Microsoft Word - 340-357 340علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية المجلد Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 Bacillus subtilis EN3نتاجية حامض الكلوتاميك من بكتريا ا دراسة معزولة من التربة إيمان جابر جاسم العطار ضال محمد صالح ن جامعة بغداد/كلية الزراعة /قسم علوم األغذية شيماء حسين الراجحي جامعة النهرين /كلية الصيدلة 2016ايار 11قبل في : 2016اذار6: استلم في الخالصة من التربة واختبرت قدرتها على انتاج حامض الكلوتاميك، وشخصت البكتريا Bacillusُعزلت بكتريا جنس . ودرست الظروف المثلى لالنتاج ومحاولة تحسين انتاجية العزلة VITEK-2ق التشخيص التقليدية وبنظام الفايتك ائبطر عزلة بكتيرية تعود 70صل عزلة من ا 24بالتالعب بمكونات الوسط االنتاجي وبالظروف البيئية لوسط االنتاج. وجد ان الفسيولجية والكيموحيوية. صفاتباألعتماد على ال B.subtilisعزلة تعود الى نوع 13وتبين ان Bacillusالى جنس 13فقد اخضعت B.subtilisاالختبارات المزرعية والمجهرية والكيموحيوية التمكن من التشخيص الدقيق لعزالت نوأل شخصت على انها EN3 و EN5 ن منهاتااظهرت نتائج التشخيص ان هناك عزل .VITEK-2 عزلة الى التشخيص بنظام B.subtilis فضالً عن عزلة واحدة تجاريةA1 ايضا شخصت على انها.B.subtilis واختيرت من بينها العزلة االكثر درست الظروف وقد ملغم/مل. 2بلغت انتاجيتها التي، EN3 B.subtilisقابلية على انتاج حامض الكلوتاميك وهي العزلة المثلى النتاج حامض الكلوتاميك من هذه البكتريا باستعمال وسط شبه صناعي حضر باضافة مستخلص مخلفات التمر Date extraction (DE) فضل مصدر نتروجيني عند تركيز أونترات االمونيوم ، %10عند تركيز انيكاربو امصدر م ورقم هيدروجيني °34ملغم/مل عند حرارة 7.2نتاجية لحامض الكلوتاميك بلغت أفضل أاج, وتحققت % من وسط االنت2 , وحققت عملية التهوية والتحريك رفع تركيز حامض الكلوتاميك المنتج عندما كانت نسبة حجم الوسط الى حجم 6.5ابتدائي نسبة تحسن بلغت تم الحصول علىساعة, و 72حضن دورة / دقيقة, ولمدة 180حاضنة الهزازة بسرعة الفي 5:1الدورق .أنتجته العزلة البرية % عما360 TLC.، مصدر كاربون، مصدر نتروجين التخمر، ،B.subtilisانتاج حامض الكلوتاميك، تشخيص : الكلمات المفتاحية للباحث األول هالبحث مستل من اطروحة دكتورا 341علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 المقدمة مركبات بايولوجية مهمة ، وتأتي اهميتها بالدرجة الثانية بعد المضادات الحيوية، (L)تُعد االحماض االمينية نوع . وهو اول حامض [1]انه مادة محسنة للطعم والنكهة إذحامض الكلوتاميك في الصناعات الغذائية ىوقد ازداد الطلب عل , فقد اكتُشف وُشخص في عام Coryneform Bacteriaاميني انتج تجارياً عن طريق التخمر المايكروبي باستعمال انتج اول ملح لحامض الكلوتاميت احادي 1909, وفي عام Heinrich Ritthausenمن قبل عالم الكيمياء االلماني 1866 ، وتميز بطعم فريد يقع خارج مناطق التذوق "اصل النكهة"التي تعني Ajinomotoالصوديوم تجارياً تحت اسم تجاري وُعرفت اربع [2]. (Umami)االربعة المعروفة واطلق على هذا الطعم في الصين بالطعم الخامس او ما يُعرف أومامي لبروتينية والحفز االنزيمي طرائق رئيسية النتاج االحماض االمينية وهي التخليق الكيميائي واالستخالص من تحلل المواد ا (L)واستعمال االحياء المجهرية بطريقة التخمر, وقد حازت الطريقة األخيرة االفضلية في انتاج احماض أمينية نوع وبذلت جهود كبيرة للبحث عن مصادر مايكروبية قادرة على افراز حامض الكلوتاميك باستعمال مصادر . [3]الحيوي رخيصة مثل موالس البنجر والقصب السكري ومخلفات البطاطا والبطاطا الحلوة والكاسافا كاربونية طبيعية متوفرة و وتوسع البحث عن مصادر مايكروبية منتجة لحامض الكلوتاميك فقد توجهت انظار الباحثين نحو انواع .[4]كمواد اولية نتاج األحماض اعلى Bacillus subtilis, وما نشر حديثاً من الدراسات في مجال تحسين قدرة .Bacillus spمن جنس من قبل GRAS (Generally Recognizeda as Safe)من الكائنات المجهرية اآلمنة ومنحت لقب تعداألمينية, . واول تطبيق غذائي لها يعود الى اكثر من الف سنة عندما استُعملت فعلياً بانتاج FDA [5]منظمة الغذاء والدواء االمريكية . اما الدراسة الحالية فقد [6] المتكون من فول الصويا المتخمر التي حظيت بقبول ورضا المستهلك nattoباني الغذاء اليا ق ائلها القدرة على انتاج حامض الكلوتاميك وتشخيصها بالطر B.subtilisتضمنت الحصول على عزلة محلية من البكتريا مصانع األغذية في تحضير اوساط شبه طبيعية ألنتاج حامض فادة من بعض مخلفات واال ، 2VITEKالتقليدية وبنظام الكلوتاميك بطريقة التخمر، مع تعيين الظروف المثلى النتاجه عن طريق التالعب بمكونات الوسط والعوامل الفيزياوية المؤثرة فيه. المواد وطرائق العمل منتجة لحامض الكلوتاميك Bacillusبكتريا جنس مل ماء مقطر ومزج 90غم من عينات مختلفة من التربة الماخوذة من (كلية الزراعة/جامعة بغداد) الى 10نقل دقيقة ، واجريت لها سلسلة من التخافيف العشرية وزرعت في اطباق على 15م لمدة °80جيدا ووضعت في حمام مائي المستعمرات النامية واعتمدت طريقة العزل ثم التقطت Nutrient agar (N.A)الوسط الزرعي األكار المغذي ت، والتشخيص على مبدأ المرحلية والحذف التي ادت الى اختصار الخطوات العملية باقل عدد ممكن من من االختبارا وحددت الخصائص الزرعية والمظهرية لها واخضعت للفحص المجهري للتعرف على شكل الخاليا وتكوينها لالبواغ كرام، وصوال الى سلسلة من االختبارات الكيموحيوية وفقا للمفاتيح التصنيفية الواردة في المرجع العلمي وتفاعلها مع صبغة بهدف تشخيصها على مستوى الجنس والنوع. ]Bergey's manual of systemic bacteriology ]7المختص الفحوصات الكيموحيوية م °121ة والتركيبية، وعقمت بالمؤصدة بدرجة حرارة ت االوساط الزرعية والكواشف والمحاليل الجاهزلمعاست .