Microsoft Word - 208-224 علوم الحياة | 208 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 Aspergillus nigerالظروف المثلى إلنتاج حامض الستريك من عزلة فطر محلية بطريقة تخمرات الحالة الصلبة محمد عمر محي الدين جامعة بغداد /كلية الزراعة /قسم علوم األغذية آيدن مازن حسين جامعة بغداد )/ابن الھيثم(كلية التربية للعلوم الصرفة /علوم الحياةقسم ٢٠١٥/شباط / ٢٥قبل في: ، ٤٢٠١/ كانون األول /١٨استلم في: الخالصة ج من ذبعض الفواكه التالفة ونما اشتملتمن مصادر مختلفة عزلة محلية من األعفان ١٤الحصول على في ھذه الدراسة تم ة الثانوية لتبعتھا الغرب الستريك حامضانتاج في لتحديد قابليتھا ھذه العزالت الى الغربلة األولية النوعية التربة. أخضعت قطعة من باستعمال ،تخمرات المغمورة وتخمرات الحالة الصلبةالفي الغربلة الثانوية طريقة تجمع واعتمدتالكمية. أغزر إنتاجاً من بين A7نمو العفن وإنتاج الحامض. فتبين أن العزلة االسفنج كمادة ساندة، ُشبعت بالمغذيات المطلوبة ل عائديتھا الى A7الضوئي، وعلى األوساط الزرعية للعزلة أظھرت الفحوصات المظھرية تحت المجھر. ھاجميع العزالت وبطريقة تخمرات الحالة لية مختلفة إلنتاج الحامض من العزلة المذكورة أومواد استعملت .Aspergillus nigerالعفن تبين من خالل تحديد الظروف المثلى إلنتاج . الدراسة عليھا فأكملتأفضل من غيرھا مسحوق الذرة أن . ووجدالصلبة (ماء: وسط) ودرجة حرارة ١:٠٫٧٥حامض الستريك من العزلة المذكورة أن أفضل تلك الظروف تمثلت بنسبة ترطيب أيام من الحضن، حيث بلغت إنتاجية حامض الستريك ٣بوغ / مل وخالل ٧١٠قاح وحجم ل ٣ورقم ھيدروجيني مْ ٢٥ مصدر للنتروجين ، % ١غم من الوسط. ولوحظ في الدراسة أن تدعيم الوسط بمستخلص الخميرة بتركيز١٠٠غم/ ٢٠٫٨ غم من ١٠٠غم / ٢٣٫٠ق زيادة إنتاجية الحامض بلغت يساھمان في تحقيمن الميثانول الى ماء الترطيب، % ٣ وإضافة HPLC (Highكماً ونوعا بطريقة ( تم تشخيص حامض الستريك المنتج. كان محدوداً فضافة اإليثانول إثير أتأما الوسط. Performance Liquid Chromatography فوجد أن كمية الحامض المنتجة بعد ثالثة أيام من الحضن تحت الظروف وإن ،Pyridine وباستعمالوھي أقل من تلك التي قدرت بالطريقة الكيميائية .غم من الوسط١٠٠غم/ ١٣٫٥٤ المثلى تبلغ ثمة مركب آخر رافق إنتاج الحامض بكمية غير قليلة، لم يتم التعرف عليه، قد يكون أحد الحوامض العضوية لدورة نتائج تقدير حامض الستريك على ، الذي يحتمل أنه يتداخل مع حامض الستريك عند تقديره بطريقة البريدين. وبناءً سكريب اإلنتاجية الفعلية للحامض من العزلة قيد الدراسة بلغت القيمة المذكورة أعاله وليس تلك يمكن القول أنً HPLCبطريقة .الكيميائية طريقةالعلى أساس احتسبتالتي Aspergillus niger العفن تخمرات الحالة الصلبة ، حامض الستريك،:الكلمات المفتاحية . علوم الحياة | 209 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 المقدمة يُعد حامض الستريك من الحوامض الشائعة في الطبيعة، إذ يوجد، وبالدرجة األساس، في مجموعة الفواكه التي تدعى بالحمضيات كالبرتقال والليمون والكريب فروت واليوسفي وغيرھا، فضالُ عن وجوده في الفواكه األخرى ولكن بنسب في الحقبة التي سبقت إنتاج حامض الستريك بوساطة األحياء المجھرية كان االھتمام ينصب على إنتاجه . متفاوتة وضئيلة من Carl Wilhelm Scheeleمن الحمضيات كالليمون والبرتقال علما بأًن أول من قام بعزله وبلورته الباحث السويدي األھمية التجارية لھذا الحامض ھو حجم السوق ن أحد أھم المعايير التي توضح. إ] ١ [ ١٧٨٤عصير الليمون عام يُستھلك . ] ٢[% ٥مليون طن لكل سنة وبزيادة سنوية تقدر بحوالي ١٫٧الضخمة له حيث يصل إنتاجه العالمي الى تليھا الصناعات الصيدالنية التي وإنتاجهمن مجمل % ٧٠حامض الستريك في تصنيع األغذية بكمياٍت كبيرة تقدر بحوالي وتُعد الفطريات الخيطية .] ٣[ منه تقريباً، أما ما تبقى فيجد طريقه في تطبيقات أوصناعات أخرى متنوعة % ١٢تنفذ تس ق إنتاج ائوتتنوع طر. ]٤[ Aspergillus nigerاألكثر إستعماالً لھذا الغرض السيما Aspergillusالتي تعود الى جنس Submerged Cultureوطريقة المزارع المغمورة Surface Cultureحامض الستريك بين طريقة المزارع السطحية أن حامض الستريك ينتج بطريقة تخمرات ] ٦[وذكر. Solid state fermentation [5] الحالة الصلبةوطريقة تخمرات الحالة الصلبة وطريقة المزارع المغمورة . يستعمل حامض الستريك كمادة مضادة لألكسدة ومادة حافظة أو إلعطاء النكھة الحامضية للمشروبات وفي صناعة الجلي والمربيات و الكانديز والنبيذ وغيرھا ، كما أنه من المنظمات الجيدة للحموضة كمادة حافظة مانعة ةالمتزايد استعماالتهكونه يمتلك خاصية مخلبية تربط المعادن. وھذه الخاصية قادت الى عن فضال وتتنوع ] ١١، ٧،٨،٩،١٠ [ألكسدة الدھون والزيوت، كما يستعمل في الصناعات الصيدالنية وفي مواد التجميل وغيرھا البكتريا والخمائر واألعفان. غير أن معظم الدراسات تناولت إنتاجه األحياء المجھرية المنتجة لحامض الستريك ، ما بين منذ أمد بعيد لھذا الغرض، وھو من الفطريات الخيطية الذي يتميز بسھولة التعامل A. nigerمن األعفان. وأستعمل العفن ب نظامه األنزيمي ببس ]١٢ [كمية وفيرة من الحامضل هتخمير مختلف المواد الرخيصة و إنتاجفي قابليته فضال عن معه، -nوثمة سالالت من الخمائر معروفة بإنتاجيتھا العالية منه، ومن بعض المركبات الھيدروكاربونية مثل ]١٣ [المتطور alkanat .