Microsoft Word - 246-253 علوم الحياة | 246 ٢٠١٥) عام 2(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (2) 2015 Enterococcus faecalisتشخيص بكتريا المكورات المعوية البرازية تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل عمالباست نساناالالمعزولة من جذور اسنان (PCR) عذراء حميد حسون للعلوم الصرفة ابن الھيثم / جامعة بغدادقسم علوم الحياة / كلية التربية سوزان علي كاظم مديرية تربية الكرخ الثالثة / وزارة التربية ٢٠١٥/اذار/١٥قبل البحث :، ٢٠١٥/كانون الثاني/٢٠ استلم البحث في : الخالصة ا ذي اعمار مختلفة مأخوذة من مرضى ) عينة 100في ( Enterococcus faecalisتم التحري عن وجود بكتري مصابين بالتھاب جذر السن للمرة االولى ولم يخضعوا بعد للعالج ( اصابة ابتدائية )، ومرضى مصابين بالتھاب جذر السن ، و عينة من االصابات االبتدائية لجذر ( 70 ) تاخذاذ السن بعد الخضوع للعالج و فشل العالج (اصابة ثانوية ) ، السن ( اعادة العالج ) . ت الثانوية لجذرعينة من االصابا ( 30) عزلة تعود 24شخصت البكتريا باالعتماد على الطرزالمظھرية بالطرائق الكيموحياتية التقليدية حيث تم الحصول على ل رة المتسلس ل البلم ة تفاع تعمال تقني ة باس رز الجيني ى الط اد عل ت باالعتم م شخص ة ، وث ورات المعوي ا المك لبكتري Polymerase Chain Reaction (PCR) assey ى ول عل م الحص ود 32وت ة تع ة عين ورات المعوي ا المك لبكتري البرازية . بكتريا المكورات المعوية البرازية ، جذر السن ، تفاعل البلمرة المتسلسلالكلمات المفتاحية : علوم الحياة | 247 ٢٠١٥) عام 2(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (2) 2015 المقدمة في امعاء ( Normal flora )كنبيت طبيعي Enterococcus faecalisتتواجد المكورات المعوية البرازية االنسان والحيوان ،فضالً عن وجودھا في الجھاز التناسلي االنثوي وفي تجويف الفم وأحيانا في الجھاز التنفسي ، كما توجد لھذا النوع من البكتريا خالل عقد التسعينيات بسبب تنوع االخماج التي . ازدادت االھمية السريرية[1]التربة والميــاهفي ) من االصابات المتسببة عن المكورات المعوية التي تصيب االنسان ، 90%ولة عن حوالي (ؤتسببھا ، اذ وجد انھا المس واألنزيم ( Cytolysin ) سينيوان امراضيتھا مرتبطة بقدرتھا على انتاج العديد من عوامل الضراوة التي تشمل السايتوال ة ادات الحيوي ددة للمض ة والمتع ا العالي ن مقاومتھ الً ع ا ، فض اق وغيرھ ل االلتص نس وعوام ون الج دم وفرم ال لل الح فيات بة بالمستش اج المكتس ببة لالخم ة المس ات الرئيس ن الممرض دة م ا واح ا جعلھ رات مم ا [2]والمطھ تھرت بكتري . اش الثانوية االصابات ، وباالصابات االبتدائية لجذور االسنان ي طب االسنان بسبب ارتباطھاالمكورات المعوية البرازية ف وجدتفي احيان قليلة من االصابات االبتدائية لجذور االسنان حيث E.faecalis، وقد عزلت بكتريا [3,4](فشل العالج ) اكثر االنواع المعزولة تكرارا من االصابات الثانوية E.faecalisجنبا لجنب مع البكتريا الالھوائية ،بالمقابل كانت بكتريا ق الزرعية والكيموحياتية التقليدية للتحري عن الكائنات الحية الدقيقة التي تسبب ائالطر ت.استخدم [5]لجذور االسنان واع الموجود ة ھي اكثر االن ة البرازي ا المكورات المعوي ة تكرارا والسيما في اخماج جذور االسنان ، وأكدت ان بكتري ذور وات الج ة لقن ابات الثانوي ي [6].