ساعة للتلقيح 24- 18دقيقة، واستعملت بكتريا االختبار بعمر 15لمدة 2باوند/انج 15وتحت ضغط أستعمل وسط الجيالتين ، إذ[8]اجري االختبار وفق ما ذكره Gelatin liquification: فحص تسييل الجيالتين . Gelatinaseفي الكشف عن قابلية البكتريا على انتاج انزيم الجيالتينيز Nutrient Gelatinالمغذي اذ [9]الذي حضر حسب طريقة Starch Agarاستعمل وسط أكار النشأ : Starch hydrolysisفحص تحلل النشأ حول المستعمرات نتيجة موجبة استعمل هذا الوسط لمعرفة قابلية البكتريا على تحليل النشأ، اذ يعد ظهور مناطق بنية اللون لتحلل النشا. [9]الذي حضر وفق طريقة Indol Production Mediumاستعمل وسط انتاج االندول Indol test: أختبار األندول وُعدت النتيجة موجبة عند ظهور حلقة حمراء في قمة الوسط. [10]وفق طريقة fermentation sugar medium حضر وسط تخمر السكر فحص تخمر السكريات وانتاج الغاز: استعمل هذا الوسط في الكشف عن قابلية البكتريا على تخمر السكريات وانتاج الحامض عن طريق تغير لون الكاشف من وعدت النتيجة موجبة في حالة تكوين غاز داخل انبوبة درهم. اللون البنفسجي الى اللون االصفر وفق طريقة Nitrate Reduction Brothحضر وسط اختزال النترات : Nitrate reductionفحص اختزال النترات وعدت النتيجة موجبة عند ظهور اللون الوردي المحمر. [9] واستعمل هذا لمعرفة قابلية البكتريا [11]وفق طريقة Egg Yolk Agarحضر الوسط Lycithinase:اختبار اللسثينيز حول خط النمو البكتيري. االلسثنين. وتعد النتيجة موجبة اذا كان هناك ترسب على تحلل NaClيضاف له NB ستعمال الوسط السائلاب [12]: اجري الفحص وفق طريقة فحص النمو بتركيز ملحي مرتفع ت المنشطة في ووزع على انابيب اختبار وعقم بالمؤصدة، لقحت االنابيب بمسحة من العزال 7%، 10% و7% و5بنسبة 342علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 ساعة مع متابعة كثافة النمو الحاصل ومقارنته بالوسط غير 24م ولمدة °37) وحضنت في Slantمائل االكار المغذي ( الملقح. : لقحت االطباق الحاوية على وسط االكار المغذي بمسحة من العزالت بطريقة فحص النمو بدرجات حرارة مختلفة ساعة ويعد ظهور النمو نتيجة موجبة للفحص. 24م لمدة °55و 45و 35التخطيط وحضنت االطباق في درجة ، Hanging Drop: فحصت حركة البكتريا قيد االختبار بطريقة القطرة المعلقة Motility testفحص الحركة . [9]الموصوفة من وحضر تبعاً Agar Simmons's Citrate: استعمل الوسط الجاهز Citrate Utilizationالسترات فحص استهالك .[13] ، يُعد تغير لون الوسط من االخضر الى االزرق المضيء نتيجة موجبةHiMediaلتعليمات الشركة المصنعة . ويعد وجود خثرة متقطعة في الوسط مع تغير [9]حسب ماذكره Litmus Milk: حضر وسط Litmus Milk فحص اللون الى األزرق نتيجة موجبة لهذا الفحص. وعدت النتيجة موجبة عند [9] حسب طريقة Glucose Phosphate Broth: حضر وسط Vogas-Proskaurاختبار . قطرات من كاشف المثيل األحمر 5بعد اضافة تكوين لون احمر وعدت النتيجة موجبة عند تكوين لون [9]كما ذكره Glucose Phosphate Brothحضر وسط : Methyl redأختبار .V-Pبعد اضافة كاشف احمر شاحب ، وعدّ ظهور منطقة شفافة حول النمو [9]على وفق طريقة Milk Agarحضر وسط اكار الحليب فحص تحلل الكازين: دليالً على تحلل الكازين. ويعد التغير في لون الوسط من [14]على وفق طريقة Urea Agarحضر وسط اليوريا الصلب : Ureasاختبار اليوريز الوردي المحمر جراء تغيير الرقم الهيدروجيني نتيجة تكوين االمونيا من اليوريا بفعل انزيم اليوريز, وعد هذا االصفر الى التغير باللون نتيجة موجبة. %على المستعمرات 3اجري الفحص باضافة قطرات من محلول بيروكسيد الهيدروجين Catalase:فحص الكاتاليز . [13] ويدل ظهور فقاعات غازية على ايجابية الفحصالنامية على وسط األكار المغذي ثوان نتيجة 10ويعد ظهور اللون البنفسجي خالل [13] اجري هذا الفحص وفق طريقة Oxidase: فحص االوكسيديز موجبة للفحص. VITEK2تشخيص العزلة بنظام التي ُشخصت Bacillus subtilisفي تأكيد تشخيص عزالت VITEK 2استعمل نظام التشخيص اآللي بالفحوصات الكيموحيوية, اذ استعملت عدة التشخص الخاصة باالحياء المجهرية الموجبة لكرام والتابعة لعائلة BCL) Bacillaceae فحصاً ووفق تعليمات الشركة المصنعة ( 63) الحاوية علىbioMerieux.( ، 40، الذي يتكون من (غم/لتر) كلوكوز [15]: حضر الوسط وفق طريقة Seed Mediumوسط االبذار (اللقاح) .O27H.4MgSO 0.5 ،4HPO2K 1 ،4PO2KH 1 ،NaCl 2.5 ،O2.H4MnSO 0.1، 10خالصة الخميرة [16] وفق طريقةحضر الوسط :)BPM) Basal Production Mediumوسط االنتاج األساسي ، 4PO2KHغم Urea ،1غم 4SO2)4NH ،(2غم 2من قبل باحث الدراسة الحالية، الذي يتكون من(غم/لتر) ةوالمحور ، المصدر الكاربوني يتضمن NaCl ،µg3 Biotinغم O2.7H4FeSO ،0.5غم O2.7H4MgSO ،0.05غم 0.5 سكريات نقية و مستخلصات مخلفات مصانع االغذية. التخمر خالل الدراسةالفحوصات التي اجريت على وسط [17] الموصوفه من Paper chromatography (PC)اتبعت طريقة :الكشف النوعي عن حامض الكلوتاميك للكشف النوعي لحامض الكلوتاميك لجميع العزالت المستحصل عليها في مراحل العزل والتشخيص لغرض انتقاء العزالت حقة عليها.المنتجة لحامض الكلوتاميك ألجراء الدراسات الال حسب الطريقة الموصوفة Thin Layer Chromatography (TLC)اتبعت التقدير الكمي لحامض الكلوتاميك: ، :20:20)80استعمل محلول الفصل البيوتانول: حامض الخليك: ماء مقطر ( إذلتقدير كمية حامض الكلوتاميك ، [18] من كحول اثيلي)، ثم جففت االلواح وقشطت البقع بعد تحديدها %0.2كاشف اللننهيدرين ( عمالوطور لون البقع المفصولة باست نانومتر وقدر 570االمتصاصية على الطول الموجي وقرأت)، %75مل ايثانول( 5ووضعت في انابيب اختبار تحوي ).1حامض الكلوتاميك بالرجوع الى المنحنى القياسي الموضح بالشكل ( pH .meterتم قياس الرقم الهيدروجيني لوسط االنتاج باستعمال جهاز :وجينيتقدير الرقم الهيدر قيست كثافة النمو البكتيري بطريقة قياس االمتصاصية بجهاز المطياف الضوئي قياس النمو البكتيري: Spectrophotometer اج وسجلت ، وذلك بأخذ حجم معين من العالق البكتيري لوسط االنت[19]وفق الطريقة المتبعة من في الوسط االنتاجي (اعداد الخاليا الحية و.ت.