مكونات الوسط الغذائي من مصادر الكاربون إنتاج حامض الستريك مثل في عوامل عدة تؤثر وھناك المعدنية وتركيزھا، فضال عن ظروف التخمر وتشمل الرقم الھيدروجيني ودرجة والنتروجين والفوسفات والعناصر Solid Stateالدراسة تخمرات الحالة الصلبة هالحرارة والتھوية والمحتوى الرطوبي للوسط. واستعملت في ھذ Fermentation مجھرية على مواد عرف ھذا النوع من التخمر بأنه عملية تتم فيھا تنمية األحياء اليلغرض اإلنتاج. و مكانية إلوتفضل تخمرات الحالة الصلبة على التخمرات المغمورة ]١٤[أساس صلبة تحتوي على نسبة واطئة من الماء وقلة المخلفات المطروحة، وليس ثمة قلق من تصريف ھذه المخلفات الى البيئة لكون معظم [15] الحصول على ريع مركز وتفضل على المغمورة أيضاً من حيث محدودية إحتماالت تلوثھا ،]١٦[أثناء التخمرالمغذيات فيھا تكون قد استنفذت . وبصورة عامة، فإن الباحثين والعلماء ما زالوا يتحّرون [17] باألحياء المجھرية الدخيلة غير تلك المستعملة في اإلنتاج مثل لحالي خلفات المستعملة في الوقت اعن مخلفات رخيصة غنية بمصادر الكاربون للتحويالت الحيوية، الى جانب الم .]١٨[الموالس الذي القى رواجاً أكثر من غيره في إنتاج حامض الستريك بسبب توفره نسبيا ورخص ثمنه ق العمل:ائالمواد وطر :مصادر العزل تم Aspergillusاستعملت في ھذه الدراسة عدد من الفطريات التي تتوافق خواصھا المزرعية والمجھرية مع الجنس الحصول عليھا من مصادر متعددة اشتملت على التربة والفواكه الحامضية التالفة ، فضال عن ثالث عزالت من مختبر التقنية الحيوية. وسطا لعزل وحفظ وتنشيط الفطريات. حيث حضر حسب Potato dextrose agar (PDA)استعمل العزل والغربلة: لمدة ٢باوند/انج ١٢١ في غم في لترمن الماء المقطر. عقم في المؤصدة ٣٩بإذابة DOXOIالشركة المجھزة تعليمات أما دقيقة. وأستعمل كذلك في تنقية العزالت وفي دراسة خواصھا المزرعية وطبيعة نموھا كخطوة باتجاه تشخيصھا. ١٥ ر واحد من الماء ـالمذكورة ادناه في لتات ـة المكونـوحضر بإذابCzapek-Dox Agar عملية الغربلة فقد تمت على وسط وبواقع حسب الھدف من التجربة، مع استبدال النشا بالكلوكوز أو السكروز وبعض التحوير] ١٩ [يـبما ورد فـالمقطر وحس غم ، ٠٫٥ 4MgSOغم ، ١٫٠ 4HPO2Kغم ، ٠٫٥ KClغم/ لتر من الماء المقطر. والمكونات االخرى ھي: ٣٠ 3NaNO 4(3غم، ٣٫٠(SO2Fe بحامض ٦ضبط الرقم الھيدروجيني للوسط على غم. ١٣. ٠غم ، آكار ٠٫٠١ %٩٥في %١موالري. وعقم اضيف الى الوسط كاشف المثيل االحمر المحضر بتركيز ٠٫١الھيدروكلوريك بتركيز طة على الوسطمل من الوسط بعد التعقيم. نقلت قطعة صغيرة من العزالت المنش ١٠قطرات لكل ٤-١ميثانول وبواقع تكوين الحامض/قطر النمو(سم) خالل مدد تم خاللھا تقدير نسبة قطر ليوم ويومين وثالثة أيام وستة أيام ٠م ٣٠وحضنت في .)١٩٩٥(السامرائي،انتاج الحامضفي معينة من الحضن. واتخذت ھذه النسبة دليال أولياّ على قابلية العزالت علوم الحياة | 210 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 :تحضير اللقاح مل من الماء المقطر المعقم. تم ٥٠حضر لقاح من أبواغ العزالت قيد الدراسة بنقل عدد من قطع النمو من وسط العزل الى تحريك القطع بھدف تفريط األبواغ ، مرر العالق عبر قمع معبأ بالقطن ومعقٍم سلفاً للتخلص من الھايفات. ُحسب عدد . وخفف بالماء المقطر Hemocytometerاوية معقمة، وذلك باستعمال شريحة األبواغ في الراشح الذي تم استقباله في ح بوغ . ٦١٠× ٥مللتر منه على ١المعقم بحيث يحتوي :نتاج حامض الستريكا أعتمدت طريقتان النتاج الحامض ھما: جابك دوكس سم بوسط ٨×سم ٢طريقة الساند الصناعي: وفيھا شبع ساند صناعي يتألف من قطعة إسفنجة بأبعاد -أ ٦ْم ولمدة ٣٠. لقحت بلقاح العزالت قيد االختبار وحضنت على [20]الخالي من اآلكار والحاوي على السكروز أيام. . تم تقدير الحموضة الكلية بطريقة التسحيح. وحسبت كفاءة اإلنتاج على أساس النسبة المئوية للحامض لطريقة في الغربلة الثانوية للعزالت.المتكون من السكريات الكلية في الوسط. اعتمدت ھذه ا غم من المادة االولية المتمثلة باحد المخلفات الزراعية وبنسبة ١٠طريقة تخمرات الحالة الصلبة: وفيھا رطبت - ب بوغاً وذلك في دورق مخروطي ٦١٠× ٥مل من لقاح يحتوي على ١من الماء وعقمت بالمؤصدة ولقحت بـ ١:١ مل ٥٠ايام. استخلص الحامض من وسط التخمير بـ ٦لمدة ٠م ٣٠في درجة مل. حضنت الدوارق ٢٥٠بسعة ٨٠٠٠ثم اخضع الراشح للطرد المركزي على قوة Whatman No. 1من الماء المقطر ، ورشح عبر ورقة دقيقة للتخلص من الشوائب المحتملة. قدر حجم الراشح و رقمه الھيدروجيني وحموضته ١٥دورة/دقيقة لمدة ق المذكورة ادناه. اعتمدت ھذه الطريقة ائية والسكريات المتبقية فيه، فضال عن حامض الستريك وذلك بالطرالكل عند تعيين الظروف المثلى النتاج الحامض من العزلة األكفا في االنتاج. بأسلوب تخمرات Aspergillus niger A7تعيين الظروف المثلى إلنتاج حامض الستريك من العفن :الصلبةالحالة نخالة الحنطة وكسبة زھرة الشمس وسحالة الرز تم انتاج الحامض بالطريقة التي وردت اعاله باستعمال مواد اشتملت على الكمال مسحوق الذرة . اختير تجانس األجزاء تقريباً الى درجة ومسحوق الذرة بعد تجفيف ھذه المواد ھوائيا ثم طحنھا جيدا (ماء: ١:١٫٥الى ١:٠٫٥الدراسة عليھا الفضليتھا، وذلك تحت ظروف متباينة من نسبة الترطيب التي ترواحت ما بين ٨١٠الى ٦١٠ ٥xْم ، وحجم اللقاح الذي تراوح بين ٤٠الى ٢٠مسحوق الذرة)، ودرجة الحرارة التي تراوحت ما بين . علما بان نتائج كل مرحلة من مراحل تعيين الظروف ٧الى ٢راوح من بوغ/مل والرقم الھيدروجيني االبتدائي الذي ت إنتاج في ُدرس تأثير عدد من مصادر النتروجين المثلى قد تم تسقيطھا على المرحلة التالية وبالتسلسل المذكور. كما على مستخلص الخميرة الحامض وتحت الظروف المثلى التي تم التوصل إليھا في التجارب السابقة واشتملت ھذه المصادر . كما درس تأثير تراكيز %١والببتون و كلوريد األمونيوم ونترات األمونيوم إذ أضيفت الى محلول الترطيب وبتركيز بعد ان تبين انھا افضل مصادر النتروجين في انتاج الحامض. % ٢٫٥الى ٠٫٥من مستخلص الخميرة تراوحت من مختلفة نتاج بإضافتھما الى وسط ) كمادة محفزة لال%٩٥الكحول المثيلي واألثيلي (وبتركيز ستعمل في ھذه الدراسة كل مناو ، وكالّ على حده.من ماء الترطيب % ٥، ٣،٤، ٢، ١، ٠ بعد الترطيب والتعقيم وبمستويات ھيمسحوق الذرة ق التقدير :ائطر بعد ضبط الجھاز باستعمال نوعين من pH-meterستعمل جھاز قياس الرقم الھيدروجيني ا تقدير الرقم الھيدروجيني: . 