االص تعملة ف ة المس ة التقليدي ق الكيموحياتي ة والطرائ ق الزرعي تعمال الطرائ ان اس المسببة إلصابات جذور االسنان بسبب صعوبة عزل وتشخيص ھذه المجھرية التشخيص محدود جدا في تشخيص الكائنات د استخدم ا ، لھذا فق ة المسببة الخماج جذور البكتري ة للتحري عن االنواع البكتيري ت مؤخرا الطرائق الوراثية الجزيئي باستعمال . اكدت طرائق التشخيص الجزيئية [7]االسنان ولتشمل االنواع البكتيرية التي تكون صعبة العزل والتشخيص ا (PCR ) تقنية ة تكرارا من االصابات الثانوية للقنوات ھي اكثر االنواع المعزول E.faecalisايضا على ان بكتري ة ا ظون .[7,8]الجذري ة بكتري ت دراس ي تناول ات الت ة الدراس نان ، E.faecalisرا لقل ذور االس وات ج ن قن ة م المعزول ا باستعمال تقنية ( ) ألول مرة في PCRوتشخيصھا بالطرائق الوراثية الجزيئية جاءت ھذه الدراسة لتشخيص ھذه البكتري . 16s ribosomal RNAالعتماد على الجين المتخصص بغداد با المواد وطرائق العمل Samplingجمع العينات ت( ابين ب )100جمع ى المص ن المرض ة م ة ، اعين ور ، والكرام نان الن ز اس ى مرك راجعين ال ن الم ذر الس اة ج اج قن خم ) لكال الجنسين 15-2-`2014) الى ((15-9-2013بين واليرموك ، وكلية طب االسنان / جامعة بغداد ، في بغداد ، وللمدة ما ( االصابة االبتدائية لقناة جمعت العينات من اشخاص مصابين بالتھاب قناة جذر السن ألول مرة.ومن مختلف الفئات العمرية العالج وأشخاص مصابين بالتھاب قناة جذر السن بعد مصابا . 70 وعددھمPrimary root canal infection, الجذر) اثناء مصابا ، 30 وعددھم ، Post treatment ( secondary root canal infection)(االصابة الثانوية لقناة الجذر ) المستعملة Paper Pointخضوعھم لفتح قناة الجذر لغرض العالج . وتم الحصول على العينات وذلك بأخذ الورقة الدقيقة . لتجفيف القيح الموجود في مكان الخمج وزرعھا مباشرة في االوساط الزرعية المنتخبة Isolation of E.faecalisعزل المكورات المعوية البرازية وبعدھا تم ،جذر السن بعد فتح وتنظيف قناة الجذرقناة زرعت جميع العينات المأخوذة من االشخاص المصابين بالتھاب لمدة دقيقة العزالت ادخال الورقة الدقيقة عبر القناة المفتوحة لغرض امتصاص القيح الموجود في موضع االلتھاب ، وتركت ( يتكون من ) (2xyetوسط مليلتر من 5داخل قناة الجذر ، ثم نقلت ھذه الورقة الى انبوبة معقمة سعة مليلتر حاوية على ° م 37حضنت في درجة حرارة . [9])واحد لتر لكلوريد الصوديوم لك 0.5رة ، و غم مستخلص الخمي10غم تربتون ، و16 ) الصلب وحضنت االطباق في درجة حرارة Azid Blood Agarساعة ، ثم نقلت المستعمرات النامية الى وسط ( 24لمدة (Pfizer selective enterococci) وانتخبت المستعمرات المفردة وزرعت على وسط . ساعة 24-48لمدة ºم 37 No2MacConkeyنقلت ھذه المستعمرات النامية الى وسط ( وساعة 24-48لمدة 37في درجة حرارة وحضنت االطباق agar م 37) بطريقة التخطيط وحضنت في درجة حرارةº ساعة . 24لمدة : Diagnosis of E.faecalis تشخيص المكورات المعوية البرازية Microscopic examinationالفحص المجھري وذلك بأخذ جزء صغير (Pfizer selective enterococci) عملت مسحات من المستعمرات النقية النامية على وسط من المستعمرات النامية بوساطة ناقل معقم الى شريحة زجاجية وفرشت بشكل متجانس ، وتركت لتجف ثم ثبتت وصبغت . [10]تجاه صبغة غرام امالحظة الشكل الخلوي وطبيعة اصطباغ البكتريا غرام لملون ب Biochemical testsالفحوصات الكيموحياتية لغرض تشخيص العزالت البكتيرية على مستوى النوع اجريت االختبارات الكيموحياتية المعتمدة وكاالتي : Catalase testفحص الكاتاليز (بالناقل) من كل عزلة على شريحة زجاجية نظيفة واضيف لھا قطرة من محلول بيروكسيد الھيدروجيننقل جزء من النمو . [11].