Microsoft Word - 118-130 118 | Biology 2014) عام 3(العدد 27المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham Jour. for Pure & Appl. Sci. Vol. 27 (3) 2014 التباين الوراثي بين العزلة البرية وعزالت طافرات العوز الغذائي في بكتيريا Sinorhizobium meliloti بأعتماد تقانة RAPD-PCR إحسان عرفان حسين سلوى علي غانم أبن الھيثم/ جامعة بغداد –قسم علوم الحياة/كلية التربية للعلوم الصرفة 2014/تشرين الثاني /24/ ، قبل البحث في : 2014/ايلول /1استلم البحث في : الخالصة Medicago sativa (alfalfa)من نبات الجت Sinorhizobium melilotiلبكتيريا SGI2عزلت عزلة برية SGI2طافرات عوز غذائي من العزلة البرية 9الذي حصلنا عليه من منطقة الطارمية / محافظة بغداد، وتم الحصول على pSymA. امتلكت جميع العزالت البرية والطافرة بالزميدين كبيرين ھما Nitrous acidبالتطفير مع حامض النيتروز ات نتيجة التطفير بحامض النيتروز. أظھرت التباينات الوراثية ولم يظھر الترحيل الكھربائي لھما أي تغير pSymBو SGI6بين العزلة البرية وعزالت طافرات العوز الغذائي وجود حزمة واحدة في العزلة RAPD-PCRبأعتماد تقانة بين أظھر تباينات كبيرة OPB7، وعند أستعمال البادئ OPY-04كيلو قاعدة عند أستعمال البادئ 1.5بحجم أكبر من كيلو 1.5قاعدة و 800بحجم SGI2العزلة البرية في حزمتين تم مشاھدةالعزلة البرية وعزالت طافرات العوز الغذائي. SGI10عزلة الطافرة القاعدة في 800الحزمة التي بحجم . أظھرت قاعدة وعدم ظھورھا في العزالت الطافرة األخرى كيلو قاعدة كما في 1.5 نقاعدة إلى أكثر م 200ماً تباين حجمھا من بقية العزالت الطافرة حزفي حين أظھرت فحسب، إن ظھور ھذه الحزم. SGI12و SGI8 ،SGI9ولم تظھر أي حزم عند أستعمال ھذا البادئ في العزالت . SGI6العزلة طفير الكيمياوي نتيجة الت على المستوى الجيني للجينوم الكلي وليس على مستوى البالزميد يوضح مدى التباين الوراثي حامض النيتروز. بأستعمال Genetic variation ،Sinorhizobium meliloti ،RAPD ,Nitrous acidالكلمات المفتاحية: 119 | Biology 2014) عام 3(العدد 27المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham Jour. for Pure & Appl. Sci. Vol. 27 (3) 2014 المقدمة إلى العمليات التي تقوم بھا األحياء الدقيقة Biological nitrogen fixationالتثبيت الحيوي للنيتروجين يشير ستغالله من قبل النيتروجين الجوي داخل العقد الجذرية للنباتات التي تساعد على جعل النيتروجين متاحاً لغرض لالمثبتة قولية دوراً مھماً التثبيت الحيوي للنيتروجين بواسطة العالقة بين بكتيريا الرايزوبيوم والنباتات البيؤدي . [1]تلك النباتات بصورة إحدھماتتم عملية تثبيت النيتروجين بطريقتين: و. [2]نتاج المحاصيل والمحافظة على خصوبة التربة إفي زيادة وقسم Azotobacter، وھذه الطريقة تقوم بھا عدد من األحياء المجھرية وھي بكتيريا الـ Free nitrogen fixationحرة أو Symbiotic nitrogen fixationبصورة تكافلية واألخرى:. Cyanobacteria من الطحالب الخضر المزرقة إذ ،Rhizobium ـبصورة غير حرة، وھذه الطريقة يقوم بھا جنس خاص من البكتيريا تسمى بكتيريا العقد الجذرية أو ال الفاصوليا, وفول والجت، ورسيم, مثل الب Legumes والنباتات البقولية Rhizobiumتمثل عالقة تكافلية بين بكتيريا الـ ھذه البكتيريا تكون عقداً جذرية إذ إنعالقات البيئية بين الميكروبات وبين الكائنات الراقية لأحد أشھر األمثلة لوھي ،الصويا مداد إيقوم النبات ب إذمن اآلخر، يفيد، وفي ھذه العالقة نجد كال الكائنين Legume plantsعلى جذور النباتات البقولية تقوم البكتيريا حين في ,[3]البكتيريا بالمصدر الكاربوني (السكر) ومصادر الطاقة واألحماض العضوية وغير العضوية منه كتحويله إلى أحماض أمينية مثل يفيدبعملية تثبيت النيتروجين الجوي وتحويله الى صورة يمكن للنبات أن Asparagine وGlutamic. ن التثبيت الحيوي للنيتروجين من الجو إ، و%85 بنحوالمثبت حيوياً تقدر نسبة النيتروجين وتقدر كمية النيتروجين التي يثبتھا الجت ، [4]من المصادر الرئيسة لمجموع النيتروجين الذي يحسن التربة الزراعية دعيُ Alfalfa كغم 335- 125 بنحوفي التربةN ًلعضوية ال تلبي إال جزءاً من وألن األسمدة الكيمياوية وا. [5]/ھكتار سنويا ھا من مخزون التربة من ھذه المركبات ؤيجب أستيفا الحاجاتالزراعة من مركبات النيتروجين لذلك فأن تلك حاجات .[6]وكذلك عن طريق تثيت النيتروجين تكافلياً بقولية معينة محدثة العقد الجذرية، صابة نباتات إفي التربة ولھا القدرة على بصورة حرةتعيش بكتيريا الرايزوبيوم ،ولكل نبات بقولي أو مجموعة من النباتات البقولية نوع أو ساللة معينة من بكتيريا الرايزوبيا تستطيع أن تكون عليھا العقد تعيش بكتيريا الرايزوبيوم في التربة لذلك فأن الظروف البيئية من درجة حرارة . ال تستطيع ذلك ساللة أخرى في حين وتسعى األبحاث العلمية إلى ،[7]ورطوبة وملوحة ودرجة الحامضية تؤثر في نموھا وكفاءتھا في تثبيت النيتروجين إن نتاج الزراعي للنباتات البقولية. زيادة وتحسين اإل فيبكتيريا الرايزوبيوم في المجال الزراعي لما لھا من أھمية أستعمال ولھا المقدرة على تكوين العقد الجذرية على نباتات الجت ،كرام لملونة سالب Sinorhizobium melilotiبكتيريا Alfalfa والبرسيم الحلوSweet clover ونبات الحلبةTrigonellaصابة البكتيرية عند الشعيرات الجذرية . تحدث اال يا الرايزوبيوم في تثبيت تشارك بكتير. [9 , 8]شارات بين البكتيريا والنبات شتراك مع تبادل