7واألخر برقم ھيدروجيني 4الدوارئ أحدھما برقم ھيدروجيني :تقدير الحموضة الكلية ٠٫١نتاج مع ھيدروكسيد الصوديوم بتركيز مل من راشح اال ٥بتسحيح ] ٢[1قدرت الحموضة الكلية حسب طريقة ى اساس حامض الستريك.موالري باستعمال دليل الفينو فثالين . وحسبت عل تقدير حامض الستريك : مل من ١٫٣مل من راشح االنتاج الى أنبوبة اختبارثم أضيف اليھا ١، إذ نقل ] ٢ [2قدر حامض الستريك وفقا لطريقة ووضعت في حمام Acetic anhydrateمل من ٥٫٧ورجت األنابيب بسرعة ثم أضيف اليھا Pyridineكاشف البريدين نانوميتر بوساطة ٥٤٠دقيقة لغرض تطور اللون .أخذت قراءة االمتصاصية على طول موجي ٣٥ْم ولمدة ٣٢مائي على . واحتسبت كمية حامض الستريك المنتجة باالستعانة بالمنحنى القياسي Spectrophotometerجھاز المطياف الفوتومتري ي.للعالقة بين االمتصاصية وتراكيز متدرجة من حامض الستريك النق علوم الحياة | 211 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 نتاج:تقدير السكريات الكلية والمتبقية بعد اال وحسبت كمية ] ٢[3نتاج الحامض، والمتبقية فيھا بعد انتاجه بإتباع طريقةانتاج قبل قدرت السكريات الكلية في وسط اال السكريات المستھلكة بطرح الثاني من االول. غم من الوسط)١٠٠(غم/ حامض الستريك ١٠٠× كفاءة التحول % = غم من الوسط )١٠٠كمية السكريات المستھلكة (غم/ :HPLCتشخيص حامض الستريك كما ونوعا باستعمال كماً ونوعاً في عدد من العينات باستعمال Aspergillus niger A7تم تقدير حامض الستريك المنتج من العفن في ادناه . وحسب ظروف استخدام الجھاز HPLC(High Performance Liquid Chromatographyجھاز( HPlCظروف استعمال جھاز النتائج والمناقشة والغربلة:العزل -١ األعفان من عينات من تربة أخذت من كلية الزراعة ومن الفواكه التالفة، على وسط آكار عزلة محلية من ١٤تم انتقاء دكستروز البطاطا، وتم تنقية العزالت على الوسط نفسه وبعدة نقالت. وروعي إبتداًء أن تكون ھذه العزالت من النوع الذي والمتمثلة بتكوين مستعمرات قطنية سوداء niger Aspergillusوالمجھرية للعفن ينطبق عليھا الخواص المزرعية وتكوين ھايفات تنتھى بخاليا قدمية من جھة، وبرؤوس كونيدية داكنة، تتوزع عليھا أبواغ سوداء عارية متسلسلة، ذلك زالت مشخصة تم الحصول عليھا نتاج حامض الستريك. اخضعت ھذه العزالت مع ثالث عالتميّز ھذا النوع من العفن على انتاج حامض الستريك، بتنميتھا على وسط آكار جابك في ة قابليتھا فمن مختبر التقنية الحيوية، الى الغربلة األولية لمعر أيام. أتخذ تحول لون ٦م لمدة ٣٠دوكس الحاوي على السكروز مصدرا للكاربون وكاشف أحمر المثيل وبدرجة حرارة نتاج الحامض في االعزالت ةر الى األحمر جراء تغيّر الحموضة دليالً على تكون الحامض. قورنت كفاءالوسط من األصف ) كفاءة ١يوماً من التنمية. ويوضح الجدول ( ٦و ٣و ٢بحساب النسبة بين قطر المنطقة الملونة الى قطر منطقة النمو خالل عزلة بأن أعطت نسبة إنتاج عالية بلغت ١٧ت من أصل سم . وتميزت ست عزال ٧٫٦ - ٣٫٢العزالت ، إذ تراوحت بين الوسط نفسه بعد استبدال باستعمالسم أو أكثر. اختيرت ھذه العزالت الختبارھا في مرحلة الغربلة األولية الثانية ٥ ة ذات انتاجي A7 , A8 , A13أن ثالث عزالت منھا وھي )٢ھو موضح في الجدول( السكروز بالكلوكوز. فتبين وكما وفي خطوة الحقة ).١أيام (الشكل: ٦و ٢و ١عالية من الحامض بداللة نسبة قطر تكون الحامض الى قطر النمو بعد نتاجاً للحامض. أجريت ھذه الخطوة ا أخضعت العزالت الثالثة ھذه، لخطوة إضافية من الغربلة للوقوف على أغزرھا Column نوع العمود HITACHI LaChrom C18-AQ (5µm) (4.6 mmI. D.×250 mm) Elute محلول الغسل 1mmol/L H٢SO٤ + 8 mmol/L Na٢SO٤ (pH 2.8) Flow rate معدل الجريان 1.0 mL/min Column Temperature درجة حرارة العمود 25°C Detection وحدة االمتصاصية UV 210 nm Injection vol. حجم الحقن 15 µL علوم الحياة | 212 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 وباستعمال ساند صناعي تمثل بقطعة من األسفنج. تم تقدير الحموضة بطريقة تجمع بين تخمرات الحالة الصلبة والسائلة نتاج على أساس النسبة المئوية للحامض المتكون من السكريات الكلية في الوسط. الكلية بطريقة التسحيح. وحسبت كفاءة اال ٨Aنتاج للعزلة االبينما كانت كفاءة % ١٢٫٦٦نتاج الحامض حيث بلغت الاكانت أكثر كفاءة ٧Aفوجد أن العزلة كمال الدراسة عليھاال A7على التوالي. عليه وقع االختيار على العزلة ٨٫٦٦و ١١٫٦٦قد بلغت A ١٣والعزلة بأسلوب تخمرات A. niger A7نتاج حامض الستريك من العفنتعيين الظروف المثلى ال : الحالة الصلبة :نتاج الحامضاختبار الوسط األفضل ال-١ نتاج حامض الستريك تضمنت سحالة الرز من المخلفات الزراعية والمتوفرة أثناء الدراسة وسطا صلبا ال أستعمل عدد قد أعطى أعلى إنتاجية A7) أن العفن ٢ونخالة الحنطة وكسبة زھرة الشمس ومسحوق الذرة. ويالحظ من الشكل ( من وسط نخالة الحنطة بينما أظھرت غم ١٠٠غم/ ١٫٠٨غم من وسط مسحوق الذرة و ١٠٠غم / ٢٫٢٥للحامض بلغت نتاجية الحامض من سحالة الرز فكانت واطئة للغاية إذ بلغت اغم أما ١٠٠غم/ ٠٫٣٧كسبة زھرة الشمس إنتاجية بلغت نتاجية الحامض باستعمال مسحوق الذرة وسطاً كانت أعلى من غيرھا، عليه تم اغم من الوسط. ولكون ١٠٠غم/ ٠٫١٩ يُعزى تباين إنتاج الحامض في األوساط الصلبة المختلفة الى عدد من . والالحقة من ھذه الدراسةإعتمادھا في المراحل األسباب أبرزھا تباين مكونات الوسط من المواد العضوية والالعضوية وتكوين معقدات ما بين المواد العضوية مع مكونات اوية للمواد المستعملة في تخمرات الحالة الصلبة لخواص الفيزيفضال عن االوسط الالعضوية من األمالح والمعادن، .