م/مل) ، تم التعرف على كثافة النمو 600امتصاصيته على الطول الموجي ).2بالرجوع الى المنحنى القياسي ألعداد الخاليا الحية الموضح بالشكل ( ) التي وصفت من DNS )3́`,5́`- Dinitro Salicylic Acidت طريقة عملاست :تقدير كمية الكلوكوز المتبقية ).3( الكلوكوز المتبقي بوسط األنتاج بالرجوع الى منحنى الكلوكوز القياسي الموضح بالشكل تركيز . وقُدر[20] 343علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 نتاج حامض الكلوتاميكتحديد الظروف المثلى ال دراسة تأثير المصدر الكاربوني في انتاج حامض الكلوتاميك متمثلة بالسكريات الصناعية النقية والمتضمنة الكلوكوز والفركتوز والسكروز تم اختبار مصادر كاربونية حسبن حضرا ياختبرت عدة مصادر كاربونية طبيعية شملت مستخلص مخلفات التمر ومستخلص مخلفات العنب اللذو طا وفق طريقة . وحضر مستخلص مخلفات البطا[22]، وقصر لونهما باستعمال الفحم المنشط حسب طريقة [21]لطريقة ا . وقدرت نسبة الكاربوهيدرات الكلية للمستخلصات قيد الدراسة [24]ومستخلص سبوس الرز حضر وفق طريقة [23] .[25]بطريقة اضيفت المصادر الكاربوني قيد االختبار بتركيز موحد الى وسط االنتاج : تحديد نوع المصدر الكاربوني األمثل 120) وحضنت بحاضنة هزازه و.ت.م/مل 610×2.8بتركيز ( EN3 B.subtilisاالساسي باستعمال لقاح من بكتريا ساعة، ألختبار المصدر الكاربوني االمثل ألنتاج 48أنتاج ولمدة 7م وعند رقم هيدروجيني بدائي °37دورة/دقيقة وبدرجة حامض الكلوتاميك. الطبيعي الذي اعطى مستخلص الاستعملت تراكيز مختلفة من : تحديد التركيز االمثل لمستخلص مخلفات التمر %.12% و10% و8% و6% و4% و2شملت افضل انتاجية، وكلوريد األمونيوم ونترات األمونيوم وفوسفات األمونيوم نترات البوتاسيومشملت : تحديد مصدر النتروجين األمثل مع مراعاة استعمال التركيز االمثل للمصدر الكاربوني. %،1اليوريا ، اضيفت بتركيز و كبريتات األمونيوم والببتونو فضل مصدر نتروجيني ألنتاج حامض ألتراكيز مختلفة اختبرت تحديد التركيز األمثل لمصدر النتروجين األمثل: .%3% و2% و1% و0.5شملت ،الكلوتاميك م في انتاج °42و 37و 34و 31و 28و 25أختبر تأثير اربع درجات حرارية هي : تحديد درجة الحرارة المثلى الحامض مع مراعاة الظروف المثلى المتحققة في التجارب السابقة. وبفارق 8-5.5حضر وسط االنتاج االساسي بأرقام هيدروجينية تراوحت بين : تحديد الرقم الهيدروجيني االمثل بقة.نصف رقم هيدروجيني بين معاملة وأخرى مع مراعاة تعديل الوسط حسب التجارب السا سرع مختلفة شملت عمالدرس تأثير سرعة دوران الحاضنة الهزازة باست: تحديد سرعة التحريك والتهوية المثلى دورة/دقيقة، ودرس تأثير التهوية بأتباع اسلوب نسبة حجم الوسط االنتاجي الى 220و 180و 160و 120و 80و 60و 40 حجم الدورق (تغيير حجم الدرق) واستخدمت في هذه التجربة دوارق بحجوم مختلفة كل منها يحتوي على حجم ثابت من على التوالي. 20:1و 15:1و 10:1و 6:1و 5:1و 3:1سط : حجم الدورق وسط االنتاج لكي تغدو نسبة حجم الو ت كل الظروف المثلى التي تم تعيينها في القفرات السابقة في تجربة استهدفت تحديد عملاست: تحديد مدة االنتاج المثلى سط االنتاج من حيث المدة الالزمة للوصول الى اعلى انتاجية من حامض الكلوتاميك, مع رصد التغيرات الحاصلة في و ساعة 12ساعة وبواقع 96تركيز حامض الكلوتاميك والنمو البكتيري والرقم الهيدروجيني وكمية الكلوكوز المتبقي لغاية بين متابعة وأخرى. حسبت نسبة التحسن ألنتاجية حامض الكلوتاميك بعد تعيين الظروف حساب نسبة التحسن ألنتاجية حامض الكلوتاميك: سط األنتاج على وفق المعادلة التالية:المثلى لو النتائج والمناقشة subtilis Bacillusعزل وتشخيص بكتريا أُعتمد التشخيص بالبدء على شكل وحجم ولون المستعمرات إذعزلة لدراسة الصفات المزرعية 70اخضعت م °37عند تنميتها على الوسط الزرعي االكار المغذي في Bacillusصفات جنس عزلة 24اظهرت إذوطبيعة نموها, ف ساعة، مستعمرات بيضاء الى كريمي مع ارتفاع مسطح بالوسط، كثيفة لزجة قليالً غير منتظمة الشكل ذات حوا 24لمدة متموجة ولها رائحة القش القديم, وتكون مستعمراتها مزدحمة على سطح الطبق، واستكمل دراسة صفاتها المجهرية من حيث كونها موجبة لصبغة Bacillusفأستبعدت العزالت التي لم تظهر صفات مجهرية مقاربة او مطابقة لصفات جنس السل قصيرة وغالباً ما تكون بشكل ازواج مكونة لألبواغ شبه كرام وتمتلك اشكاالً عصوية او شبه عصوية تتجمع بشكل س . ووفقا Bacillusفي تشخيص جنس [7]) وذلك استنادا الى اسس التصنيف وفق ما جاء به Semicentralمركزية ( أجري عليها بعض Bacillus صفات جنسمطابقة لعزالت التي افرزت نتائجها لنتائج دراسة الصفات المجهرية ) نتائج هذه 2) و (1يلخص الجدول ( إذ، Bacillusات الكيموحيوية والفسيولوجية تمهيدا لتحديد نوع جنس االختبار وفق المفاتيح التصنيفية Bacillus subtilisاالختبارات حيث تم استبعاد خمس عزالت اعطت نتائج متباينة مع صفات و EN24و EN19و EN14وEN9 و EN5و EN4و EN3عزلة هي 13، ووقع األختيار على [27] و [26]المعتمدة تحسن اإلنتاجية (%) = األنتاجية في الخطوة قيد الدراسة (ملغم/مل) ×100 األنتاجية قبل تعيين الظروف المثلى (ملغم/مل) 344علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 EN25 و EN29 و EN30 وEN34 وEN35 وEN39 تميزت هذه العزالت بصفات مقاربة لصفاتBacillus subtilis ومنتجة لحامض الكلوتاميك . )Vitek 2 Compact System( 2لتشخيص بنظام الفايتك ا بعد التأكد منها بوساطة فضال عن العزلة التجارية بكتيريةعزلة 13لتشخيص 2 اختبار الفايتك أعتمد على شخصت على انها EN5و EN3ان هناك عزلتين هما واظهرت نتائج األختبار . [28]االختبارات الكيموحيوية االولية B.subtilis فضال عن عزلة تجارية % على التوالي 90% و94بنسبة احتماليةB.subtilis A1 96بنسبة احتمالية ،% Bacillus و Bacillus pumilusعلى انها EN34و EN24و EN19و EN9و EN4في حين شخصت العزالت megaterium وBrevibacillus choshinensis وBacillus licheniformis وGeobacillus thermoleovorans 14على التوالي، أما العزالتEN وEN25 وEN29 وEN30 و EN35 وEN39 فلم يتم .)Unidentified Organismتشخيصها ( تحديد العزلة األكفأ في انتاج حامض الكلوتاميك في هذه المرحلة على عزلتين فضالً عن العزلة التجارية B.subtilisاشتملت الغربلة الكمية للعزالت المشخصة نوع A1 اذ أُختبرت مقدرتها على انتاج حامض الكلوتاميك، لوحظ تفوق العزلة EN3 بأنتاج حامض الكلوتاميك والتي بلغت ملغم /مل. 0.92فقد بلغت A1ملغم/مل، اما العزلة التجارية EN5 1.15ملغم/مل, في حين بلغت انتاجية العزلة 2 ت مصانع األغذيةتقدير النسبة المئوية للكاربوهيدرات الكلية لمخلفا قدرت النسب المئوية للكاربوهيدرات متمثلة بالكلوكوز في المستخلصات لمخلفات التمر والعنب والبطاطا وسبوس % 3.5% ثم البطاطا 5% يليه مستخلص العنب 8الرز، فقد كان مستخلص مخلفات التمر اعلى نسبة كاربوهيدرات بلغت %.2وادناها سبوس الرز الظروف المثلى النتاج حامض الكلوتاميكتحديد تأثير المصدر الكاربون في انتاج حامض الكلوتاميك ) تأثير سبعة مصادر كاربونية تضمنت اربعة مصادر طبيعية شملت مستخلصات مخلفات التمر4يبين الشكل ( )DEوالعنب ( GE)) والبطاطا (PE) (السبوس) وقشور الرز (BE (ثالثة سكريات صناعية و)نقية كلوكوز(Glu 20اضافتهم الى الوسط األنتاجي األساسي بتركيز في انتاج حامض الكلوتاميك بعد Suc)) وسكروز (Fruوفركتوز ( ) DEالتمر(و.