اإلللنبات المضيف باال باستعمالالتطفير تقانة أعتمدت. Plasmidبالزميد بصورة اً أضافي اً النيتروجين مع النباتات البقولية التي تحمل كروموسوم التي لھا أھمية في Rhizobial genesلتعيين جينات الرايزوبيا Transposonالترانسبوزن باستعمالالمواد الكيمياوية أو لعزل طافرات 2Nitrous acid (HNO(حامض النيتروز عمالالتطفير الكيمياوي باست واعتمدت تقانةة التكافلية. العالق تحتاج إلى وجود Rhizobiaقامة العالقة التكافلية مع النبات العائل. الرايزوبيا إطافرات التي تفشل في الالعوز الغذائي و الرايزوبيوم بواسطةبعض ھذه األحماض األمينية تصنعلتقيم عالقة تكافلية فعالة مع النباتات البقولية، اً أميني اً حامض 20 Randomباعتماد تقانة Fingerprint. تعتمد البصمة الوراثية [3]اآلخر من قبل النبات بعضھايزود في حين amplified polymorphic DNA (RAPD-PCR) بادئات استعمالعلىPrimers قصيرة والتي تھجن Hybridize رتباط ھذه البادئات تحت درجات حرارية امع كمية كافية من تسلسالت الدنا الكروموسومي على أن يكون الجزيئية التي تعتمد على التقانات. تكون [10]واطئة بطريقة يمكنھا البدء بتضخيم تلك القطعة من دنا الجينوم البكتيري ، سھلة في دراسة التشخيص والتنوع الوراثي Polymerase chain reaction (PCR)متسلسل طريقة تفاعل البلمرة ال Genetic diversity ن التباينات في الصفات المظھرية والوراثية لبعض أنواع الرايزوبيا إسريعة وبسيطة ومميزة. ألنھا يجاد الفروق بين سالالت الرايزوبيوم إخيص والمفيدة في التش التقاناتمن PCRالـ وتعد تقانة ,[13 , 12 , 11]موجودة . GC-rich oligonucleotide primers [14]بادئات غنية بالقواعد النيكلوتيدية الكوانين والسايتوسين باستعمال كمادة 2Nitrous acid (HNO(حامض النيتروز باستعمالتركز ھذه الدراسة على الحصول على طافرات العوز الغذائي طريقة الترحيل الكھربائي لھالم باعتماد Megaplasmidsزل البالزميدات الكبيرة وع. S. melilotiمطفرة في بكتيريا Polymerase chainطريقة تفاعل البلمرة المتسلسل اعتماد. كما تم Agarose gel electrophoresisاآلكاروز reaction (PCR) التضخيم باعتماد تقانةبين الساللة البرية وطافرات العوز الغذائي لغرض أيجداد التباينات الوراثية .Random amplified polymorphic DNA (RAPD-PCR)األشكال العشوائي للدنا متعدد المواد وطرائق العمل المستعملةالعزالت البكتيرية Medicago sativaمن العقد الجذرية لنبات الجت S. melilotiعزلة محلية واحدة من بكتيريا عزلت (alfalfa) طافرات عوز غذائي 9، فضالً عن ([16 , 15]حسب طريقة ب الذي جمع من منطقة الطارمية / محافظة بغداد ( 120 | Biology 2014) عام 3(العدد 27المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham Jour. for Pure & Appl. Sci. Vol. 27 (3) 2014 أديمت . 2Nitrous acid (HNO(حامض النيتروز باستعمالبطريقة التطفير SGI2تم الحصول عليھا من العزلة البرية .مرة أخرى أديمتلمدة شھر واحد ومن ثم º م 4الت البكتيرية وحفظت بالثالجة تحت حرارة العز النبات العائل المستعمل لصنف واحد تم الحصول عليه من قسم المحاصيل الزراعية / كلية M. sativa (alfalfa)ستعملت بذور نبات الجتا .[15]لغرض التأكد من العزلة البرية وإصابتھا لنبات الجت وتكوينھا للعقد الجذرية وبحسب طريقة الزراعة / جامعة بغداد المستعملةاألوساط الزرعية عند عزل البكتيريا من العقد الجذرية Mannitol salt extract (MSY) mediumالوسط الغذائي الكامل استعمل .1 Yeastغم من Mannitol ,0.2غم من 10ذابة إالذي يتكون من [17]حسب طريقة بمن نبات الجت الذي حضر extract ،0.2 4غم منHPO2K ،0.2 4غم منPO2KH ،0.1 غم منO2.7H4MgSO غم من 0.05و O2.2H2CaCl األكار أضيفو ،في لتر واحد من الماء المقطرAgar مل من الوسط 100غم لكل 2.0-1.5بتركيز لمدة ºم 121وساط غذائية صلبة، ومن ثم عقم الوسط الغذائي بالمؤصدة تحت حرارة الغذائي لغرض الحصول على أ .2بار/أنج 15دقيقة وتحت ضغط جوي 15 عزل التطفير، في تجارب Tryptone-yeast extract (TY) mediumالوسط الغذائي الكامل استعمل .2 غم 5ذابة إالذي يتكون من [18]ب طريقة حسب RAPD-PCR باعتماد تقانةالبالزميدات ودراسات التباين الوراثي في لتر واحد من الماء المقطر، ومن ثم O2.2H2CaClغم من 0.12و Yeast extractغم من Tryptone ،3من .يعقم الوسط الغذائي بالمؤصدة في تجارب التطفير Rhizobial minimal medium (RMM)الوسط الغذائي الرايزوبي الناقص استعمل .3 غم من 0.45الذي تكون من Aالذي تكون من محلولين. المحلول األول [19]حسب طريقة بو O2.12H4HPO2Na ،2 4غم منSO2)4(NH ،0.002 3غم منFeCl ،0.1 غم منO2.7H4MgSO 0.040و ن م Bتكون المحلول .في لتر واحد من الماء المقطر، ومن ثم عقم الوسط الغذائي بالمؤصدة O2.2H2CaClغم من مل 10ضافة إلتر من الوسط الغذائي الناقص تم 1ولتحضير من محلول الكلوكوز الذي يعقم بواسطة المرشح، 20% . Aمل من المحلول 990إلى Bمن المحلول حسب بفي تجارب عزل البالزميدات Liquid nutrient poor mediumالوسط الغذائي الفقير السائل استعمل .4 ، Tryptoneغم من Yeast extract ،0.05غم من Peptone ،0.05غم 0.4تكون من أذابة يالذ [20]طريقة مليلتر من الماء المقطر. 100في 2CaClغم من 0.02و 4MgSOغم من 0.02 لنمو النباتات المطلوب Nitrogen free plant growth medium الوسط الغذائي الخالي من النيتروجين استعمل .5 .