، كحجوم الدقائق والمساحة السطحية ومسامية الوسط نزيماتنتاج المركبات األيضية واالاتأثيرات متباينة في :نتاج الحامضال نسبة الترطيب األمثل-٢ غم من مسحوق الذرة في دوارق مخروطية توزيعاً ١٠أجري الترطيب بتوزيع الكمية المطلوبة من الماء على سطح ) أن ٣م ولمدة ستة أيام . ويبين الشكل ( ٣٠متجانساً ما أمكن ذلك. جرت عملية انتاج الحامض في درجة حرارة حضن غم من الوسط بينما ١٠٠غم/ ٤٫٤٠ذ بلغت إنتاجية الحامض (ماء : وسط االنتاج) إ ١:٠٫٧٥أفضل نسبة ترطيب كانت عند . كما لوحظ تدھور اإلنتاجية عند زيادة نسبة ترطيب الى ١:١غم من الوسط عند نسبة ترطيب ١٠٠غم / ٢٫٧٠كانت غم من الوسط عند نسبة الترطيب ١٠٠غم/ ٠٫٩٠غم من الوسط. انخفضت الى ١٠٠غم/ ١٫٣٠اذ كانت ١:١٫٢٥ عامال حرجا وحاسما في تخمرات دإن محتوى الرطوبة يع .النسبة المثلى ١:٠٫٧٥ت نسبة الترطيب دع. عليه ١:١٫٥ الحالة الصلبة ألنه يؤثر على نمو الكائن وتخليق وإفراز المركبات األيضية المختلفة التي يقوم بتخليقھا.إن زيادة نسبة نعدام نتقال األوكسجين أو تعيقه الا ألنھا تّحُد من نخفاضاُ في الحصيلةاالترطيب عن المستويات المطلوبة قد تسبب ختزال ذوبان المواد المغذية للمادة انخفاض المحتوى الرطوبي يؤدي الى اان كما غات البينية بين أجزاء الوسط. االفر د على كل من الخاضعة وانخفاض درجتي االنتفاخ والشد المائي العاليتين وبذلك فإن القيم المثلى للمحتوى الرطوبي تعتم . ] ٢٤ [الكائن الحي المجھري المنتج والوسط الصلب المستعمل درجة الحرارة المثلى للحامض:-٣ ) تأثير درجة الحرارة في إنتاج الحامض من العفن وياُلحظ إنخفاض اإلنتاجية بإرتفاع درجة الحرارة مع ٤يوضح الشكل ( ْم . ٢٠غم من الوسط عند ١٠٠غم/ ١٠٫٦٠كانت اإلنتاجية للحامض م فقد ٢٥و ٢٠تقارب اإلنتاج عند درجتي الحرارة غم من الوسط ثم بدأت بالتدھور عند درجات الحرارة ١٠٠غم/ ١١٫٨٠م فبلغت ٢٥شھدت زيادة عند درجة الحرارة لفسلجية السيما . أن تأثير درجة الحرارة في إنتاج حامض الستريك من األحياء المجھرية يرتبط بتأثيراتھا ا٠م٣٠أعلى من ) مما تتسبب في تراكم بعض المنتجات األيضية األخرى مثل حامض citrate synthaseفعالية األنزيمات ومنھا (في ) تجعل األعفان تميل نحو إنتاج حامض مْ ٤٠الى أن درجة الحرارة العالية ( ] ٢٦ [ وتوصل .] ٢٥[االوكزاليك ر.االوكزاليك بشكل يفوق حامض الستريك بكثي نتاج الحامض:حجم اللقاح األمثل ال -٤ بوغ/مل. إذ يالحظ ان ٨١٠، ٧١٠× ٥، ٧١٠، ٦١٠×٥) نتائج إضافة اللقاح الى الوسط بحجوم مختلفة ھي ٥يبين الشكل ( بوغ/مل . ٧١٠غم من الوسط عند استعمال لقاح بحجم ١٠٠غم/١٢٫٣٠نتاج الحامض يصل حدوده القصوى البالغ ا هان ]٢٧ [. في ھذا الصدد ذكر ٦١٠×٥بوغ/مل إوعند خفضه الى ٨١٠و ٧١٠×٥نتاجية بزيادة حجم اللقاح الى تتدھور اال مع قليل من الكحول بطريقة Aspergillus niger M-101نتاج حامض الستريك من العفن قد وجد حجم اللقاح األمثل ال بوغ /مل.٨١٠المزارع المغمورة كان األمثل النتاج الحامض:الرقم الھيدروجيني -٥ علوم الحياة | 213 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 نتاج الحامض مع زيادة الرقم الھيدروجيني اإلبتدائي، وبلغ حده األقصى عند في ا) زيادة قابلية العفن ٦يالحظ من الشكل ( نخفاض تدريجيا مع أرتفاع غم من وسط مسحوق الذرة، بدأت باال١٠٠غم/١٥٫٣فكانت اإلنتاجية ٣الرقم الھيدروجيني كأفضل رقم إلنتاج الحامض في المراحل الالحقة. ٣عتماد الرقم الھيدروجيني اأو أكثر. وعليه تم ٤ى الرقم الھيدروجيني ال سكروز %١باستعمال الموالس وإضافة ٥نتاج حامض الستريك ھو وجدا أن الرقم الھيدروجيني األمثل ال [ 28]بيد أن العنب مخلفات من الستريك حامض نتاجالدروجيني ن أفضل رقم ھيإ ]٢٩[وجد وبطريقة تخمرات الحالة الصلبة. بينما .٦٫٥ھو Aspergillus niger الصلبة أيضاً و بوساطة عزلة محلية من العفن الحالة تخمرات باستعمال نتاج الحامض:االمصدر النتروجيني األمثل في -٦ لكونه مھماً لنمو العفن فحسب وإنما في نتاج حامض الستريك ليس اال بد من اإلشارة أن النتروجين جزء أساسي ومؤثر في عمليات األيض األولي والثانوي. ويعد مستخلص الخميرة، مصدراً لعدد من الفيتامينات الى جانب كونه مصدراً نتاج الحامض أكثر من غيره من المصادر النتروجينية ا للنيتروجين. ولعل ھذا ھو السبب الذي ساھم في أن يكون تأثيره في ) تأثير عدد من مصادر النتروجين التي استعملت لتدعيم الوسط ٧ي استعملت في ھذه الدراسة. يوضح الشكل (األخرى الت نتاج حامض الستريك واشتملت على مصادر منھا ماھي عضوية وأخرى العضوية وھي كلوريد األمونيوم ونترات افي في كل أن مستخلص الخميرة كان له التأثير األكبر . ويتبين من الش % ١األمونيوم والببتون ومستخلص الخميرة وبتركيز غم من ١٠٠غم/ ١٤٫٤٠غم من وسط مسحوق الذرة، بينما كانت اإلنتاجية ١٠٠غم/١٦٫٤٠نتاجية الحامض، فكانت ا غم من الوسط بإضافة نترات األمونيوم وكلوريد ١٠٠غم/ ٦٫٥غم و ١٠٠غم/ ١٠٫٠٠الوسط عند استعمال الببتون و نتاجية الحامض على وسط السكروز كانت اأن داقد وج [28]األمونيوم للوسط وعلى التوالي. ويذكر في ھذا الصدد أن أعلى بتدعيمه بنترات األمونيوم مقارنة مع مستخلص الخميرة والببتون. وفي تجربة مكملة جرت محاولة تحديد التركيز ٠٫٥األفضل من مصدر النتروجين األمثل وھو مستخلص الخميرة وذلك بإضافته الى وسط اإلنتاج بمستويات تراوحت من ، % ١) أن أفضل انتاج للحامض قد تحقق عند استعمال ٨ما بين المعامالت. و يوضح الشكل ( % ٠٫٥وبفارق ٢٫٥الى شھد تدھورا واضحاُ إذ فقد كما في التجربة السابقة، حيث شھد إنتاج الحامض باإلنحراف عن ھذه النسبة زيادة أو نقصاناً، .% ٠٫٥غم عند المستوى ١٠٠غم/ ١٠٫١٠وبلغ % ١٫٥غم من الوسط عند المستوى ١٠٠غم/ ١١٫٤٠بلغ :نتاج الحامضنتاج األمثل) المدة الحضن المثلى (زمن اال-٧ نتاج الحامض. تم متابعة جميع المتغيرات الحاصلة في الوسط خالل مدة ا) تأثير مدة الحضن في ٣الجدول ( يوضح حامض الستريك والسكريات المستھلكة. ويالحظ من الحضن، متابعة يومية، من الرقم الھيدروجيني و الحموضة الكلية و غم من وسط ١٠٠غم/ ٢٠٫٨٠نتاجية مع الزمن وبلوغھا حدھا األقصى في نھاية اليوم الثالث إذ بلغت الشكل زيادة اال نتاجية باالنخفاض غم من الوسط .