ان مالحظة تكون الفقاعات داللة على ايجابية الفحص 3 % بتركيز علوم الحياة | 248 ٢٠١٥) عام 2(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (2) 2015 ºم 45و 10فحص النمو في درجة حرارة لكل عزلة بالمزارع السائلة للعزالت البكتيرية بعمر لقحت انابيب حاوية على وسط نقيع القلب والدماغ السائل بواقع انبوبتين ساعة 24 لمدة °م 45واألخرى في درجة حرارة ºم 10ثم حضنت احداھما في درجة حرارة 1%ساعة بحجم لقاح 24 . [12]ولوحظ النمو من خالل تكون العكرة ) كلوريد الصوديوم6.5 %فحص النمو بوجود ( كلوريد الصوديوم بالمزارع السائلة % 6.5لقحت انابيب حاوية على وسط نقيع القلب والدماغ السائل والحاوي على ساعة. لوحظ النمو من 24-18لمدة ºم 45ثم حضنت بدرجة حرارة ، 1%ساعة وبحجم لقاح 24للعزالت البكتيرية بعمر . [13]خالل تكون العكرة داللة على ايجابية الفحص ) 9.6فحص قابلية البكتريا على النمو في الرقم الھيدروجيني( دل ائل المع دماغ الس ب وال ع القل ص ( وسط نقي ذا الفح اص بھ ي الخ ى الوسط الزرع ة عل ب الحاوي رقم لقحت االنابي ال 37موالري من ھيدروكسيد الصوديوم ) بالعزالت البكتيرية وحضنت بدرجة حرارة 0.1 باضافة 9.6الى الھيدروجيني له . [14] ساعة. ظھور النمو من خالل تكون العكرة داللة على الفحص الموجب 24لمدة ºم التشخيص الجزيئي لبكتريا المكورات المعوية البرازية دناعملية استخالص وقياس تركيز ونقاوة ال واستخلص الدنا بحسب ، (Promega USA)الكلي والمصنعه في شركة DNAالجاھزة الستخالص الاستخدمت العدة .النشرة المرفقة من قبل الشركة .Nanodropباستعمال جھاز دنا ونقاوته تركيز ال قيس PCRتشخيص بكتريا المكورات المعوية البرازية بأ ستخدام تقنية ال لتشخيص بكتريا المكورات المعوية وذلك عن طريق استعمال بادئات PCR assey لسلتفاعل البلمرة المتس استخدمت تقنية استخدمو . S Ribosomal RNA 16صممت بتسلسل متخصص موجود ضمن المادة الوراثية للبكتريا ، الذي يطابق جين ا الكندية البادئ المصنع في شركة e.f F GTT TAT GCC GCA TGG CAT AAG )البادئ ھو وكان تسلسلالف AG , e,f R CCG TCA GGG GAC GTT CAG ) وتم اختيار البادئ زوج قاعدي ، 310، وطول القطعة . [15] لمصدرالمتخصص تبعا ل تخفيف البادئ ، وحفظ كخزين dd H2O ( deionized sterile distilled water) الماء المقطر مليلتر من1خفف البادئ اوال في ( Stock ) مليلتر من 1وخفف في خزينمايكرولتر من ھذا ال 100. اخذ °م -20في درجة حرارةdd H2O للحصول ى ز عل والر 10 تركي ايكرو م اھز لل .م يط الج تخدم الخل مى PCR واس ركة (Master mix)المس ي ش نع ف والمص )Promega USA (من كال من البادئ المصمم مايكرو لتر 1البكتريا ودنا من نانو غرام (50)مايكرولتر 3مزج مع اذ ( Forward and Reverse) الخالي من ماء المقطرمايكرو لتر بال 25 ، اكمل الحجم الى مايكرو موالر 10ذو التركيز nuclease عليمات الشركة .