) 3دقائق، دلت النتائج المبینة في الشكل رقم 10االنزیم كل یةالمتحرر وكفا تركیــز تـزداد بزیـادة % DEكسـتروز دالمئویـة للاالنـزیم المعبـر عنهـا بالنســبة یـةا بكمیـة الكلوكـوز المتحــررة وكفاالمعبـر عنهـ ، وان انـزیم الكلوكـوامیلیز مـن فتـرة الحقـن لكافـة التراكیـز المسـتخدمة 50وان اقصـى سـرعة تحلـل لـه كانـت عنـد الدقیقـة االنـزیم ، 19( یـةبتراكیـز عال عمالهمتعـددة بتقاعـل عكسـي عنـد اسـت یؤدي الى تفاعل بلمرة للكلوكوز أي یحول الكلوكوز الى سـكریات .Bو Aمل في الوسطین /ملغم 0.0600للكلوكوامیلیز كانت عند التركیز یةلذا فان افضل كفا) 24، 23 فیمـا كـان ،ً كـان سـلوكًا منتظمـًا وواضـحا Aفـي الوسـط ان سـلوك االنـزیم (b)و (a) 3كما دلت النتائج المبینة بالشـكل رقـم وهـذا یعتمـد علـى شـكل ونـوع وحجـم جزیئـة النشـا الخاصـة بالمـادة االسـاس التـي لهـا تـأثیرًا Bفي تحلل الوسط سلوكه عشوائیاً ).23-21، 19(سلوك وتفاعل االنزیم فيواضحًا النشـا الخـام االسـود المحلیـة فـي تحـلل Asp.nigerتج مـن عزلـة نـقابلیـة الكلوـكوامیلیز الم فـيتأثیر المعامالت الحراریة . والمجلتن م للنشـا الخــام ْ 45بدرجــة Bو Aمــل الـى الوسـط /ملغـم بـروتین 0.0600فـي هـذه التجربــة أضـیف االنـزیم بتركیــز ، 22، 19،20، 2،3(النشـا وهي الدرجات الحراریة المسـتخدمة فـي العملیـات التصـنیعیة لمنتجـاتم للنشا المجلتن ْ 50ودرجة .عالیةثباتیة حراریة يیتطلب فیها استخدام انزیم ذ التي) 24 الكلوكــوامیلیز یـةلحراریــة لـم تــؤثر فـي فاعلیــة وكفاان المعاملـة ا (b)و (a) 4دلـت النتــائج المبینـة فــي الشـكل رقــم و انم ْ 70االنزیم ذو ثباتیة حراریـة عالیـة تصـل الـى النتحت ظروف هذه التجربة Asp.nigerالمنتج من العزلة المحلیة ).25(من نوع المحب لدرجات الحرارة العالیة عملالفطر المست امـا .فـي تحلـل النشـا یتهشاط التحللي لالنزیم ودرجة كفاوتطابقًا في الن تشابهاً (a) 4اظهرت النتائج في الشكل رقم م و فـي الحـالتین النشـا الخـا tلتوزیـع 0.05لیست ذي فارق معنوي عنـد مسـتوى فكانت (b) 4النتائج المبینة في الشكل رقم االنـزیم ذو قـدرة النومـن الممكـن ان االسـتغناء عـن عملیـة طـبخ النشـا فـي العملیـات التصـنیعیة المجلـتن لوسـط نشـا البطاطـا یتكــون مــن أنـــواع االســود Asp.nigerانــزیم الكلوكــوامیلیز المنــتج مــن العزلــة انللنشــا الخــام وهــذا یــدل علــى تحلیلیــة جیــدة مختلفة من الكلوكوامیلیز تختلف في شكل الموقع الفعال والوزن الجزیئي ولها القدرة على التغلغل الى داخل عدیدة رفة والتطبیقیة المجلد 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الص اذ، )25، 20، 9(اللفـا أمیلیــزكتلـة البـولیمر فــي جزیئـة النشــا لتحطـیم االواصـر الداخلیــة التـي اقتصــر تحطیمهـا علـى انــزیم ا نـه یعمــل علـى االواصـر الداخلیــة لتمهیـد العمـل النــزیم الالنشـا اعتمـدت الصـناعات علـى االلفــا امیلیـز فـي تحطــیم بـولیمرات ).22، 20، 15(انهائی االكلوكوامیلیز الذي یحطم االواصر الخارجیة للسكریات المتعددة ویحولها الى الكلوكوز ناتج المصادر 1. Horvathova, V.; Janecek, S. and Sturdik, E., (2000).Amy loly tic enzmes :theirsp ecificties,origins and roperties,Biologia, Bratislava. 