ثم أخذت اال ١٠٠غم/ ٥٫١٠مسحوق الذرة إذا ما قورنت بنھاية اليوم األول إذ كانت غم من الوسط بعد اليوم الرابع والخامس والسادس وعلى التوالي. ويالحظ ١٠٠غم / ١٦٫١٠و ١٦٫٧٠و ١٧٫٥٠غت فبل من الجدول أيضاً أن كفاءة تحويل السكريات الموجودة في الوسط الى حامض الستريك في ضوء ھذه النتائج قد بلغت ھي من السكريات %٥٢، مما يعني أن ما يقارب من %٥١٫٨٥ت األخرى حدھا األقصى في نھاية اليوم الثالث أيضاُ، وكان قد تم تحويلھا الى حامض الستريك وما تبقى قد استغلت من قبل العفن في %٧٣٫٨٤الكلية الموجودة في الوسط والبالغة غم / ٣٠٫١١ت انتاج الطاقة وتكوين الكتلة الحيوية . ومع ھذا فإن كمية السكريات التي بقيت في الوسط دون استغالل كان ومن األسباب الرئيسة في إنخفاض إنتاجية الحامض بعد مدة من وصولھا . غم من الوسط في نھاية اليوم السادس ١٠٠ ، وفي المقدمة منھا حامض Catabolitesحدودھا القصوى ھو تراكم النواتج الثانوية والوسطية لعمليات األيض الھدمي اشاروا ]٣٠ [الستريك، وظھور التأثير الكابح لھذه النواتج في فعالية المركبات المشاركة في العمليات األيضية .غير ان ألى أن أفضل مدة إلنتاج الحامض في ظروف التجارب التي قاموا بھا كانت خمسة أيام لحامض:تأثير الكحول المثيلي واالثيلي في إنتاج ا-٨ مستويات من الكحول المثيلي ومثله من الكحول األثيلي في إنتاج الحامض في الظروف المثلى التي تم ةدرس تأثير خمس من الكحول المثيلي (حجم/حجم) % ١زيادة اإلنتاجية عند إضافة )١٠التوصل إليھا في ھذه الدراسة. ويالحظ من الشكل ( الى % ٣وبلغت قيمتھا القصوى عند % ٢رتفعت بزيادة نسبتھا الى غم من الوسط و إ ١٠٠غم/٢٠٫٨٠إذ كانت غم من الوسط وذلك عند ١٠٠غم/0١٦٫٨غم من الوسط، ثم أخذت باالنخفاض والتدھور حتى وصلت الى ١٠٠غم/٢٣٫٠٠ ربما يحّد من نمو نتاج في التراكيز العالية ، أنه . ويعزى التأثير السلبي للكحول المثيلي في اال% ٥نسبة الكحول المضافة نتاج في التراكيز الواطئة فيعود الى دور الميثانول في تكييف المايسيليوم ويؤخر تكوين السبورات، أما سبب الزيادة في اال المايسيليوم إذ يزيد من نفاذية الجدار الخلوي دون أن يضعف أيض العفن وبذلك يسمح للخلية بافراز السترات وتستجيب . بيد أن ] ٥[نتاجھا من السترات من أجل أن تحافظ على مستوى كاٍف منھا في داخلھااعن طريق زيادة الخلية لھذا الوضع نتاج الحامض، مشيرا أنه ليس من احظ أن إضافة الكحول المثيلي الى الوسط وبأي مستوى كان ، يؤدي الى تدھور ال [31] علوم الحياة | 214 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 نتاج ا.بينما Aspergillus nigerنتاج إيجابيا مع جميع عزالت أو سالالت العفن الضرورة أن يكون تأثيره في اال غم من الوسط ١٠٠غم/ 0٢١٫٦نتاج حيث بلغ اال %٣الحامض يزداد بزيادة تركيز الكحول االثيلي المضاف وصوال الى . وبمقارنة ھذه %٥التركيز غم من الوسط نفسه عند ١٠٠غم/١٤٫٧٠نخفض الى اثم بدأ اإلنتاج بالتدھور تدريجيا حيث أن إضافة [32],النتائج مع تلك الخاصة بالميثانول يمكن القول أن تأثير األخير كان أفضل من تأثير اإليثانول وبين ٤٠٫٦٥غم الوسط مقابل ١٠٠غم/٤٥٫٨٥غم الوسط قد حققت زيادة في إنتاج الحامض بلغ ١٠٠مل/ ٢٥الميثانول بتركيز إضافة الكمية نفسھا من اإليثانول.غم الوسط جراء ١٠٠غم/ :HPLCتشخيص حامض الستريك كماً ونوعاً باستعمال أيام من الحضن في الظروف المثلى، كما ونوعا ٦و ٥و ٣نتاجھا بعد اتم تشخيص حامض الستريك في العينات التي تم ) أن قمة حامض الستريك القياسي يظھر ١٠. ويبين الشكل ( HPLCوباالستعانة بالمحاليل القياسية ، وذلك باستخدام جھاز من مجمل المساحة الكلية لمختلف القمم للمحلول القياسي % ٩٤٫٥٨دقيقة وبمساحة بلغت ٨٫٤٠في زمن إحتجاز مقداره من أيام من الحضن فكان ز ٦و ٥و ٣مايكروليتر. أما عينات الحامض المنتجة بعد ١٥الذي حقن في الجھاز بمقدار دقيقة ٨٫٤٤٧و ٨٫٢٩٦و ٨٫٤١٧إحتجازھا مطابقا الى حد بعيد لزمن احتجاز حامض الستريك القياسي، وھي وعلى % ١١٫٠٦٣و % ١٩٫١٩١و % ٢٥٫٦٢١)، شغلت مساحة بلغت نسبتھا من مجمل مساحة القمم ٤(الجدول: يك في العينات مع االخذ بنظر اإلعتبار حجم التوالي. مما يعني أن العينات تتضمن ھذا الحامض. قدرت كمية حامض الستر غم من ١٠٠غم / ٥٫٨٥و ١٠٫١٥و ١٣٫٥٤مستخلصات الحامض وعدد مرات التخفيف قبل الحقن في الجھاز، فكانت نتاج التي تم تحديدھا في ھذه الدراسة . ويالحظ أن ھذه القيم أيام من الحضن في الظروف المثالية لال ٦و ٥و ٣الوسط بعد ) وإن ثمة ٣(الجدول: ١٦٫١٠و ١٦٫٧٠و ٢٠٫٨٠ستعمال البريدين وھي امن تلك التي قدرت بالطريقة الكيميائية ب أقل ) لم ١١(الشكل: تقريباً ٣٫٣ة اإلحتجاز مدنتاج الحامض بكمية توازي أحياناً كمية حامض الستريك وفي امركب آخر يرافق وامض العضوية لدورة كريبس، والذي يحتمل أنه يتداخل مع حامض يتم التعرف عليه أو تشخيصه ، قد يكون أحد الح نتاجية ن االايمكن القول HPLCالستريك عند تقديره بطريقة البريدين. وبناًء على نتائج تقدير حامض الستريك بطريقة لى أساس طريقة حتسبت عا غم من الوسط وليس تلك التي ١٠٠غم / ١٣٫٥٤الفعلية للحامض من العزلة قيد الدراسة تبلغ غم من الوسط. ١٠٠غم / ٢٠٫٨٠البريدين وھي المصادر 1-Abou-Zeid, A.; and Mohamed, (1984). Production of citric acid : A review Agricultural wastes ., 9:51-76 2-Kana, E. B. G. ; Oloke J. K. , Lateef A. and Oyebanji A. ,( 2012). Comparative evalution of artifical neural network coupled genetic algorithm and respons surface methodology for modeling and optimization of citric acid Production by Aspergillus niger MCBN297.Chem Eng. Transac., 27:397-402. 