وبحسب ت ظروف التفاعل از ي جھ ل ف ري التفاع راري اج دوير الح ى Thermal cycler الت روف المثل د الظ دة لتحدي ارب عدي راء تج د اج بع )١( الجدول حسببالبرنامج طبق للتفاعل .و باستعمال الترحيل الكھربائي PCRالتحري عن نواتج ال الذي صبغ %0.2بتركيز االكاروز ھالم عشرة مايكرو لتر من النواتج المتضاعفة بوساطة الترحيل الكھربائي في رحلت 30فولت ولمدة 60في فولتية مقدارھا Ethidium bromideمايكرو لتر من صبغة ال0.5 باستعمالترحيل بعد انتھاء ال DNA عملتحت ضوء االشعة فوق البنفسجية . واستشوھدت الحزم . TBE bufferمايكرو لتر من 0.5دقيقة في ladder )100-1000 pb دي م زوج قاع اطة (marker) كمعل ور بوس م ص ة ( ) . ث اميرا الرقمي Digitalالك camera . (نتيجة التفاعل موجبة وذلك عند ظھور قطع عدتDNA ازواج قاعدية 310في الجل بطول. النتائج والمناقشة عزل بكتريا المكورات المعوية البرازية اذاعتماداً على الصفات الزرعية للمستعمرات من شكل وحجم ولون وقوام المستعمرات ، sE.faecaliبكتريا عزلت ھذا الوسط د في الوسط ويع ري الى اللون االبيض وظھور العكورة داللة على وجود نمو بكتي ( 2xyt )تحول لون وسط الضرورية لنمو البكتريا مثل الكاربون ، جيدا لنمو البكتريا بسبب احتوائه على مستخلص الخميرة وتوفر المواد الغذائية الصلب ذات شكل دائري Azide blood baseظھرت مستعمرات ھذه البكتريا على وسط . والكبريت ، وفيتامين ب محدب قليالً وذي حافة ملساء بيضاء او كريميه اللون ، اذ يعد ھذا الوسط جيداً للعزل االولي للبكتريا وھو ذو كفاءة عالية ) التي تثبط Sodium azideبكتريا المكورات المعوية من العينات المرضية الحتوائه على مادة ازايد الصوديوم ( في عزل . [16]نمو االنواع المختلفة من البكتريا السالبة لصبغة غرام والسماح للبكتريا الموجبة لصبغة غرام بالنمو عليــــــــــه الصلب لماعة وحولت لون الوسط الى اللون االسود Pfizer selective enterococcusظھرت المستعمرات على وسط ، وان انتشار )Esculetinبسبب قابليتھا على تحليل االسكولين بوجود امالح الصفراء وشطره الى الكلوكوز واسكيولتين ( علوم الحياة | 249 ٢٠١٥) عام 2(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (2) 2015 طي اللون االسود للوسط يعالذي Ferric ammonium citrateمركب يكونفي االكار واتحاده مع الحديد سكيوليتين اال ، وان احتواء ھذا الوسط على امالح الصفراء ومادة ازايد الصوديوم قد ساعد على تثبيط نمو المسبحيات )١صورة ( ) واالنوع المختلفة من البكتريا السالبة لصبغة غرام مما يميز ھذا Dالمحللة لالسكولين التي تعود للمجموعة المستضدية ( االوساط االساسية في تشخيص المكورات المعوية عن االنواع االخرى من غير المكورات المعوية الوسط ويجعله من في حين ظھرت المستعمرات صغيرة الحجم ، ملساء دائرية الشكل ووردية ، [17]التابعة لنفس المجموعة المستضدية أكد العزل االولي لھذه البكتريا العتباره من اللون على وسط المكونكي الصلب وذلك لقدرتھا على تخمير سكر الالكتوز ، و االوساط أالنتخابية اذ يثبط نمو البكتريا الموجبة لصبغة غرام باستثناء المكورات المعوية لمقاومتھا ألمالح الصفراء عزلة من االصابات 19 ،تعود لبكتريا المكورات المعوية عزلة 45علىحصل . [18,19]وصبغة البلورات البنفسجية لسن . وذلك اعتمادا على صفاتھا المظھرية و اعزلة من االصابات الثانوية لقناة جذر 26البتدائية لقنوات جذر السن ، و ا الزرعية . Microscopic diagnosisالتشخيص المجھري اظھر الفحص المجھري لمسحات محضرة من المزروع البكتيري للمستعمرات والمصبوغة بصبغة غرام بأنھا خاليا موجبة لصبغة غرام وغير مكونة للسبورات كروية مفردة او بيضوية متطاولة احياناً او على شكل ازواج في احيان اخرى .