تنقية حامض الالجينك من عزلة محلية لبكتريا Azotobacter Vinelandii IBN AL- HAITHAM J. FOR PURE & APPL. SCI VOL.22 (2) 2009 Purification of algnic acid by Local isolate of Azotobacter Vinelandii J.I.Mahdi,M.R.Ali, H.M.Hamza* Foundation of Technical Education , Technical Medical Instute Al- Mansour *Univarsity of Arbil Abstarct The bacteria Azotobacter Vinelandii was taken from a central research in Baghdad, The purification of alginic acid which produced from the bacteria by several steps starting with precipitation with isopropanol (3:1) v/v , Washing by ppt with 100ml of isopropanol : distilled water (3:1) v/v , then the ppt was dissolved in warm distilled water and dialysis against distilled water from 24 h/s . To Complete the purification , gel filtration chromatography was conducted on sephacryl s-100 column followed by ion – exchange chromatography . Using DEAE cellulose column . The molecular Weight of purified al ginic acid was higher than that of blue dextran 2000,It was more than (2) millions Dalton . 2002( 2) 22المجلد مجلة ابن الهيثم للعلوم الصرفة والتطبيقية تنقية حامض االلجينك من عزلة محلية لبكتريا Azotobacter Vinelandii *، محمد رفيق علي، حيدر موسى حمزةجندي علك مهدي المعهد الطبي التقني المنصور،هيئة التعليم التقني جامعة أربيل* لخالصها ثم تمت تنقية Azotobacter Vinelandiiأخذت عزلة محلية من أحد المراكز البحثية والمشخصة على أنها حامض االلجنيك المنتج منها بعدة خطوات تضمنت الترسيب بالكحول االيزوبروبيلي بحجم يعادل ثالثة أضعاف حجم ول : ماء ( ثم أذابة الراسب بالماء المقطر زوبروبان)اي 3:1من خليط مللتر 311وغسل الراسب بحجم 3:1المستخلص ساعة . 42مدة لمقطر الدافئ والديلزة حيال الماء ا ، وكان حامض االلجينك ذا DEAE-Cellulase استكملت التنقية بكروماتوغرافيا التبادل االيوني بوساطة عمود . 4111االزرق دالتون ، عند مقارنته بالدكستران 401110111وزن جزيئي أكبر من المقدمة تعد خطوة التنقية واحدة من الخطوات المهمة واالساسية في أنتاج المواد الحيوية ، وفي حالة السكريات المتعددة ة لهذه المركبات هي يات الفصل ، ولكن المشكلة الرئيسطرائق النبذ بعمل تقل فيها مشاكل العزل اذ استعملتالخارجية التي . (1)التي تعيق أزاحة الخاليا اللزوجة العالية لتنقية السكريات المتعددة كأعمدة Ion-exchange chromatographyأن أستخدام كروماتوغرافيا التبادل األيوني DEAE-Cellulose وأن أستخدام الكروماتوغرافيا يقود في كثير من الحاالت الى ،صاص هذه السكرياتتميعمل على أ ذ وجد أن في السالسل ، اDEAE-Cellulaseرتبطة مع السكريات المتعددة عند أستخدام عمود فصل الكثير من المواد الم الوزن الجزيئي الواطئ أقل من المواد ذي( يكون أرتباط المواد ذات الوزن Linearالمتماثلة ذات التركيب الخيطي ) . (2)الجزيئي العالي ،اذ أن (3)الصناعات الغذائية والصيدالنية مثل : متعددةولألهمية العالية لحامض االلجنيك ودخوله في صناعات ( Stabilising) ا"( ، مثبتThickening) ا"( ، مثخنGelling agent) ا"يستخدم مجلتن دة اذت صناعية عديله أستعماال هو حماية طبي مهم لحديثة أن لحامض االلجنيك أستعمال، ولوحظ بالدراسات ا (4)للماء في مجاالت مختلفة ا"أو حاجز . وكذلك (5)محتويات المعدة من االلتهابات وسوء الهضم والعمل على أيقاف النزف من خالل مركبات الجينات الكالسيوم . (6)يستخدم في حشوات األسنان .