[21]حسب طريقة بلمختبر البقولية في ا 2Nitrous acid (HNO(تحضير حامض النيتروز ذابة إب وذلك [22]حسب طريقة ب في المختبر قبل البدء بعملية التطفير 2Nitrous acid (HNO(حامض النيتروز حضر Sodiumمل من دارئ أستيت الصوديوم 5في 2Sodium nitrite (NaNO(غم من نترات الصوديوم 0.035 acetate buffer 0.1بتركيز (pH4.6) أستيت الصوديوم دارئ. كما يتم تحضر موالريSodium acetate buffer بتركيز Acetic acidمل من حامض األسيتك 25.5مل وذلك بخلط 100في دورق حجمي بحجم موالري 0.1بتركيز مل 100. يكمل الحجم إلى موالري 0.2بتركيز Sodium acetateمل من الصوديوم أستيت 24.5مع موالري 0.2 بالماء المقطر ومن ثم يعقم بالمؤصدة. 2Nitrous acid (HNO(حامض النيتروز باستعمالتطفير بكتيريا الرايزوبيوم TYمل من الوسط الغذائي السائل 10وضع . [22]حسب طريقة بتم تطفير بكتيريا الرايزوبيوم بحامض النيتروز مل وعمل له تخافيف متسلسلة 0.1ساعة وأخذ منه بعد ذلك 24المزروع ببكتيريا الرايزوبيوم في حاضنة ھزازة لمدة مل 1.5أخذ .Colony forming unit (CFU)ونمي على وسط غذائي صلب لغرض حساب عدد المستعمرات النامية وتم ترسيب الخاليا Eppendorfونقل إلى أنبوبة فسهن أيضاً من نفس الوسط الغذائي المزروع ببكتيريا الرايزوبيوم ومن ثم تم التخلص من الجزء الطافي وعلق الراسب ،دقائق 10دورة/دقيقة لمدة 6000النبذ المركزي بسرعة بواسطة النبذ باعتمادالخاليا مرة أخرى رسبت موالري. 0.1بتركيز Sodium acetate bufferبدارئ Vortex باستعمال 1وعلق راسب الخاليا البكتيرية بـ الذي طفا،وتم التخلص من الجزء ،دقائق 10دورة/دقيقة لمدة 6000كزي بسرعة المر دقيقة من 20و 15و 10سحب من العينة بعد .ºم 5المحضر حديثاً تحت حرارة Nitrous acidمل من حامض النيتروز ومن ثم زرعت الخاليا الباقيزالة حامض النيتروز إل (NaCl %0.85) بالمحلول الفسلجيبعد البدء بعملية التطفير وغسل محلول الغسلت الخاليا بعد ذلك ب ساعات لغرض عزل الطفرات الراجعة. 8وحضنت لمدة ،السائل TYفي الوسط الغذائي Penicillinأضيف .RMMساعات على الوسط الغائي السائل الناقص 6ونميت الخاليا لمدة (NaCl %0.85) الفسلجي 121 | Biology 2014) عام 3(العدد 27المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham Jour. for Pure & Appl. Sci. Vol. 27 (3) 2014 G مايكروغرام/مل إلى الوسط الغذائي السائل الناقص 300بتركيزRMM وحضنت لمدة ساعتين لغرض قتل الخاليا التي وعمل لھا تخافيف (NaCl %0.85) فسلجيمحلول الالغسلت الخاليا مرتين ب تحتوى على طافرات العوز الغذائي. ال درجة حرارة بساعة و 48- 24حضنت في الحاضنة الكھربائية لمدة الصلب و TYالوسط الغذائي بينمتسلسلة وزرعت ختبارات الكشف عن طافرات العوز الغذائي. تم ومن ثم خضعت ال ،وبعد ذلك حسب عدد المستعمرات النامية ºم 2±28 :اآلتيةحسب المعادلة بوذلك الباقيةحساب النسبة المئوية لعدد المستعمرات مل عدد الخاليا الحية بعد التطفير/ – مل بكتيرية الحية قبل التطفير/عدد الخاليا ال X 100 = )%(نسبة القتل عدد الخاليا البكتيرية الحية قبل التطفير / مل الكشف عن طافرات العوز الغذائي تم الكشف عن طافرات العوز الغذائي Nitrous acidحامض النيتروز باستعمالنتھاء عملية التطفير الكيمياوي ابعد TYوأطباق الوسط الغذائي RMMناقص بزراعة الخاليا البكتيرية الناتجة من عملية التطفير في أطباق الوسط الغذائي ال ساعة. في حالة مشاھدة النمو في أطباق 48-24لمدة من ºم 28±2وحضنت في الحاضنة الكھربائية تحت حرارة ،الصلبة فھذا يعني أنھا طافرة عوز غذائي. أخذت RMMوعدم حصوله في أطباق الوسط الغذائي الناقص TYالوسط الغذائي جراء الفحص إلغرض الخزن و ºم 4درجة حرارة بونقيت وحفظت TYفي أطباق األوساط الغذائية المستعمرات التي نمت بأخذ [23]طريقة اتبعتلمعرفة نوع طفرة العوز الغذائي بعد ذلك لغرض معرفة نوع طفرة العوز الغذائي. ،األخير عليھا على شريحة زجاجية، وبواسطة الفسلجيالمحلول من طافرة العوز الغذائي وعلقت في قطرة من Loopfulعروة ءمل من القطرة التي فيھا عالق الخاليا البكتيرية وزرع العالق في أطباق كمية صغيرة جداً تم أخذعيدان تنظيف األسنان المعقمة فضالً RMMمن الوسط الغذائي الناقص اً طبق 11. تتكون أطباق مجمع ھوليدي من (Holliday pools)مجمع ھوليدي مايكروغرام/مل على 10و 30و 50مزودة باألحماض األمينية والقواعد النيتروجينية والفيتامينات بتراكيز أنھا عن فھذا يعني أن الطافرة تكون في الجين ،Pool 9والطبق Poo1 2بعد حدوث النمو على طبقين مثل الطبق .التوالي ).1(جدول طافرات العوز الغذائي إلى بقية وھكذا بالنسبة Asparagineنتاج الحامض األميني إالمسؤول عن Rhizobiumعزل بالزميدات بكتيريا الرايزوبيوم مستعمرات أخذت. [24]، وھي طريقة محورة قليالً عن طريقة [20]حسب طريقة ببالزميدات بكتيريا الرايزوبيوم عزلت . وضعت األوساط Nutrient poor mediumمل من الوسط الغذائي الفقير 10خاليا بكتيريا الرايزوبيوم وزرعت في دورة/دقيقة لمدة 130بسرعة Shaker incubatorالغذائية السائلة والمزروعة ببكتيريا الرايزوبيوم في حاضنة ھزازة السائل وحضنت لمدة TYمل من الوسط الزرعي 2المزروع بعد ذلك بـ خفف. ºم 28±2ساعة وتحت حرارة 24 SDSمل من محلول 0.5ليهإوأضيف Eppendorfمل من الوسط الغذائي المزروع ونقل إلى أنبوبة 0.25 أخذساعتين. الذ دورة/دقيقة. تم التخلص من الجزء 13000دقائق بسرعة 5لمدة الخاليا البكتيرية بنبذھا مركزياً جمعت. %10بتركيز 10بتركيز RNaseعلى يحتويمن محلول اً مايكرومليلتر 25ضافةإوعلق الراسب (خاليا البكتيريا) ب طفا، التي تكون Sucroseمن محلول السكروز %10و Lysozymeمايكروغرام/مل