3-Rodrigues, C. ;Vandenbergh L. P. S., Sturm W., Dergint,D. E. A. Spier,M.R. Carvaalho J.C.D. and Soccol,C. R. ,(2013).Effect of forced aeria on citric acid production by Aspergillus sp. Mutants in SSF. World. J. Micro. Biotech., 4-Kirimura , K . ;Yoda, M. ; Kumatani, M. ; Ishii, Y. ; Kion, K. and Usami, S. (2002). Cloning and expression of Aspergillus niger icd A gen encoding mitoconderia NADP+-specific Isocitrate Dehydrogenase J.Biosci . and Bioeng. 93: 136-144. جامعة الموصل. - ).التكنولوجيا الحيوية .دار الكتب للطباعة والنشر١٩٩٣العاني ، فائزعزيز.(-٥ 6-Adham, N. Z. ; (2002). Attempts at improving citric acid fermentation by Aspergillus niger in beet-molasses medium. Bioresource Technology. 84(1) : 97 – 100 . 7-Baei, M.S. ; Mahmoud, M. & Yunesi, H. A. ( 2008) Kinetic model for citric acid production f rom apple pomace by Aspergillus niger. Afr J Biotechnol, 7(19), . 3487- 3489. علوم الحياة | 215 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 8-Wasay, S.A. ; Barrington S. ; and Tokunaga.S. (2001). Organic acids for the in situ remediation of soils polluted by heavy metals: Solid flushing in columns. Water, Air, and Soil Pollution.127(1-4):301-314. 9-Majumder, L. ; khalil, l . Munshi,M.K. Alam,K. Harun- Rashid, Begum R. and N. Alam, ( 2010). Citric acid Production by Aspergillus niger using molasses and pumpkin as substrates. Eur. J. Biol. Sci., 2 : 01 – 08. 10-Amenaghawon, N.A. &Aisien, F.A. ( 2012). Modeling and Simulation of citric acid production from Corn Starch Hydrolysate Using Aspergillus niger. Res, 2(1), 73-85 11-Aysegul, P. ; and Christian P. K. ( 2003). Effects of Sucrose Concentration during Citric acid Accumulation by Aspergillus niger . Turk. J. Chem. 27:581-590. 12-Imandi, S. B. ; Bandarru,V. V. R. ; Somalanka S. R. and Garapati, H. R. ( 2007). Optimization of medium composition of citric acid from by product glycerol using Dehlert experimental design . Enzyme. Microbial,Technol.1,40:13667-1372. 13-Munshi, M., Hossain F. ; H uque, R. . Rahman, Khatun. A.; Islam M. and M. I. Khalil, (2013) Eff ect of biomass and sugar on citric acid production by Aspergillus niger using molasses and jackfruit as substares. Am. J. Food Nutr.,1:1-6. 14- Mazutti , M., ;Bender , J.P. ;Treichel, H. and Luccio , M.D. (2006). Optimization of inulinase production by solid state fermentation using sugarcane bagasse as substrate. Enzyme and microbial Technology, 39 : 56-59. 15-Mazaheri, M.A., and Nikkhah, M.( 2002). Production of citric acid from date pulp by solid state fermentation. J. Agric Sci. Techno. 16-Kareem, S. O.; Akpan, I. and Alebiowu, O. O. (2010) Production of citric acid by Aspergillus niger using pineapple waste. Malaysian Journal of Microbiology. 6(2),. 161-165 17-Imandi, S.B.; Bandaru, V.V.R.; Somalanka, S.R.; Bandaru, S.R. &Garapati, H. R. ( 2008) Application of statistical experimental designs for the optimization of medium constituents for the production of citric acid from pineapple wastes. Bioresource Technol, 99(10),.pp 4445-4450. 18-Pazouki, M., Feles,P.A. Sinha J. and . Panda T,( 2000). Comparative studies on citric acid production by Aspergillus niger and Candida lipolytica using molasses and glucose. Bioprocess Eng., 22:353-361 شا بوساطة الفطر ).انتاج حامض الستريك من الن١٩٩٥السامرائي ،سوسن مصطفى عبد الرحمن .(-١٩ Aspergillus niger جامعة بغداد. –.رسالة ماجستير .كلية الزراعة ) إستخدام ساند صناعي بدالُ من المخلفات ٢٠١٣محي الدين، محمد عمر، رقيباء على جيجان ومصطفى محمد (-٢٠ وزارة التخطيط / الجھاز .٣٩٢٣الزراعية في إنتاج األنزيمات بطريقة تخمرات الحالة الصلبة. برأءة اختراع برقم المركزي للتقييس والسيطرة النوعية. 21-Pearson, D. (1973).The chemical anylases of food. 6 th Ed. Chemical publishing Co., Inc., London. 22-Marier, J. R. and Boulet, M.(1958).Direct determination of citric acid in milk with an improved pyridine –acetic anhydrate method . 23-Whitaker, J. R. and Bernhard, R. A. (1972). Experiments for An Introduction to Enzymology. The Whiber press, Davis 24-Perez-Guerra, N.; Torrado-Agrasar, A.; Lopez-Marcias, C. and Pastrana , L.(2001). Main characteristics and applications of solid substrate fermentation. Website: copyright 2001 electronic J. of Environ. Agri. And Food Chem. علوم الحياة | 216 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 25-Arzumanov, T .E.; Shishkanova, N. V. and Finogennova, T. V. (2000) Biosynthesis of citric acid by Yarrowia lipolytica repeat-batch culture on ethanol J. Appl. Microbial and Biotechnol.53:525-529. 26-Haq , I., Ali , S.; Qadeer , M. A. and Iqbal , J. (2002) . Citric acid fermentation by mutant strain of Aspergillus niger GCMC-7 using molasses based medium . Elect. J. Biotechnol. 5 ; 125- 132. 27-Nadeem, A.; Syed, Q., Baig, S., Irfan, M. and Nadeem, M. (2010) Enhanced production of citric acid by Aspergillus niger M-101 using lower alcohols. Turkish . J. Biochem. 35(1):7-13. 