ولهذا البولمر أهمية في فصل وأستخالص (8)ومعالجة المياه وبتقييد األنزيمات ايضا" في أفالم التصوير يستعمل . (8)( Ion-exchange)أيوني "ه كمبادالمن األيونات الفلزية عند أستعمال دالعدي 2002( 2) 22المجلد مجلة ابن الهيثم للعلوم الصرفة والتطبيقية المواد وطرائق العمل الترسيب بالكحول االيزوبروبيلي - بأضافة الكحول بحجم يعادل ثالثة (Jarman …etal)(9)رسب حامض االلجنيك حسب الطريقة الموصوفة من ، غسل الراسب Whtman No.1دقائق بورق ترشيح 31أضعاف حجم العينة مع الرج الشديد ثم الترشيح بعد مرور ساعة 42م لمدة 42نموذج بفرن حراري وبروبانول وجفف االر ( ماء : اي1:3مللتر من خليط ) 311 بمحلول الديلزة – ( مع التحريك المستمر ثم أجريت عملية الديلزة حيال ºم22مللتر ماء مقطر دافئ ) 41 غرام( في 2أذيب الراسب ) وحفظ لحين ( Lyophilizer)ثم سحب الرائق بجهاز ºم6 – 2ساعة وبدرجة 42الماء المقطر بعدة تبديالت خالل . (10)األستخدام Gel filtration chromatographyكروماتوغرافيا الترشيح الهالمي – 11 بسرعة جريان سم وتمت موازنته بمحلول الخالت الداري 404X 66تم تهئية عمود الترشيح الهالمي بأبعاد 401110111 بوزن جزيئي Blue Dextrant 2000قياسيتان هما الدكستران األزرق ناتعين تمللتر/ساعة ثم أضيف كاًل على T-70 مللتر من الدكستران االزرق والدكستران 1ضافة لتون بأدا 610111بوزن جزيئي T-70 دكستراندالتون وال مللتر/ساعة . 11 حده لسطح الهالم بهدوء بشكل متجانس وشطف بالمحلول الدارئ بسرعة جريان نانوميتر ، أما 611وجي جمع المحلول النافذ أسفل العمود وقرأ األمتصاص بجهاز المطياف الضوئي على طول م نانوميتر . 291فقرأ األمتصاص له على طول موجي T-70 الدكستران مللتر وعينة حامض 2ملغرام/مللتر وبحجم 2بواقع BDHعينة من حامض االلجنيك القياسي شركة تأضيف نانوميتر ثم رسم 291راءة األمتصاص الضوئي ق.تمت متابعة األجزاء النافذة ب نفسيهما التركيز والحجمب المحلية االلجنيك حني األمتصاص الضوئي .من Ion-exchange chromatographyكروماتوغرافيا التبادل األيوني – ة :المحاليل المستعمل . 602موالري وبرقم هيدروجيني 10112محلول الفوسفات الدارئ بتركيز –أ ء المقطر وعدل مللتر من الما 01 مللتر من حامض الخليك الى 1026محلول االسترداد والمحضر بأضافة –ب مللتر بالماء المقطر . 311 الرقم الهيدروجيني وأكمل الحجم الى موالري . 103محلول حامض الهيدروكلوريك -جـ محلول فوسفات الصوديوم أحادية الهيدروجين . –د موالري هيدروكسيد الصوديوم . 1042-موالري كلوريد الصوديوم 1042محلول -هـ والري حامض الهيدروكلوريك .