من الـ 100/مل و اتمايكروغرام غم من Tris base ،0.93غم من 10من أذابة [25]حسب طريقة بالذي حضر Tris-borate bufferمذابة في محلول ويكمل الحجم إلى لتر واحد من Boric acidغم من 5.5و Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)مادة . حملت العينة في فتحات المشط الصغير في ھالم اآلكاروز الذي 8.3إلى pHالماء المقطر ويعدل األس الھايدروجيني 3X5أحدھما بقياس من األمشاط استعمل نوعان. Tris-borate buffer، والذي حضر في محلول 0.65%يكون بتركيز وتم وضعھما الواحد بجنب اآلخر مع ترك مسافة ضيقة بينھما. فتحات المشط الكبير تمأل ،ملم 1.5X5ملم واآلخر بقياس , أما فتحات المشط الصغير (SDS, 0.5% agarose, 0.05% bromophenol blue % 1)بالمحلول الحاوي على Tris baseغم من مادة 108ذابة الذي حضر من إ TBEرحلت العينات باستعمال دارئ بالعينة التي حضرت سابقاً. فمأل الماء المقطر المعقم أظيفموالري. 0.5بتركيز EDTAمل من مادة 40و Boric acidغم من حامض البوريك 55و تجاه القطب إسود السالب بمن القطب األ رحلت العينات. 8إلى (pH)ألس الھايدروجيني اوصوالً إلى لتر واحد مع تعديل وبعد ذلك ولمدة ثالث ،دقيقة أو لغاية حصول تحليل الخاليا البكتيرية 30فولت لمدة 10-5األحمر الموجب بجھد فولتية تجاه العينة الموجودة في المشط الصغير. إبالرحيل ب SDSفولت. جھد الفولتية الواطئ يساعد الـ 100ساعات بجھد فولتية 0.5بتركيز Ethidium bromide (EtBr)األيثيديوم برومايد باستعمال صبغ الھالمة الترحيل الكھربائي بعد توقف عملي جھاز باستعمالبعد ذلك وصور ،U.Vدقيقة ومن ثم أظھر الدنا الموجود في الھالم على جھاز الـ 15مايكروغرام/مل لمدة خاصة.المزود بكاميرا Gel documentation systemتوثيق الھالم 122 | Biology 2014) عام 3(العدد 27المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham Jour. for Pure & Appl. Sci. Vol. 27 (3) 2014 Sinorhizobium melilotiستخالص الدنا الكلي من بكتيريا ا درجة بالصلب لمدة يومين TYعلى الوسط الغذائي S. meliloti. نميت بكتيريا [26]حسب طريقة بعزل الدنا البكتيري من اً لترمليمايكرو 25ضافةإوعلقت ھذه الكمية بـ Loop. أخذت كمية من المزروع البكتيري بواسطة الـ 28ºCحرارة المحضر Lysis bufferالتحلل دارئمن اً لترمليمايكرو 25. أضيف بعد ذلكEppendorfالماء المقطر المعقم في أنبوبة الحاوية على Eppendorf. وضعت أنابيب الـNaOHعياري من 0.1في الذي حضر %0.5بتركيز SDSحديثاً من ملي موالر من مادة 0.1الذي يتكون من TEلتر من دارئ مليمايكرو 200دقيقة. أضيف 15الخليط في حمام مائي لمدة EDTA من مادة اتملي موالر 10وTris-HCl واألس الھايدروجيني لھذا الدارئ pH 815العينة مركزياً لمدة ت. نبذ جديدة Eppendorfالدنا إلى أنبوبة دورة/دقيقة. نقل الجزء الطافي المتكون بعد ذلك والحاوي على 13000دقيقة بسرعة وأن قيمة تركيز الدنا النقي اً نانوميتر 260طول موجي باعتماد Nanodropالـ باستعمالومعقمة. عين تركيز ونقاوة الدنا نانوغرام من 100استعمل. الستعماللحين ا ºم 20-حرارة ب. حفظت العينة [27]مايكروغرام/مايكروليتر 0.1±1.8ھي . RAPD-PCRجراء أختبارات الـ إكقالب لغرض الدنا RAPD-PCRطريقة باعتماد Sinorhizobium melilotiالتباين الوراثي لبكتيريا Random amplified باعتماد تقانةوطافرات العوز الغذائي S. melilotiالتباين الوراثي لعزلة بكتيريا درس polymorphic DNA (RAPD-PCR) حضر الـخليط األساسي .Master Mix للـبادئOPY-04 (5´- AAGGCTCGAC-3´) وللـبادئ [28]حسب طريقة بOPB7 (5´-GGTGACGCAG-3´) [29]حسب طريقة ب Promegaالمزود من شركة Go Taq® Green Master Mix. استعمل تحت ظروف مبردة مع بعض التحويرات مايكرومولر 1مايكرومليلتر وبتركيز 2.5بحجم Primerوالبادئ 1Xمايكرومليلتر وبتركيز 12.5األميركية بحجم 25نانوغرام وكان الحجم الكلي للتفاعل 100مايكرومليلتراً وبتركيز 2بحجم DNA template قالب الدناو برنامج الجھاز وضبطلغرض تضخيم الدنا Thermocyclerالعينات في جھاز التدوير الحراري مايكرومليلتراً. وضعت ولمدة ºم 94حرارة بدرجة Denature templateدنترة القالب كانت ل OPY-04لبادئ ل للحصول على ظروف التفاعل Annealingلمدة دقيقة واحدة وأرتباط البادئ ºم 94حرارة بدرجة Initial denaturationبتدائية دقائق والدنترة اال 3 لمدة دقيقتين واألستطالة النھائية ºم 72حرارة بدرجة Extensionولمدة دقيقة واحدة واألستطالة ºم 38.6درجة حرارة ب Final Extension م 72حرارة بدرجةº 30ستطالة كانت لـ بتدائية وأرتباط البادئ واالدقائق. مراحل الدنترة اال 6لمدة والدنترة ثانية 30لمدة ºم 95حرارة بدرجة Denature templateة القالب دنترل OPB7لبادئ ل ظروف التفاعلو دورة. 42.7حرارة بدرجة Annealingرتباط البادئ او ثانية 30لمدة ºم 95حرارة بدرجة Initial denaturation بتدائية اال Final Extensionستطالة النھائية لمدة دقيقتين واال ºم 72حرارة بدرجة Extensionستطالة لمدة دقيقة واحدة واال ºم نواتج حملت دورة. 45رتباط البادئ واألستطالة كانت لـ ابتدائية ودقائق. مراحل الدنترة اال 10لمدة ºم 72حرارة بدرجة وطافرات العوز الغذائي في المكان المخصص S. melilotiالبادئين أعاله لعزلة بكتيريا استعمالتضخيم الدنا الناتج من حسب النشرة المرفقة معه الذي كان ب، كما وضع الواصم الجزيئي الوراثي %1.5ا في ھالم اآلكاروز الذي كان بتركيز لھ 2في كل عينة بحجم Bromophenol blueكيلو قاعدة. حملت صبغة التحميل البروموفينول األزرق 1.5بحجم 60تجاه القطب األحمر الموجب تحت جھد كھربائي الب بلتر ورحلت العينات كھربائياً من القطب األسود السامليمايكرو 15لمدة Ethidium bromide (EtBr)ھالم اآلكاروز بصبغة األثيديوم برومايد صبغساعات. 