[11]او تظھر بشكل سالسل قصيرة Biochemical testsاتية الفحوصات الكيموحي اجريت الفحوصات للعزالت النامية على االوساط االنتقائية وذلك لتشخيص المكورات المعوية الى مستوى النوع .واستبعاد االنواع البكتيرية االخرى التي تتشابه معھا في بعض الصفات اتاليز الذي يعمل على تحرير غاز االوكسجين من عزلة من العزالت عدم قدرتھا على انتاج انزيم الك 24اظھرت ، ºم 10-45قدرة على النمو بدرجات حرارية تتراوح ما بين ذات ھابيروكسيد الھيدروجين بشكل فقاعات غازية ،اال ان ، والنمو في وسط )9.6 والنمو في وسط ذي رقم ھيدروجيني قاعدي يصل الى ( وتعد ھذه التفاعالت الكيموحياتية المفتاح التشخيصي لجنس . صوديوممن كلوريد ال % 6.5سائل ذي تركيز ملحي ) التي ليس لھا القدرة على النمو في Dالمكورات المعوية التي تميزھا عن بقية المسبحيات التابعة للمجموعة المستضدية ( . [11]مثل ھذه الظروف PCRباستعمال تقنية ال E.faecaliالتشخيص الجزيئي لبكتريا التي شخصت مسبقا بالطرائق الزرعية و PCR assay بتقنية العزالت النامية على االوساط االنتقائية جميعشخصت وتضخيم القطعة DNA لالرتباط بقالب 16srRNAباديء جين استخدم اذتاكيد التشخيص ، غرض الكيموحياتية ل ھالم االكاروز قطعة استعمال التي اعطت عند ترحيلھا ب E.faecalisعزلة تعود لجنس (32)المطلوبة منه . حصل على DNA االصابات االبتدائية لقناة جذر السن منمعزولة ھا عزلة من ( 13 ) 2)الصورة ازواج قاعدية ( 310طولھا Primary root canal infection )11 عزلة من (19)و عزلة معزولة من الذكور)2معزولة من االناث ومنھا عزلة عزالت 5عزلة معزولة من االناث وSecondary root canal infection )14االصابات الثانوية لقناة جذر السن . (2)الجدول كما في )معزولة من الذكور ان ھناك اختالف واضح بين نتائج التشخيص بالطرائق الزرعية والطرائق الكيموحياتية والطرائق الجزيئية لوحظ اظھرت عائديتھا عزلة النامية على االوساط االنتقائية 45 من عزلة فقط 24اظھرت نتائج التشخيص الكيموحيوي ان حيث من ال عزلة 32. بينما اظھرت نتائج التشخيص الجزيئي عائدية E.faecalisلبكتريا المكورات المعوية البرازية . E.faecalisلنوع عزلة 45 في E.faecalisعن نسبة تواجد بكتريا بالتحري في دراسته Coguluet al. [15]اتفقت ھذه النتائج مع ماتوصل اليه قنوات الجذور الملتھبة و ذلك عن طريق تشخيصھا باستعمال طرائق التشخيص الزرعية والكيموحياتية التقليدية وباستعمال عند تشخيصھا بالطرائق الزرعية في حين وجد عند تشخيصھا % 26بنسبة وجد بانھا كانت متواجدة اذ PCRتقنية ال تواجد عن التحري حول [20 ].ة.كما اتفقت ھذه النتائج جزئيا مع نتائج دراس % 35انھا تشكل نسبة PCR بطريقة ال و % 4وجد انھا تشكل نسبة اذ PCRفي قنوات الجذور االسنان بالطرائق الزرعية وطريقة ال E.faecalisبكتريا في االصابات الثانوية لقنوات الجذور عند استعمال 76 % و % 42في االصابات االبتدائية لقنوات الجذور و % 82 في التشخيص على التوالي .