م 1042محلول –و تهيئة العمود ثم علق بالماء المقطر بأسطوانة ،(wbitaker)(11)ونشط حسب طريقة DEAE Celluloseغرام من 21وزن موالري هيدروكسيد الصوديوم بواقع 1042 –موالري كلوريد الصوديوم 1042ثم علق بمحلول ،مللتر 211مدرجة بحجم ،ثم غسل مرتين بالماء المقطر ،ثم رشح تحت التفريغ على ورق ترشيح ،م من مسحوق المبادلغرا 421مللتر لكل 211 موالري حامض الهيدروكلوريك ثم غسل بعدها أكثر من مرة بالماء المقطر ثم علق بمحلول 1042ثم غسل بمحلول 103ك بمحلول حامض الهيدروكلوري 601عدل الرقم الهيدروجيني المطلوب والفوسفات الدارئ 2002( 2) 22المجلد مجلة ابن الهيثم للعلوم الصرفة والتطبيقية ( بوساطة مضخة تفريغ Degassingموالري وعلق بداري الموازنة وأجريت له عملية أزالة الفقاعات الهوائية ) ازنة )محلول األسترداد( وبسرعة ثم غسل بدارئ المو ،سم 3X42ثم عبئ العمود بأبعاد ،(Vaccum pump) مختبرية مللتر/ساعة . 11جريان أضافة النماذج واألسترداد 31ملغرام/مللتر وبحجم 2بعد أذابتها بدارئ الموازنة بتركيز BDHأضيفت عينة حامض االلجنيك القياسي شركة مللتر لكل جزء . 6اقع مللتر الى سطح المبادل بوساطة ماصة وبهدوء ثم جمعت األجزاء المتدفقة من العمود بو .نانوميتر 291النماذج بطول موجي ( وفحصتElutionجرت عملية األسترداد ) ثم رسم منحني األمتصاص نفسها وتحت الظروف نفسيهما أضيفت عينة حامض االلجنيك المدروسة التركيز والحجم نانوميتر . 291الضوئي عند طول موجي النتائج والمناقشة Gel filtration كروماتوغرافيا الترشيح الهالمي ث تنقية حامض االلجنيك باستعمالبحتضمن ال chromatography وكروماتوغرافيا التبادل األيوني Ion-exchange chromatography وكانت أولى خطوات ، عطاء صورة تقريبية عن الوزن ( حيال الماء المقطر ألكمال التنقية وأDialysisالتخلص من الجزئيات الصغيرة هي الديلزة ) بالمقارنة مع مركبات معروفة الوزن الجزيئي Azotobacter Vinelandii الجزيئي لحامض االلجنيك المنتج من بكتريا بينت Sephacryl-s-1000بوساطة كروماتوغرافيا الترشيح الهالمي ، ثم أمرار عينة حامض االلجنيك من خالل عمود 401110111والذي يبلغ 4111االزرق جزيئي للدكسترانبر الوزن الجزيئي له بالمقارنة مع الوزن ال( ك3النتائج بالشكل ) ظهرت القمة لحامض نانوميتر ف 231عند T-70 مللتر أما الدكستران 402أسترداد حيث ظهرت القمة عند حجمدالتون .مللتر 424االلجنيك عند حجم أسترداد cohen and)(12)دالتون وقد أشار 401110111زن الجزيئي أكبر من ( الى أن الو 4شكل رقم )يشير johnstone) الى أن الوزن الجزيئي لحامض االلجنيك المنتج من بكترياAzotobacler -Vinelandii أكبر من قياسي أكبر من الوزن الجزيئي ( نجد أن الوزن الجزيئي لحامض االلجنيك ال4دالتون وعند مالحظة شكل ) 4110111 مللتر . 411بلغ حجم األسترداد له اذ نموذج البكتري لال Azotobacler -Vinelandiiأن حامض االلجنيك النتج من بكتريا (penman and sanderson)(13)لقد بين لمنتجة من الطحالب ، ( مقارنة مع االلجنيات اHomopoly mericيحتوي على نسبة متغيرة من التتابعات المتجانسة ) (14)يك أكبر من حامض الكوليرونيك مقارنة مع االلجنيات الطحلبية ات تكون فيها نسبة حامض المانيرونكما أن االلجني . بسبب صفاته المتميزة من أبرزها القدرة على فصل االوزان الجزيئية العالية 