4-3ولمدة من اً فولت المزود Gel documentation systemجھاز توثيق الھالم بواسطةقطع الدنا المتضخمة وشوھدت وصورت ،دقيقة بكاميرا خاصة. النتائج والمناقشة Sinorhizobium melilotiعزل وتشخيص بكتيريا من منطقة وجمع M. sativa (Alfalfa)من نبات الجت S. melilotiمحلية من بكتيريا عزلة عزلت ). ظھرت البكتيريا بعد عزلھا وزرعھا على الوسط الغذائي الكامل الصلب 2محافظة بغداد كما في الجدول (/الطارمية (MSY) البكتيريا بطريقتي التخطيط والتخافيف المتسلسلة نقيتمستعمرات بيضاء اللون، مخاطية القوام. بصورة (Alfalfa)صابتھا مختبرياً مع نبات الجت المحلي ابعد . تأكد من العزلة البكتيرية MSYالوسط الغذائي الكامل باستعمال . ظھرت العقد الجذرية بعد مرور ثالثة أسابيع من بداية الزرع. [15]حسب طريقة ب عزل طافرات العوز الغذائي حامض باستعمال طفرتبعد أن S. melilotiلبكتيريا (SGI2)طافرات العوز الغذائي من العزلة البرية عزلت وأوساط (TY)عزلة بكتيرية على أوساط غذائية كاملة 1690ختبرت ا. [17]حسب طريقة ب Nitrous acidالنيتروز 123 | Biology 2014) عام 3(العدد 27المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham Jour. for Pure & Appl. Sci. Vol. 27 (3) 2014 من الطافرات بعد تنميتھا على األوساط تأكد. [23]الطافرات بأستعمال مجمع ھوليدي وشخصت (RMM)غذائية ناقصة مزودة بالحامض األميني أو والواألوساط الغذائية الناقصة (RMM)واألوساط الغذائية الناقصة (TY)الغذائية الكاملة حامض النيتروز كمادة باستعماللنموھا. كان معدل نسبة القتل المتحصل عليھا المطلوبالقاعدة النيتروجينية أو الفيتامين ).3دول (في ھذه الدراسة وكما في الج استعملتعلى تسع طافرات عوز غذائي و تحصل، كما %86مطفرة ھي Sinorhizobium melilotiبكتيريا عزل البالزميدات الكبيرة من البرية وطافرات العوز الغذائي لھذه S. melilotiأوضحت نتائج الترحيل الكھربائي للبالزميدات في عزلة بكتيريا ولم يتأثر عدد ھذه البالزميدات بعملية التطفير بحامض النيتروز، ،البكتيريا بوجود بالزميدين كبيرين لكل عزلة وطافرة التي تقع على نتاج الحياتي لألحماض األمينيةمما يدل على أن التطفير كان على المستوى الجيني للجينات المسؤولة عن اإل اد الذائبة وكذلك لھا دور مة نقل الموظجينات مسؤولة لعدد كبير ألن ]30،31[نوجد عدد من الباحثيھذه البالزميدات. كذلك وجود الجينات ،LPSوالسكريات المتعددة الدھنية EPSأساسي في التصنيع الحياتي للسكريات المتعددة الخارجية ، كما أوضحوا في بيئة التربة توجدالتي لھا عالقة بالتصنيع والھدم الحياتي لألحماض األمينية أو المركبات التي يمكن أن لم يتم التعرف على أحجام ھذه .pSymBتم تشخيصھا أيضاً في البالزميد الكبير قد األساسية لنمو البكتيريا الجينات بأن التي يجب أن تكون بحجم كبير لعدم توفرھا في السوق (Genetic markers)البالزميدات لعدم ترحيل الدالئل الجزيئية دون ھذه من رحلت العيناتنجاز الدراسة إوقتاً ولضيق وقت بيتطلستيرادھا من الخارج االمحلية العراقية علماً بأن بحجم اً واحد اً تمتلك بالزميد S. melilotiھناك دراسات أوضحت بأن بكتيريا ).1ا في الصورة رقم (مالدالئل الجزيئية ك .Sن في بكتيريا يكبيرن يبأن ھناك بالزميد [33]بين ھاينس وآخرون في حين، [32]ميكا قاعدة وحتى أكبر من ذلك 1.5 meliloti وھماpSymA ميكا قاعدة واآلخر 1.4بحجمpSymB ميكا قاعدة. تتفق ھذه الدراسة مع دراسات 1.7بحجم 1.6ميكا قاعدة و 1.4تمتلك بالزميدين كبيرين وتقريباً بحجم S. meliltiالذين أظھروا بأن بكتيريا [34]ن يأورسنك وآخر تمتلك بالزميدين كبيرين بأحجام S. melilotiالذين بينوا بأن [35]ن يدراسات كلبرت وآخر ميكا قاعدة. وتتطابق مع لعزالت [36]ميكا قاعدة، كما تتفق مع الدراسة التي قام بھا الكناني وآخرون 1.35ميكا قاعدة واآلخر 1.65جزيئية ميكا قاعدة 1.6الزميدين كبيرين أحدھما بحجم من محافظة البصرة / العراق الذين وجدوا أيضاً ب S. melilotiبكتيريا ميكا قاعدة. 1.3واآلخر األشكال التضخيم العشوائي للدنا متعدد باعتماد تقانةالتباينات الوراثية بين العزلة البرية وطافرات العوز الغذائي (RAPD-PCR) باعتماد تقانةمن البادئات لغرض دراسة التباينات الوراثية بين العزلة البرية وطافرات العوز الغذائي استعمل نوعان ) توضح التباينات الوراثية لعزلة طافرة العوز الغذائي 2. الصورة (RAPD-PCR األشكالالتضخيم العشوائي للدنا متعدد SGI6 بالمقارنة مع العزلة البريةSGI2 البادئ استعمالالعوز الغذائي األخرى بوعزالت طافراتOPY-04 .