55: 603-613. 2. Ueda, S. and Koba, Y., (1981). Amy loly tic sy st em of blak-koji mold, Biotech.Bioeng,. 23: 291. 3. Park, Y.K., (1982). J of Biotech. Bioeng., 24: 495. 4. Abouz eid, A.M ., (1997). 89 (358): 55-66.. 5. Chessa, J. P.; Feller G. and Gerday, C., (1999). TAC 240B- can. J. M icrobiol., 45: 452- 457. 6. Pandey, A.; Nigam, P.; Soccol C.; Singh D. and M ohan, R., (2000). Biotechnol. Ap p li. Biochem., (31): 135-152. 7. Jabor, S.; Jawad, M . and M ahammad, J. S., (2004). J. of P. Ap p lied sciences, 17(2): 10- 18. 8. Dlaly , B.K. and M ahmood, W.A., (1985). zanco.. 3(2): 47-58. . 9. El-Safey , E.M . and Ammar, M .S., (2004). Univ. Bull. Environ.. 7(1): 93-99. 10. Octavio, L.F.; Daniel, J. R. and Francislete, R.M ., (2000). Eur. J. Biochem. 267: 2166- 2173. 11. Alani, H.H.; Soy ood, R.; Zainab, M . and Abdl-Kharim, A., (1994). unp ublished j. of app lied sciences 6(1): 22-32. 12. Gasp erik, J.; Hostinova, E.; M inarikova,O.; Soldaneva, I. and Zelinka, J., (1988). Biologia, Bratislava, 43: 673-679. 13. Hostinova, E.; Solovicova A.; Dvorsky , R. and Gasp erik, J., (2003). Arch. Biochem. Biophy s. 411: 189-195. 14. Dixon, M . and Webb, E.G., (1964). Enzy mes, 2 nd Edit. Academic press. Inc. New York. 15. Simone, C.; Peixoto. Joao, A. and Jorge. Hecto, F., (2003). Int. M icrobiol, 6: 269-273. 16. Hadwan, H. A., (1987). Ph.D. thesis Division M y cology and plant p athology . India Agri. Research Institut e, New Delhi. 17. Chy kin, S., (1966). Biochemistry laboratory . Techniques John wiley and Sons. New York, London, Sy dney. 18. Somogy , M . Noles, (1952). J. Biol. Chem. 195: 19-22. 19. Horvathova, V.; Slajsova, K. and Ernest , S., (2004). Biologia, Bratislava, 59(3): 361-365. 20. Chaplin, M .F., (1986). M onosaccharides in carbohydrate analysis, Ed. By M .F. Vhaplin and J.F. Kennedy . IR1. Press Limited. England. 21. Tanlamond, P.; Desseaus, V.; M orean, Y.; Santimone M . and M arseille G., (2002). Comp Biochem p hy siol. B Biochem M ol. Biol. 133(3): 351-360. 22. James,J.A. and Lee, B.H, (1997). J. food. Biochem 21: 1-52. 