3111-لقد أستخدم هالم سيفاكريل أس . (15)ن( دالتو X 31 41أعلى من ) DEAE خطوة أضافية أخرى لتنقية حامض االلجنيك بوساطة عمودكروماتوغرافيا التبادل األيوني تأستعمل Cellulose ( ، بينت 1قمم عند األسترداد بمحاليل متدرجة من الرقم الهيدروجيني شكل ) وأظهرت النتائج أنفصال أربع ت القياسية وااللجينات المنتجة من هذا البحث ولقد كانت أعلى قمة عند نموذج االلجيناالنتائج أنفصال القمم األربعة ال بالنسبة 1029األمتصاص الضوئي نموذجين ، إذ بلغت قيمة لال 103محلول األسترداد المكون من حامض الهيدروكلوريك خرى نجد أننموذج البكتري ، وعند مقارنة قيم األمتصاص الضوئي للقمم األلال 1062وذج القياسي و ملنالى ا 2002( 2) 22المجلد مجلة ابن الهيثم للعلوم الصرفة والتطبيقية وبلغت قيمة 1024كان 201وعند رقم هيدروجيني ،1021كان 101عند محلول أسترداد ذو رقم هيدروجيني د تعزى هذه النتيجة الى تفاوت ق 201رقم هيدروجيني يمحلول أسترداد ذ عند أستعمال 10162ألمتصاص الضوئي ا المناطق المتبادلة كثافة الشحن الموجودة في تركيب االلجينات من ناحية حامضي المانيرونيك والكوليرونيك ونسبة (Alternating regions قد يفسر سبب أنفصال أكثر من قمة وسبب تفاوت الشحنة السالبة بينهما ، فنجد أن محلولي ) تركيز قليل بمالحظة قيم وأن القيم المنفصلة ذ 201و 201 هو الرقم الهيدروجيني ا( ذ103دارئ األسترداد )الخالت ال نموذج البكتيري ، وقد تعزى هذه النتيجة لال 10324و 10146للنموذج القياسي و 1024و 10162األمتصاص الضوئي تنفصل ذا المحتوى الواطئ واألضعف ،اذالمنتجةالى التفاوت في محتوى مجاميع الكاربوكسيل للسالسل المكونة لاللجنيات في حين كانت ذا المحتوى األعلى من الكاربوكسيل األقوى في ،في كثافة شحنتها من العمود في محاليل األسترداد هذه عباري حامض الهايدروكلوريك . 103لذا كانت هي األخيرة في األسترداد عند محلول ،كثافة الشحنة واألقوى أرتباطاً أرقام هيدروجينية متدرجة في مثل هذا البحث لم تطبق سابقًا فأغلب الدراسات ن أستعمال محاليل أسترداد ذيأ ناد الى تفرة أستخدمت أعمدة التبادل األيوني لفصل نواتج التحلل المائي الحامضي لاللجنيات مما ال يسمح باألساالمتو نية وظروفها .هذه التق للفارق الكبير بين أهداف أستعمال نتائجها المصادر 1 – Cerning , J. (1990) ,Microbio.revi., 87:113-130. 2 – Lourent , T.C.(1961). Arch . Biochem . Biophys ., 92: 224-230. 3 – Whistler, R.L. and Beriller, J.(1973) Industrial Gums” 2 nd .ed.Acadmic press,New York 4 – Morris,V.J. (1987).New and Modified polysaccharides” . food Biotechnology 1 Elsevier Applied science . London pp.193-249- 5 – Colwell, R.R.(1985),Marine polysaccharides for pharmaceuticsl” and Micoobiological Application . In Biotechnology of Marine polysaccharides , Washinglon . New York , London . pp. 364-376 . 6 – Tyler , V.E. Brady,L.R. and Robbers , G.E. (1988) “Pharmacognosy” 9 th edition . Lca and febiger Philadelphia 7 – Rosevear ,A., (1988)”Immobilized plant cell” . Food Biothechnology” . Elsevier Applied science pp.83-117, 8 – Kakino, K.; Mizuno, H.; saito T.