ت.م/مل). لوحظ ان مستخلص مخلفات EN3 Bacillus subtilis )2.8×610غم/لتر وباستعمال بكتريا 1.76اميك عند نفس التركيز, اذ أعطى الكلوكوز اعلى انتاجية بلغت في انتاجية حامض الكلوت الكلوكوزكان يماثل ملغم/مل، ويأتي مستخلص العنب بالدرجة الثانية من حيث تأثيره في انتاجية 1.73فقد بلغت انتاجية DEملغم/مل، اما جة التي تحققت بأضافة سكر ملغم/مل وهي ايضا مقاربة للنتي 1.44حامض الكلوتاميك بواسطة البكتريا قيد الدراسة والبالغة ملغم/مل، لكنها كانت اعلى من النتيجة المستحصل عليها باضافة بأضافة السكروز الى الوسط االنتاجي 1.49الفركتوز ملغم/مل، وهذه النتيجة تمكننا من استغالل مخلفات معامل 0.835ملغم/مل، واعطى مستخلص السبوس اقل 1.38والبالغة في اوساط االنتاج التخمرية والحصول على نواتج تخمرية كاالحماض االمينية واالنزيمات األقحامهتصنيع التمر والمضادات الحيوية وغيرها من النواتج االيضية وبالتالي تؤدي الى خفض كلفة االنتاج وبنفس الوقت تقليل مخاطر التلوث المتمثلة ،عند استعمالهم مخلفات زراعية [19] يهوقد جاءت هذه النتائج مقاربة لما حصل عل البيئي عند رميها كمخلفات، بقشور الكاسافا ومخلفات الذرة ومخلفات االناناس كمصدر كاربوني وحيد النتاج حامض الكلوتاميك واوضح ان هناك تباين ية من في نسبة انتاج حامض الكلوتاميك تعود الى نوع السكريات التي تحويها هذه المخلفات الزراعية فقد بلغت اعلى كم %). 71.6(نسبة الكاربوهيدرات فيها بأستعمال مخلفات الذرة B.subtilisملغم/مل بواسطة بكتريا 4.1 حامض الكلوتاميك ، دُرس تأثير B.subtilis EN3في انتاج حامض الكلوتاميك من بكتريا DEمستخلص من وبغية تحديد التركيز األمثل في DE) ان االنتاجية تزداد مع زيادة تركيز 5في الوسط االنتاجي, ويوضح الشكل ( DEاستعمال تراكيز مختلفة من %، في حين شهد انتاج حامض الكلوتاميك 10ملغم/مل عند تركيز 2.74الوسط، اذ تم الحصول على اعلى انتاجية والبالغة نتاجية عند المستويات العالية من انخفاض اال ود%. ويمكن ان يع12انخفاضا بزيادة تركيز نسبة المادة السكرية الى الكلوكوز الى حدوث تثبيط بالمادة االساس لفعالية بعض االنزيمات او الى زيادة نسبة الكاربون الى النتروجين في الوسط [29]. مصدر النتروجين مصدرين عضويين هما الببتون واليوريا وخمس مصادر العضوية رت سبعة مصادر نيتروجينية شملت باخت كبريتات االمونيوم كالً على حدة ونترات البوتاسيوم وفوسفات االمونيوم وكلوريد االمونيوم ونترات االمونيوم شملت %) وعند 10(مستخلص مخلفات التمر عند تركيز ثبت نوع وتركيز المصدر الكاربوني ان %, بعد0.2تركيز موحد وب ) يبين تأثير هذه المصادر على انتاج حامض الكلوتاميك حيث 6. والشكل (7م ورقم هيدروجيني ابتدائي °37درجة حرارة ملغم/مل ويليها 3.285تفوقت نترات االمونيوم من بين جميع المصادر التي تم اختيارها, اذ بلغ تركيز حامض الكلوتاميك ملغم/مل على الترتيب، 2.055و 2.315و 2.87كبريتات االمونيوم وكلوريد االمونيوم وفوسفات االمونيوم بنسب بلغت ملغم/مل بينما تفوقت اليوريا عند استعمالها كمصدر نيتروجيني عضوي, حيث كانت 1.525وادناها نترات البوتاسيوم ملغم/مل، في حين ادنى مستوى النتاج حامض الكلوتاميك كان عند استعمال الببتون كمصدر نيتروجيني 3.06األنتاجية 345علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 كأفضل مصدر العضوي مع اليوريا كأفضل 3NO4NHمل. وعند مقارنة نترات االمونيوم ملغم/ 1.525عضوي اذ بلغ السبب الى ان أيونات ودوقد يع ،مصدر عضوي نالحظ تفوق نترات االمونيا على اليوريا في انتاج حامض الكلوتاميك NH الالعضوية اكثر مما في الحرة المطلوبة الجل انتاج حامض الكلوتاميك تكون متوفرة في مصادر النيتروجين . تفضل البكتريا المنتجة لحامض الكلوتاميك امالح االمونيوم على غيرها من مصادر النتروجين اذ [30]المصادر العضوية المسؤول عن تحول GDH( Glutamate dehydrogenaseفي هذه االمالح يحفز انزيم ( NHان ايون االمونيوم .[31] الكلوتارات الى كلوتاميت % بغية تحديد التركيز االمثل في 3% و 2% و 1% و 0.5وجرى اختبار تراكيز مختلفة من نترات األمونيوم 3.72) ان اعلى انتاجية لحامض الكلوتاميك بلغت 7اظهرت النتائج الموضحة في الشكل ( إذانتاج حامض الكلوتاميك, % اذ بلغت 2النتاج عند استعمال تراكيز اقل من في حين حصل انخفاض ا% نترات االمونيوم ، 2ملغم/مل عند تركيز % من نترات االمونيوم على التوالي، وكذلك الحال لوحظ 1% و0.5ملغم/مل عند استعمال 3.5ملغم/مل و 3.28ادنى كمية النتيجة وجاءت هذه %. 3ملغم/مل عند تركيز 3.58% ليبلغ االنتاج 2تركيز اعلى من عمالانخفاض كمية االنتاج عند است % كبريتات االمونيوم كمصدر نيتروجيني للحصول على أعلى تركيز لحامض 2عند استعماله [32] موافقة لما حصل عليه Brevibacterium strain.الكلوتاميك بوساطة ساللة من درجة الحرارة الكلوتاميك م في انتاج حامض 40و 37و 34و 31و 28و 25شملت هذه الدراسة تأثير ست درجات حرارية هي ) ان افضل درجة حرارة 8, ويبين الشكل (7وعند رقم هيدروجيني الوسط الذي تم تحديد مكوناته في التجارب السابقةب ملغم/مل، في حين لوحظ انخفاض مستوى االنتاجية دون هذا المستوى عند 5.54م اذ بلغت االنتاجية 34لالنتاج هي ملغم/مل على التوالي, كما ان انتاجية حامض الكلوتاميك انخفضت الى 3.2و ملغم/مل 2.52م لتبلغ  28و 25حرارة م. ان درجة الحرارة المثلى لنمو البكتريا 40م و37ملغم/مل عند رفع درجة حرارة الحضن الى 2.1ملغم/مل و 4.33 االمينية في درجات الحرارة م, وان انخفاض انتاجية البكتريا من االحماض 35و 30المنتجة لالحماض االمينية تقع بين .