28-Vasanthabharathi,V. N. Sajitha, N. and Jayalakshmi, S. ,(2013). Citric acid production from U-V Mutated Estuarine Aspergillus niger .Advances in Biological Research 7(3):89-94 علي-٢٩ ) إنتاج حامض الستريك من مخلفات العنب ٢٠٠٦سليمان ( بدوي ، امين و محمد ثلج، كركز محمد و ، احمد Aspergillus nigerباستخدام تخمرات الحالة الصلبة بواسطة الفطر . مجلة ، 11 -مجلد مجلد الصرفة، للعلوم تكريت دعد 1. 30-Shojaosadati, A. A. and Babaeipour, V. (2002) Citric acid production from apple pomace in multi-layer packed bed solid state bioreactor. J. Process Biochem. 37: 909- 914 31-Kuforiji, o; Kuboye, A. O. and Odunfa, S. A. (2010) Orange and pineapple wastes as potential substrates for citric acid production International journal of Plant Biology 1, 1 32-Ashraf, H. ; Rehman, A. and Haq ,I. (2004) Effect of alcohols on the production of citric acid by Aspergillus niger.using solid state fermentation .J. food Technol. 2:1-4. علوم الحياة | 217 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 Czapek Doxنتاج الحامض في وسطفي ا المرحلة األولى من الغربلة األولية لتحديد قابلية العزالت .)١(رقم جدول agar الحاوي على السكروز والمثيل األحمر بداللة نسبة قطر تكون الحامض الى قطر النمو نسبة قطر تكون الحامض/قطر النمو(سم)لمدد مختلفة من الحضن مصدر العزالت العزالت ستة أيام ثالثة أيام يومان ١A ٤٫٢ ٤٫٢ ٤ التربة ٢A ٤٫٢ ٤ ٣٫٨ التربة ٣A ٥٫٧ ٤٫٩ ٤٫٣ التربة ٤A ٣٫٦ ٣٫٦ ٣٫٢ التربة ٥A ٣٫٢ ٣٫٢ ٣ التربة ٦A ٤٫٥ ٤٫٢ ٤ الفاكھة ٧A ٧٫٦ ٥٫٩ ٥٫٣ الفاكھة ٨A ٥٫٥ ٤٫٥ ٤٫٥ الفاكھة ٩A ٤٫٥ ٣٫٧ ٣٫٣ الفاكھة ١٠A ٦٫٢ ٥٫٥ ٤٫٥ الفاكھة ١١A ٤٫٩ ٤٫٤ ٤٫١ الفاكھة ١٢A ٤٫٦ ٤٫٣ ٣٫٦ الفاكھة ١٣A ٧٫١ ٥٫٥ ٥٫٢ الفاكھة ١٤A ٤٫٦ ٣٫٧ ٢٫٣ الفاكھة ١٥A عزلة من مختبر التقنية ٥٫٥ ٤٫٥ ٤٫٣ ١٦A عزلة من مختبر التقنية ٣٫٣ ٣٫٢ ٣٫٠ ١٧A عزلة من مختبر التقنية ٤٫٣ ٤٫٢ ٣٫٢ Czapek Doxنتاج الحامض في وسطفي ا الغربلة األولية لتحديد قابلية العزالتالمرحلة الثانية من .)٢(رقم جدول agar الحاوي الكلوكوز والمثيل األحمر بداللة نسبة قطر تكون الحامض الى قطر النمو العزالت تمصدر العزال لمدة نسبة قطر تكوين الحامض/قطر النمو(سم)بعد الحضن ستة أيام يومان يوم ٣A ٥٫٩ ٤٫٣ ٤٫١ التربة ٧A ٧٫٢ ٥٫٥ ٤٫٧ الفاكھة ٨A ٦٫٣ ٥٫٦ ٥٫١ الفاكھة ١٠A ٥٫٦ ٥٫٢ ٥٫٠ الفاكھة ١٣A ٦٫٧ ٥٫٣ ٤٫٧ الفاكھة ١٥A عزلة من مختبر التقنية ٥٫٢ ٤٫٢ ٤٫٢ علوم الحياة | 218 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 باستعمال مسحوق الذرة بطريقة تخمرات Aspergillus niger A7نتاج حامض الستريك من العفن ا .)٣( رقم جدول أيام في ٦خالل المراحل المختلفة من الحضن لمدة ٣بتدائي اوبرقم ھيدروجيني ١:٠٫٧٥الحالة الصلبة المرطبة بنسبة بوغ/مل٧١٠وبحجم لقاح مقداره ٠م ٢٥درجة حرارة مدة الحضن باأليام الحموضة الكلية غم ١٠٠(غم/ من الوسط) حامض الستريك غم ١٠٠(غم/ من الوسط) ية السكريات الكل المتبقية بعد االنتاج غم من ١٠٠(غم/ الوسط) السكريات المستھلكة غم من ١٠٠(غم/ الوسط) كفاءة التحويل* (% ) - - ٧٣٫٨٤ - - صفر ٥٥٫٥ ١ ٠٥٫٥ ٣٣٫٢٢ ٢٢٫٦١ ٥١٫٢٣ ٠١١٫٦ ٢ ٧٥٫٩ ٠٤٢٫٣ ٩١٫٠٣ ٣١٫٥٤ ٠٥٫٢٣ ٣ ٠٢٠٫٨ ٥١٫٨٥ ٤٠٫١١ ٣٣٫٧٣ ٠١٩٫٣ ٤ ٥٤٫١٧ ٤٢ .٩٧ ٤٠٫٧٨ ٣٣٫٠٦ ٠١٨٫٥ ٥ ٠١٦٫٧ ٤٠٫٧٣ ٤١٫٠٠ ٣٢٫٨٤ ٧٥٫١٧ ٦ ٠٥٫١٦ ٧٠٫٣٦ ٤٣٫٧٣ ٣٠٫١١ باستعمال مسحوق الذرة بطريقة تخمرات الحالة الصلبة A7 A.nigerإنتاج حامض الستريك من العفن .)٤(رقم جدول HPLCتحت الظروف القياسية بطريقة نوع العينة رقم القمة )زمن اإلحتجاز(دقيقة مساحة القمة من مجموع القمم (%) عدد مرات ل التخفيف قب الحقن في الجھاز حامض الستريك غم) ١٠٠(غم/ من الوسط حامض الستريك القياسي مل)١٠٠غم/١( ٦ ٨٫٤٠ ٩٤٫٥٨ _ _ أيام من ٣نتاج بعد اال الحضن في الظروف المثلى ١٧ ٨٫٤١ ٢٥٫٦٢ ١٠ ١٣٫٥٤ أيام من ٥نتاج بعد اال الحضن في الظروف المثلى ١٩ ٨٫٢٩ ١٩٫١٩ ١٠ ١٠٫١٥ أيام من ٦نتاج بعد اال الحضن في الظروف المثلى ٢٠ ٨٫٤٤ ١١٫٠٦ ١٠ ٥٫٨٥ علوم الحياة | 219 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 نتاج حامض الستريك بداللة تغيير لون المنطقة المحيطة بالنمو على الوسط في ا A7قابلية العزلة .)١( رقم شكل Czapek Dox agar رالحاوي على المثيل األحم على أوساط مختلفة بطريقة تخمرات A7 Aspergillus nigerنتاجية حامض الستريك من العفن ا.) ٢(رقم شكل أيام ٦م ولمدة ٣٠بوغاً/مل في درجة الحرارة ٦١٠×٥حجمه وبلقاح ١:١الحالة الصلبة المرطبة بنسبة باستعمال مسحوق A7 Aspergillus nigerنتاج حامض الستريك من العزلةاتأثير نسبة الترطيب في .)٣(رقم شكل أيام وبرقم ٦م ولمدة ٣٠بوغاً/مل في درجة الحرارة ٦١٠×٥الذرة وسطاً لتخمرات الحالة الصلبة وبلقاح حجمه ٧ ھيدروجيني 0 1 2 3 4 5 ٠٫٥ ٠٫٧٥ ١ ١٫٢٥ ١٫٥ ة جي نتا اال ) /غم ١ ٠ ٠ ط س لو ن ا م غم ( نسبة الترطيب 0 0.5 1 1.5 2 2.5 نخالة الحنطة سحالة الرز كسبة زھرة الشمس مسحوق الذرة ة جي نتا اإل ) /غم ١ ٠ ٠ ط س لو ن ا م غم ( نوع الوسط علوم الحياة | 220 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 باستعمال مسحوق A7 Aspergillus nigerنتاج حامض الستريك من العزلةاتأثير درجة الحرارة في .)٤(رقمشكل لإلنتاج بطريقة تخمرات ٧بوغ/ مل ورقم ھيدروجيني ٦١٠×٥وسطاً وبحجم لقاح ١:٠٫٧٥الذرة المرطبة بنسبة أيام ٦الحالة الصلبة ولمدة باستعمال مسحوق A7 Aspergillus nigerنتاج حامض الستريك من العزلةاتأثير حجم اللقاح في .)٥(رقم شكل ٦ولمدة ٧ورقم ھيدروجيني ٠م ٢٥وسطاً لإلنتاج بطريقة تخمرات الحالة الصلبة بدرجة ١:٠٫٧٥الذرة المرطبة بنسبة )٦١٠×(حجم اللقاح المذكورأيام باستعمال Aspergillus niger A7 نتاج حامض الستريك من العفناتأثير الرقم الھيدروجيني في .)