ن ظھور إ -RAPDكيلو قاعدة في الترحيل الكھربائي لناتج التضخيم العشوائي للدنا متعدد األشكال 1.5حزمة واحدة بحجم أكبر من PCR لكلي لھا نتيجة في التسلسل النيكلوتيدي للدنا ا اً يؤكد وجود بعض التباينات الوراثية لھذه العزلة وأن ھناك تغير باعتماد OPB7بادئ آخر وھو باستعمالقمنا SGI6ختالف فقط في ھذه العزلة االتطفير العشوائي له. وبالنظر لظھور RAPD-PCRلنواتج التضخيم العشوائي للدنا متعدد األشكال ) توضح نتائج الترحيل الكھربائي 3. الصورة (تقانة نفسھا ن ظھور حزمتين لعينة العزلة البرية إالذي يؤكد وجود تباينات كبيرة بين العزلة البرية وعزالت طافرات العوز الغذائي. SGI2 كيلو قاعدة وعدم ظھورھا في العزالت الطافرة األخرى يوضح مدى التباين الوراثي نتيجة 1.5قاعدة و 800بحجم كيلو قاعدة لم تظھر في بقية عزالت طافرات العوز 1.5وز. الحزمة التي بحجم حامض النيتر باستعمالالتطفير الكيمياوي . بقية العزالت الطافرة قد حسبف SGI10قاعدة قد ظھرت في عزلة الطافرة 800الحزمة التي بحجم في حينالغذائي ، SGI8عدا العزالت ، ماSGI6كيلو قاعدة كما في العزلة 1.5 نقاعدة إلى أكثر م 200أظھرت حزماً يتباين حجمھا من SGI9 وSGI12 مع تسلسالت النيكلوتيدات المستعملالتي لم تظھر أي حزم لعدم توافق تسلسالت النيكلوتيدات بين البادئ لدنا ھذه العزالت. حزم مادة مطفرة قد فتح الباب لدراسات أخرى لھا في المستقبل وذلك بعزل تلك ال استعمالن وجود ھذه التباينات نتيجة إ ومن ثم مقارنة ھذه التسلسالت مع الجينوم الكامل DNA sequencingجراء دراسات التسلسل التتابعي للدنا إالجديدة و لغرض تحديد مكان الضرر في [37]الموجود في الموقع الرسمي لجينوم بكتيريا الرايزوبيوم S. meliloti 1021لبكتيريا العوز الغذائي الموجودة فيھا مما قد يسھم في دراسة فضالً عن طفرةاألخرى دنا تلك البكتيريا وتحديد نوعية الطفرات إلى جنب طفرة العوز الغذائي. التعبير الجيني للجينات الطافرة األخرى جنباً المصادر 1. Hajare, B. and Ade, A. (2012). Confirming location of nitrogen fixing genes on plasmids in Rhizobium isolated from Pisum sativum. Biosci. Discovery. 3(2):160-164. 2. Sharma, P. and Yadav, S. (2012). Symbiotic characterization of mutants defective in proline dehydrogenase in Rhizobium sp. Cajanus under drought stress condition. European J. Exp. Biol., 2(1):206-216. 124 | Biology 2014) عام 3(العدد 27المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham Jour. for Pure & Appl. Sci. Vol. 27 (3) 2014 3. Randhawa, G. S. and Hassani, R. (2002). Role of rhizobial biosynthetic pathways of amino acids, nucleotide bases and vitamins in symbiosis. Indian J. Exp. Biol., 40(7):755-764. 4. Bradic, M. ; Sikora, S. ; Redžepović, S. and Štafa, Z. (2003). Genetic identification and symbiotic efficiency of an indigenous Sinorhizobium meliloti field population. Food Technol. Biotechnol. 41(1):69-75. ). علم أحياء التربة المجھرية. كلية العلوم. جامعة الموصل، 1989قاسم، غياث محمد وعلي، مضر عبد الستار.( .5 العراق.- والبحث العلمي، الموصل وزارة التعليم العالي ). مقدمة في مايكروبيولوجيا التربة. جامعة كورنيل.1988الكسندر, مارتن.( .6 7. Bayoumi, H. E. ; Biro, B. and Kecskes, M. (1995). Some environmental factors in fencing the survival of Rhizobium legumeinosarum bv. viceae. Acta. Biol. Hungary, 46(1):17-30. 8. Spaink, H. P. (2000). Root nodulation and infection factors produced by rhizobia. Annu. Rev. Microbiol. 54257-54288. 9. Barnett, M. J. and Fisher, R. F. (2006). Global gene expression in the rhizobial-legume symbiosis. Symbiosis. 421-424. 10. Williams, J. G. K., Kubelik, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A. and Tingey, S. V. (1990). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res.18: 6531–6535. 11. Vinuesa, P., Rademaker, J. L. W., de Bruijin, F. J. and Werner, D. (1998). Genotypic characterization of Bradyrhizobium strains nodulating endemic woody legumes of the canary Islands by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of genes encoding 16S rRNA (16S rDNA) and 16S-23S rDNA intergenic spacers, repetitive extragenic palindromic PCR genomic fingerprinting, and partial 16S rDNA sequencing. Appl. Environ. Microbiol.64:2096-2104. 12. Wei, G. H., Zhang, Z. X., Chen, C., Chen, W. M. and Ju, W. T. (2006). Phenotypic and genetic diversity of rhizobia isolated from nodules of the legume genera Astragalus, Lespedeza and Edysarum in northwestern China. Microbiol. Res. 163(6):651-662. 13. Silva C., Kan, F. L. and Martínez-Romero, E. (2007). Population genetic structure of Sinorhizobium meliloti and S. medicae isolated from nodules of Medicago spp. in Mexico. FEMS Microbiol. Ecol.60:477-489. 14. Sajjad, M., Malik, T. A., Arshad, M., Zahir, Z. A., Yusuf, F. and Rahman, S. U. (2008). PCR studies on genetic diversity of rhizobial strains. Int. J. Agric. Biol. 10:505-510. 15. Vincent, J. M. (1970). A manual for the practical study of the root-nodule bacteria. I. B. P. Handbook No. Blackwell ScientificPublication Ltd., Oxford, U. S. A., Pp.164. 16. Vincent, J. M. (1982). Nitrogen fixation in Legumes. Academic Press Sydney, New York, London. 17. Khanuja, S.P. S. and Kumar, S. (1989). Symbiotic and galactose utilization properties of phage RMP64-resistant mutants affecting three complementation groups in Rhizobium meliloti. J. Genet. 68(2):93-108. 18. Khanuja, S.P. S. and Kumar, S. (1988). Isolation of phages for Rhizobium meliloti AK631. Indian J. Exp. Biol. 26:665-667. 