[33] العالية والمنخفضة يعود الى انخفاض كفاءة التوجيه االيضي للكلوكوز الرقم الهيدروجيني يعد الرقم الهيدروجيني االبتدائي لوسط االنتاج من اهم العوامل المؤثرة في انتاجية االحماض االمينية من البكتريا, B.subtilisفي انتاج حامض الكلوتاميك من بكتريا 8و 7.5و 7و 6.5و 6و 5.5لذا تمت دراسة تاثير ارقام هيدروجينة EN3 34% نترات األمونيوم وحرارة 2مستخلص مخلفات التمر و% 10في الوسط األنتاجي الذي احتوى على  م ويبين 6.5) ان اعلى انتاجية من حامض الكلوتاميك قد تحققت في وسط االنتاج الذي تم ضبط رقمه الهيدروجيني الى 9الشكل ( 2.1لى أدنى مستوى ملغم/ مل, كما يتضح من الشكل نفسه ان انتاجية حامض الكلوتاميك تصل ا 6.12قبل التلقيح, اذ بلغت 8األبتدائي, كما يالحظ حدوث انخفاض االنتاجية عند ارتفاع الرقم الهيدروجيني الى 5.5ملغم/ مل عند الرقم الهيدروجيني ملغم/ مل. ان عامل الرقم الهيدروجيني له تأثيرات واضحة على فسلجة االحياء 3.2لتبلغ انتاجية حامض الكلوتاميك يره على ذوبانية المواد الغذائية وأمتصاصها وعلى نشاط االنزيمات وعلى الشكل المورفولوجي المجهرية عن طريق تأث وقد جرى قياس النمو للخاليا البكتيري [34]. لغشاء الخلية, وتكّون نواتج ثانوية وتفاعالت االكسدة واالختزال )OD₆₀₀nm األرقام الهيدروجين المختبرة، وأتضح ان ) في نهاية مرحلة األنتاج مرافقة لتقدير حامض الكلوتاميك عند كثافة نمو الخاليا ازداد مع اقتراب الرقم الهيدروجيني األبتدائي الى التعادل فنالحظ من الشكل نفسه ان كثافة النمو ارتفعت 2.35و 2.4، ثم تبلغ اقصاها 6عند رقم هيدروجيني ابتدائي 1.108لتصل الى 5.5عند رقم هيدروجيني ابتدائي 0.5من على التوالي. وقد يعود زيادة كثافة النمو في االوساط الزرعية ذات االرقام الهيدروجينية 7.5و 7عند الرقم الهيدروجيني القريبة من التعادل الى طبيعة النظام الفسيولوجي للكائن المجهري الذي يؤثر على ذوبانية المغذيات وامتصاصها وعلى على الطبيعة المورفولوجية لغشاء الخلية وعلى تكوين النواتج األيضية.النشاط األنزيمي فضال ن تأثيرة تأثير التهوية والتحريك نظراً الهمية التهوية في انتاج حامض الكلوتاميك بالدوارق الهزازة فقد درس تأثير النسبة بين حجم الوسط اخل الدورق يؤدي الى تغيرات في شدة في االنتاج, االختالف في حجم الوسط د عملاالنتاجي الى حجم الدورق المست مع مراعاة الظروف المثلى ألنتاج حامض الكلوتاميك التي تم تحديدها في التجارب الحركة وكذلك في تجهيز االوكسجين وسرعة دوران 5:1نسبة عمال) ان است10يوضح الشكل ( اذ. السابقة من حيث مكونات الوسط والظروف البيئية لالنتاج ، كما م°34عند درجة الحرارة المثلى ملغم/مل 6.56قة حققت اعلى انتاجية من حامض الكلوتاميك بلغت دورة/دقي 180 ) وفي حالة 12:1) و(20:1نالحظ انخفاض األنتاجية في كلتا حالتي التهوية الوفيرة المتمثلة بالمعاملة السادسة والخامسة ( في المعاملتين السادسة والخامسة يرتفع انتاج حامض الكلوتاميك بزيادة ف, )3:1التهوية المحدودة المتمثلة بالمعاملة االولى ( دورة/دقيقة، بعدها يبدا تركيز حامض 160ملغم/مل على التوالي عند 1.17ملغم/مل و 0.92سرعة الدوران ليبلغ دورة/دقيقة. وبنفس االسلوب يتزايد نمو الخاليا(على اساس الكثافة 220و 180الكلوتاميك باالنخفاض عند سرعة كما موضح ذلك في دورة /دقيقة 180 وسرعة دوران (5:1) نانومتر عند استخدام نسبة 3.6الضوئية) لتبلغ أقصاها 346علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 و 1.13ضوئية) ليبلغ في المعاملتين السادسة والخامسة فقد انخفض نمو الخاليا (على اساس الكثافة ال، اما 11) الشكل ( على التوالي, وقد يعود هذا االنخفاض في االنتاجية ونمو الخاليا الى نفاذ المصدر الكاربوني والنتروجيني نانومتر 1.22 إذمن الوسط االنتاجي بسبب النمو السريع للخاليا البكتيرية نتيجة وفرة االوكسجين المذاب, االخرى فضالً عن المغذيات ة الدوران للحاضنة على زيادة مزج االوكسجين بالوسط وزيادة ذائبيته، وتحتاج البكتريا الى االوكسجين تعمل زيادة سرع لكن وفرة االوكسجين بمستويات عالية يؤدي الى تشجيع االيض والذي يعمل كمستلم نهائي لاللكترونات في االيض الخلوي, الضروري لتخليق حامض NADPHنه قلة توفر مما ينتج ع PPPمسار وخفض توجيه االيض نحو TCAعبر دورة . α-Ketoglutaric acid [35] الكلوتاميك وتراكم كميات من مدة االنتاج المثلى التي تم B.subtilis EN3تم اجراء هذه التجربة في الظروف المثلى النتاج حامض الكلوتاميك من بكتريا من حامض الكلوتاميك ومراقبة B.subtilis EN3تحديدها في التجارب السابقة من هذه الدراسة ، وسجلت انتاجية البكتريا ساعة , كما 96ساعة ولمدة 12التغيرات الحاصلة بالرقم الهيدروجيني و كثافة النمو وتركيز السكر المتبقي (ملغم/مل) كل ساعة. 96ات الحاصلة على وسط االنتاج اثناء تحديد المدة المثلى لالنتاج والتي استمرت ) بعض التغير3يوضح الجدول ( 0.6اذ لم يحدث انتاج كفوء لحامض الكلوتاميك في االثنتي عشرة ساعة االولى من الحضن, في حين انتجت هذه البكتريا 7.2من حامض الكلوتاميك والتي بلغت ساعة من الحضن, وسجلت اعلى انتاجية 24ملغم/مل من حامض الكلوتاميك بعد وقد ساعة، 96ملغم/مل بعد 2.11ساعة من الحضن, ثم انخفضت انتاجية حامض الكلوتاميك لتصل الى 72ملغم/مل بعد هذا االنخفاض في انتاجية حامض الكلوتاميك الى عدة عوامل، اهمها حصول تغيرات في االليات التنظيمية لمسار وديع كلوتاميك جراء ما طرأ على وسط االنتاج من تغيرات بيئية كانخفاض تركيز الكاربون والنتروجين تخليق حامض ال رقملوحظ حصول حالة انخفاض في ال. [36]وانخفاض الرقم الهيدروجيني للوسط, وايضاً تراكم النواتج العرضية بعد 6.11الى 6.5الهيدروجيني من رقمالالهيدروجيني مرافقة النتاج حامض الكلوتاميك وتراكمه في الوسط, فقد انخفض ساعة من انتاج حامض الكلوتاميك، ويعد انخفاض الرقم الهيدروجيني لوسط 72بعد مرور 5.12ساعة لتصل الى 24 االنتاج احد اهم المؤشرات التي تنعكس على انتاج حامض الكلوتاميك بواسطة االحياء المجهرية, كونه من االحماض ية, لذا يوصى دائماً بمراقبة االس الهيدروجيني لوسط التخمر والمحافظة عليه عند حدود القيمة االمينية الحامض المستخدمة في انتاج حامض الكلوتاميك قد B.subtilis EN3وايضاً يتبين من الجدول نفسه ان خاليا بكتريا . [23]البدائية والتي بلغت OD600م بداللة الكثافة الضوئية °34ساعة من الحضن على 24دخلت مرحلة الثبوت العددي بعد مرور ساعة عن الزمن الالزم لبلوغ انتاجية حامض الكلوتاميك حدودها القصوى والتي 36ساعة وبفارق 36حدها االقصى بعد يوضح الجدول انخفاض كمية السكر المتبقي (الكلوكوز) مع تقدم مدة التخمر وايضا من الحضن. 