٦(رقم شكل بوغ/مل بطريقة تخمرات الحالة الصلبة في ٧١٠وسطاً لإلنتاج ولقاح حجمه ١:٠٫٧٥مسحوق الذرة المرطبة بنسبة أيام ٦م ولمدة ٢٥ درجة الحرارة 0 5 10 15 ٥ ١٠ ٥٠ ١٠٠ ية ج نتا اإل ) /غم ١ ٠ ٠ ط س لو ن ا م غم ( )مل/بوغ(حجم اللقاح 0 5 10 15 20 ٢ ٣ ٤ ٥ ٦ ٧ ة جي نتا اإل ) /غم ١ ٠ ٠ ط س لو ن ا مم غ ( الرقم الھيدروجيني 0 5 10 15 ٢٠ ٢٥ ٣٠ ٣٥ ٤٠ ة جي نتا اإل ) /غم ١ ٠ ٠ ن م غم ط س لو ا ( درجة الحرارة علوم الحياة | 221 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 باستعمال Aspergillus niger A7 نتاج حامض الستريك من العفناتأثير مصادر النتروجين في .) ٧(رقمشكل بوغ/مل وسطاً لإلنتاج بطريقة تخمرات الحالة ٧١٠والملقحة بلقاح حجمه ١:٠٫٧٥مسحوق الذرة المرطبة بنسبة أيام ٦م ولمدة ٢٥في درجة الحرارة ٣الصلبة برقم ھيدروجيني Aspergillus niger نتاج حامض الستريك من العفناتأثير تركيز مختلفة من مستخلص الخميرة في .)٨(رقم شكل A7 ٣نتاج بطريقة تخمرات الحالة الصلبة برقم ھيدروجيني وسطاً لال ١:٠٫٧٥باستعمال مسحوق الذرة المرطبة بنسبة أيام ٦ولمدة ٠م٢٥بوغ/مل في درجة ٧١٠والملقح بلقاح بحجم قدره 0 5 10 15 20 control مستخلص خميرة ببتون نترات االمونيوم كلوريد االمونيم ية ج نتا اال ) /غم ١ ٠ ٠ ن م غم ط س لو ا ( المصادر النتروجينية 0 5 10 15 20 ٠٫٥ ١ ١٫٥ ٢ ٢٫٥ ة جي نتا اإل ) /غم ١ ٠ ٠ ط س لو ن ا م غم ( مستخلص الخميرة علوم الحياة | 222 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 Aspergillus niger A7نتاج حامض الستريك من العفن اتأثير الكحول المثيلي واالثيلي في .) ٩(رقم شكل وبلقاح ٣بتدائي اورقم ھيدروجيني ١:٠٫٧٥بطريقة تخمرات الحالة الصلبة باستعمال مسحوق الذرة المرطبة بنسبة م.٢٥أيام من الحضن على درجة حرارة ٣بوغ /مل خالل مدة ٧١٠حجمه 0 5 10 15 20 25 ٠ ١ ٢ ٣ ٤ ٥ غم ة جي نتا اال / ١ ٠ ٠ ط س لو ن ا م %تركيز الميثانول وااليثانول لميثانو لايثانو علوم الحياة | 223 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 علوم الحياة | 224 ٢٠١٥) عام 3(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (3) 2015 Optimization of Citric acid production from Locally isolate fungus Aspergillus niger by solid state fermentation Mohammed O. Mohi-Aldin Dept.Scince of Food/ College Agriculture/ University of Baghdad Aiden M. Hussain Dept. of Biology/ College of Education for Pure Science(Ibn Alhatham) / University of Baghdad Received in: 18/ December/2014 , Accepted in: 25/February /2015 Abstract This study aimed to obtain an isolate of a mold that has well characteristic for production of citric acid from raw materials available locally by solid-state fermentation and determination of the optimum conditions for production .Fourteen mold isolates producing acid were obtained from different sources, involved decayed fruits and soils. These isolates were subjected to initial qualitative screening followed by secondary quantitative screening In secondary screening a method combined between the submerged fermentation and solid-state fermentation was followed using a piece of sponge saturated by nutrients required for growth and production of acid. It was found that the isolate of A7 was the highest producer for citric acid than any other isolates including three standard isolates obtained from the Laboratory of Biotechnology/ College of Agriculture. Morphological analysis under the light microscope and cultural characteristics on solid media showed that the isolate A7 belongs to Aspergillus niger. Different raw materials were used for the production of citric acid from this isolate by solid-state fermentation included sunflower waste, wheat bran, rice bran as well as ground corn. It was found that the latter was better than others,therefore it was used for optimization of production conditions of the acid. The optimum conditions were achieved on ground corn moistened with water at a ratio 1:0.75 with an initial pH 3 inoculated with 107 spores/ml during an incubation time of 3 days at 25 C0..The productivity of citric acid under these conditions was 20.8 gm/100 gm of the media. Supporting the media with 1% of yeast extract and adding 3% of methanol to moisten solution was found to increase the productivity to 23.0 g /100 g, while the effect of ethanol was limited. Citric acid produced in this study was detected quantitatively and qualitatively by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and it was found that the amount of citric acid produced after three days of incubation under optimum production conditions was ١٣٫٥٤ gm/ 100 gm of media. This value was less than that estimated by the chemical method using pyridine. It was also noted that, beside citric acid, there was another compound produced in visible quantity. Although this compound was not recognized in this study, it is thought to be any of organic acids of Kreb's cycle and this compound may be interact with citric acid when determined by pyridine. According to results of determination of citric acid by HPLC it can be said that the actual production of citric acid was as mentioned above (13.54 gm/ 100 gm) but not as estimated by the chemical method using pyridine . Keyword: Solid state fermentation , Citric acid, Aspergillus niger