19. Singh, A., Ram, J., Sikka, V. K. and Kumar, S. (1984). Derivation of marked strains in Rhizobium legumeinosarum R1d1 by nitrosoguanidine and transposon mutageneasis. Indian J. Exp. Biol. 22:239-247. 125 | Biology 2014) عام 3(العدد 27المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham Jour. for Pure & Appl. Sci. Vol. 27 (3) 2014 20. Hynes, M. F., Simon, R. and PÜhler, A. (1985). The development of plasmid-free strains of Agrobacterium tumefaciens by using incompatibility with a Rhizobium meliloti plasmid to eliminate pAtC58. Plasmid. 13:99-105. 21. Engelke, T. H., Jagadish, M. N. and Pühler, A. (1987). Biochemical and genetical analysis of Rhizobium meliloti mutants defective in C4-dicarboxylate transport. J. Gen. Microbiol. 133:3019-3029. 22. Kerppola, T. K. and Kahn, M. K. J. (1988). Symbiotic phenotypes of auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti 104A14. J. Gen. Microbiol. 134:913-919. 23. Holliday, R. (1956). A new method for the identification of biochemical mutants of microorganisms. Nature. 178:987-990. 24. Eckhardt, T. (1978). A rapid method for the identification of plasmid desoxyribonucleic acid in bacteria. Plasmid. 1:584-588. 25. Hirsch, P. R., Van Montagu, M., Johnston, A. W. B., Brewin, N. J. and Schell, J. (1980). Physical identification of Bacteriocinogenic, nodulation and other plasmids in strains of Rhizobium legumeinosarum. J. Gen. Microbiol. 120:403-412. 26. Sambrook, J. ; Fritsh, E. F. and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning. A laboratory manual. Second Edition. Cold Spring. Harbor Laboratory. Press Cold Spring Harbor. New York. USA. 27. Clark, M. S. (1997). In: Plant Molecular Biology - A Laboratory Manual, pp. 305-328, Springer-Verlog Berlin Heidelberg, New York. 28. Elboutahiri, N., Thami-Alami., I., Zaïd, E. and Udupa, S. (2009). Genotypic characterization of indigenous Sinorhizobium meliloti and Rhizobium sullae by REP- PCR, RAPD and ARDRA analyses. African J. Biotech. 8(6):979-985. 29. Carelli, M., Gnocchi, S., Fancelli, S., Mengoni, A., Paffetti, D., Scotti, C. and Bazzicalupo, M. (2000). Genetic diversity and Dynamics of Sinorhizobium meliloti populations nodulating different alfalfa cultivars in Italian soils. Appl. Environ. Microbiol. 66(11):4785-4789. 30. Keller, M., Müller, P., Simon, R. and Pühler, A. (1988). Rhizobium meliloti genes for Exopolysaccharides synthesis and nodule infection located on megaplasmid 2 are activity transcribed during symbiosis. Mol. Plant-Microbe Interact. 1(7):267-274. 31. Finan, T. M., Weidner, S., Wong, K., Buhrmester, J., Chain, P., Vorholter, F. J., Hernández-Lucas, I., Becker, A., Cowie, A., Gouzy, J., Golding, B. and Pühler, A. (2001). The complete sequence of the 1,683 kb pSymB megaplasmid from the N2-fixing endosymbiont S. meliloti. Proc. Nati. Acad. Sci. USA.98:9889-9894. 32. Burkardt, B. and Burkardt, H.J. (1984).Visualization and exact molecular weight determination of a Rhizobium meliloti megaplasmid. J. Mol. Biol. 175:213-218. 33. Hynes, M. F., Simon, R., Muller, P., Niehaus, K., Labes, M. and Pühler, A. (1986). The two megaplasmids of Rhizobium meliloti are involved in the effective nodulation of alfalfa .Mol. Gen .Genet. 202:356-362 . 34. Oresnik, I. J., Liu, S. L., Yost, C. K. and Hynes, M. F. (2000). Megaplasmid pRme2011a of Sinorhizobium meliloti is not required for viability. J. Bacteriol. 182:3582- 3586. 35. Galibert, F., Finan, T. M., Long, S. R., Pühler, A., Abola, P., Ampe, F., Barloy-Hubler, F., Barnett, M. J., Becker, A., Boistard, P., Bothe, G., Boutry, M., Bowser, L., 126 | Biology 2014) عام 3(العدد 27المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham Jour. for Pure & Appl. Sci. Vol. 27 (3) 2014 Buhrmester, J., Cadieu, E., Capela, D., Chain, P., Cowie, A., Davis, R. W., Dreano, S., Federspiel, N. A., Fisher, R. F., Gloux, S., Godrie, T., Goffeau, A., Golding, B., Gouzy, J., Gurjal, M., Hernandez-Lucas, I., Hong, A., Huizar, L., Hyman, R. W., Jones, T., Kahn, D., Kahn, M. L., Kalman, S., Keating, D. H., Kiss, E., Komp, C., Lelaure, V., Masuy, D,, Palm, C., Peck, M. C., Pohl, T. M., Portetelle, D., Purnelle, B., Ramsperger, U., Surzycki, R., Thebault, P., Vandenbol, M., Vorholter, F. J., Weidner, S., Wells, D. H., Wong, K., Yeh, K. C., Batut, J. (2001). The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science. 668-672. 