وجاءت ھذه النتيجة متفقة مع نتائج PCRالطرائق الزرعية والكيموحياتية التقليدية وتقنية ال في االصابات االبتدائية والثانوية لقنوات جذور E.faecalisفي دراسته حول التحقق من وجود بكتريا حيث اوضح [21] ان ھذه البكتريا توجد بنسبة اعلى في االصابات الثانوية لقنوات اثبت اذفي تركيا Real time PCRاالسنان باستعمال االصابات االبتدائية لقناة جذر 25 % في االصابات الثانوية لقناة جذر السن وبنسبة % 74.4الجذور وكانت تشكل نسبة في 19 %بنسبة E.faecalisحيث اثبت تواجد بكتريا [22]السن . كما اتفقت نتائج الدراسة الحالية مع نتائج دراسة اة الجذر المصابة بالتھاب دواعم السن . في جذور االسنان الشخاص يحتاجون العادة العالج لقن % 38اللعاب ونسبة من االصابات %33تشكل نسبة E.faecalisحيث وجد ان بكتريا دراسة [23]واتفقت نتائج الدراسة الحالية مع نتائج الثانوية لقنوات الجذور وذلك عند دراسته في التحري عن االنواع البكترية الموجودة في االصابات االبتدائية والثانوية جذور االسنان .ل علوم الحياة | 250 ٢٠١٥) عام 2(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (2) 2015 اذ ( استھالكا للوقت ھاطرائق المستعملة في التشخيص ، واقلالاسھل كانت PCRواكدت نتائج الدراسة الحالية ان تقنية ال ) ، واكثر كفائة في التشخيص مقارنة بالتشخيص بالطرائق التي تعتمد على ساعات ونصف 9 حوالي لتشخيصيتطلب ا الطرز المظھرية في التشخيص. في تشخيص البكتريا وذلك 16sr RNAلقد استخدم تسلسل محدد من الحمض النووي البكتيري والذي يسمى جين ال مددومنذ عمل في التصنيف حيث انه است اذھبي امعيار دلكونه عالي الثبات وغير قابل للتغير مع مرور الزمن لذلك فان يع يحتوي على 16sr RNAثباته العالي فان جين ال فضال عن. و[24] طويلة في دراسة العالقات التطورية في البكتريا مناطق عالية التغاير بين االنواع البكتيرية وبذلك فانه يوفر تسلسل خاص بكل نوع من االنواع البكتيرية التي يستفاد منھا في خص في تشخيص االنواع البديل االسرع واألر 16sr RNAتشخيص االنواع البكتيرية ونتيجة لذلك اصبح تسلسل جين ال . [25]البكتيرية بالمقارنة مع الطرائق المعتمدة على الطرز المظھرية في تشخيص البكتريا المصادر 1- Hayes,J.R. ; English,L.L. ; Carr,L.E. , Wagner,D.D. and Joseph,S.(2004).Multiple- antibiotic resistance of Enterococcus spp.isolated from commercial poultry productionenvironments.APPL.Environ.Microbiol.,70(10):6005 -11. 2- De-Marques,E.B. and Suzart,S. (2004). Occurrence of virulence-associated genes in clinicalEnterococcus faecalis strains isolated in Londrina. Brazil. J.Med.Microbiol.53:1069-7 . 3- Love, R.M.( 2001). Enterococcus faecalis—a mechanism for its role in endodontic failure. Int. Endod. 34(5): 3 40.ArticlePubMed. 4- Kayaoglu, G. and Orstavik, D.(2004). Virulence factors of Enterococcus faecalis : relationship to endodontic disease. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 15(5).: 308 – 320 ArticlePubMed, 5- Peciuline, V.; Reynauld, A.H.; Balciuniene, I. and Haapasalo, M. (2001) .Isolation of yeasts and enteric bacteria in root filled teeth with chronic apical periodontitis. Int. Endod;34:429-34. 6-Molander, A .; Reit, C. ; Dahlen, G. and Kvist, T.(1998). Microbiological status of root- filled teeth with apical periodontitis. Int. Endod. J. ;31:17. 