72اعة كانت عند الس %, وقد يتوافق 68ومالحظة تأثير ذلك على تركيز حامض الكلوتاميك المنتج, اذ كان معدل استهالك الكلوكوز بهذه الفترة 4.04مر االنخفاض في تركيز السكر المتبقي الى ان بلغ هذا االستهالك مع النمو المايكروبي في الوسط االنتاجي ويست ساعة من التخمر. 96ملغم/مل بعد من حامض الكلوتاميك B.subtilis EN3مستوى تحسين انتاجية البكتريا التجارب السابقة محاولة تحسين انتاجية العزلة البكتيرية قيد الدراسة من حامض الكلوتاميك وذلك بتحديد تهدف  ملغم/مل لعزلة 2لحامض الكلوتاميك من الظروف المثلى لالنتاج والذي ساهم في تحسين األنتاجية B.subtilis EN3 ، اذ يعود معظم )%360تحسن بنسبة ين الظروف المثلى (اي ملغم/مل بعد تعي 7.2البرية قبل تعيين الظروف المثلى الى %10% الى 4التحسن في هذه الخطوة الى زيادة تركيز المصدر الكاربوني المتمثل بمستخلص مخلفات التمر من وعند 6.5م ورقم هيدروجيني ابتدائي °34% وباستعمال حرارة 2واستعمال نترات األمونيوم كمصدر نتروجيني بنسبة ساعة. 72دورة/دقيقة ولفترة تخمر بلغت 180هتزاز بلغت شدة ا المصادر 1. Shyamkumar, R., Moorthy, I.M.G., Ponmurugan, K. and Baskar, R. (2014). Production of L-glutamic acid with Corynebacterium glutamicum (NCI M2168) and Pseudomonas reptilivora (NCIM 2598): A study on Immobilization and Reusability. Avicenna Journal of Medical Biotechnology, 6 (3): 163-168. 2. Ault, A. (2004). The Monosodium glutamate story: The commercial production of MSG and other amino acids. J.Chemical Education, 81(3): 347-355. 3. Crueger, W. and Crueger, A. (1982). Amino acids. In: “Biotechnology: A Text Book of Industrial Microbiology”. T. D. Brock, ed. Sinaur Association Inc., Madison. 4. Schallmey, M., Singh A., and Ward O.P. (2004). Developments in the use of Bacillus species for industrial production. Canada. J. Microbiol., 50: 1-17. 347علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 5. Zweers, J.C., Baràk, I., Becher, D., Driessen, A.J.M., Hecker, M., Kontinen, V.P., Saller, M.J., Vavrova, L. and Dijl, J.M.V. (2008). Towards the development of Bacillus subtilis as a cell factory for membrane proteins and protein complexes. Microbial cell factories, 7:10. 6. Westers L., Wasters, H. and Quax, W.J. (2004). Bacillus subtilis as cell factory for pharma ceutical oroteins: a biotechnological approach to optimize the host organism. Biochim. Biophys. Acta., (1694): 299-310. 7. Buchanan, R.E. and Gibbons, N.E. (1974) Bergy’s Manual of Determinative Bacteriology. (8th Ed.). Williams and Wilkins, Baltimore, USA. 8. Cruickshank, R., Duguid, J., Marimon, B. and Swain, R. (1975). Medical Microbiology the Practical of Medical Microbiology.. 2, 12th edition, Churchill Livingstone, UK. 9. Harrigan, W.F. and McCance, M.E. (1976). Laboratory methool in food and dairy microbiology. Academic press Inc. San Diego. 10. Atlas, R.M. (2005). Handbook of Media for Environmental Microbiology. Second Edition. Taylor and Francis Group. USA. 11. Jan, M. H., Carlos, A. and Tony, t. (1998). Bacteriological Analytical manual, 8th Edition, Revision A. 12. Starr, M. P., Stolp, H., Truper, H. G., Balows, A. and Schlegel, H.G. (1981). The Prokaryotes. Vol. II. Springer–Verlag New York. 13. MacFaddin J.F. (2000). Biochemical tests for identification of Medical Bacteria, 3rd ed. Lippincott Wilkins and Williams, philadephia. 14. Atlas, R. M. (1995). Principles of microbiology. 15. Biotechnology,  Mosby,  Inc.  Missouri. 597-648. 15. Pasha, S.Y., Ali, M.N., Tabassum, H. and Mohd, M.K. (2011). Comparative Studies on production of glutamic acid using with type, mutants, immobilized cells and immobilized mutatnts of Corynebacterium glutamicum. Internationl Journal of Engineering Science and Technology, 3(5): 3941-3949. 16. Gutcho, S.J. (1973). Chemicals by Fermentation. Noyes Data Corp. New Jersey. 215. 17. Malik F., (2007). Studies on mino acid producing bacteria through microbial fermentation using different agriculture wastes. University of the Punjab Lahore. Thesis of Ph.D. 18. Mohammed, A., Abdul Moheman, and El-Desoky. G.E. (2012). Amino acid and Vitamin determinations by TLC/HPLC: review of the current state. Central European Journal of Chemistry, 10(3): 731-750. 19. Lawal. A.K, Oso, B.A., Sanni A.I, Grillo, J.A. and Elemo, G.N. (2011). Production of L.glutamic acid from Bacillus isolates cultivated on agro-industrial wastes containing medium. Global Research journal of Microbiology, 1(3): 043-055. 20. Whitaker, J. R. and Bernhard, R. A. (1972). Experiments for: An Introduction to Enzymology. Whiber Press, Davis. 21. Ahmed, Y.M., Khan, J.A., Abulnaja, K.A., and Al-Malki, A.L. (2013).production of glutamic acid by Corynebacterium glutamicum using dates syrup as carbon source. African Journal of Microbiology Research, 7(19): 2071-2077. 348علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 22. Nachat, N., Tobarameekul, P. and Worathanakul, P. (2014).Activated Carbon from Bagasse for Syrup Decolorization as an Alternative for Waste Management and the Assessment of Carbon Footprint.Environment and Natural Resources J., 12(2): 66-73. 23. Moosavi-NaSab, M., Izadi, M., and Hosseinpour, S., (2010). Glutamic acid production from potato by Brevibacterium linens. World academy of science, Engineering and Technology, 4: 1043-1045. باقر، عبد الواحد، العبيدي، خالد عباس، محمد، يسرى خالد وطوبيا، نديم ميخائيل. كفاءة بعض عزالت خميرة .24 Saccharomyces cerevisia المحلية وعزلة تجارية جافة النتاج خميرة الخبز بعد تنميتها في مستخلص ). مجلة علوم 2002المواد الصلبة الذائبة والبايوتين. (مخلفات صناعة الرز الحاوي على تراكيز مختلفة من .9- 1 :)19)، (139المستنصرية. ( 25. Dubois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers. P.A. and Smith, F. (1956). Phenol Sulfuric acid method for the determination of total carbohydrates, Anal. Chem, 28: 350-356. 26. Breed R.S., Murray, E.G.D. and Smith, N.R. (1957). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th Ed. William and Wilkins Company, Baltimore. 27. Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H., Staley, J.T. and Williams, S.T. (1994). "Bergey's manual of determinative Bacteriology". 9th Ed. Williams and Wilkins, Baltimore. 28. Funke, G., Monnet, D., de Bernardis C., Graevenitz, A.V. and Freney, J. (1998). Evaluation of the Vitek 2 system for Rapid Identification of Medially Relevant Gram- Negative Rods. J. Clinical Microbiology, 36(7): 1948-1952. 29. Ingraham, J. L., Maaloe, O. and Neidhardt, F. C. (1983). Growth of the bacteria cell. Sinauer associates Inc. Publishers Sunder land and Massachusettes. 30. Goto, A. and Kunioka, M. (1992). Biosynthesis and hydrolysis of poly- (γ-glutamic acid) from Bacillus subtilis IFO 3335, Biosci. Biotechnol. Biochem., 56(7): 430-437. 31. Riviera, J. (1977). Industrial application of microbiology. Translated by Moss, M. O. and Surrey, J. E. University Press,166-169. 32. Nadeem, S., Niaz, B., Muzammil, H.M., Rana, S.S., Rajok, M.I. and Shakoori, A.R. (2011). Optimizing carbon and Nitrogen sources for L-Glutamic acid production by Brevibacterium strain NIABSS-67. Pakistan J. zool., 43(2): 285-290. 33. Eggeling, L., Pfefferle, W. and Saham, H. (2001). Amino acids. In "Basic Biotechnology". Ratledge, C. and Kristiansen, B., Cambridge Univ., Press. Combrigde, UK. 281-303. 34. Bajaj, I.B. and Singhal, R.S. (2009). Sequential optimization Approach for Enhanced production of poly (- glutamic acid) from Newly Isolated Bacillus subtilis. Food Technol. Biotechnol., 47(3): 313-322. 35. Shah, A. H., Ahmad, S. and Khan, G.M. (2002). Optimization of culture Conditions for L-lysine fermentation by Corynebacterium glutamicum. J. Biological Sciences. 2(3): 151-156. 36. Bala, S. (1976). Studies on the microbial production of Amino acids. Uineversity of the Punjab Lahore. Thesis of Ph.D. 349علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 subtilis EN3 Bacillusختبارات الكيموحيوية لعزالت بكتريا ) نتائج اال1جدول ( *A1 العزلة التجاريةBacillus subtilis A1 ،- انتاج مقبول ، ++ انتاج متوسط + انتاج ضعيف -، التنتج +++ ، لة عز ال تخمر الكاربوهيدرات األختبارات * ي ع نو ال ف ش لك ا يز سد وك األ ص ح ف ص ح ف يز تل كا ال ول ند األ ص ح ف ص ح ف V -P ت را ست ال ك ال ته س ا شأ لن ل ا حل ت ت را نت ال ال تز خ أ ن زي كا ال لل ح ت ن تي ال جي ال لل ح ت يز ور لي ا ز ني سث الل س مو لت ال M R وز وك كل وز كر س وز كت ال ول يت ان م وز ان م EN1 - + - + - + + ++ + - - - + + - + - + - EN2 - + - - + - - + + + - - - + + - + - ++ EN3 + + - + + + + + + - - + - + + - + - +++ EN4 - + - + + + + + + - - + + + + - + - ++ EN5 + + - + + + + + + + - + - + + - + - ++ EN9 - + - + + + + + + - - + - + + - + - +++ 31EN - + - + + + + - - - - + - + + - + - + - EN14 - + - + - + - + + + - + - + + - + - ++ EN16 - + + + + + + + + - + _ - - + - - - + - EN17 + + - + + + + + + + - + - + + - + - + - EN19 - - - + + + - + + + - + - + + - + - ++ EN20 - + - + - + - + + + - + - + + - - - + - EN21 - + - + + + + + + + - + - - + - - - + - EN24 - + - + + + - + + + - + - + + - + - ++ EN25 - + - + + + + + + + - + - + - - + - ++ EN28 - + - + + + - + + + - + - + + - + + - EN29 - + - + + + + + + + - + - + + - + + +++ EN30 + + - + + + + + + - - + + + + - + - ++ EN33 - + - + + + + + + + - + - + + - + - + - EN34 - + - - + + - + + - - _ - + - - + - +++ EN35 - + - + + + - + + + - + - + + - + - ++ EN38 - + - - + + + + + + - + + + + - + - + - EN39 - + - + + + + + + + - + + + + - + - +++ EN40 - + + + + + - + + - - + + + + ++ - ++ A1 - + - + + + - + + + - - - + + - + - ++ 350علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 Bacillusختبارات الفسيولوجية لعزالت بكتريا ) نتائج اال2( جدول لة عز ال ام كر غ صبي ت غ وا ألب ن ا كو ت كة حر ال %النمو بوجود NaCL PHالنمو عند م°النمو بحرارة مختلفة مختلف 5% 7% 10% 25 35 45 55 5 7 9 EN1 + + + + + - + + + - - + + EN2 + + + + + - + + + + - + + EN3 + + + + + - + + + - - + + EN4 + + + + + - + - + + - - + + EN5 + + + + + - + + + - - + + EN9 + + + + - + - + + + - - + + EN13 + + + + + - + + + - + - + + EN14 + + + + + - + + + - + + + EN16 + + + + + - + + + - - + + EN17 + + + + + - + + + - - + + 351علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 نمو ضعيف -ال يوجد نمو + -+ يوجد نمو عند تحديد مدة األنتاج المثلى انتاج حامض الكلوتاميك) التغيرات الحاصلة على وسط 3جدول ( EN19 + + + + + - + + + - - + + EN20 + + + + + - + + + - + - + + EN21 + + + + + - + + + - - + + EN24 + + + + + - + + + - + + + EN25 + + + + + - + + + - - + + EN28 + + + + + - + + + - - + + EN29 + + + + + - + + + - - + + EN30 + + + + + - + + + - - + + EN33 - - - + + - + + + - +- + + EN34 + + + + + - + + + - - + + EN35 + + + + + - + + + - - + + EN38 + + - + + - + + + - - + + EN39 + + + + + - + + + - - + + EN40 + + + + + - + + + - - + + A1 + + + + + - + + + - - + + مدة الحضن (ساعة) تركيز الكلوكوز المتبقي الرقم الهيدروجيني (ملغم /مل) كثافة النمو 600OD تركيز حامض الكلوتاميك (ملغم/مل) 0 6.5 100 0.05 0 12 6.81 90.8 0.4 0.6 24 5.63 78.12 1.06 2.02 36 5.38 75 2.11 4 48 5.21 61.85 2.17 6.2 60 5.18 47.5 2.21 6.73 72 5.12 31.7 1.928 7.2 84 5.77 9.14 1.78 4.55 96 7.02 4.05 1.702 2.11 352علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 الكلوتاميك حامضلتقدير ) المنحنى القياسي 1شكل ( EN3 B. subtilisبكتريالد الخاليا الحية داعلحساب أ) المنحنى القياسي 2شكل ( المتبقيالكلوكوز لتقدير منحنى القياسيال) 3شكل ( 353علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 EN3 B.subtilisترا أنتاجية حامض الكلوتاميك من عزلة بك) 4شكل ( بأستعمال مصادر كاربونية مختلفة DE) العالقة بين تراكيز مختلفة من مستخلص مخلفات التمر 5شكل ( EN3من بكتريا وانتاج حامض الكلوتاميك EN3ا) تأثير مصادر نتروجينية مختلفة في انتاج حامض الكلوتاميك من بكتري6شكل ( 7ورقم هيدروجيني °37عند درجة حرارة 354علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 في انتاج حامض الكلوتاميك تراكيز مختلفة من نترات األمونيومالعالقة بين ) 7شكل ( EN) تحديد درجة الحرارة المثلى ألنتاج حامض الكلوتاميك من بكتريا8شكل ( %10ومصدر كاربون 7عند رقم هيدروجيني وتأثيره على EN3) تحديد الرقم الهيدروجيني األمثل ألنتاج حامض الكلوتاميك من بكتريا 9شكل ( م °34كثافة النمو عند درجة الحرارة المثلى 355علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 B.subtilis EN3تاثير التهوية وشدة الحركة في انتاج حامض الكلوتاميك من بكتريا ) 11شكل ( B.subtilis EN3بكتريا ) تأثير التهوية وشدة الحركة على كثافة نمو خاليا 12شكل ( 0 1 2 3 4 5 6 7 3:01 5:01 6:01 10:01 15:01 20:01 لغم ك م تام كلو ض ال حام ز ری ت / ل م حجم الدورق: نسبة حجم الوسط 40 80 120 160 180 220 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3:01 5:01 6:01 10:01 15:01 20:01 و لنم ة ا ثاف OD 60 0 ة حجم الوسط حجم الدورق : نس 40 80 120 160 180 220 356علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016 Study Productivity of Glutamic Acid by Bacillus subtilis EN3 Isolated from the Soil Eman J. Al-Attar Nidhal M. Salih Dept. of Food Science /College of Agriculture /University of Baghdad Shaymaa H. Al-Rajhi College of Pharmacy /University of Al Nahrain Received in:6March2016, Accepted in :11May2016 Abstract The genus Bacillus bacterium isolated from soil and tests their ability to produce glutamic acid, the bacteria are diagnosed by traditional methods and VITEK-2 system. And we studied the optimal conditions for production and try to improve the productivity of the isolation by manipulating the components of the production medium and of the circumstances environmental of production medium. There is 43 isolates of the 70 bacterial isolates belonging to the genus Bacillus depending on phenotypic characteristics of the colonies and microscopic characteristics and found that 13 isolated revert to species B.subtilis depending on physiological and biochemical characteristics. As well as on microscopic and biochemical tests, 13 isolates were subjected to the diagnostic by VITEK-2 system. The results showed that EN5 and EN3 diagnosed as B.subtilis as well as a commercial isolate A1 was also diagnosed as B.subtilis was selected EN3 isolation, as highest productivity (2 mg/ml).then optimal conditions was studied to produce glutamic acid by using the semi synthesis medium contained waste of extract dates (DE) as best Carbone source at 10% and use of ammonium nitrate as the best source of nitrogen at 2% from the production medium, and achieved better productivity of glutamic acid amounted to 7.2 mg/ml, at the temperature 34°C, pH initial 6.5, ventilation and agitation increase concentration of glutamic acid product when the proportion of medium size to the size of the flask 5:1 in the shaker incubator speeds of 180 rpm, for incubated period of 72 hours, were obtained, improvement rate was amounted to 360% from what was produced wild isolation. Key words: Production of glutamic Acid, Diagnose B.subtilis, Fermentation, Carbon & Nitrogen source, TLC Part of Ph.D. Thesis of the first author 357علوم الحياة | 2016) عام 2العدد ( 29لمجلد ا مجلة إبن الهيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 29 (2) 2016