36. Al-Kanaany, G. F., Al-Yassri, H. F. and Al-Mousawi, A. A. (2012). Plasmid profile of two isolates of Sinorhizobium meliloti isolated from different soil areas in Basrah/ Iraq. Basrah J. Agric. Sci. 25(1):13-18. 37. https://iant.toulouse.inra.fr/bacteria/annotation/cgi/rhime.cgi. Holliday’s pool): مجمع ھوليدي 1(رقم جدول Pool 5 Pool 4 Pool 3 Pool 2 Pool 1 Pools Thiamine Methionine Cysteine Guanine Adenine Pool 6  Valine Lysine Isoleucine Leucine Histidine Pool 7  Proline Threonine Tryptophan Tyrosine Phenylalanine Pool 8  Arginine Aspartic acid Uracil Asparagine Glutamine Pool 9  Glycine Alanine Glutamate Serine Thymine Pool 10  Cobalamine Biotin Riboflavin Pantothenic acid Pool 11  127 | Biology 2014) عام 3(العدد 27المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham Jour. for Pure & Appl. Sci. Vol. 27 (3) 2014 في ھذه الدراسة المستعملة): العزالت البكتيرية 2(رقمجدول أسم العزلة المصدر الصفات المظھرية والوراثية SGI2 ,عزلة محلية برية+Nod ،pSymA ،pSymB منطقة الطارمية/ بغداد SGI4 ,طافرة عوز غذائي-Ade ،pSymA ،pSymB ھذه الدراسة SGI6 ،طافرة عوز غذائي-Cys ،pSymA ،pSymB ھذه الدراسة SGI7 ،طافرة عوز غذائي-Gly ،pSymA ،pSymB ھذه الدراسة SGI8 ،طافرة عوز غذائي-Met ،pSymA ،pSymB ھذه الدراسة SGI9 ,طافرة عوز غذائي-Try ،pSymA ،pSymB ھذه الدراسة SGI10 ،طافرة عوز غذائي-Ala ،pSymA ،pSymB ھذه الدراسة SGI11 ،طافرة عوز غذائي-Asp ،pSymA ،pSymB ھذه الدراسة SGI12 ،طافرة عوز غذائي-Try ،pSymA ،pSymB ھذه الدراسة SGI14 ،طافرة عوز غذائي-Lys ،pSymA ،pSymB ھذه الدراسة Sinorhizobiumلبكتيريا SGI2): طافرات العوز الغذائي التي تم الحصول عليھا من العزلة البرية 3(رقم جدول meliloti نوع الطفرة في الحامض األميني / القاعدة النيتروجينية / الفيتامين العزلة SGI4 )-Adenine (Ade SGI6 )-Cysteine (Cys SGI7 )-Glycine (Gly SGI8 )-Methionine (Met SGI9 )-Tryptophan (Try SGI10 )-Alanine (Ala SGI11 )-Aspartic acid (Asp SGI12 )-Tryptophan (Try SGI14 )-Lysine (Lys 128 | Biology 2014) عام 3(العدد 27المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham Jour. for Pure & Appl. Sci. Vol. 27 (3) 2014 Sinorhizobium melilotiفي عزلة بكتيريا Megaplasmids): البالزميدات الكبيرة 1(رقم صورة وطافرات العوز الغذائي البرية وطافرات Sinorhizobium meliloti): ھالم الترحيل الكھربائي لدنا عزالت بكتيريا 2(رقم صورة RAPD-PCRاألشكال التضخيم العشوائي للدنا متعدد تقانةو OPY-04البادئ باستعمالالعوز الغذائي 129 | Biology 2014) عام 3(العدد 27المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham Jour. for Pure & Appl. Sci. Vol. 27 (3) 2014 البرية وطافرات Sinorhizobium meliloti): ھالم الترحيل الكھربائي لدنا عزالت بكتيريا 3(رقم صورة RAPD-PCRاألشكال التضخيم العشوائي للدنا متعدد وتقانة OPB7البادئ باستعمالالعوز الغذائي 130 | Biology 2014) عام 3(العدد 27المجلد مجلة إبن الھيثم للعلوم الصرفة و التطبيقية Ibn Al-Haitham Jour. for Pure & Appl. Sci. Vol. 27 (3) 2014 Genetic variation between wild type and auxotrophic mutant isolates of Sinorhizobium meliloti by using RAPD- PCR technique Ihsan A. Hussein Salwa A. Ganim Dpet . of Biology/College of Education for Pure Science –( IbAl-Haithim) /University of Baghdad Receivd in:1/Septemper/2014, Accepted in :24/ November /2014 Abstract SGI2 wild type isolate of Sinorhizobium meliloti was isolated from Medicago sativa (alfalfa) plant which was obtained from Al-Tarmiaa region / Baghdad. Nine auxotrophic mutants were obtained from the SGI2 wild type isolate by mutagenesis with Nitrous acid (HNO2). The SGI2 wild type and the all auxotrophic mutant isolates had two Megaplasmids; pSymA and pSymB. No genetic variations in plasmid number and size were detected when gel electrophoresis was done for plasmid profile detection. Genetic variations by using RAPD-PCR technique were obtained between wild type and auxotrophic mutant isolates. One band was detected in SGI6 gel profile with 1.5 Kb size when OPY-04 primer was used. Using OPB7 primer by using RAPD-PCR technique showed large variation between all the isolates. Two bands were obtained from the SGI2 wild type isolate with 800 bases and 1.5 Kb in size. These bands were absent from the auxotrophic mutant isolates. The band with 800 bases was also found in SGI10 isolate. The other auxotrophic mutant isolates have different bands with size ranging from 200 bases and more than 1.5 Kb for the SGI6 isolate. No bands were detected in SGI8, SGI9 and SG12 isolates. The large differences in bands number and size suggested that the variation is clear at the genes level of the total genome and not at plasmid level as a result after nitrous acid mutagenesis. Keywords: Genetic variation, Sinorhizobium meliloti, RAPD, Nitrous acid