7- Siqueira, J.F. and Rôças, I.N.( 2005). Uncultivated phylotypes and newly named species associated with primary and persistent endodontic infections. J. Clin. Microbiol ;43:3314. 8- Rôças, I.N.;Siqueira, J.F.; Aboim,M.C.and Rosado, A.S.(2014). Denaturing gradient gelelectrophoresis analysis of bacterial communities associated with failed endodontic treatment. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. ; 98:741–9. 9- Mhmoudpour,A.;Rahimi,S.;Sina,M.;Soroush,H.M.Shahisa ,S.andAminabadi,N. (2007) . Isolation and identification of Enterococcusfaecalisfrom necroticroot canal using multiplex PCR . Journal of oral sci..49(3) :221-227. 10- Collee, J.G.;Fraser,A.G.;Marmion,B.P. and Simmons,A.(1996). "Practical Medical Microbiology" 14th editionChurchill Livingstone,U.K. 11- Macfaddin,J.F. (2000). Biochemical test for identification of medical Bacteria.3rdedition.Lippincott Williams &Wilkins,Co. London. 12-Holt,J.G. ; Kreieg,N.R. ; Sneath,P.H. ; Staley,J.T. and Williams,S.T. (1994)."Bergey`s Manual of Determinative Bacteriology .9th edition. Williams2 & Wilkins. P:1063. 13-Facklam ,R.R.and Wilkinson ,H.W.(1981).The Prokaryotes . A Handbook on Habbitats , Isolation and Identification of Bacteria. The Family Streptococcaceae (Medical Aspect). 127:1572-1597. . Berlin Heidelberg , NewYork . 14-Facklam, R.R. (1972). Recognition of Group D Streptococcal SpeciesOf Human Origin by Biochemical and Physiological Tests. Appi.Microbiol.23(6). علوم الحياة | 251 ٢٠١٥) عام 2(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (2) 2015 15- Cogulu,D.; Uzel,A. and Eronat,C.(2007).Detectio of Enterococcus faecalis in Necrotic Teeth Root Canals by Culture and Polymerase Chain Reaction Method . Eur.J. Dent.:216-221. 16- Facklm,R.R. and Teixeira,L.M. (1997).Enterococcus.In :Collier,A. ;Balow,S. &Sussman,M.(Eds.). "Microbiology & Microbial Infections".Topiey&Wilson.9thedition.Edward Arnold, London.pp:669-82. 18-Huycke,M.M. ; Sahm,D.F. and Gilmore,M.S. (1998) . Multiple- Drugresistant Enterococci : the nature of the problem & an agenda for the future . Emerg.Infect.Dis.,4(2). 19- Murray,B.E. ; Baron,E.J. ; Paller,M.A. ; Tenover,F.C. and Yolken,R.H. (1999). "Manual of Clinical Microbiology".7thedition.ASM Press. Waashington. D.C.PP:297-305. 20-Gomes, P.B.; Pinhiero,T.E.; Sousa, L.R.E.; Jacinto,C.R. and Zaia,A. A .(2006). Enterococcus faecalis in dental root canal detected by culture and By polymerase chain reaction analysis. Oral Sur., Oral Pathol. and Endod. 102(2): 247-253. 21-Selcuk,M.; Ozbek, A. and Erdorgan, A.S. (2009). Analysis ofEnterococcus faecalisin Samples from Turkish Patients with Primary endodontic infections and failed endodontic treatmenby real –time PCR SYBR green method. Jornalof Appl.OralSci . 