( 1980),Effect of M/G ratio on sdution properties of Alginic Acid” . Reports on progress in polymer physics in japan vol XXXIV 9 – Jarman , T.R.; Deavin,L. ; Slocombea, S. and Righetto, R.C. (1978). effect of. J.of Gen . Microblo . v.107 : 59-64 10- Anderson , A.J.,A.J.Hacking and E.A.Dawes ., (1987). “Alternative pathwags for Biosynthesis of Alginate from fructose and Glucose in pseudomonas mendocina and Azotobacter Vinelandii “ J.Gene . Microbio 133:1045-1052 . 11 – Wbitaker , J.R. (1985). “Principle of enzymology for the food science” Marcel Dekker, Inc New York 12 – Cohen, G.H. and Johnstone ,D.B. (1964). j.bacteriolo . 88 :29-338 . 13 – Penman , A. and Sanderson ,G.R. (1972). Carbohyd . Res ,25 :273-282 . 14 – Haug , A. and Larsen , B.(1971) . Carbohyd . Res . 17: 297-308 . 15 – Pharmacia , fine chemicals .(1987) Sephacryl s-400, s-500, s-1000 super fine for the separation of very large molecule and small paiticles . 2002( 2) 22المجلد ثم للعلوم الصرفة والتطبيقية مجلة ابن الهي ( سم تمت موازنته x 67 0.0) 1222-في عمود سيفاكريل أس 0222( الترشيح الهالمي للدكستران األزرق 1):شكل 5مللتر/ساعة )حجم الجزء 02بسرعة جريان 7.2وجيني موالري( ذي الرقم الهيدر 0.2بمحلول الخالت الدارئ ) مللتر( . 0.06 0.05 0.00 0.01 0.02 0.04 0.03 0 10 20 30 40 50 60 . . . . . . . . . . . . . . ي ج و م ل و ط ى عل ي وئ ض ال ص صا مت أل ا 0 6 6 ر يت وم ان ن الجزءرقم 2002( 2) 22المجلد مجلة ابن الهيثم للعلوم الصرفة والتطبيقية مض األلجنيك المنتج من ( وحا .) ( وحامض األلجنيك القياسي )T-70( الترشيح الهالمي للدكستران 2):شكل ( سم تمت x 67 0.0) 1111-) ( في عمود سيفاكريل أس A.vinelanndii( لبكتريا 1العزلة المحلية ) مللتر/ساعة )حجم 02بسرعة جريان 7.2موالري( ذي الرقم الهيدروجيني 0.2موازنته بمحلول الخالت الدارئ ) مللتر( 5الجزء . . . . . 0.06 0.05 0.00 0.01 0.02 0.04 0.03 0 10 20 30 40 50 60 70 ي ج و م ل و ط ى عل ي وئ ض ال ص صا مت أل ا 0 9 6 ر يت وم ان ن رقم الجزء 2002( 2) 22المجلد هيثم للعلوم الصرفة والتطبيقية مجلة ابن ال في .vinelandii A( التبادل األيوني لأللجينات القياسية واأللجينات المنتجة من العزلة المحلية لبكتريا 3):شكل موالري( ذي الرقم 1012موازنته بمحلول الفوسفات الدارئ ) ( سم تمت1X22، ) DEAE-cellulose عمود مللتر( 2مللتر/ساعة )حجم الجزء 31. سرعة الجريان 001الهيدروجيني . . . . . . . . . . محلول األسترداد PH5 0.00 1 0.2 0.4 0.8 0.6 0 10 20 30 40 50 60 70 . . . . . . ستردادمحلول األ PH4 محلول األسترداد PH3 محلول األسترداد PH0.1N الرقم الهيدروجيني األلجينات القياسية األلجينات المنتجة من العزلة ي ج و م ل و ط ى عل ي وئ ض ال ص صا مت أل ا 0 9 6 ر يت وم ان ن رقم الجزء ي ين ج و ر يد له ا قم ر ال ي ائ نه ال