23. Abdel-Rahman, E. M ., (1990). Ph.D. thesis, Al-Az har Univ., Fac. Of Sci., Bot. and M icrobial. Dept., Cairo, Egy p t. 24. El-Safey , E.M , (1994). Sci. A thesis, Bot. and M icrobial. Dep t., Fac. Sci., Al-Az har Univ., Cairo, Egy p t. 25. Odibo, F.J.C. and Ulbrich- Hofmann, R., (2001). Acta Biotechnological, 21(2):141-153. 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد Aspergillus nigeتنقیة انزیم الكلوكوامیلیز المنتج من عزلة ): 1(جدول r االسود. طریقة التنقیة حجم االنزیم ml فعالیة االنزیم u/ml كمیة البروتین mg/ml الفعالیة الكلیة u/ml البروتین الكلي u/ml الفعالیة النوعیة u/mg prot عدد مرات التنقیة الكلوكوامیلیز الخام )راشح المزرعة( 200 266.1 0.42 53220 84 633 1 كبریتات االمونیوم %)60اشباع درجة ( 200 660.7 0.18 132140 36 3670.5 5.7 الدیلزة مقابل السكروز البلوري 15 2213.1 0.55 33196 8.25 4023.6 6.2 Sephadex G200 chromatogr aphy )الترشیح الهالمي( 5 3236 0.5 16180 2.5 6472 10 A. niلیزالمنتج من میتنقیة انزیم الكوكوا )a 1( مقكل ر ش ger 200 عمالبالترشیح الهالمي باست G scphadex 40المنفصل وبسرعة جریان مل للجزء 5وبواقع 4.2رقم الهیدروجیني ال ذي M 0.1ومحلول منظم الفوسفات ساعة/مل 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الصرفة والتطبیقیة المجلد G S 200 عماللیز القیاسي باستیالهالمي النزیم الكلوكوامالترشیح : )1b(شكل ephadex ومحلول منظم .ساعة/مل 40مل للجزء المنفصل وبسرعة جریان 5وبواقع 4.2رقم الهیدروجیني ال ذي M 0.1الفوسفات TLCلیز بطریقة یفصل نواتج تفاعل انزیم الكلوكوام )2(شكل رفة والتطبیقیة المجلد 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الص ) pH )4.2في 2A %(v/w)تأثیر تركیز الكلوكوامیلیز في تحلل نشا الذرة الخام : (a3)شكل .م ْ 40ودرجة م ْ 40ودرجة ) 4.2( pHفي 2B %(v/w)الخام لبطاطاتأثیر تركیز الكلوكوامیلیز في تحلل نشا ا: b) 3(شكل 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 ١٠ ٢٠ ٣٠ ٤٠ ٥٠ ٦٠ ٧٠ ٨٠ ٩٠ ٠.٠٠٧٥ ٠.٠١٥ ٠.٠٣ ٠.٠٦ ٠.١٢ )دقیقة(الوقت 0 5 10 15 20 25 ١٠ ٢٠ ٣٠ ٤٠ ٥٠ ٦٠ ٧٠ ٨٠ ٩٠ ٠.٠٠٧٥ ٠.٠١٥ ٠.٠٣ ٠.٠٦ ٠.١٢ )دقیقة(الوقت غم مل ز كو لو لك ا یة كم / ل م غم مل ز كو لو لك ا یة كم / ل م رفة والتطبیقیة المجلد 2009) 3( 22مجلة ابن الهیثم للعلوم الص م ْ 45وبدرجة حرارة pH 4.2و (v/w) %2تأثیر المعاملة الحراریة في عمل الكلوكوامیلیز في نشا الذرة : (a4)شكل للنشا المجلتن م ْ 50للنشا الخام ودرجة وبدرجة حرارة pH 4.2و (v/w)% 2لكلوكوامیلیز في نشا البطاطاتأثیر المعاملة الحراریة في عمل ا: (b4)شكل نشا المجلتن م 50ْم للنشا الخام ودرجة 45ْ لل 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 ١٠ ٢٠ ٣٠ ٤٠ ٥٠ ٦٠ ٧٠ ٨٠ ٩٠ لتن ا مج نش خام نشا )دقیقة(الوقت غم مل ز كو لو لك ا یة كم / ل م 0 5 10 15 20 25 30 ١٠ ٢٠ ٣٠ ٤٠ ٥٠ ٦٠ ٧٠ ٨٠ ٩٠ لتن ا مج نش خام نشا )دقیقة(الوقت غم مل ز كو لو لك ا یة كم / ل م