17 (5) . 22- Wang ,Q.Q. ;Zhange, C.F.;Chu,C.H.andZuh,X.F. (2011). Prevalence of Enterococcus faecalis in saliva and filledroot canals of teeth associatedwith apical periodontitis.Internationa journal of Oral Sci: 19–23. . 23-Tennert,C. ;Fuhrmann,M ;Wittmer,A.;Karygianni,L.; Altenburger , M .J.; Palz,K. Hellwig, E. and Al-Ahmad, A. Copyright © (2014).American AssociationofEndodontists.40(5). 24- Woese, C.R. and Fox, G.E. (1977). "Phylogenetic structure of the prokaryotic domain : The primary kingdoms". PNAS 74(11): 5088–509. 25 - Kolbert, C.P. and Persing, D.H. (1999). "Ribosomal DNA sequencing as atool for identification of bacterial pathogens.".Current opinion in microbiology.2 (3): 299- 305. المواقع االلكترونية 17-Himedialalabs.com/TD/M787.pdf. 16s ribosomal RNAالمستعملة لتضخيم جين لبوادئ ا PCRظروف تفاعل ال : )(1رقم جدول الخطوات درجة الحرارة الوقت عدد الدورات 1 3 min °94 cالمسخ االولي 35 30 sec °94 cالمسخ 1 min °58cدرجة ارتباط البادئ 40 sec °72 cاالستطالة 1 5 min °72 cاالستطالة النھائية علوم الحياة | 252 ٢٠١٥) عام 2(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (2) 2015 اعداد ونسب عزالت المكورات المعوية البرازية المعزولة من اصابات جذور االسنان وفقا لنتائج : (2)رقم جدول PCRالتشخيص الجزيئي باستعمال تقنية ال النسبة المئوية العزالتعدد نوع اصابة جذر السن %18.5 عينة 70عزلة من 13 االصابة االبتدائية للجذر %63.3 عينة 30عزلة من19 االصابة الثانوية للجذر Pfizer selective enterococcusعلى وسط E.faecalisنمو بكتريا : )1صورة رقم ( 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 * L 1Kb 500 310bp 100 %2في ھالم االكاروز تركيز PCR ستعمال تقنيةالترحيل الكھربائي لنواتج التشخيص الجزيئي با :( 2)صورة رقم )PCR ،1Kb) Ladder *Lھي عينات موجبة للتشخيص بال 14-1من علوم الحياة | 253 ٢٠١٥) عام 2(العدد 28المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham J. for Pure & Appl. Sci. Vol. 28 (2) 2015 Identification of Enterococcus faecalis Isolated from Infected Human Tooth Root Canals Human by Using Polymerase Chain Reaction Athraa H. Hasson Biology Dept. College of Education for Pure Science ( Ibn Al.Haithem)/ Univeristy of Baghdad Susan A. Kadhem Directorate-General of Education Baghdad/ Karkh 3 15/3/2015Received in :20/1/2015, Accepted in : Abstract One hundred samples of root canal bacteria were isolated from patients teeth with primary and secondary infected root canal from all the ages . Biochemical and microscopial tests were done for identification of these isolates. Twenty four isolates were confirmed as E. faecalis species by using these tests. Genetic diagnosis for the all isolates was also done by using polymerase chain reaction ( PCR ). Thirty two isolates were confirmed to belong to E. faecalis species by using this test. Key Words :E.faecalis , Root canal , PCR